CN117683134A

CN117683134A - 一种抗sla i纳米抗体及应用

Info

Publication number: CN117683134A
Application number: CN202311708583.9A
Authority: CN
Inventors: 张念之; 杜刘宝; 王素秋; 汤子澈
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2023-12-13
Filing date: 2023-12-13
Publication date: 2024-03-12

Abstract

本发明属于生物医学或抗原表位鉴定技术领域，具体涉及一种抗SLAI纳米抗体及应用。所述SLAI结合分子包括抗SLAI纳米抗体或其抗原结合片段，所述抗SLAI纳米抗体的互补结合区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO：1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO：2所示的序列、CDR3包括SEQ ID NO：3所示的序列。本发明提供的抗SLA I类分子纳米抗体相较于传统的抗SLA一类分子抗体而言，分子量更小，穿透性更强，结构简单并且稳定性也好，易于重组和表达。本发明提供的纳米抗体高特异性针对猪的SLAI蛋白且该纳米抗体亲和力强且生产简便。

Description

一种抗SLA I纳米抗体及应用

技术领域

本发明属于生物医学或抗原表位鉴定技术领域，具体涉及一种抗SLA I纳米抗体及应用。

背景技术

猪主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex，简称MHC)，又称为SLA(Swine LymphocyteAntigen)，即猪白细胞抗原。SLA复合体位于第七号染色体上，由三个基因簇组成，分别为SLA I、III、II类。SLA I类和II类区域分别编码SLA I类分子和II类分子，而III类区域编码对免疫防御和炎症重要的基因。为防止误解为直接的HLA同源物而将SLA I类分子指定为SLA-1、SLA-2、SLA-3。

其中，SLA I类分子分布最为广泛，存在于所有有核细胞表面，SLA I分子由重链α和轻链sβ2m组成，其中重链的α1与α2亚区形成多肽结合区，与抗原多肽、T细胞受体相互结合形成三分子复合物，从而诱导机体产生细胞免疫应答。轻链sβ₂m与重链以非共价键结合，以稳定SLA-I天然构型及其表达。SLA I类分子与猪抗病性能相关，主要识别细胞毒性T细胞表位。有研究将人MHC I类分子、病毒CTL表位和轻链sβ₂m进行体外复性、结晶，解析晶体结构，可以从空间结构解析MHC I类分子与病毒CTL表位结合的规律。因此，SLA I类分子在猪病毒的T细胞抗原表位鉴定上的应用越来越受到人们的重视。

目前针对SLA I类分子上的结合肽洗脱，可以通过免疫层析方式捕获SLA分子后进行洗肽，而免疫层析需要有针对SLA I类分子的抗体。目前针对SLA I类分子的抗体多为鼠源或兔源，生产成本高。纳米抗体是在驼类动物上产生的，只有重链没有轻链的，一种10-14kd大小的小分子，用于小分子检测和疾病的治疗。与常规的四肽链抗体不同，其缺少传统抗体中的轻链和重链恒定区CH1区域，只有重链，也叫做重链抗体(heavy chain antibody，HCAb)或单域抗体(Single domain antibody，sdAb)。其N末端的抗原结合区仅有重链可变区(heavy chain variable region，VHH)组成，VHH晶体结构显示其为宽2.5nm、长4nm的椭球形的抗体，由于结构微小，也叫做纳米抗体(Nanobody，Nb)。在结构上，传统免疫球蛋白(Ig)由两个独立的区域组成，分别是片段抗原结合区(Fab)和抗体恒定区(Fc)。Fc区在抗原结合时启动生物学过程，fab区负责抗原识别，整个Ig分子的结合特异性全部源于Fab区结构域，特别是顶部可变重链(VH)和可变轻链(VL)上的两个可变区。其中重链可变区包含4个骨架区(FRs：免疫球蛋白结构域的中心框架结构)和三个抗原结合区(CDRs：参与抗原抗体反应)。VHH与人类VH的同源性高达80％，但是其中FR2和CDR3区表现显著的序列差异。FR2区的42、49、50和52氨基酸位点由亲水性更高的氨基酸替代，使VHH表现更好的亲水能力。与传统抗体的轻链加重链6个CDR区类似，仅有3个CDR区的VHH通常在抗原-抗体相互作用中发挥作用，其中，较长的CDR3区能够形成伸展出去的多肽环结构，可以识别蛋白质表面更多的空间表位。纳米抗体具有独特的性质例如分子量小，水溶性好，稳定性强，抗原识别能力强，易于生产等。目前尚未见如本申请所记载的抗SLA I类分子的纳米抗体相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗SLA I纳米抗体及应用，该抗SLA I纳米抗体分子量更小，穿透性更强，结构简单并且稳定性也好，易于重组和表达，可通过细菌或酵母大量发酵生产，产量高且成本低，能够应用到与SLA I相关的疾病诊断与预防、基础医学研究、生物学研究等多个领域。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种SLA I结合分子，所述SLA I结合分子包括抗SLA I纳米抗体或其抗原结合片段，所述抗SLA I纳米抗体的互补结合区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO：1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO：2所示的序列、CDR3包括SEQ ID NO：3所示的序列。

进一步的，所述SLA I结合分子还具有以下一项或多项的特征：

(1)所述SLA I结合分子为包含一条、两条或多条抗SLA I纳米抗体或其抗原结合片段的单价或多价纳米抗体或单域抗体、或多特异性纳米抗体或单域抗体；

(2)所述纳米抗体为骆驼重链抗体；

(3)所述纳米抗体包括重链恒定区；

(4)所述SLA I结合分子为嵌合抗体。

本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子选自以下任一项的序列：

(1)权利要求1所述SLA I结合分子的编码序列；

(2)权利要求1所述SLA I结合分子的编码序列的互补序列。

本发明还提供一种核酸构建物，包括权利要求3所述的核酸分子。

进一步的，所述核酸构建物为克隆载体、表达载体或整合载体。

本发明还提供一种所述的SLA I结合分子或所述的核酸分子或所述的核酸构建物在与SLA I相关的疾病诊断与预防中的应用。

本发明还提供一种所述的SLA I结合分子或所述的核酸分子或所述的核酸构建物在基础医学研究领域和生物学研究领域中的应用。

本发明还提供一种所述的SLA I结合分子或所述的核酸分子或所述的核酸构建物在针对SLA I类的靶向疫苗设计中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的抗SLA I类分子纳米抗体相较于传统的抗SLA一类分子抗体而言，分子量更小，穿透性更强，结构简单并且稳定性也好，易于重组和表达，可通过细菌或酵母大量发酵生产，产量高且成本低，将其用于SLA一类分子的捕获或荧光显影中更具有优势。在细胞上捕获的SLA I类分子上进一步进行洗肽从而进行T细胞表位鉴定；本发明提供的纳米抗体高特异性针对猪的SLA I蛋白且该纳米抗体亲和力强且生产简便。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为大肠杆菌表达的SLA-1：0401，SLA-2：1001抗原蛋白的蛋白纯化与SDS电泳图，其中A为SLA-1：0401抗原蛋白的蛋白纯化与SDS电泳图，B为SLA-2：1001抗原蛋白的蛋白纯化与SDS电泳图；

图2为原核表达Twin StrepⅡ标签纳米抗体图，其中，1：Twin StrepⅡ-VHH-1，2：Twin StrepⅡ-VHH-58，3：Twin StrepⅡ-VHH-63；

图3为大肠杆菌表达抗SLA I分子纳米抗体与SLA I分子的表面等离子共振试验，其中，经测量后亲和力数值A为KD＝2.34e^-8M，B为KD＝1.03e^-6M，C为KD＝8.85e^-9M。

图4为人源化Fc-VHH的流式细胞荧光结合分析图；

图5为原核表达pull down结果图，其中，右图中1：洗脱峰，2：纳米抗体，3：SLA-1*0401，4：抗体上柱流穿峰5：洗脱流穿峰。

图6为抗原肽质谱鉴定结果，使用纳米抗体沉淀SLA I类分子后，弱酸洗脱抗原肽进行质谱分析。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量筛选，发现一类抗SLA I类分子纳米抗体及其抗原结合片段，其能特异性识别SLA I类分子，以高亲和力与SLA I类分子，具有良好的功能活性。

具体地，本发明利用SLA I类分子免疫羊驼，获得了高质量的单域抗体基因文库，然后利用噬菌体展示技术筛选抗体基因库，从而获得了SLA I类分子特异性的单域抗体基因。再将此基因转至哺乳动物细胞中，从而获得了能在哺乳动物中高表达且特异性高的抗体株。所述抗体或其抗原结合片段具有良好的安全性和靶向性，能特异性的结合猪的SLA I类分子。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供含有Flag，strepⅡ标签纳米抗体，将表达的带标签纳米抗体固定在标签蛋白纯化树脂上，可以用于对表达SLA I类分子的细胞进行免疫沉淀实验。对实验中免疫沉淀的蛋白进行弱酸洗脱鉴定。

本文中，术语“抗体"包括单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白FC区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，双抗体和单链分子，以及抗体片段，尤其是抗原结合片段，例如，Fab，F(ab')和Fv。本文中，“抗体"与“免疫球蛋白"可互换使用。

传统的“抗体"含有基本的4链抗体单元，是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。每条重链在N末端具有可变结构域(VH)，接着是三个(对于每种a和丫链，CH1、CH2和CH3)和四个(对于和8同种型，CH1、CH2、CH3和CH4)恒定结构域(CH)以及位于CH1结构域与CH2结构域之间的绞链区(Hinge)。

如本文所用，术语“单域抗体"、“抗SLA I单域抗体"、“重链抗体的重链可变区结构域"、“VHH"可互换使用，均指特异性识别和结合于SLA I的单域抗体。单域抗体是重链抗体的可变区。通常，单域抗体含有三个CDR和四个FR。优选地，本发明的单域抗体具有SEQ IDN0：1所示的CDR1、SEQ ID NO：2所示的CDR2、和SEQ ID NO：3所示的CDR3。单域抗体是最小的功能性抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。

本文中，“纳米抗体”是指含有本文所述VHH的抗体。其可以是如上所述的重链抗体，还可以是含有多条VHH的多价或多特异性抗体，也可以是将VHH和抗体FC(例如CH2和CH3或CH2、CH3和CH4)重组获得的重组抗体。包含两条或多条单域抗体的结合分子是多价单域抗体；包含两条或多条不同特异性单域抗体的结合分子是多特异性单域抗体。多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子通常由选自G和S的1一15个氨基酸组成。

本文中，重链抗体和抗体(传统四链抗体)旨在区分抗体的不同组合方式。由于二者的结构具有相似性，下述针对抗体的结构描述除涉及轻链外也均适用于重链抗体。

抗体的“可变区"或“可变结构域"是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH"和“VL"。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。

术语“可变的"指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。可变结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的全部氨基酸。相反，其集中在三个称为高变区(HYR)的区段(在轻链和重链可变结构域中均有)，即分别为重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3(重链抗体中可简称为CDR1、CDR2、CDR3)以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。可变结构域中更为高度保守的部分称为骨架区CFR)。

"FC区"(可结晶片段区域)或“FC结构域"或“FC"是指抗体重链的c一末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的FC受体的结合，或者与经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。在lgG，1gA和lgD抗体同种型中，FC区由来自抗体两条重链的CH2结构域和CH3结构域的两个相同的蛋白片段构成；1gM和lgE的FC区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2一4)虽然免疫球蛋白重链的FC区的边界可以变化，但是人lgG重链FC区通常定义为从重链位置C226或P230的氨基酸残基到羧基端的序列段，其中该编号是根据EU索引，如在Kabat中一样。如本文所使用的，FC区可以是天然序列FC或变体FC。

“抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ah')、F(ah')2、Ed、和Fv片段、二硫键连接的Fv；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；scFv-Fc片段；由抗体片段形成的多特异性抗体；以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。抗原结合片段可以通过多种技术制备，包括但不限于将完整的抗体蛋白水解消化，以及由包含抗原结合片段的宿主细胞表达产生。

“Fv"是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HYR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整结合位点。“单链Fv"也可缩写为“sFv"或"scFv"，是包含抗体VH和VL结构域的连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成期望的抗原结合结构。对于重链抗体或纳米抗体而言，scFv即为VHH。

本文中，术语“单克隆抗体"指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆"表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法、噬菌体展示法、重组DNA法、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术、单细胞测序法。

单克隆抗体在本文中也包括“嵌合"抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

非人(例如鼠)抗体的“人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。因此，“人源化抗体"通常指可变结构域构架区与在人抗体中发现的序列交换的非人抗体。通常在人源化抗体中，整个抗体(除CDR以外)由人来源的多核苷酸编码或与这种抗体相同(除CDR以外)。CDR(其中一些或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植到人抗体可变区的卩一折叠骨架中以产生抗体，其特异性由被移植的CDR来决定。这类抗体的产生方法本领域周知，例如使用具有基因工程免疫系统的小鼠而产生。本发明中，抗体、单域抗体、重链抗体等均包括各所述抗体的经人源化的变体。

在一些实施方案中，本发明还提供与本发明的任何抗SLA I纳米抗体的抗原接合区结合人SLAI上相同表位的纳米抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段(例如单域抗体VHH)，即能够与本发明的任何纳米抗体的抗原结合区交叉竞争与SLA I的结合的纳米抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段。

本发明中，抗SLA I纳米抗体具有SEQ ID N0：1所示的CDR1、SEQ ID NO：2所示的CDR2、SEQ ID NO：3所示的CDR3。

当单域抗体与重链恒定区连接时，纳米抗体是包含本文所述单域抗体的重链抗体。重链恒定区可以是骆驼重链抗体的恒定区，包含CH2和CH3。优选地，所述抗体恒定区源自：lgG1、lgG2、lgG3、lgG4、lgA、lgM、lgE和lgD中的任意一者的恒定区，更优选源自lgG1、lgG2、lgG3、lgG4中的任意一者的恒定区。在一个或多个实施方案中，所述重链恒足区是人IgG FC的CH28日CH3，例如IgGl的CH2和CH30。

本文所述SLA I结合分子可以是包含一条、两条或多条本文所述的抗SLA I纳米抗体或单域抗体的单价或多价纳米抗体或单域抗体、或多特异性纳米抗体或单域抗体。多特异性可以是针对SLA I和另一种抗原，也可以是针对SLA I的两种不同表位。

本发明还包括所述抗体衍生物和类似物。“衍生物"和“类似物"是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的衍生物或类似物可以是(i)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(i)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的抗体序列改变一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。这些变体包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1一50个，较佳地1一30个，更佳地1一20个，最佳地1一10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质的功能。如在FR和/或FC区中将具有类似性质的氨基酸进行取代。可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所周知。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。又比如，在c末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。

本文所述抗体的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。在一些实施方案中，本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明还包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98‰以上)的同源性。

可采用本领域常规的方法制备本发明的抗体，如杂交瘤技术。可采用本领域常规的方法制备本发明的纳米抗体，如本领域熟知的噬菌体展示技术。或者，本发明的抗体或纳米抗体可在其他细胞系中表达。可用编码本发明抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞，然后培养宿主细胞并纯化抗体。转化可采用任何已知的方法进行，例如包括将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。

形成本发明的嵌合抗原受体的上述各部分，如(l)8信号肽、抗SLA I纳米抗体、(l)8a铰链区、(l)8a跨膜区、(l)3胞内信号域、4一IBB共刺激域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3、25个氨基酸残基，例如3、15、5、15、10、20个氨基酸残基。

应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N一末端、C一末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的VHH的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，Strep_Tag等。这些标签可用于对蛋白进行纯化与定位。

本发明的VHH中的抗原识别区可以是前述的抗SLA I纳米抗体或其功能性片段序列的变体。此外，VHH的其他部分也可以发生序列变化，得到的突变体与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该VHH的生物学活性。可采用例如NCBI的BLAST计算两条比对的序列之间的序列相同性。

突变体还包括：在任一实施方案所述的VHH的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该VHH的生物学活性的氨基酸序列。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸"包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有卩一分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

本发明还提供了编码上述抗体或CAR的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括CDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。CAR的序列也可以如上获得。或者，可以如上得到CAR的各部分(信号肽、抗原识别区、铰链区、跨膜区或胞内区)的序列后再连接得到CAR的全长。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。CAR各部分可以顺序克隆到载体中或者可以整合为全长CAR后再克隆。

本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸序列可以多种方式被操作以保证所述抗体或CAR的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域己知的。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。

本领域的技术人员应该知道，本发明中的编码基因(DNA分子)还可以以“表达盒或“重组载体"的形式存在。“表达盒"是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。

标记的纳米抗体

本发明的一个优选例中，所述纳米抗体带有可检测标记物。更佳的，所述的标记物选自下组：同位素，胶体金标记物，有色标记物或荧光标记物。

如上所述，本发明的纳米抗体有广泛的生物应用价值和临床应用价值，其应涉及到与SLA I相关的疾病诊断与预防、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对SLA I类的靶向疫苗设计。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本技术方案构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

为了让本领域普通技术人员更方便地理解本发明相对于现有技术的改进之处，本发明的一些附图和描述己经被简化，并且为了清楚起见，本申请文件还省略了一些其它元素，本领域普通技术人员应该意识到这些省略的元素也可构成本发明的内容。

实施例1重组SLA I蛋白表达载体构建与原核表达

(1)基因序列合成及蛋白的表达载体构建

从PDB库中下载猪的SLA I蛋白重链与轻链序列(https：//www.rcsb.org/)，经密码子在线优化工具(http//www.jcat.de/#opennewwindow)优化后，交由生工合成SLA I胞外段基因序列。通过分子克隆，拼接产物用TaKaRa无缝克隆试剂盒克隆到PET28a中，获得表达载体。

(2)重组SLA I蛋白的表达与纯化

将表达载体转化入BL21表达菌株中，IPTG诱导培养，搜集菌体，破碎提取包涵体。破碎后的包涵体经SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色，重链显示其大小约为34KD左右，轻链显示大小为12KD左右。

将包涵体重链：轻链：肽按体积3：1：10比例，加入复性液中进行体外复性。浓缩后通过分子筛凝胶柱层析法收集蛋白样品，将对应UV值的出锋位置进行SDS-PAGE鉴定。结果如图1所示，可见SLA I类分子中，SLA-1基因座0401与SLA-2基因座1001均可在90ml左右有明显紫外吸收峰，证明可以通过包涵体复性方式纯化出有结构功能的蛋白。

实施例2抗SLA I纳米抗体的制备

(1)纳米抗体噬菌体展示文库构建

采用一步法构建纳米抗体噬菌体暂时文库，将羊驼纳米抗体VHH基因连接到噬菌体展示载体中。

(2)羊驼免疫

羊驼选择：选择健康强壮、精神状态良好、体型适中的羊驼，挑选的羊驼毛色光亮无受伤不适症状。挑选好动物，先预养1周左右以淘汰有些不合格的动物，使后期的实验能顺利进行。

免疫方案：挑选好羊驼并确保动物适合，记录耳号后开始免疫实验。一共进行4次免疫。免疫方案如下：免疫前取血10mL，作为阴性血清对照，将抗原0.5mg与CFA 1m1混匀后皮下注射；将抗原0.25mg与CFA 1m1混匀后皮下注射；取血10ml；将抗原0.25mg与CFA 1m1混匀后皮下注射；采50mL外周血分离淋巴细胞；将抗原0.25mg与CFA 1m1混匀后皮下注射；采50mL外周血分离淋巴细胞。

(3)血清检测

A.将抗原用0.05M碳酸盐buffer(pH 9.6)稀释至2μg/mL，按100μL/well，4℃包被过夜；

B.弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL 5％脱脂牛奶，37℃封闭1h；

C.PBST洗涤3次，加入100此/孔的血清稀释液(从1：2000开始倍比稀释)，37℃，孵育45min；

D.PBST洗涤5次，分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗Alpaca二抗(用PBS按1：1W稀释)，100μL/孔，37℃孵育45min；

E.PBST洗板5次。加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃，5min，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度。

(4)cDNA合成

提取PBMC总RNA：用Trizol保存的外周血淋巴细胞冰上溶解后转移至1.5mL的离心管，加入1/5体积的氯仿震荡混匀，室温静置5分钟后4℃，12000g离心15分钟：将离心后的上清液转移到新的离心管，往新离心管中加入等体积的异丙醇，室温静置10分钟后4℃12000g离心10分钟，用75％乙醇清洗沉淀，4℃7500g离心5分钟后弃去上清，沉淀室温晾干后溶解于适量的无RNA酶的水中。从A260/280来分析RNA提取纯度，准备RNA转录。

cDNN合成：使用SuperScript IV First-Strand Synthesis System试剂盒反转录得CDNA并-80℃保存。

(5)VHH基因扩增

噬菌粒载体pcomb3xTT及VHH基因用Sfi l DNA内切酶进行单酶切，50℃酶切16h，酶切后的pcomb3xTT载体经1％琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒(Promega)回收4000bp载体片段。酶切后的VI-IH基因直接用胶回收试剂盒进行过柱回收(400bp)。将VHH基因用T4DNA连接酶试剂盒(Invitrogen)连接到噬菌粒载体中，16℃连接过夜，取少量连接产物琼脂糖凝胶电泳检测连接效率连接产物用MECK MILLIPOREF微孔滤膜进行脱盐。

将上述连接产物加入自制的TGI电转化感受态中，然后使用电转仪进行电击转化。取出50μL此菌液用PBS进行梯度稀释10²-10⁵倍。取10μL此各梯度稀释液在Amp/2YT plate上流线，37℃孵育过夜，以此计数并统计噬菌体抗体文库的大小。剩余的电转化后的细菌补2YT至500m1，加入100μL的50mm氨苄青霉素，30℃220rpm培养过夜。最后得到超过9E9的VHH免疫文库。电击转化后的抗体文库经过夜扩增，离心收集文库菌体，加终浓度20％甘油-80℃保存。

取冻存的部分天然抗体噬菌体展示文库菌种接种到2YT培养集中，接种密度为0.10D，将菌液置于37℃、220rpm条件进行培养，大约1.5小时后，菌液密度达到0.60D，此时加入20倍于菌体数的M13K07噬菌体静置30分钟侵染，然后30℃、220rpm培养过夜第二天，10000g离心菌液，收集培养上清，向培养上清中加入1/4体积的PEG/NaCl溶液(20％PEG8000，2.5M NaCl)，混匀后冰浴1小时。冰浴结束后，8000g离心10分钟收集沉淀，10％Glycerol PBST溶解沉淀即得到VHH噬菌体展示文库。测OD₂₆₈，并将其分装至1.5mL离心管中，-80℃保存。

(5)淘选抗SLA I VHH抗体

用生物素化试剂盒(易锦生物)按试剂盒说明书，将重组SLA I蛋白的avi-tag进行生物素修饰，得到生物素化的SLA I蛋白取10ug上述生物素修饰的重组蛋白加入到经PBS洗涤3次的100此链霉亲和素磁珠(DynaBeads 280)中，置于旋转摇床上，速度20转每分钟，室温偶联1小时后PBS洗涤3次。

进行阴性淘选，阳性淘选，再重复阳性淘选。

将上述封闭后的偶联有SLA I蛋白的磁珠加入到阴性淘选后的噬菌体上清中进行阳性淘选，20转每分钟，室温旋转封闭1小时。孵育结束后用1mLPBST(O.I％Tween-20inPBS)洗涤磁珠，重复洗涤10次。洗涤结束后加入1mL 100甘氨酸(pH2.0)，置于旋转摇床上速度设定20转每分钟，旋转洗脱10分钟。洗脱结束后将EP管置于磁力架上，待磁珠都贴壁后将洗脱液转移至新的EP管中。向洗脱液中加入0.2mL 1M Tris-HCI溶液(PH 8.0)进行中和。将中和后的洗脱液加入到30mLOD₆₀₀约为0.6的TGI菌液中静置侵染30分钟，然后加入20倍于菌体数的M13K07噬菌体，静置侵染30分钟，最后加入100mL 2YT培养基及终浓度为10加g/mL的氨苄霉素和卡那霉素，30℃、220rpm培养过夜。第二天按上述收获噬菌体文库的方法收获噬菌体，此时得到的噬菌体为Input2。按上述淘选方法进行2次重复，即将Input2进行下一轮阴性淘选和阳性淘选得到Input3。不同之处在于Input3进行淘选得到的洗脱液侵染TGI后，不加M13K07，而是取10μL此菌液用PBS进行梯度稀释，取10³、10、10⁵三个稀释梯度各100μL此菌液涂布2YT/Amp平板，30℃培养过夜，剩余的菌液30℃、220rpm培养过夜。

验证阳性克隆

根据测序结果，选取抗体CDR3氨基酸序列差异较大的克隆重新接种并诱导过夜，按上述ELSIA方法再次验证所选克隆能否结合SLA I。最终得到VHH的抗体序列。

其中，抗SLA I纳米抗体的互补结合区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO：1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO：2所示的序列、CDR3包括SEQ ID NO：3所示的序列。

SEQ ID NO：1：

Ser Thr Tyr Cys Met Gly

Ser Ser Gly Cys Met Gly

Ser Tyr Tyr Cys Met Ala

Ser Ser Tyr Cys Met Gly

SEQ ID NO：2：

Gly Val Ala Ala Ile Cys Ala Phe Gly Gly Ser Thr Tyr

Gly Val Ala Thr Leu Tyr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Tyr

Ala Val Ala Ala Ser Ser Ser Ser Gly Ala Asn Thr Tyr

Gly Val Ala Thr Leu Tyr Thr Gly Thr Gly Ser Thr Tyr

SEQ ID NO：3:

Ala Gly Met Asp Arg Ser Asn Ile Gly Thr Trp Ser Ser Ser Ala Tyr TyrAsn

Ala Thr Asp Ala Thr Ser Trp Cys Tyr Asp Arg Leu Arg Ser Gly Asn MetGlu

Ala Arg Asp Leu Thr Phe Ser Cys Gly Thr Gly Asp Thr Trp Ala Thr ProSer Asn Tyr Lys

Ala Ala Asp Ala Thr Ser Trp Cys Tyr Gly Arg Leu Arg Ser Gly Asn MetGlu

实施例3SLA I纳米抗体的制备

(1)将前面测序分析所获的克隆株质粒转化到大肠杆菌中，将其涂布在含有氨苄青霉素的培养平板上，37℃过夜培养。

(2)挑选单个菌落接种到1.5ml含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床8H。

(3)接种100μL到100ml含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm，6H。

(4)将100ml的菌液加入到1L的LB培养基，37℃，200rpm，1.5H，培养至OD值为0.6-0.8时，加入IPTG，37摄氏度，180rpm，6h。

(5)离心，收菌，超声破碎。

(6)离心，提包涵体，盐酸胍溶解。

(7)通过精氨酸复性液体系进行复性，恢复原有的蛋白结构。

(8)经过分子筛层析法制备纳米抗体，纯化结果如图2所示，可见在图二中三株纳米单抗均可通过包涵体形式表达并复性成功。

其中，图2中突变体Fc-VHH-1，Fc-VHH-58，Fc-VHH-63等均为VHH的基础上加了标签，不同的标签可以实现不同的生物学功能，其分别使用了FLAG标签，strep-2标签，HIS标签。

其中，各个突变体的氨基酸序列为：

带FLAG标签VHH-1序列(SEQ ID NO：4)：

HMDVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCAASGYTYSTYCMGWFRQAPGKEREGVAAICAFGGSTYYADSVKGRFTIAQDNAKNTLYLQMNNLKPEDTAVYYCAGMDRSNIGTWSSSAYYNNWGQGTQVTVSSLEDYKDDDDK

带HIS标签VHH-1序列(SEQ ID NO：5)：

HMDVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCAASGYTYSTYCMGWFRQAPGKEREGVAAICAFGGSTYYADSVKGRFTIAQDNAKNTLYLQMNNLKPEDTAVYYCAGMDRSNIGTWSSSAYYNNWGQGTQVTVSSLEHHHHHH

带strep-2标签VHH-1序列(SEQ ID NO：6)：

HMDVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCAASGYTYSTYCMGWFRQAPGKEREGVAAICAFGGSTYYADSVKGRFTIAQDNAKNTLYLQMNNLKPEDTAVYYCAGMDRSNIGTWSSSAYYNNWGQGTQVTVSSLEWSHPQFEK

实施例4抗体亲和力测定

(1)插入一个新的BIAcore CM-5葡聚糖芯片。

(2)用PBS作为工作液以持续流动系统平衡系统。其中PBS应提前加入吐温，用来结合固定的蛋白也应提前加入吐温。

(3)用实验确定最佳缓冲条件和浓度，使非特异性结合到羧酸酯化葡聚糖上的靶蛋白和配体蛋白最小化。对带有高度带负电荷的葡聚糖非特异吸收的配体可能变性，并且在溶液中可非特异性地结合靶蛋白。

(4)插入一张新的芯片。

(5)在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的情况下活化葡聚糖羧酸酯。

(6)在低pH的乙酸钠缓冲液中注入配体蛋白，使得葡聚糖上存在足够的蛋白量。同做几个平行实验，在这些平行实验中变化葡聚糖上配体蛋白的密度。改变接触时间和蛋白质浓度，然后检测目的蛋白从每个配体密度上分离的速率。配体密度应该优化，以获得呈现产生清楚的结合反应的足够的分子表面。充分稀释以测量应该恒定的解离率常数。

(7)乙醇胺处理封闭所有没有反应活化的羧酸酯。

(8)在步骤3中确定的缓冲条件和浓度范围内注入含有已知浓度的假设靶蛋白。改变流速和分析物浓度以最小化扩散或者「大量输运」影响。结合速率常数对于某个特定反应必须是不变的。

(9)用实验方法确定再生条件，比如在什么条件下靶蛋白能够完全从共价结合的配体上解离。

(10)如果有必要的话，插入一张新的芯片。

(11)在最适的缓冲液条件和配体密度下重复步骤2、5、6、7和8中的操作。

(12)使用步骤9确定的再生条件。如要获得数据，则重复步骤8和步骤12，使用三种不同浓度的靶蛋白。

(13)用BIA评估软件point-and-click，计算分离率和结合率常数。用三个靶蛋白浓度所得的结合率和分离率的平均值计算平衡常数。结果见图3，图VHH-1、VHH-58和VHH-63分别为KD＝2.34e^-8M，KD＝1.03e^-6M和KD＝8.85e^-9M。

实施例5流式细胞术检测猪有核细胞上SLA一类分子分布

(1)细胞准备：使用的是PK15细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；胰酶消化处理后，铺24孔板培养皿中。

(2)固定：根据需要选择适当的固定剂，例如4％的多聚甲醛固定细胞。固定后的细胞可置于PBS中4℃保存1周，超过一周则不推荐使用。固定后用PBS洗涤3×5min。

(3)通透：使用多聚甲醛固定细胞后，由于想要检测的SLA分子是位于膜表面，无需进行透膜操作。

(4)封闭：加入牛血清白蛋白封闭液对细胞进行30min封闭。

(5)一抗结合：室温孵育1h或者4℃过夜。PBS漂洗3次，每次冲洗5min。

(6)二抗结合：间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PBS漂洗3次，每次冲洗5min后，再用纯水漂洗一次。

(7)荧光显微镜检查，结果见图4，与空白组相比，纳米抗体均可实现染色，其中Fc-VHH-1染色染色效果最好。

实施例6通过pull down实验进行抗原肽洗脱

(1)将大肠杆菌表达的带有Strep-twin的纳米抗体重组蛋白进行复性(本实验表达蛋白以包涵体形式出现，目前需要稀释复性法恢复空间结构)。

(2)待测样品收集，注射上Streptactin Beads 4FF柱子(特异结合twin STREPⅡ标签)，互作蛋白被吸附在柱子。

(3)清洗，去除未结合的杂蛋白。

(4)加入细胞裂解液或者纯化好的抗原蛋白。

(5)脱硫生物素竞争洗脱，得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物。结果见图5，洗脱液在峰值上SDS-PAGE电泳分析，SDS-PAGE呈现纳米抗体成功与抗原SLA-I分子结合。

(6)收集洗脱液，用新的10kd超滤管浓缩至200μl。3400g离心15min，收集上清。257000g离心1h，收集上清。用3KD超滤管(提前用65度预热的质谱级纯水常温下离心8次洗去PEG污染)6000rpm过夜浓缩，得到滤液。滤液除盐。质谱检测搜猪的全蛋白组库。结果见图6，可见在2号和9号锚定残基位置均有明显肽的偏好性，符合MHC-I类分子的生物学特征。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。此外，所述实例仅属于本发明的一种应用，因此利用本发明中相关的修复模式进行其他DNA片段(不仅限于融合标签的DNA序列)的定点插入，也均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种SLAI结合分子，其特征在于，所述SLAI结合分子包括抗SLAI纳米抗体或其抗原结合片段，所述抗SLA I纳米抗体的互补结合区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO：1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO：2所示的序列、CDR3包括SEQ ID NO：3所示的序列。

2.根据权利要求1所述的SLAI结合分子，其特征在于，所述SLAI结合分子还具有以下一项或多项的特征：

(1)所述SLAI结合分子为包含一条、两条或多条抗SLAI纳米抗体或其抗原结合片段的单价或多价纳米抗体或单域抗体、或多特异性纳米抗体或单域抗体；

(2)所述抗SLAI纳米抗体为骆驼重链抗体；

(3)所述抗SLAI纳米抗体包括重链恒定区；

(4)所述SLAI结合分子为嵌合抗体。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子选自以下任一项的序列：

(1)权利要求1所述SLAI结合分子的编码序列；

(2)权利要求1所述SLAI结合分子的编码序列的互补序列。

4.一种核酸构建物，其特征在于，包括权利要求3所述的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物为克隆载体、表达载体或整合载体。

6.权利要求1-2任一项所述的SLA I结合分子或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4-5任一项所述的核酸构建物在与SLAI相关的疾病诊断与预防中的应用。

7.权利要求1-2任一项所述的SLA I结合分子或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4-5任一项所述的核酸构建物在基础医学研究领域和生物学研究领域中的应用。

8.权利要求1-2任一项所述的SLA I结合分子或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4-5任一项所述的核酸构建物在针对SLAI类的靶向疫苗设计中的应用。