CN117683765A - 一种dna片段组装方法 - Google Patents

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CN117683765A CN202311706163.7A CN202311706163A CN117683765A CN 117683765 A CN117683765 A CN 117683765A CN 202311706163 A CN202311706163 A CN 202311706163A CN 117683765 A CN117683765 A CN 117683765A
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Abstract

本发明公开了一种DNA片段组装方法，包括如下步骤：(1)设计至少一插入片段扩增引物对，通过PCR扩增在至少一插入片段的两端分别引入至少一核糖核苷酸，且当插入片段的数目多于一时，相邻插入片段间具有同源臂；(2)获得能够与步骤(1)所得的至少一插入片段的PCR扩增产物相连的载体片段的PCR扩增产物或酶切产物；(3)将步骤(1)获得的至少一插入片段的PCR扩增产物和步骤(2)所得的载体片段的PCR扩增产物用RNase H进行处理；或将步骤(1)获得的至少一插入片段的PCR扩增产物用RNase H进行处理，与步骤(2)所得的载体片段的酶切产物混合；(4)将步骤(3)所得的产物进行体内或体外组装。本发明组装阳性率高，可以获得高于90％阳性克隆，可应用于体内体外的多DNA片段的组装、DNA多位点的定点突变和小片段的组装。

Description

一种DNA片段组装方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种DNA片段组装方法。
背景技术
DNA片段组装技术始于上世纪70年代，对分子生物学的发展起着里程碑式的作用。随着DNA片段组装技术的不断进步，合成生物学、医学、农业、工业等其他领域也开启了新的时代。DNA片段组装技术已经成为大多数实验室基础且不可缺少的一部分。快速、简单、高效地完成DNA片段组装技术是目前大多科研工作者的基本需求。
合成生物学是二十一世纪新兴的学科，合成生物学将引领生物学开展新的革命，合成生物学需要新兴的各种技术作为发展动力。新的DNA片段组装技术将是合成生物学的一大助力。
DNA片段组装技术按照基本原理可以分为以下几种：传统的依赖内切酶的分子克隆、PCR(TA)克隆、不依赖连接酶的克隆(LIC)、无缝克隆和同源重组等。其中USER克隆是一种常用的无缝克隆技术，在PCR引物中插入尿嘧啶脱氧核苷酸(dU)，利用USER酶混合物处理扩增的片段，产生互补的3′突出端，可以实现不同片段的组装。但是USER克隆技术局限于尿嘧啶脱氧核苷酸(dU)，如果组装片段附近没有合适的位点，将不适用于克隆组装。另外PCR过程中也比较依赖PfuCx等少数DNA聚合酶，存在着一定的局限性。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种DNA片段组装方法。
本发明的技术方案如下：
一种DNA片段组装方法，包括如下步骤：
(1)设计至少一插入片段扩增引物对，通过PCR扩增在至少一插入片段的两端分别引入至少一核糖核苷酸，且当插入片段的数目多于一时，相邻插入片段间具有同源臂，该核糖核苷酸包括rA、rC、rU和rG；
(2)获得能够与步骤(1)所得的至少一插入片段的PCR扩增产物相连的载体片段的PCR扩增产物或酶切产物，该酶切产物具有3’端突出的粘性末端；
(3)将步骤(1)获得的至少一插入片段的PCR扩增产物和步骤(2)所得的载体片段的PCR扩增产物用RNase H进行处理；或将步骤(1)获得的至少一插入片段的PCR扩增产物用RNase H进行处理，与步骤(2)所得的载体片段的酶切产物混合；
(4)将步骤(3)所得的产物转化进入感受态细胞进行细胞内修复。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)为：设计载体扩增引物对，通过PCR扩增在载体片段的两端分别引入至少一核糖核苷酸，使得由至少一插入片段构成的总插入片段与载体片段间具有同源臂，在进行所述步骤(4)之前，该步骤(2)的反应产物用RNase H进行处理。
在本发明的一个优选实施方案中，所述同源臂的长度为6-14bp。
在本发明的一个优选实施方案中，获得所述步骤(2)中的酶切产物所用的酶为核酸外切酶T5或核酸酶PfAgo；所述RNase H为RNase HI、RNase HII或RNase HIII。
进一步优选的，所述RNase H II的氨基酸序列如SEQ ID NO.73至SEQ ID NO.77所示之一，所述RNase HI的氨基酸序列如SEQ ID NO.78所示，所述RNase HIII的氨基酸序列如SEQ ID NO.79所示。
本发明的另一技术方案如下：
一种DNA片段组装方法，包括如下步骤：
(1)设计至少一插入片段扩增引物对，通过PCR扩增在至少一插入片段的两端分别引入至少一核糖核苷酸，且当插入片段的数目多于一时，相邻插入片段间具有同源臂，该核糖核苷酸包括rA、rC、rU和rG；
(2)获得能够与步骤(1)所得的至少一插入片段的PCR扩增产物相连的载体片段的PCR扩增产物或酶切产物，该酶切产物具有3’端突出的粘性末端；
(3)将步骤(1)获得的至少一插入片段的PCR扩增产物和步骤(2)所得的载体片段的PCR扩增产物用RNase H进行处理；或将步骤(1)获得的至少一插入片段的PCR扩增产物用RNase H进行处理，与步骤(2)所得的载体片段的酶切产物混合；
(4)将步骤(3)所得的产物、5'-3'核糖核苷酸外切酶和DNA连接酶混合反应，即成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)为：设计载体扩增引物对，通过PCR扩增在载体片段的两端分别引入至少一核糖核苷酸，使得由至少一插入片段构成的总插入片段与载体片段间具有同源臂，在进行所述步骤(4)之前，该步骤(2)的反应产物用RNase H进行处理。
在本发明的一个优选实施方案中，所述同源臂的长度为6-14bp。
在本发明的一个优选实施方案中，获得所述步骤(2)中的酶切产物所用的酶为核酸外切酶T5或核酸酶PfAgo，所述RNase H为RNase HI、RNase HII或RNase HIII，所述5’-3’核糖核苷酸外切酶为YgdG，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
进一步优选的，所述RNase H II的氨基酸序列如SEQ ID NO.73至SEQ ID NO.77所示之一，所述RNase HI的氨基酸序列如SEQ ID NO.78所示，所述RNase HIII的氨基酸序列如SEQ ID NO.79所示，所述YgdG的氨基酸序列如SEQ ID NO.113所示。
本发明的有益效果是：
1、本发明可以极大地减少DNA片段组装反应成本。
2、本发明中的引物设计更加方便，不再局限于特定的序列。所设计的引物或者合成序列可以含有一个或多个RNA碱基，切除部分也可以包含其他修饰碱基。
3、本发明组装阳性率高，可以获得高于90％阳性克隆，可应用于体内体外的多DNA片段的组装、DNA多位点的定点突变和小片段的组装。
附图说明
图1为本发明的技术原理图。
图2为本发明实施例1中的RNase HII的SDS-PAGE电泳图：。
图3为本发明实施例2中RNase HII酶用量以及引物同源臂长度优化的示意图和结果图。
图4为本发明实施例3中RNase HII Fusion和USER cloning的比较示意图和结果图。
图5为本发明实施例4中多片段组装和多点突变的示意图和结果图。
图6为本发明实施例5中小片段组装的原理示意图和结果图。
图7为本发明实施例6中引物中增加核糖核酸数目对RNase HII Fusion影响的原理示意图和结果图。
图8为本发明实施例7中反应时间优化的结果图。
图9为本发明实施例8中核酸外切酶T5介导的载体制备原理示意图和结果图。
图10为本发明实施例9中核酸酶PfAgo介导的载体制备的原理示意图和结果图。
图11为本发明实施例10中不同感受态对RNase HII Fusion效率影响的结果图。
图12为本发明实施例11中不同类型RNase H切割原理示意图示意图。
图13为本发明实施例12中YgdG和T4 DNA连接酶介导的体外连接结果图。
图14为本发明实施例13中YgdG的SDS-PAGE电泳图。
图15为本发明实施例14中YgdG的体外切割核酸质谱结果图。
图16为本发明实施例15中体外质粒组装结果图。
图17为本发明实施例15中DNA体外组装的技术原理图。
图18为本发明实施例16中利用分子信标验证RNase HII的切割活性结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1RNase HII的制备
本实施例中，RNase HII基因克隆自Rosetta(DE3)pLysS，利用LIC(不依赖连接酶的克隆)方法将目的基因克隆到pCri-8b(Addgene，Plasmid#61331)载体上，获得pCri-8b-RNase HII(SEQ ID NO.67)，接着转化至TOP10感受态中，挑选单克隆测序，把测序正确的阳性质粒转化至Rosetta(DE3)pLysS感受态中，得到RNase HII表达菌。
将表达菌种子液按照1∶100转接至LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD＝0.6左右，加入IPTG至终浓度0.25mM诱导表达，表达温度为18℃，转速为200rpm。过夜培养后，离心收菌，破碎后的上清经HisTrap excel亲和层析柱和Superdex 75 Increase 10/300 GL分子筛两步纯化后得到目的蛋白。蛋白纯化结果如图2所示，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色可以看出，成功制备了RNase HII，蛋白大小为23.9kDa。
其中pCri-8b-RNase HII构建克隆所用引物如下表1所示：
表1
引物名称 序列信息(5′-3′) SEQ ID NO
RNase HII-F ttacttccagggccatatgatcgaatttgtttatccgc 1
RNase HII-R ggtgatgatgctcgagttaggacgcaagtcccagtg 2
pCri-8b-F ctcgagcatcatcaccaccaccact 3
pCri-8b-R atggccctggaagtaaaggttttcgcc 4
其中纯化蛋白所用buffer如下表2所示：
表2
实施例2 RNase HII酶用量以及引物同源臂长度的优化
本实施例对RNase HII酶的用量进行优化。利用蓝白斑筛选实验，将LacZa重新插入pUC19载体(SEQ ID NO.68)中(如图3A所示)，参照USER cloning引物设计，在引物中插入核糖核酸，载体与插入片段间有8bp的同源臂(如图3B所示)。酶的浓度梯度为1000ng、500ng、250ng、125ng、65ng、32ng、16ng、8ng、4ng、2ng、1ng、0.5ng、0.25ng、0.125ng和0ng。片段经过RNase HII处理后，转入感受态，37℃培养箱过夜培养。优化结果如图3C所示，每个反应加入4ng RNase HII酶时，能够得到较多的克隆。后续的实验每个反应均使用4ng RNaseHII酶。
其中酶用量优化所用引物如下表3所示：
表3
引物名称 序列信息(5′-3′) SEQ ID NO
LacZa-rX-8bp-F atgaccat(rG)attacgccaagcttgc 5
LacZa-rX-8bp-R aaacctct(rG)acacatgcagctcc 6
pUC19-backbone-rX-8bp-F agaggttt(rU)caccgtcatcaccg 7
pUC19-backbone-rX-8bp-R atggtcat(rA)gctgtttcctgtgtga 8
PCR反应体系如下表4所示：
表4
本实施例中PCR反应条件如下表5所示：
表5
注*：LacZa片段PCR延伸20s，pUC19 backbone片段PCR延伸80s RNase HII酶反应体系如下表6所示：
表6
组分 用量(μL)
DDW 6
10×RNase HII buffer 1
LacZa(20ng/μL) 1
pUC19 backbone(50ng/μL) 1
RNase HII(浓度梯度稀释) 1
总量 10
RNase HII酶反应条件如下表7所示
表7
阶段 条件
酶切 37℃20min
退火 20℃20min
上述表6中的10×RNase HII buffer组分如下表8所示：
表8
在上述实验结果的基础上，本实施例进一步对插入片段与载体同源臂长度进行优化，分别设计载体与插入片段间有4bp、6bp、10bp、12bp、14bp同源臂的引物(8bp引物已在酶浓度优化实验中设计)，进行RNase HII Fusion实验(参考表6的RNase HII酶反应体系和表7的RNase HII酶反应条件)。实验结果显示如图3D所示，6bp、8bp、10bp和12bp的同源臂引物都能得到较多的克隆。
其中引物同源臂长度优化所用引物如下表9所示：
表9
实施例3 RNase HII Fusion和USER cloning的比较
本实施例将实施例2的RNase HII Fusion与商用的USER cloning进行对比，利用蓝白斑筛选实验，将LacZa重新插入pUC19载体中。首先设计了类似的引物，分别插入dU(尿嘧啶脱氧核苷酸)或者rU(尿嘧啶核苷酸)，USER cloning的载体与插入片段间有8bp同源臂，由于两种酶的切割位置不同，RNase HII Fusion的载体与插入片段间有6bp同源臂。
为了比较在有相同长度同源臂时的效果，又对RNase HII Fusion额外设计了载体与插入片段间有8bp同源臂的引物。RNase HII Fusion和USER cloning的引物设计示意图如图4A所示，首先选取特定的位置，可以设计USER cloning的引物，特定的位置一般为A-nN-U，根据USER cloning的引物设计类似的RNase HII Fusion引物，因为两种酶的切割方式不同，额外设计含有8bp同源臂的引物。PCR比较效果如图4B所示，插入rU(尿嘧啶核苷酸)的引物可以适用于更多的DNA聚合酶，插入dU(尿嘧啶脱氧核苷酸)的引物局限于PfuCx等少数DNA聚合酶。其中PCR所用的PfuS7为超保真PCR试剂盒(NEB，#E0553S)或PhusionTM高保真DNA聚合酶(Thermo，F530S)、PfuX7为PfuTurbo Cx热启动DNA聚合酶(Agilent，600410)，PfuX7为PfuCx的一种突变体。测试结果如图4C所示，两种条件的RNaseHII Fusion都比USER cloning效果更好。
其中RNase HII Fusion和USER cloning的比较所用引物如下表10所示：
表10
实施例4多片段组装和多点突变
(1)多片段组装
本实施例运用实施例2的RNase HII Fusion进行多片段组装，通过把SARS-CoV-2S蛋白分成大小为1kb(S1)、1.5kb(S2)和1.4kb(S3)的三个片段，通过多种组合，与载体pcDNA6B(5.6kb)重新组装，组合模式及组装效果如图5A所示，最终多片段组装有着较高的效率。
多片段组装所用引物如下表11所示：
表11
引物名称 序列信息(5′-3′) SEQ ID NO
S-1-F gaacaatgtt(rU)gtttttcttgttttattgcc 33
S-1-R aacattgttc(rG)tttagttgttaacaagaac 34
S-330-F gatttcctaa(rU)attacaaacttgtgccct 35
S-330-R ttaggaaatc(rU)aacaatagattctgttggt 36
S-816-F agaggtcat(rU)tattgaagatctacttttcaac 37
S-816-R atgacctct(rU)gcttggttttgatgg 38
S-1273-F cacatctag(rA)gattacaaggatgacgac 39
S-1273-R ctagatgtg(rU)aatgtaatttgactcctttg 40
多片段组装的引物组合如下表12所示：
表12
组合片段名称 所用引物名称
S-1 S-1-F+S-330-R
S-2 S-330-F+S-816-R
S-3 S-816-F+S-1273-R
S-123 S-1-F+S-1273-R
S-12 S-1-F+S-816-R
S-23 S-330-F+S-1273-R
S-V S-1273-F+S-1-R
(2)多点突变
本实施例运用实施例2的RNase HII Fusion进行多点突变，通过把S蛋白的3个位点进行突变，突变位点为T19R、T478K和D950N，通过多种组合，分别对一个位点(T478K)、两个位点(T19R和D950N)和三个位点(T19R、T478K和D950N)进行突变。一个位点进行突变时，与传统的Dpn I突变法进行比较。组合模式及组装效果如图5B所示，多点突变和单点突变均有着较高的效率，与传统的Dpn I突变法相比，RNase HII Fusion单点突变效率更高。
多个位点突变所用引物如下表13所示：
表13
多点突变组合的引物组合如下表14所示：
表14
组合名称 所用引物名称
1 site SDM S-T478K-F+S-T478K-R
2 site SDM-insert S-T19R-F+S-D950N-R
2 site SDM-vector S-D950N-F+S-T1 9R-R
3 site SDM-insert-1 S-T19R-F+S-T478K-R
3 site SDM-insert-2 S-T478K-F+S-D950N-R
3 site SDM-vector S-D950N-F+S-T19R-R
图5中的pcDNA6B SARS-CoV-2-S序列如SEQ ID NO.69所示。
实施例5小片段组装
基于外切活性产生粘性末端的克隆方法如LIC、Gibson组装，在组装小片段时容易发生过度切割，使小片段被完全降解，因此存在一定的局限性。
本实施例通过两种方法，成功将小片段(Linker+Hibit)插入目标载体pUC19中。方法一和方法二的区别在于小片段的制备方法不同，方法一是通过引物退火形成带粘性末端的双链产物，方法二是通过PCR生成插入核糖核苷酸的双链DNA产物，当与含核糖核苷酸的载体经实施例2的RNase HII Fusion处理后，方法一和方法二均能组装成大量的正确克隆。小片段组装的示意图如图6A和6B所示，组装结果如图6C所示。
小片段组装所用引物如下表15所示：
表15
图6中的pUC19-Hibit的序列如SEQ ID NO.70所示。
实施例6引物中增加核糖核酸数目对实施例2的RNase HII Fusion的影响
当引物中插入一个核糖核酸时，6bp、8bp、10bp和12bp的同源臂引物都能得到较多的克隆，14bp的同源臂引物得到较少的克隆。在同源臂为14bp时，引物中插入两个核糖核酸，克隆数目显著增加。引物设计示意图如图7A所示，引物中插入一个核糖核酸为rX组，引物中插入两个核糖核酸为2rX组。实验结果如图7B所示，在同源臂为14bp时，引物中插入1个核糖核酸，克隆数目较少；引物中插入两个核糖核酸，克隆数目显著增加。
引物中增加核糖核酸数目对RNase HII Fusion的影响所用引物如下表16所示：
表16
引物名称 序列信息(5′-3′) SEQ ID NO
LacZa-rX-14bp-F gctatgaccatgat(rU)acgccaagc 25
LacZa-rX-14bp-R tgaaaacctctgac(rA)catgcagct 26
pUC19-backbone-rX-14bp-F gtcagaggttttca(rC)cgtcatcacc 27
pUC19-backbone-tX-14bp-R atcatggtcatagc(rU)gtttcctgtgt 28
LacZa-2rX-14bp-F gctatga(rC)catgat(rU)acgccaagc 55
LacZa-2rX-14bp-R tgaaaac(rC)tctgac(rA)catgcagct 56
pUC19-backbone-2rX-14bp-F gtcagag(rG)ttttca(rC)cgtcatcacc 57
pUC19-backbone-2rX-14bp-R atcatgg(rU)catagc(rU)gtttcctgtgt 58
实施例7反应时间的优化
为了进一步缩短整个体系的反应时间，本实施例对实施例2中RNase HII Fusion的反应时间进行优化。起初的反应条件为酶切阶段37℃20min，退火阶段20℃20min。首先优化退火阶段的反应时间，反应条件依次为20℃20min、20℃10min、20℃5min和20℃0min。退火阶段反应时间优化结果如图8A所示，缩短退火阶段反应时间同样可以得到较多的克隆，去掉退火阶段也可以得到较多的克隆。进一步优化酶切阶段的反应时间，反应条件依次为37℃20min、37℃10min、37℃5min。酶切阶段反应时间优化结果如图8B所示，缩短酶切阶段反应时间同样可以得到较多的克隆，仅用37℃反应5min就可以得到较多的克隆。
反应时间的优化所用引物如下表17所示：
表17
实施例8核酸外切酶T5介导的载体制备
在克隆过程中，载体相对长度较大，PCR过程中可能会引入突变。有些载体含有重复序列，在PCR过程中更不容易正确扩增。载体除PCR扩增获得，还可以通过酶切获得。传统的内切酶通常产生含有5′端突出的粘性末端，一般不适用于RNase HII Fusion。本实施例表明利用核酸外切酶T5消化经限制性内切酶处理的载体，产生3′端突出的粘性末端，可以用于RNase HII Fusion。
本实施例设置时间梯度优化核酸外切酶T5制备载体的反应时间。如图9A所示，核酸外切酶T5处理载体后，加入1μL 0.5M EDTA(pH 8.0)终止反应，与经RNase HII处理后的插入片段混匀，(载体50ng，插入片段20ng)转入TOP10感受态中。核酸外切酶T5与RNase HIIFusion联用的实验结果如图9B所示，两种经核酸外切酶T5处理的载体均可以应用于RNaseHII Fusion。其中pCri-8b-LacZa(SEQ ID NO.71)经测序统计后的阳性克隆率为10/12，pcDNA6B-LacZa(SEQ ID NO.72)经测序统计后的阳性克隆率为12/12。
核酸外切酶T5介导的载体制备所用引物如下表18所示：
表18
pcDNA6B限制性内切酶酶切反应体系如表19所示：
表19
组分 用量(μL)
DDW 41
10×CutSmart buffer 5
BamHI(10U/μL) 1
pcDNA6B(1000ng/μL) 3
总量 50
pCri-8b限制性内切酶酶切反应体系如表20所示：
表20
组分 用量(μL)
DDW 37
10×CutSmart buffer 5
NdeI(10U/μL) 1
XhoI(10U/μL) 1
pCri-8b(500ng/μL) 6
总量 50
核酸外切酶T5介导的载体制备反应体系如表21所示：
表21
上述5×核酸外切酶T5 mix组分(1mL)如表22所示：
表22
上述核酸外切酶T5介导的载体制备反应条件如表23所示：
表23
阶段 条件
酶切 30℃(时间梯度)
终止 加1μL 0.5M EDTA(pH 8.0)
RNase HII介导的插入片段制备反应体系表24所示：
表24
组分 用量(μL)
DDW 3
10×RNase HII buffer 0.5
RNase HII 0.5
插入片段LacZa(20ng/μL) 1
总量 5
实施例9核酸酶PfAgo介导的载体制备
实施例8证实利用核酸外切酶T5制备载体可以用于RNase HII Fusion，但是由于核酸外切酶T5消化产出3′端突出粘性末端长度的不确定性以及细菌内质粒修复时容易产生错误，精准的切割产生能用于RNase HII Fusion的载体是必要的。
本实施例利用核酸酶PfAgo制备载体，可以产生特定长度的3′端突出粘性末端。核酸酶PfAgo利用5′端磷酸化的sgDNA可以产生3′端突出的粘性末端，3′端突出的粘性末端的长度也可以通过sgDNA设计调整。核酸酶PfAgo处理载体后，载体跑胶回收，与经RNase HII处理后的插入片段混匀，(载体50ng，插入片段20ng)转入TOP10感受态中。核酸酶PfAgo制备载体的示意图如图10A和10B所示，核酸酶PfAgo与RNase HII Fusion联用的实验结果如图10C所示，核酸酶PfAgo介导的载体制备可用于RNase HII Fusio，能够生产大量的克隆。另外其他类似的Ago蛋白也可以用于载体制备，如CbAgo等。核酸酶PfAgo介导的载体制备所用引物如下表25所示：
表25
引物名称 序列信息(5′-3′) SEQ ID NO
LacZa-rX-8bp-F atgaccat(rG)attacgccaagcttgc 5
LacZa-rX-8bp-R aaacctct(rG)acacatgcagctcc 6
pUC19-sgDNA-1 5′-Phosphate-ggaaacagctatgacc 63
pUC19-sgDNA-2 5'-Phosphate-tggcgtaatcatggtc 64
pUC19-sgDNA-3 5'-Phosphate-tgcatgtgtcagaggt 65
pUC19-sgDNA-4 5′-Phosphate-atgacggtgaaaacct 66
pUC19限制性内切酶酶切反应体系如下表26所示：
表26
组分 用量(μL)
DDW 41
10×CutSmart buffer 5
EcoRI(10U/μL) 1
pUC19(1000ng/μL) 3
总量 50
核酸酶PfAgo介导的载体制备反应体系如下表27所示：
表27
2×核酸酶PfAgo buffer组分如下表28所示：
表28
组分 浓度
HEPES(pH 7.0) 40mM
MnCl2 2mM
NaCl 300mM
核酸酶PfAgo介导的载体制备反应条件如下表29所示：
表29
阶段 条件
酶切 95℃15min
退火 每10s降温1℃，冷却至25℃
RNase HII介导的插入片段制备反应体系如下表30所示：
表30
组分 用量(μL)
DDW 3
10×RNase HII buffer 0.5
RNase HII 0.5
插入片段LacZa(20ng/μL) 1
总量 5
实施例10不同感受态对RNase HII Fusion效率的影响
为了探索不同感受态是否会对RNase HII Fusion效率产生影响，本实施例选取了常用的10种感受态进行测试，利用蓝白斑筛选实验，将LacZa重新插入pUC19载体中(其中DB3.1、Stbl3、BW25113和ER2566这4种感受态不可以用作蓝白斑筛选)。测试不同感受态效率用的感受态是上海唯地生物的商业感受态，其他实验用的感受是自己制作的高效感受态。如图11所示，本实施例选用的10种感受态对RNase HII Fusion的效率不会产生影响，均可以得到较多的克隆。能够用作蓝白斑筛选的6种感受态阳性克隆率均在98％以上。
不同感受态对RNase HII Fusion效率的影响所用引物如下表31所示：
表31
引物名称 序列信息(5′-3′) SEQ ID NO
LacZa-rX-8bp-F atgaccat(rG)attacgccaagcttgc 5
LacZa-rX-8bp-R aaacctct(rG)acacatgcagctcc 6
pUC19-backbone-rX-8bp-F agaggttt(rU)caccgtcatcaccg 7
pUC19-backbone-rX-8bp-R atggrcat(rA)gctgtttcctgtgtga 8
实施例11其他类型RNaseH的应用
本发明所保护的内容包括且不限于E.coli RNase HII。本发明主要用到的是E.coli RNase HII，另外其他种属的RNase HII也可应用于RNase HII Fusion，其他类型的RNase H(RNase HI和RNase HIII)也可以用于新型克隆方法。DNA双链中嵌入三个以上相邻的核糖核苷酸可以被RNase HI切割，DNA双链中嵌入两个以上相邻的核糖核苷酸可以被RNase HIII切割，DNA双链中嵌入1个核糖核苷酸只能被RNase HII切割(18)。通过引物设计加入不同个数的核糖核苷酸，RNase HI和RNase HIII可以实现类似RNase HII Fusion的作用。不同类型RNase H切割示意图如图12所示，DNA双链中嵌入三个以上相邻的核糖核苷酸可以被RNase HI切割，DNA双链中嵌入两个以上相邻的核糖核苷酸可以被RNase HIII切割，DNA双链中嵌入1个核糖核苷酸只能被RNase HII切割。
本实施例中：
E.coli RNase HII的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示：
B.subtilis RNase HII的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示：
Thermus thermophiles HB8 RNase HII的氨基酸序列如SEQ ID NO.75所示：
Homo sapiens RNase HII的氨基酸序列如SEQ ID NO.76所示：
Mus musculus RNase HII的氨基酸序列如SEQ ID NO.77所示：
E.coli RNase HI的氨基酸序列如SEQ ID NO.78所示：
B.subtilisRNase HIII的氨基酸序列如SEQ ID NO.79所示：
实施例12 YgdG和T4 DNA连接酶介导的体外连接
RNase HII Fusion产物可以通过和YgdG、T4 DNA连接酶联用实现DNA体外连接。RNase HII Fusion产物经RNase HII酶切后还会保留核糖核苷酸，本实施例通过加入YgdG(具体制备请见实施例13)后，可以把核糖核苷酸切掉且不会额外切割脱氧核糖核苷酸。进一步加入T4 DNA连接酶可以实现DNA的体外连接。其中YgdG是大肠杆菌中的未知功能蛋白，属于FEN1家族，本实施例首次验证了YgdG可以特异性切割核糖核苷酸。用于体外连接的引物与之前的引物略有不同。两者都可以进行RNase HII Fusion(图13A)。如图13B所示，当RNase HII、YgdG和T4 DNA连接酶三种酶同时存在时，可以把1Kb和1.5Kb的片段连接成2.5Kb的片段，缺少任意一种酶都无法实现体外连接。
YgdG和T4 DNA连接酶介导的体外连接所用引物如下表32所示：
表32
引物名称 序列信息(5′-3′) SEQ ID NO
pUC19-1.5K-F cgtgacaccacgatgcctgtag 80
pUC19-backbone-rX-8bp-T4-R atggtcat(rA)gctgtttcctgtgtga 81
LacZ-rX-8bp-T4-F atgaccat(rG)attacgccaagcttgc 82
LacZ-1K-R gatgcttttctgtgactggtgagtact 83
YgdG和T4 DNA连接酶介导的体外连接反应体系如下表33所示：
表33
YgdG和T4 DNA连接酶介导的体外连接反应条件如下表34所示：
表34
实施例13YgdG的制备
YgdG基因克隆自TOP10，构建克隆方法同pCri-8b-RNase HII，蛋白制备也同实施例1。蛋白纯化结果如图14所示，本实施例成功地制备了YgdG，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色可以看出，成功制备了YgdG，蛋白大小为30.6kDa。
其中pCri-8b-YgdG(如SEQ ID NO.86所示，其中，YgdG的氨基酸序列如SEQ IDNO.113所示)构建克隆所用引物如下表35所示：
表35
引物名称 序列信息(5′-3′) SEQ ID NO
YgdG-F acttccagggccatatggctgttcatttgcttattgtc 84
YgdG-R ggtggtggtgctcgagttaccgtaccaaccgcaattg 85
其中纯化蛋白所用buffer如下表36所示：
表36
Buffer名称 Buffer组分
AC binding buffer 20mM Tris-HCl，500mM NaCl，10％glycerol，pH 8.0
AC wash buffer 20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM imidazole，10％glycerol，pH 8.0
AC elution buffer 20mM Tris-HCl，500mM NaCl，500mM imidazole，10％glycerol，pH 8.0
GF buffer 20mM Tris-HCl，500mM NaCl，10％glycerol，pH 8.0
Storage buffer 20mM Tris-HCl，500mM NaCl，10％glycerol，pH 8.0
实施例14 YgdG的体外切割
本实施例首次验证了YgdG可以特异性切割核糖核苷酸。YgdG是大肠杆菌中的未知功能蛋白，属于FEN1家族(21，30)。本实施例利用CP-Light 1000全自动微生物质谱检测系统(厦门金诺花)验证了YgdG的体外切割活性。DNA引物或者RNA碱基修饰引物退火后，用500ng YgdG 37℃处理30min，然后用Clean Resin(Agena)进行脱盐，用核酸质谱上机检测。如图15A所示：RNA修饰的引物经过YgdG处理后，可以被切割掉1nt的核糖核苷酸；当引物为DNA引物时，不会被切割。YgdG可以特异性地切割核糖核苷酸且不会切割脱氧核糖核苷酸，不论核糖核苷酸带AUGC任意碱基都可以进行切割。如图15B所示，YgdG可以切割5’端的核糖核苷酸，而不能切割3’端的核糖核苷酸。如图15C所示，5’端的核糖核苷酸有没有磷酸基团都可以被YgdG切割，但是有磷酸基团的核糖核苷酸底物更容易被切割。
YgdG的体外切割所用引物如下表37所示：
表37
引物名称 序列信息(5′-3′) SEQ ID NO
FEN1-1C (rC)cttgcagcacatccccctttcgcc 87
FEN1-2G (rG)cttgcagcacatccccctttcgcc 88
FEN1-3U (rU)cttgcagcacatccccctttcgcc 89
FEN1-4A (rA)cttgcagcacatccccctttcgcc 90
FEN1-1C-DNA ccttgcagcacatccccctttcgcc 91
FEN1-2G-DNA gcttgcagcacatccccctttcgcc 92
FEN1-3U-DNA tcttgcagcacatccccctttcgcc 93
FEN1-4A-DNA acttgcagcacatccccctttcgcc 94
FEN1-1C-DNA-40NT ggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggta 95
FEN1-2G-DNA-40NT ggcgaaagggggatgtgctgcaagccgattaagttgggta 96
FEN1-3U-DNA-40NT ggcgaaagggggatgtgctgcaagacgattaagttgggta 97
FEN1-4A-DNA-40NT ggcgaaagggggatgtgctgcaagtcgattaagttgggta 98
FEN1-1C-3’ ccttgcagcacatccccctttcgc(rC) 99
FEN1-1C-5'P /5Phos/(rC)cttgcagcacatccccctttcgcc 100
引物退火反应体系如下表38所示：
表38
组分 用量(μL)
DDW 40
TE(天根) 5
退火引物1 2.5
退火引物2 2.5
总量 50
引物退火反应条件如下表39所示：
表39
阶段 条件 循环
预变性 95℃3min 1
循环降温程序 第一个循环95℃10s，之后每个循环降温1℃ 70
YgdG的体外切割反应体系如下表40所示：
表40
组分 用量(μL)
10×RNase HII buffer 2
YgdG(1ug/μL) 0.5
退火引物 17.5
总量 20
YgdG的体外切割反应条件如下表41所示：
表41
阶段 条件
酶切 37℃30min
实施例15体外质粒组装
本发明成功地在实施例12中实现了RNase HII Fusion产物体外连接。进一步的，本实施例则成功地实现了体外质粒组装。。四个片段组装示意图如图17所示，在引物中插入核糖核苷酸，通过PCR获得载体和目的片段，RNase HII在核糖核苷酸与其5′端的脱氧核糖核苷酸间酶切产生5′磷酸和3′羟基末端，使载体和目的片段形成互补的突出末端，YgdG进一步切割核糖核苷酸，加入T4 DNA连接酶，实现了DNA体外组装。
如图16A所示：当RNase HII、YgdG和T4 DNA连接酶三种酶同时存在时，可以把SARS-CoV-2S蛋白分成的1kb(S1)、1.5kb(S2)和1.4kb(S3)的三个片段与载体pcDNA6B(5.6kb)组装成9kb的质粒如图16B所示，体外连接产物转化至TOP10感受态中可以得到较多的克隆，且与常用的Gibson组装能达到一致的效果。但在Gibson组装的菌液PCR中检测到了未能成功组装的克隆，经测序发现，缺失了某一片段(图16C)。
体外质粒组装所用引物如下所表42示：
表42
引物名称 序列信息(5′-3′) SEQ ID NO
S-1-F cgaacaatgtt(rU)gtttttcttgttttattgcc 101
S-1-R aaacattgttc(rG)tttagttgttaacaagaac 102
S-330-F agatttcctaa(rU)attacaaacttgtgccct 103
S-330-R attaggaaatc(rU)aacaatagattctgttggt 104
S-816-F aagaggtcat(rU)tattgaagatctacttttcaac 105
S-816-R aatgacctct(rU)gcttggttttgatgg 106
S-1273-F tacacatctag(rA)gattacaaggatgacgac 107
S-1273-R tctagatgtgt(rA)atgtaatttgactcctttg 108
实施例16利用分子信标验证RNase HII的切割活性
本实施例利用分子信标验证RNase HII的切割活性，证明了RNase HII可以切割任意核糖核苷酸。本实施例设计了4种含有RNA碱基的不同分子信标来测试RNase HII的切割活性(如图18A所示)。在37℃的反应条件下，不含RNasHII的分子信标不会产生荧光信号。含有RNasHII的分子信标，被切割之后释放FAM，产生荧光信号。信标序列中不管插入是A、U、G和C，RNasHII都可以进行切割(图18B)。实验用到的几个分子信标的熔解温度都在70℃以上(图18C、18D)。RNasHII对不同核糖核苷酸都可以识别切割，RNase HII fusion不会有序列的依赖性。
利用分子信标验证RNase HII的切割活性所用引物如下表43所示：
表43
引物名称 序列信息(5′-3′) SEQ ID NO
probe-U 5FAM-caga(rU)ctcaaaagagatctg-3BHQ1 109
probe-A 5FAM-caga(rA)ctcaaaagagttctg-3BHQ1 110
probe-G 5FAM-caga(rG)ctcaaaagagctctg-3BHQ1 111
probe-C 5FAM-caga(rC)ctcaaaagaggtctg-3BHQ1 112
利用分子信标验证RNase HII的切割活性反应体系和反应程序分别如下表44和表45所示：
表44
表45
阶段 条件 循环
循环降温程序 37℃15s，采集荧光 99
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种DNA片段组装方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)设计至少一插入片段扩增引物对，通过PCR扩增在至少一插入片段的两端分别引入至少一核糖核苷酸，且当插入片段的数目多于一时，相邻插入片段间具有同源臂，该核糖核苷酸包括rA、rC、rU和rG；
(2)获得能够与步骤(1)所得的至少一插入片段的PCR扩增产物相连的载体片段的PCR扩增产物或酶切产物，该酶切产物具有3’端突出的粘性末端；
(3)将步骤(1)获得的至少一插入片段的PCR扩增产物和步骤(2)所得的载体片段的PCR扩增产物用RNase H进行处理；或将步骤(1)获得的至少一插入片段的PCR扩增产物用RNaseH进行处理，与步骤(2)所得的载体片段的酶切产物混合；
(4)将步骤(3)所得的产物转化进入感受态细胞进行细胞内修复。
2.如权利要求1所述的一种DNA片段组装方法，其特征在于：所述步骤(2)为：设计载体扩增引物对，通过PCR扩增在载体片段的两端分别引入至少一核糖核苷酸，使得由至少一插入片段构成的总插入片段与载体片段间具有同源臂，在进行所述步骤(4)之前，该步骤(2)的反应产物用RNase H进行处理。
3.如权利要求1所述的一种DNA片段组装方法，其特征在于：所述同源臂的长度为6-14bp。
4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的一种DNA片段组装方法，其特征在于：获得所述步骤(2)中的酶切产物所用的酶为核酸外切酶T5或核酸酶PfAgo；所述RNase H为RNaseHI、RNase HII或RNase HIII。
5.如权利要求4所述的一种DNA片段组装方法，其特征在于：所述RNase H II的氨基酸序列如SEQ ID NO.73至SEQ ID NO.77所示之一，所述RNase HI的氨基酸序列如SEQ IDNO.78所示，所述RNase HIII的氨基酸序列如SEQ ID NO.79所示。
6.一种DNA片段组装方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)设计至少一插入片段扩增引物对，通过PCR扩增在至少一插入片段的两端分别引入至少一核糖核苷酸，且当插入片段的数目多于一时，相邻插入片段间具有同源臂，该核糖核苷酸包括rA、rC、rU和rG；
(2)获得能够与步骤(1)所得的至少一插入片段的PCR扩增产物相连的载体片段的PCR扩增产物或酶切产物，该酶切产物具有3’端突出的粘性末端；
(3)将步骤(1)获得的至少一插入片段的PCR扩增产物和步骤(2)所得的载体片段的PCR扩增产物用RNase H进行处理；或将步骤(1)获得的至少一插入片段的PCR扩增产物用RNaseH进行处理，与步骤(2)所得的载体片段的酶切产物混合；
(4)将步骤(3)所得的产物、5’-3’核糖核苷酸外切酶和DNA连接酶混合反应，即成。
7.如权利要求6所述的一种DNA片段组装方法，其特征在于：所述步骤(2)为：设计载体扩增引物对，通过PCR扩增在载体片段的两端分别引入至少一核糖核苷酸，使得由至少一插入片段构成的总插入片段与载体片段间具有同源臂，在进行所述步骤(4)之前，该步骤(2)的反应产物用RNase H进行处理。
8.如权利要求6所述的一种DNA片段组装方法，其特征在于：所述同源臂的长度为6-14bp。
9.如权利要求6至8中任一权利要求所述的一种DNA片段组装方法，其特征在于：获得所述步骤(2)中的酶切产物所用的酶为核酸外切酶T5或核酸酶PfAgo，所述RNase H为RNaseHI、RNase HII或RNase HIII，所述5’-3’核糖核苷酸外切酶为YgdG，所述DNA连接酶为T4DNA连接酶。
10.如权利要求9所述的一种DNA片段组装方法，其特征在于：所述RNase H II的氨基酸序列如SEQ ID NO.73至SEQ ID NO.77所示之一，所述RNase HI的氨基酸序列如SEQ IDNO.78所示，所述RNase HIII的氨基酸序列如SEQ ID NO.79所示，所述YgdG的氨基酸序列如SEQ ID NO.113所示。
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