CN117683801A - 一种多基因表达载体、d-氨基酸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种多基因表达载体、D‑氨基酸及其制备方法；所述多基因表达载体包括第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因，其中，所述第一目的基因包括表达L‑氨基酸脱氨酶的基因序列，所述第二目的基因包括表达内消旋‑二氨基庚二酸脱氢酶的基因序列，所述第三目的基因包括表达甲酸脱氢酶的基因序列；通过该多基因表达载体可以表达出含有L‑氨基酸脱氨酶、内消旋‑二氨基庚二酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的催化酶组合物，解决了不稳定的中间产物难以分离的问题，且具有立体选择性高、反应条件温和、操作简单且环保等优点，使得其在工业生产中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种多基因表达载体、D-氨基酸及其制备方法。
背景技术
D-氨基酸是一种非天然的手性化合物，在食品、医药和化妆品化工领域有着重要的作用。在通常的情况下，由于在肝、肾以及血液中很少有代谢通路能够代谢D-氨基酸，因此D型对映异构体不仅比L型构型的药物更加有效，而且在对抗酶降解方面更加的稳定。因此对D-氨基酸的合成方法进行研究具有重大的意义。
而现有D-氨基酸制备工艺主要是化学合成法和生物合成法，其中，化学法合成D-氨基酸主要通过拆分D，L-氨基酸的外消旋体和从潜手性底物出发通过不对称催化而实现化学合成，但是其缺点在于合成的过程中会产生大量废弃物污染环境，不符合绿色制造的理念，同时在反应过程中需要特殊的温度和压力环境，使得生产成本高，并且部分方法获得的产物光学纯度较低，需要进一步进行拆分提纯；而目前的生物合成方法通过特定的生物载体表达出D-氨基酸，或者通过中间生物表达载体表达出催化L-氨基酸转变为D-氨基酸的催化酶，但是由于生物载体直接表达出D-氨基酸的效率低，因此难以得到大量D-氨基酸，而通过中间生物表达载体表达出催化酶的过程中会出现大量不稳定的中间产物，这些不稳定的中间产物会与D-氨基酸混合而难以分离出纯净的D-氨基酸。
发明内容
本申请提供了一种多基因表达载体、D-氨基酸及其制备方法，以解决现有技术中D-氨基酸制备工艺所存在的污染环境、生产成本高、产物纯度低和中间产物难以分离的技术问题。
第一方面，本申请提供了一种多基因表达载体，所述多基因表达载体包括第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因，其中，所述第一目的基因包括表达L-氨基酸脱氨酶的基因序列，所述第二目的基因包括表达内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的基因序列，所述第三目的基因包括表达甲酸脱氢酶的基因序列。
可选的，所述第一目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，
所述第二目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；和/或，
所述第三目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第二方面，本申请提供了一种制备第一方面所述的多基因表达载体的方法，所述方法包括：
以表达L-氨基酸脱氨酶目的基因的质粒为模板，采用第一引物组进行PCR扩增，得到第一目的基因；
对表达载体和所述第一目的基因分别进行第一酶切，后进行DNA连接酶连接，得到仅含第一目的基因的第一表达载体；
以表达内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶目的基因的质粒为模板，采用第二引物组进行PCR扩增，得到第二目的基因；
对所述第一表达载体和所述第二目的基因分别进行第二酶切，后进行DNA连接酶连接，得到含第一目的基因和第二目的基因的第二表达载体；
以表达甲酸脱氢酶目的基因的质粒为模板，采用第三引物组进行PCR扩增，得到第三目的基因；
对所述第二表达载体和所述第三目的基因分别进行第三酶切，后进行DNA连接酶连接，得到含第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因的多基因表达载体。
可选的，所述第一引物组包括PmLAAD-BamHI-F和PmLAAD-HindIII-R，所述PmLAAD-BamHI-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述PmLAAD-HindIII-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
可选的，所述第二引物组包括StDAPDH-NdeI-F和StDAPDH-KpnI-R，所述StDAPDH-NdeI-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述StDAPDH-NdeI-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
可选的，所述第三引物组包括FDH-KpnI-F和FDH-XhoI-R，所述FDH-KpnI-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述FDH-XhoI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
可选的，所述第一酶切的酶切位点为BamHI和HindIII；和/或，
所述第二酶切的酶切位点为NdeI和KpnI；和/或，
所述第三酶切的酶切位点为KpnI和XhoI
第三方面，本申请提供了一种催化酶组合物，所述催化酶组合物由第一方面所述的多基因表达载体表达出。
第四方面，本申请提供了一种D-氨基酸，所述D-氨基酸是由L-氨基酸为底物，并以第三方面所述的催化酶组合物催化反应得到的。
第五方面，本申请提供了一种制备第四方面所述的D-氨基酸的方法，所述方法包括：
于缓冲液体系中分别加入L-氨基酸、NADP、甲酸钠和第三方面所述的催化酶组合物，并进行催化反应，得到催化产物；
对所述催化产物进行酸碱度调节至预设酸碱度，并进行离心过滤和纯化，得到初级目标产物；
对所述初级目标产物进行旋转蒸发，后进行结晶，得到D-氨基酸产品。
可选的，所述催化反应的温度为25℃～37℃，所述催化反应的时间为8h～32h；和/或，
所述预设酸碱度为1～2。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的一种多基因表达载体，通过在多基因表达载体中引入可表达L-氨基酸脱氨酶的第一目的基因、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的第二目的基因和甲酸脱氢酶的第三目的基因，通过该多基因表达载体可以表达出含有L-氨基酸脱氨酶、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的催化酶组合物，而该催化酶组合物可以利用“一锅煮”的方法以L型氨基酸出发合成出高附加价值的D型氨基酸，不仅避免了中间产物的分离，还可以使得中间产物在生成之前就被消耗，解决了不稳定的中间产物难以分离的问题，同时由于采用了中间表达载体表达催化酶组合物的形式，具有立体选择性高、反应条件温和、操作简单且环保等优点，使得其在工业生产中具有很好的应用前景。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的催化酶组合物的催化原理示意图；
图2为本申请实施例提供的多基因表达载体的制备方法流程示意图；
图3为本申请实施例提供的D-氨基酸的制备方法流程示意图；
图4为本申请实施例提供的pET-PmLAAD质粒图谱示意图；
图5为本申请实施例提供的pET-PmLAAD-TlDAPDH质粒图谱示意图；
图6为本申请实施例提供的pET-PmLAAD-TIDAPDH-FDH质粒图谱示意图；
图7为本申请实施例3提供的D-苯丙氨酸的HPLC色谱图；
图8为本申请实施例4提供的D-丙氨酸的HPLC色谱图；
图9为本申请实施例5提供的D-亮氨酸的HPLC色谱图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
如图1所示，本申请实施例提供一种多基因表达载体，所述多基因表达载体包括第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因，其中，所述第一目的基因包括表达L-氨基酸脱氨酶的基因序列，所述第二目的基因包括表达内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的基因序列，所述第三目的基因包括表达甲酸脱氢酶的基因序列。
本申请实施例中，该多基因表达载体所表达出的催化酶组合物其催化原理如下：
该催化酶组合物是以L-氨基酸为底物，在L-氨基酸脱氨酶(PmLAAD)催化下，L-氨基酸氧化成对应的酮酸，然后在内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(TlDAPDH)以及辅酶(NADPH)作用下生成D-氨基酸，其中，由于辅酶(NADPH)的价格昂贵，不适合直接投入反应，因此基于L-氨基酸转变为D-氨基酸的过程建立了辅酶循环系统：以辅酶(NADP+)和甲酸钠为底物，在甲酸脱氢酶(FDH)催化作用下生成辅酶(NADPH)，上述辅酶循环体系中反应中除了辅酶产物外其余产物为CO2，因此不会对后续提取增加难度，更适合工业化放大生产。上述过程的具体原理如图1所示。
在一些可选的实施方式中，所述第一目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，
所述第二目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；和/或，
所述第三目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本申请实施例中，限定第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因的具体核苷酸序列，可以优化第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因的组成，使得多基因表达载体能够更好的同步表达出L-氨基酸脱氨酶、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的催化酶组合物。
如图2所示，基于一个总的发明构思，本申请实施例提供了一种制备所述多基因表达载体的方法，所述方法包括：
S1.以表达L-氨基酸脱氨酶目的基因的质粒为模板，采用第一引物组进行PCR扩增，得到第一目的基因；
S2.对表达载体和所述第一目的基因分别进行第一酶切，后进行DNA连接酶连接，得到仅含第一目的基因的第一表达载体；
S3.以表达内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶目的基因的质粒为模板，采用第二引物组进行PCR扩增，得到第二目的基因；
S4.对所述第一表达载体和所述第二目的基因分别进行第二酶切，后进行DNA连接酶连接，得到含第一目的基因和第二目的基因的第二表达载体；
S5.以表达甲酸脱氢酶目的基因的质粒为模板，采用第三引物组进行PCR扩增，得到第三目的基因；
S6.对所述第二表达载体和所述第三目的基因分别进行第三酶切，后进行DNA连接酶连接，得到含第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因的多基因表达载体。
本申请实施例中，先构建出含有第一目的基因的单基因表达载体，再在该表达载体上采用同源重组的方式依次插入第二目的基因和第三目的基因，以此构建出多基因表达载体，
该方法是针对上述多基因表达载体的制备方法，该多基因表达载体的具体组成信息可参照上述实施例，由于该制备方法采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
在一些可选的实施方式中，所述第一引物组包括Pm LAAD-BamHI-F和Pm LAAD-HindIII-R，所述PmLAAD-BamHI-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Pm LAAD-HindIII-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一些可选的实施方式中，所述第二引物组包括StDAPDH-NdeI-F和TlDAPDH-KpnI-R，所述TlDAPDH-NdeI-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述StDAPDH-NdeI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在一些可选的实施方式中，所述第三引物组包括FDH-KpnI-F和FDH-XhoI-R，所述FDH-KpnI-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述FDH-XhoI-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。
本申请实施例中，限定第一引物组、第二引物组和第三引物组的具体核苷酸序列，可以更好的针对各个质粒的模板进行PCR扩增，并且可以特异性的扩增出对应的目的基因片段，从而可以得到包含第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因的多基因表达载体。
在一些可选的实施方式中，所述第一酶切的酶切位点为BamHI和HindIII；和/或，
所述第二酶切的酶切位点为NdeI和KpnI；和/或，
所述第三酶切的酶切位点为KpnI和XhoI
本申请实施例中，限定第一酶切、第二酶切和第三酶切的具体位点，可以通过不同酶切位点的组合将第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因引入到表达载体中，从而可以得到包含第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因的多基因表达载体。
基于一个总的发明构思，本申请实施例提供了一种催化酶组合物，所述催化酶组合物由所述多基因表达载体表达出。
该催化酶组合物是基于上述多基因表达载体来实现，该多基因表达载体的具体组成可参照上述实施例，由于该催化酶组合物采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
基于一个总的发明构思，本申请实施例提供了一种D-氨基酸，所述D-氨基酸是由L-氨基酸为底物，并以所述催化酶组合物催化反应得到的。
该D-氨基酸是基于上述催化酶组合物来实现，该催化酶组合物的具体组成和来源可参照上述实施例，由于该D-氨基酸采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
如图3所示，基于一个总的发明构思，本申请实施例提供了一种制备所述D-氨基酸的方法，所述方法包括：
S1.于缓冲液体系中分别加入L-氨基酸、NADP、甲酸钠和所述催化酶组合物，并进行催化反应，得到催化产物；
S2.对所述催化产物进行酸碱度调节至预设酸碱度，并进行离心过滤和纯化，得到初级目标产物；
S3.对所述初级目标产物进行旋转蒸发，后进行结晶，得到D-氨基酸产品。
本申请实施例中，先在缓冲液体系中加入L-氨基酸和催化酶组合物作为原料，并进行催化反应，可以使得L-氨基酸转变为D-氨基酸，再通过酸碱度调节的方式使得多余的催化酶组合物沉淀，并通过离心的方式可以去除全细胞催化剂，再通过纯化和旋转蒸发的方式，从而可以纯化的D-氨基酸。
该方法是针对上述D-氨基酸的制备方法，该D-氨基酸的具体组成信息可参照上述实施例，由于该方法采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
在一些可选的实施方式中，所述催化反应的温度为25℃～37℃，所述催化反应的时间为8h～32h；和/或，
所述预设酸碱度为1～2。
本申请实施例中，限定催化反应的具体温度和具体时间，可以使得催化酶组合物有效的催化L-氨基酸转变为D-氨基酸。
该催化反应的温度可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。
该催化反应的时间可以是8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h或32h。
限定具体预设酸碱度，可以通过酸碱度调节的方式使得催化酶组合物以沉淀的方式与催化产物分离，从而方便后续通过离心过滤的方式去除全细胞催化剂。
该预设酸碱度可以是1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。
下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照行业标准测定。若没有相应的行业标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1
在单基因表达载体的基础上，继续插入目的基因，则可以构建多基因表达载体，大体步骤为：
构建含第一目的基因的单基因表达载体，再通过PCR扩增获得第二个目的基因片段(根据需要添加相应的RBS序列)，并将单基因表达载体进行线性化，采用同源重组或酶切连接的方法将连接第二目的基因并进行验证，接着按照类似的方法连接第三目的基因。
以三酶共表达菌株pET-PmLAAD-StDAPDH-FDH为例，首先以如图4所示的pET32a-PmLAAD为模板，通过设计引物组Pm LAAD-BamHI-F(CGGGATCCATGAACATTTCAAGGAGAAAGC，SEQID NO.4)和PmLAAD-HindIII-R(CCAAGCTTTTACTTCTTAAAACGATCCAAAC，SEQ ID NO.5)进行PCR扩增，获得PmLAAD目的基因，再利用BamHI和HindIII酶切位点将表达载体pETDuet-1线性化，通过同源重组的方法获得仅表达L-氨基酸脱氨酶的表达载体pET-PmLAAD。
接下来以pET-PmLAAD为表达载体，通过NdeI和KpnI进行双酶切将载体线性化，以pET32a-TlDAPDH为模板并利用设计引物组TDAPDH-NdeI-F和TLDAPDH-KpnI-R进行PCR扩增，获得TlDAPDH目的基因，再次通过同源重组的手段获得同时表达L-氨基酸脱氨酶和内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的载体pET-PmLAAD-TlDAPDH，其质粒图谱如图5所示。
上述同源重组具体实验步骤为：通过引物组TlDAPDH-NdeI-F(CCCATATGATGGGTGAGAAAATTCGTGT，SEQ ID NO.6)和TlDAPDH-KpnI-R(GGGGTACCTTAAACCAGCTGACGAATAATTTC，SEQ ID NO.7)扩增获得带有NdeI和KpnI酶切位点的TlDAPDH基因，然后用NdeI和KpnI双酶切体，然后将目标基因片段与载体连接，利用DH5α菌株进行感受态细胞制备，加入酶连产物体系，42℃热激转化30s，热激完成后立即降入LB复苏液，在37℃摇床振荡处理1h后涂于氨苄青霉素抗性的LB培养皿上。
待长出单菌落后，挑取单克隆菌落配制菌液，利用RNaseP的引物进行PCR，检测是否菌体是否成功导入连接成功的载体；当PCR跑胶检测后，选取阳性菌液接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩增，经过测序获得同时表达L-氨基酸脱氨酶和内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的载体pET-PmLAAD-TLDAPDH。
采用以上述构建的pET-PmLAAD-TLDAPDH质粒为载体，通过KpnI和XhoI进行双酶切将该载体线性化，以pET32a-FDH为模板利用引物组FDH-KpnI-F(GGGGTACCATGAAAATCGTTCTGGTTCTGT，SEQ ID NO.8)和FDH-XhoI-R(CCCTCGAGTTAAGCAACTTTTTTGTCGTT，SEQ ID NO.9)进行PCR扩增，获得FDH的目的基因，通过酶切连接的手段获得同时表达LAAD、DAPDH和FDH三个酶的载体pET-PmLAAD-TIDAPDH-FDH，导入大肠杆菌，测序正确后，即完成pET-PmLAAD-TlDAPDH-FDH的构建，其质粒图谱如图6所示。
实施例2
在实施例1所构建的pET-PmLAAD-TlDAPDH-FDH基因工程菌基础上，对该基因工程菌进行培养，具体步骤：挑取实施例1中测序正确的基因工程菌的单菌落，接种与LB培养基，置于37℃过夜培养；将所培养的基因工程菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基的1％，然后在37℃培养2-3小时，待OD600达到0.8左右加入IPTG诱导，置于20℃培养16小时，摇瓶发酵结束后，离心收集表达氨基酸脱氨酶、甲酸脱氢酶、内消旋脱氢酶的基因工程菌。
实施例3
在实施例2所得到的催化酶组合物的基础上，进一步进行操作：
在100mL的Tris-HCl(100mM，pH为9.0)中，加入80mmol的L-苯丙氨酸，160mmol的氯化铵，200mmol的甲酸钠，1g的催化酶组合物(来源于pET-PmLAAD-TlDAPDH-FDH基因工程菌表达)，0.1mgNADP(NADP+)，于30℃反应20h，在反应体系中加入稀盐酸以调节反应液的pH值至1～2，以沉淀催化剂，后离心除去全细胞催化剂。
将盐酸处理后的反应上清液以1mL/min的速度装载到填有树脂的分离柱中，用去离子水反复洗涤树脂至pH约为3，随后利用6％的氨水洗脱目的产物。
对含有目的产物的洗脱液进行旋转蒸发，结晶得到纯D-Phe。利用HPLC对得到的D-Phe进行鉴定，其色谱图如图7所示，峰列表如表1所示。
表1D-Phe的HPLC色谱图的峰列表
由图7和表1中数据可知，所得的D-Phe的转化率为93％，收率为78％，ee值>99％。
该HPLC色谱的具体参数为：
色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂；
流动相：流动相A为10mmol/L的庚烷磺酸钠与20mmol/L的磷酸氢二钠水溶液，磷酸调节pH为5.0，流动相B为乙睛，流动相A：流动相B＝90:10；
检测波长：205nm，流速：1.0mL/min；
柱温：35℃。
实施例4
在实施例2所得到的催化酶组合物的基础上，进一步进行操作：
在100mL的Tris-HCl(100mM，pH为9.0)中，加入80mmol的L-丙氨酸，160mmol的氯化铵，200mmol的甲酸钠，1g的催化酶组合物(来源于pET-PmLAAD-TlDAPDH-FDH基因工程菌表达)，0.1mgNADP(NADP+)，于37℃反应24h，在反应体系中加入稀盐酸以调节反应液的pH值至1～2，以沉淀催化剂，后离心除去全细胞催化剂。
将盐酸处理后的反应上清液以1mL/min的速度装载到填有树脂的分离柱中，用去离子水反复洗涤树脂至pH约为3，随后利用6％的氨水洗脱目的产物。
对含有目的产物的洗脱液进行旋转蒸发，结晶得到纯D-Ala。利用HPLC对得到的D-Ala进行鉴定，其色谱图如图8所示，峰列表如表2所示。
表2D-Ala的HPLC色谱图的峰列表
由图8和表2中数据可知，所得的D-Ala的转化率为89％，收率为72％，ee值>99％。
该HPLC色谱的具体参数为：
色谱柱：(奥泰)氨基键合硅胶柱；
流动相：0.05moL的磷酸二氢钾：乙睛(体积比35:65)；
检测波长：205nm，流速：1.0mL/min；
柱温：30℃。
实施例5
在实施例2所得到的催化酶组合物的基础上，进一步进行操作：
在100mL的NaHCO3-Na2CO3(100mM，pH为9.0)中，加入80mmol的L-亮氨酸，160mmol的氯化铵，200mmol的甲酸钠，1g的催化酶组合物(来源于pET-PmLAAD-TlDAPDH-FDH基因工程菌表达)，0.1mgNADP(NADP+)，于37℃反应24h，在反应体系中加入稀盐酸以调节反应液的pH值至1～2，以沉淀催化剂，后离心除去全细胞催化剂。
将盐酸处理后的反应上清液以1mL/min的速度装载到填有树脂的分离柱中，用去离子水反复洗涤树脂至pH约为3，随后利用6％的氨水洗脱目的产物。
对含有目的产物的洗脱液进行旋转蒸发，结晶得到纯D-Leu。利用HPLC对得到的D-Leu进行鉴定，其色谱图如图9所示，峰列表如表3所示。
表3D-Leu的HPLC色谱图的峰列表
由图9和表3中数据可知，所得的D-Leu的转化率为90％，收率为75％，ee值>99％。
该HPLC色谱的具体参数为：
色谱柱：YMC-TriartC18；
流动相：磷酸盐缓冲液(pH为2.8)：乙腈(体积比97:3)；
检测波长：210nm，流速：0.9mL/min；
柱温：40℃。
综上所述，本申请实施例提供的一种多基因表达载体所表达出的催化酶组合物，可以L-氨基酸为底物经过多酶催化合成D-氨基酸，而该多酶级联反应可以将L-氨基酸脱氨酶、甲酸脱氢酶及内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶这三种酶结合应用，利用“一锅煮”的方法可以从廉价易得的L-型氨基酸出发合成高附加值的D-型氨基酸，且该过程中避免了中间产物的分离，并且中间产物可以在生成的过程中就被消耗，具有立体选择性高、反应条件温和、操作简单且环保等优点，因此在工业生产中具有良好的应用前景。
本申请的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”具体为附图中的图面方向。另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种多基因表达载体，其特征在于，所述多基因表达载体包括第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因，其中，所述第一目的基因包括表达L-氨基酸脱氨酶的基因序列，所述第二目的基因包括表达内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的基因序列，所述第三目的基因包括表达甲酸脱氢酶的基因序列。
2.根据权利要求1所述的多基因表达载体，其特征在于，所述第一目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，
所述第二目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；和/或，
所述第三目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种制备如权利要求1或2所述的多基因表达载体的方法，其特征在于，所述方法包括：
以表达L-氨基酸脱氨酶目的基因的质粒为模板，采用第一引物组进行PCR扩增，得到第一目的基因；
对表达载体和所述第一目的基因分别进行第一酶切，后进行DNA连接酶连接，得到仅含第一目的基因的第一表达载体；
以表达内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶目的基因的质粒为模板，采用第二引物组进行PCR扩增，得到第二目的基因；
对所述第一表达载体和所述第二目的基因分别进行第二酶切，后进行DNA连接酶连接，得到含第一目的基因和第二目的基因的第二表达载体；
以表达甲酸脱氢酶目的基因的质粒为模板，采用第三引物组进行PCR扩增，得到第三目的基因；
对所述第二表达载体和所述第三目的基因分别进行第三酶切，后进行DNA连接酶连接，得到含第一目的基因、第二目的基因和第三目的基因的多基因表达载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一引物组包括Pm LAAD-BamHI-F和Pm LAAD-HindIII-R，所述Pm LAAD-BamHI-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述PmLAAD-HindIII-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二引物组包括StDAPDH-NdeI-F和StDAPDH-KpnI-R，所述StDAPDH-NdeI-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述StDAPDH-NdeI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第三引物组包括FDH-KpnI-F和FDH-XhoI-R，所述FDH-KpnI-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述FDH-XhoI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
7.一种催化酶组合物，其特征在于，所述催化酶组合物由权利要求1或2所述的多基因表达载体表达出。
8.一种D-氨基酸，其特征在于，所述D-氨基酸是由L-氨基酸为底物，并以权利要求7所述的催化酶组合物催化反应得到的。
9.一种制备如权利要求8所述的D-氨基酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
于缓冲液体系中分别加入L-氨基酸、NADP、甲酸钠和权利要求7所述的催化酶组合物，并进行催化反应，得到催化产物；
对所述催化产物进行酸碱度调节至预设酸碱度，并进行离心过滤和纯化，得到初级目标产物；
对所述初级目标产物进行旋转蒸发，后进行结晶，得到D-氨基酸产品。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述催化反应的温度为25℃～37℃，所述催化反应的时间为8h～32h；和/或，
所述预设酸碱度为1～2。
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