CN117679435A - 一种抑制实体瘤发生发展的siRNA药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制实体瘤发生发展的siRNA药物组合物，该siRNA药物组合物包括能够结合至编码Ang‑2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子、能够结合至编码VEGF的mRNA并抑制其表达的siRNA分子、能够结合至编码COX‑2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子中的至少两种。本发明通过靶向抑制调控肿瘤血管生成、肿瘤发生发展、肿瘤扩散转移等信号通路的多个靶标基因表达来直接杀伤肿瘤细胞、或阻断肿瘤细胞获取营养和氧气的通道而抑制血管增生，从而高效阻断胰腺癌、肺癌等实体瘤的生长。本发明的siRNA药物组合物抑制实体瘤效果显著，可以满足临床未满足的治疗需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抑制实体瘤发生发展的siRNA药物组合物。
背景技术
肿瘤是全球主要死亡原因之一，传统的肿瘤治疗手段包括手术、化学疗法和放射疗法。手术是多数实体瘤的主要治疗方式，但是由于肿瘤组织与正常组织的界限难以分辨，导致通过手术方式无法根除肿瘤病灶。化学疗法和放射疗法都能够抑制肿瘤生长，但是这些疗法的不良反应大，导致最终疗效并不能让人满意。因此，寻找高效低毒的新型肿瘤治疗方案是当前研究的热点。肿瘤生物分子靶向治疗是依赖肿瘤患者个体基因组、蛋白等准确的信息而设计研发的特异性的治疗方法，主要是通过设计降低靶标基因表达的特异性干扰分子，从而阻断起关键作用的一种或多种促癌基因表达及其下游信号通路的功能，以达到抑制肿瘤细胞的生长、浸润和转移等的治疗效果。靶向治疗因其个体特异性强、副作用小，不容易产生耐药性等优势，已经逐步成为临床肿瘤治疗的重要手段，但是目前可用于临床的实体瘤靶向治疗的生物制剂非常少，因此需要迫切地研发更多的能抑制实体瘤分子靶点表达的有效抑制分子。
肿瘤的生长和转移需要生成新的血管，在肿瘤形成的早期，肿瘤细胞主要通过扩散作用获得营养和氧气，但这样仅能长至2～3mm2。为了进一步的生长和迁移，必须有新的血管的生成，新生成的血管把还在生长的肿瘤和循环系统直接连接起来，使其供肿瘤生长的物质得以交换。血管内皮生长因子(vascular，endothelial growth，VEGF)、血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)作为缺氧诱导因子，是血管生成的积极调节因子，促进机体血管的形成。
VEGF作为血管生成的正调控因子在血管生成过程中起到关键作用，VEGF与其受体(VEGFR)结合，释放多种生长因子和细胞因子，诱导内皮细胞的增殖和迁移，并最终促进血管生成。在哺乳动物细胞中，VEGF家族成员主要包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE和胎盘生长因子(PGF)，每个成员通过特异性地与三个血管内皮生长因子受体(VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3)的特定组合相结合来发挥作用。通常VEGF即指VEGFA，VEGFA可促进新生血管形成和使血管通透性增加。VEGFA参与大多数实体瘤的生长，特别是恶性肿瘤，其表达程度间接反映了肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移和血管构建水平，直接反映了肿瘤生长的速度和转移的倾向，其与肿瘤血管丰度、恶性程度及预后成正相关，如在非小细胞肺癌中，低表达VEGF和高表达VEGF mRNA的患者的五年生存率分别为77.9％和16.7％，因此可VEGF及其受体是实体瘤潜在性的治疗靶点[Piperdi B,et al.Targeting angiogenesis in squamousnon-small cell lung cancer.Drugs 2014；74(4):403-413.]。
血管生成素(Ang)主要由Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4组成，其中，血管生成素2(Angiopoietin-2，Ang-2)是一种特异性血管生成刺激因子，也是恶性肿瘤早期的标志分子。Ang-1和Ang-2都可与Tie-2受体结合，Ang-1结合后，Tie-2受体激活并磷酸化，促进血管稳定和生长；Ang-2作为Ang-1的拮抗剂，竞争性结合Tie-2受体，阻断Ang-1的效应，从而促进炎症反应和毛细血管渗漏，形成不稳定的血管。在肿瘤发生的早期，Ang-2参与破坏瘤体周边原有的正常血管，而促进肿瘤新生血管的生成，在瘤体周边形成所谓的血管共择(co-option)区。当肿瘤形成以后，Ang-2与血管内皮生长因子(VEGF)有协同作用，共同促进肿瘤血管生成，并阻碍血管的完整性，使得肿瘤新生血管能在各种因子的刺激下不断增生。研究表明，在VEGF存在的情况下，Ang-2会促进血管内皮细胞增殖和迁移，刺激新生血管的芽生；当抑制VEGF的活性后，Ang-2则促进血管内皮细胞死亡和血管退化，增加毛细血管渗漏[Lobov I B,et al.Angiopoietin-2displays VEGF-dependent modulation ofcapillary structure and endothelial cell survival in vivo.Proc Natl Acad SciUSA.2002；99(10):11205-11210.]。当VEGF和Ang-2结合其受体时，受体二聚化和自身磷酸化激活下游信号级联反应，包括PI3K-Akt通路、p38-MAPK通路及Raf通路，进而控制血管内皮细胞的存活、增殖和迁移，促进肿瘤生长和血管生成，PI3K-Akt通路涉及的肿瘤疾病包括肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃肠道癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、淋巴瘤、恶性胶质瘤和髓母细胞瘤[Zhang S,et al.Deficiency ofγδT cells protects against abdominalaortic aneurysms by regulating phosphoinositide 3-kinase/AKTsignaling.Journal of Vascular Surgery.2018；67:899-908.]。
肿瘤科过表达COX-2及其代谢产物前列学E2(PGE2)，COX-2是环氧化酶(cyclooxygenase,COX)的一个亚型，另一亚型为COX-1，COX-1是结构型环氧化酶，由COX-1作用产生的PG参与机体正常生理过程，维持内环境稳态，对机体产生一定的保护作用，而COX-2是诱导型环氧化酶，在机体受到各种损伤性理化刺激后诱导产生，功能激活巨噬细胞或其他细胞，主要参与炎症反应以及细胞、组织损伤过程。在正常情况下，COX-2在炎症刺激下短暂增加，并在该刺激结束后迅速恢复到基础水平，然而，COX-2作为另一种缺氧型诱导因子，在多种癌症如结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌中过度表达。PGE2是一种可引发炎症和癌症的生物活性脂质，PGE2通过4个不同的G蛋白偶联受体(EP1、EP2、EP3和EP4)激活不同的下游信号通路，而EP2、EP4受体是介导PGE2抗炎和抑制免疫活性的主要分子。Cox-2/PGE2在肿瘤信号传导中发挥重要作用，其可影响肿瘤微环境中的癌细胞和反应性基质，并以多种机制抑制肿瘤免疫。在缺氧条件下的肿瘤细胞中，COX-2过表达可诱导Ang-2上调，使血管基底膜间隙增大[Pichiule P,et al.Hypoxic regulation of angiopoietin-2 expressionin endothelial ells.Journal of Biological Chemistry.2004；279:12171-12180.]，突破周围间质细胞对血管形成的限制，并增加内皮细胞对血管内皮生长因子等血管增殖因素的敏感性，诱导血管内皮细胞分裂、萌芽、迁移，继而使肿瘤血管内皮细胞高度增殖，使肿瘤血管新生，从而促进肿瘤不断生长及肿瘤细胞经血管转移。Cox-2与Ang-2在肿瘤发生发展中正相关且存在交互作用，同时抑制两者，具有明显的协同效应，增强肿瘤治疗效果。塞来昔布和罗非昔布是目前临床常用的两种COX-2特异性抑制剂，然而长期使用这两个药物可能会引起一系列副作用，如胃肠道出血、溃疡和穿孔，塞来昔布还可能增加严重心血管血栓性不良事件、心肌梗死和卒中的风险。鉴于COX-2对Ang-2的诱导作用，以及两者过表达都可以促进肿瘤血管的生成和生长，因此可以研究有效药物对其进行联合治疗以达到治疗实体瘤的目的。
VEGF通路阻滞剂已经成为癌症治疗的重要组成部分[Kerbel R S.TumorAngiogenesis.New England Journal of Medicine.2008；358:2039-2049.]。2004年，VEGF中和抗体贝伐单抗(bevacizumab)成为第一种被批准用于癌症治疗的抗血管生成药物，目前正与化疗联合用于结肠癌、肺癌、脑癌和肾癌的治疗，但是贝伐珠单抗治疗与严重的副作用相关，包括出血、蛋白尿、高血压、胃肠道穿孔和脑卒中等。尽管VEGF通路阻断已显示出对某些癌症的临床活性，但持久治愈很少见，并且总生存期的延长通常以数周或数月来衡量。在临床和临床前环境中，面对VEGF/VEGFR2通路阻断，肿瘤血管生成和肿瘤生长可以持续存在。因此可以看出，仅阻断VEGF途径不足以阻断微观转移性疾病的生长，更需要注意的是，在某些情况下，VEGF通路抑制剂可能会促进更多侵袭性和转移性疾病的发展，从而抵消这些药物在治疗过程早期可能引发的任何有益的抗肿瘤反应[John M L E,etal.Antiangiogenic therapy:impact on invasion,disease progression,andmetastasis.Nature Reviews Clinical Oncology.2011；8:210–221.]。VEGF和Ang-2在肿瘤血管生成中显示互补和协同作用，因此通过联合抑制VEGF和Ang-2来达到抗肿瘤的目的受到了广泛关注。Vanucizumab(RG7221/RO5520985)是罗氏公司研发的一种双特异性抗体，可同时阻断VEGF和Ang-2，在I期临床试验中，作为单一疗法，Vanucizumab具有良好的耐受性，并显示出良好的抗肿瘤疗效、低免疫原性和预期的药效学作用机制，然而在二期临床研究中，在未经治疗的转移性结直肠癌患者中，与贝伐单抗联合FOLOFX-6化疗进行比较，未能表现出显著优势，因其未能满足临床需求，开发就此中断。在此基础上，总结Vanucizumab失败的原因，可探寻更有前景的方法来研发联合抑制VEGF和Ang-2的组合药物。
近年来，随着科研人员对肿瘤生物学的探索和生命科学技术的发展，发现细胞癌变的重要原因之一是细胞信号转导通路的失调，导致细胞无限增殖。这一观点的提出，使得抗肿瘤药物的研发理念发生了转变，即研发焦点正在从传统的细胞毒性药物转向可对肿瘤细胞靶点发挥作用的抗肿瘤药物，特别是靶向药物的研发。靶向药物是针对肿瘤发展过程中起关键作用的大分子而研制的，起关键作用的大分子包括参与肿瘤发展过程中的信号传递和其它生物学途径靶点。通过关键分子的特异性设计相应的靶向药物，达到阻断肿瘤细胞信号传递的作用，以控制肿瘤基因的表达和改变生物学行为，或者通过阻止肿瘤血管的形成，造成肿瘤的特异性死亡而不影响正常细胞组织，从而抑制肿瘤细胞的生长和繁殖，达到抗肿瘤的作用。
但是目前靶向药物无论是小分子药物还是抗体药物，对癌症治疗的表现并不完美，存在耐受性弱、种类有限及治疗后易复发和引起不良反应等问题。与其他化疗药物相比，虽然分子靶向药物的不良反应相对较小，常见的有乏力、恶心、腹泻等，但也存在一些严重难以恢复的不良反应，如：肾损伤，常见的有蛋白尿，索拉菲和贝伐单抗在治疗过程中出现过蛋白尿症状；心血管不良反应，主要包括窦性心律不齐、高血压、心力衰竭和血管衰竭等；肝脏不良反应，在接受治疗过程中，由于肝肾综合征和肝功能衰竭可导致患者死亡；消化系统损害，临床试验表明，有将近30％的患者使用抗肿瘤靶向药物后出现消化系统的损害，主要包括转氨酶升高和便秘等。正是由于现有药物的不足，导致目前临床上各种恶性实体瘤的治疗需求未能得到完全满足，急需开发新型的、高效的、毒副作用小的创新治疗技术。
RNA干扰(RNAi)技术是一种通过小干扰核苷酸(siRNA)来抑制特定基因表达的新型技术，通过设计特异性针对肿瘤发生发展相关信号通路基因转录的mRNA的siRNA分子，引导特定的蛋白/酶复合物与mRNA以100％碱基互补的形式结合，复合物内含酶发挥催化活性将mRNA降解，实现对特定基因表达的抑制(敲低)作用。RNAi技术要求与靶标mRNA完全匹配，特异性强，极少量的siRNA分子就可以在细胞内发挥非常高效的抑制表达效果，因此剂量低于小分子或抗体药物，相应的疗效和安全性具有显著优势。同时，不同序列的siRNA均由四种核糖核苷酸构成，化学性质相似，两种或两种以上的不同siRNA可以非常方便地组合在一起使用。RNAi技术的发展，提供了一种通过抑制病毒、癌基因等疾病相关基因的表达来治疗疾病的新的基因治疗方法，可阻断或下调目标基因的表达，其诱导基因沉默具有高度的特异性以及成药迅速、周期短、操作简单等优势，因此具有广阔的应用前景。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷，本发明提供一种抑制实体瘤发生发展的siRNA药物组合物，旨在通过靶向抑制调控肿瘤血管生成、肿瘤发生发展、肿瘤扩散转移等信号通路的靶标基因表达来直接杀伤肿瘤细胞、或阻断肿瘤细胞获取营养和氧气的通道而抑制血管增生，从而实现抑制肿瘤细胞的增殖和转移，实现有效治疗多种实体瘤。
本发明的第一方面，提供一种抑制实体瘤的siRNA药物组合物，该药物组合物包括能够结合至编码Ang-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子、能够结合至编码VEGF的mRNA并抑制其表达的siRNA分子、能够结合至编码COX-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子中的至少两种。
优选地，上述siRNA药物组合物至少包括能够结合至编码Ang-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子。
优选地，上述能够结合至编码Ang-2并抑制其表达的mRNA的siRNA分子和能够结合至编码VEGF的mRNA并抑制其表达的siRNA分子可联合用药。
优选地，上述能够结合至编码Ang-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子和能够结合至编码COX-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子可联合用药。
其中，能够结合至编码Ang-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子，由如下序列的正义链和反义链组成：
正义链：5’-GAGAUCAAGGCCUACUGUGACAUGG-3’，
反义链：5’-CCAUGUCACAGUAGGCCUUGAUCUC-3’。
上述能够结合至编码VEGF的mRNA并抑制其表达的siRNA分子，由如下序列的正义链和反义链组成：
正义链：5’-CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’，
反义链：5’-UGUAUGUGGGUGGGUGUGUCUACAG-3’。
上述能够结合至编码COX-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子，由如下序列的正义链和反义链组成：
正义链：5’-GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3’，
反义链：5’-ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC-3’。
根据本发明的一实施方式，上述能够结合至编码Ang-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子和能够结合至编码VEGF的mRNA并抑制其表达的siRNA分子以摩尔比为1:2-2:1的比例组合；上述能够结合至编码Ang-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子和能够结合至编码COX-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子以摩尔比为1:2-2:1的比例组合。
进一步，基于所选siRNA药物分子针对信号通路的特异性及其潜在的直接或间接的关联性，本发明的siRNA药物组合物，也可以为，上述能够结合至编码VEGF的mRNA并抑制其表达的siRNA分子和能够结合至编码COX-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子以摩尔比为1:2-2:1之间的比例组合。
肿瘤发生发展的信号通路复杂多样，信号分子之间的交叉调控方式繁多，因此肿瘤治疗的理想方式一般需要同时抑制两个或两个以上的关键靶标，从抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制血管生成、激活机体免疫、阻断肿瘤侵袭与迁移等多个方面着手，才能实现肿瘤组织的高效清除。本发明的Ang-2、VEGF、COX-2三个促肿瘤靶标，通过不同却又有一定交叉的信号通路来诱导、促进肿瘤的发生发展和扩散，促进血管生成为肿瘤提供营养。因此，通过抑制Ang-2、VEGF、COX-2表达的三种siRNA分子中任意两个或两个以上的组合，可以发挥显著的协同抗肿瘤效应。
本发明的第二方面，提供一种siRNA药物制剂，该药物制剂包括上述的siRNA药物组合物以及药学上可接受的载体。近年来，纳米药物递送系统如纳米粒、纳米颗粒、树枝状聚合物、脂质体等用于体内递送siRNA备受青睐并得到广泛的研究，因其能够改善siRNA体内稳定性，增强siRNA靶向特异性，提高细胞/组织对siRNA的摄取，最终提高基因沉默效率，降低毒副作用，因而成为siRNA药物递送/导入的药学上可接受的载体。例如，阳离子共聚物能与siRNA通过静电吸附作用而自组装成纳米微粒，从而有效防止siRNA被核酸酶降解。阳离子共聚物由于合成简便、储存稳定、基因荷载率高、免疫原性低等优点而被广泛用于荷载siRNA制备纳米微粒复合物。但多数阳离子共聚物分子表面较高的正电荷密度会导致严重的细胞毒性，限制了其应用。因此，来源天然、正电荷分布合理的高分子聚合物，例如多肽类纳米递送系统，成为siRNA药物高效安全的药学载体，可将siRNA分子导入到特定的病灶部位，通过胞吞作用进入细胞发挥核酸干扰效果。
根据本发明的一实施方式，上述药学上可接受的载体可以包括组氨酸-赖氨酸多肽纳米导入载体。
根据一些实施方式，所以氨酸-赖氨酸多肽纳米导入载体为HKP和/或HKP(+H)。
根据本发明的一实施方式，上述siRNA药物组合物与组氨酸-赖氨酸多肽纳米导入载体以N/P质量比为1:2-1:6的比例混合，两者通过静电吸附、氢键等作用自组装成纳米药物。
一种基于抑制Ang-2、VEGF、COX-2表达的三种siRNA分子中的两个和两个以上的siRNA组合物的纳米药物制剂，包含siRNA分子和一个药用载体。组氨酸-赖氨酸多肽聚合物(HK Polymer)用于siRNA的体外和体内导入。该纳米载体包含HKP或HKP+H，两者均具有一个含四个分支的赖氨酸骨架，每个分支都含有多个重复的组氨酸、赖氨酸。制备合理的纳米药物制剂将是RNAi药物发挥疗效的关键所在。
本发明的多肽纳米载体或脂质纳米载体，是携带正电荷的阳离子聚合物。当纳米导入载体和siRNA分子以特定比混合时的，由于siRNA携带负电荷，因此可以与纳米导入载体以静电吸附、氢键等作用自动组装形成特定大小的纳米药物颗粒。当HKP或HKP(+H)水溶液和siRNA以2:1-6:1的N/P质量比混合时自组装成纳米颗粒，平均直径为50-200nm。组氨酸-赖氨酸多肽聚合物结构为(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK或KHHHKHHHKHHHHKHHHK，其中，K为赖氨酸，H为组氨酸。HKP-siRNA或HKP+H-siRNA水溶液呈半透明，没有明显的沉淀聚集，并且4℃下至少可以保存三个月。
根据本发明的一实施方式，上述药物制剂为由上述的siRNA药物组合物和上述药学上可接受的载体混合形成纳米药物，通过冷冻干燥制备而成。本发明涉及将这种HKP-siRNA或HKP(+H)-siRNA溶液冻干为干粉的工艺。用PBS或D5W(5％的葡萄糖溶液)溶解这些干粉后，这种治疗制剂可以通过静脉注射(iv)、瘤内注射(it)、皮下注射(sc)、腹腔注射(ip)输液进入血液，或者用于表皮局部给药，也可以通过雾化吸入给药方式将药物导入到呼吸系统特定病灶部位。
本发明的第三方面，提供上述的siRNA药物组合物或上述的siRNA药物制剂通过杀伤肿瘤细胞活性实现在哺乳动物中抑制实体瘤发生发展中的应用。其中，哺乳动物可以是人类或实验动物，如狗、猫、猪、非人灵长类动物，或啮齿动物，如老鼠、大鼠或豚鼠。优选的，哺乳动物是人类。
本发明提供上述的siRNA药物组合物或上述的siRNA药物制剂在治疗实体瘤中的应用，其中，实体瘤包括乳腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、结肠直肠癌中的一种或多种。
本发明的实施至少具有如下有益效果：通过同时抑制两种及以上与肿瘤发生发展密切相关的基因的表达，例如同时抑制Ang-2和VEGF，或同时抑制Ang-2和COX-2，通过靶向抑制调控肿瘤血管生成、肿瘤发生发展、肿瘤扩散转移等信号通路的靶标基因表达来直接杀伤肿瘤细胞、或阻断肿瘤细胞获取营养和氧气的通道而抑制血管增生，从而高效阻断乳腺癌、胰腺癌、肺癌等实体瘤的生长。本发明所提供的组合物抑制实体瘤效果显著，可以满足临床未满足的治疗需求。
附图说明
图1.Ang-2、VEGF、COX-2促进炎症、调控血管生成、促进肿瘤细胞存活和迁移的信号通路图。
图2.第一轮筛选Ang-2 siRNA，乳腺癌MCF-7细胞中Ang-2 mRNA的相对表达水平，图A中内参基因为β-actin，图B中内参基因为GAPDH。
图3.第二轮筛选Ang-2 siRNA，乳腺癌MCF-7细胞中Ang-2 mRNA的相对表达水平。
图4.在胰腺癌细胞BxPC3中，VEGF siRNA、COX-2 siRNA、Ang-2 siRNA单独使用和两种siRNA两两组合联合使用时对BxPC3细胞活力的抑制效果。图中所示p值为相对于正常组(Lipo组)的p值。
图5.在胰腺癌细胞BxPC3中，VEGF siRNA、COX-2 siRNA、Ang-2 siRNA单独使用和VEGF+Ang-2 siRNA联合使用时对BxPC3细胞活力的抑制效果。
图6.VEGF+Ang-2 siRNA联合使用和COX-2+Ang-2 siRNA联合使用时对胰腺癌细胞BxPC3活力的抑制效果。
图7.VEGF+Ang-2 siRNA联合使用和COX-2+Ang-2 siRNA联合使用时对乳腺癌细胞MCF-7活力的抑制效果。
图8.VEGF+Ang-2 siRNA联合使用和COX-2+Ang-2 siRNA联合使用时对肺癌细胞A549活力的抑制效果。
图9.VEGF+Ang-2 siRNA联合使用和COX-2+Ang-2 siRNA联合使用时对胃癌细胞AGS活力的抑制效果。
图10.VEGF+Ang-2 siRNA联合使用时抑制乳腺癌细胞MCF-7的细胞形态图。
图11.VEGF+Ang-2 siRNA联合使用时乳腺癌细胞MCF-7中凋亡基因的相对表达水平图。
图12.VEGF+Ang-2 siRNA联合使用时对乳腺癌细胞MCF-7的侵袭和扩散的抑制效果图。
图13.VEGF+Ang-2 siRNA联合使用和COX-2+Ang-2 siRNA联合对肺癌A549细胞的侵袭和扩散的抑制效果图。
图14.第一次BxPC3移植瘤动物实验分离后的肿瘤组织图。从上到下分别为肿瘤组、阴性对照siRNA组(NC)和VEGF+Ang-2 siRNA组合物治疗组(VA组)。
图15.第一次BxPC3移植瘤动物实验测定VEGF+Ang-2 siRNA药物组合物对胰腺癌的抑制效果的肿瘤体积生长曲线。
图16.第一次BxPC3移植瘤动物实验测定VEGF+Ang-2 siRNA药物组合物对胰腺癌的抑制效果结束时的肿瘤重量情况。
图17.动物体内实验中BxPC3移植肿瘤组织的苏木精-伊红(H&E)染色情况。
图18.第二次BxPC3移植瘤动物实验测定VEGF+Ang-2 siRNA药物组合物对胰腺癌的抑制效果的肿瘤生长情况。A为肿瘤生长曲线，B为肿瘤重量。C中从上到下分别为肿瘤组、阴性对照siRNA组(NC组)和VEGF+Ang-2 siRNA组合物治疗组(VA组)。D中从左到右分别为肿瘤组、阴性对照siRNA组(NC组)和VEGF+Ang-2 siRNA组合物治疗组(VA组)。
图19.A549肺癌细胞移植瘤动物实验测定VEGF+Ang-2和VEGF+COX-2的siRNA药物组合物对肺癌的抑制效果的肿瘤生长曲线与实验结束时的肿瘤重量情况。
具体实施方式
为了使本发明更加明显易懂，现结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，但不以任何方式限制本发明。
如图1所示，VEGF和Ang-2，COX-2和Ang-2在调控肿瘤血管生成、促进细胞增殖、存活和迁移中具有协同作用，因此本发明使用多靶标RNA干扰(RNAi)鸡尾酒通过协同抑制VEGF和Ang-2，或，COX-2和Ang-2，获得协同增益有效治疗实体瘤。发明人将VEGF基因、COX-2基因以及Ang-2基因作为RNA干扰靶标，根据人和小鼠的同源基因序列设计siRNA分子，包括正义链核苷酸序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.19的双链siRNA分子，其中，结合至编码Ang-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子的正义链核苷酸序列为SEQ ID NO.1-12，结合至编码VEGF的mRNA并抑制其表达的siRNA分子的正义链核苷酸序列为SEQ ID NO.13-18(以下简称为VEGF siRNA)，结合至编码COX-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子的正义链核苷酸序列为SEQ ID NO.19(以下简称为COX-2 siRNA)。上述siRNA序列的正义链分别如下：
5’-UCGCUCAAGGCCACAACCAUGAUGA-3’(#1，SEQ ID NO.1)；
5’-CGCUCAAGGCCACAACCAUGAUGAU-3’(#2，SEQ ID NO.2)；
5’-CUCAAGGCCACAACCAUGAUGAUCC-3’(#3，SEQ ID NO.3)；
5’-UCAAGGCCACAACCAUGAUGAUCCG-3’(#4，SEQ ID NO.4)；
5’-GAGAUCAAGGCCUACUGUGACAUGG-3’(#5，SEQ ID NO.5)；
5’-AGAUCAAGGCCUACUGUGACAUGGA-3’(#6，SEQ ID NO.6)；
5’-CAGUAAAUAACUGGAAAACAGAACA-3’(#7，SEQ ID NO.7)；
5’-AGUAAAUAACUGGAAAACAGAACAC-3’(#8，SEQ ID NO.8)；
5’-UAAAUAACUGGAAAACAGAACACUU-3’(#9，SEQ ID NO.9)；
5’-AAAUAACUGGAAAACAGAACACUUA-3’(#10，SEQ ID NO.10)；
5’-GCUCAAGGCCACAACCAUGAUGAUC-3’(#11，SEQ ID NO.11)；
5’-UCAAGGCCACAACCAUGAUGAUCCG-3’(#12，SEQ ID NO.12)；
5’-AAAUGUUCCUGCAAAAACACAGACU-3’(SEQ ID NO.13)；
5’-CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’(SEQ ID NO.14)；
5’-UGUAUGUGGGUGGGUGUGUCUACAG-3’(SEQ ID NO.15)；
5’-UUCCUGCAAAAACACAGACUCGCGU-3’(SEQ ID NO.16)；
5’-UGCAAAAACACAGACUCGCGUUGCA-3’(SEQ ID NO.17)；
5’-AACACAGACUCGCGUUGCAAGGCGA-3’(SEQ ID NO.18)；
5’-GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3’(SEQ ID NO.19)。
在本文中，术语“小干扰核酸”、“siRNA”、“siRNA序列”、“siRNA分子”、“双链siRNA”或“双链siRNA分子”可以互换，它们表示的意思和范围相同。其中，siRNA双链是正义链和反义链退火形成的双链结构。
siRNA分子的制备可采用多种方法，如化学合成法、体外转录法、酶切长链dsRNA、载体表达RNA、PCR合成RNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。
下述实验方法中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件；所使用的实验材料、试剂等，如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例1.Ang-2 siRNA分子筛选
本实施例用于筛选对Ang-2 mRNA沉默效果最好的siRNA分子。
(1)采用人类乳腺癌MCF-7细胞系对设计合成的12条针对Ang-2靶标基因的siRNA分子进行第一轮筛选：
将人类乳腺癌MCF-7细胞用含有10％肽牛血清的DMEM完全培养基接种于12孔板，接种密度为2-5×105细胞/孔，每孔1mL培养基，37℃培养过夜。将12孔板中的细胞培养液吸弃，每孔加入0.5mL无血清的RPMI-1640或DMEM培养基。
将2μL浓度为20μM的待筛选的siRNA稀释于200μL的Opti-MEM无血清培养基中，轻轻混匀；将2μL的LipofectamineTM2000(Life Technologies/Invitrogen公司)(以下简称Lipo2000)稀释于200μLOpti-MEM无血清培养基中，混匀后室温孵育5分钟；将稀释的siRNA和稀释的Lipo2000混合，轻轻混匀，室温孵育20分钟，以便形成纳米复合物。转染分组包括：(a)Ang-2 siRNA转染实验组；(b)只加Lipo2000的空白对照组。
然后进行转染，对于Ang-2 siRNA转染实验组，在接种有MCF-7细胞的12孔板中按照每孔400μL加入上述混合溶液，Ang-2 siRNA的最终浓度为100nM。细胞于37℃培养4-6小时，再向每孔加入1mL含有10肽牛血清的RPMI-1640或DMEM完全培养基，继续在37℃培养21-48小时。
通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)分别检测转染了Lipo2000和#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#8、#9、#10、#11、#12 siRNA的MCF-7细胞中Ang-2基因的mRNA表达水平。
PCR具体步骤为：使用M5 Hiper Universal RNA Mini Kit(组织/细胞RNA快速提取试剂盒，北京聚合美生物科技有限公司，货号MF036-01)提取MCF-7细胞中的总RNA：分别取0.5μg总RNA按照反转录试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司，货号MF012-01)的使用方法反转录得到cDNA。使用2x Realtime PCR Supper mix(北京聚合美科技有限公司，货号MF013-01)试剂盒，以cDNA为模板按照说明书的步骤进行Ang-2 mRNA的相对表达水平检测。
结果如图2所示，其中图2A中内参基因为β-actin，图2B中内参基因为GAPDH。结合两次实验结果，MCF-7细胞转染编号为#3、#5、#6、#7、#9、#11的siRNA后，Ang-2 mRNA基因的相对表达水平有明显降低，因此，选取这6条siRNA分子进行第二轮筛选，特别注意的是#5的siRNA对Ang-2 mRNA基因的抑制效果比较稳定。
(2)采用人类胰腺癌BxPC3细胞系对上述步骤中筛选的6条siRNA分子进行第二轮筛选：
与第一轮筛选的区别在于，采用胰腺癌BxPC3细胞系替换乳腺癌MCF-7细胞系，新增一组NC-siRNAs阴性对照组，通过实时荧光定量PCR分别检测转染了Lipo2000、NC-siRNAs、#3、#5、#6、#7、#9、#11 siRNA的BxPC3细胞中Ang-2 mRNA的相对表达水平。结果如图3所示，从图中可以看出编号为#3和#5的siRNA对Ang-2 mRNA基因有显著的抑制效果，因此综合MCF-7细胞和BxPC3细胞中所选siRNA对Ang-2 mRNA基因的抑制效果，可以看出编号为#5的siRNA(以下简称Ang-2 siRNA)对Ang-2 mRNA基因的沉默效果最佳。
实施例2.所选siRNA对胰腺癌细胞活力抑制效果
本实施例使用CCK-8法检测VEGF siRNA(SEQ ID NO.14)、COX-2 siRNA(SEQ IDNO.19)和实施例1中选定的Ang-2 siRNA(#5，SEQ ID NO.5)单独使用和分别联合使用时在体外对胰腺癌细胞BxPC3的细胞活力抑制效果。
将人类胰腺癌细胞BxPC3用含有10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基接种于96孔板，接种密度为2-5×105细胞/孔，每孔0.1mL培养基，37℃培养过夜。将96孔板中的细胞培养液吸弃，每孔加入0.2mL无血清的1640培养基。
分别制备100nM的VEGF siRNA、COX-2 siRNA、Ang-2 siRNA和100nM(50nM+50nM)的VEGF+Ang-2 siRNA、VEGF+Cox-2 siRNA溶液、Ang-2+Cox-2 siRNA；取2μL的Lipo2000稀释于200μLOpti-MEM无血清培养基中，制备4份，混匀后室温孵育5分钟；将制备的siRNA分别与稀释的Lipo2000混合，轻轻混匀，室温放置20分钟，以便形成纳米复合物。转染分组包括：(a)VEGF siRNA转染实验组；(b)COX-2 siRNA转染实验组；(c)Ang-2 siRNA转染实验组；(d)VEGF+Ang-2 siRNA转染实验组；(e)VEGF+Cox-2 siRNA转染实验组；(f)Ang-2+Cox-2 siRNA转染实验组；(g)siNC阴性对照转染组；(h)只加Lipo2000的空白对照组。转染细胞与37℃培养4-6小时，再向每孔中加入0.1mL含有10％胎牛血清的1640完全培养基，继续在37℃培养。
通过CCK8试剂盒分别检测转染了Lipo2000、siNC、VEGF siRNA、COX-2 siRNA、Ang-2 siRNA、VEGF+Ang-2 siRNA、VEGF+Cox-2 siRNA和Ang-2+Cox-2 siRNA的BxPC3细胞的细胞活力。具体步骤为：
培养转染的细胞24-48小时后，取CCK8溶液10μL加入到96孔板中，培养箱中培养1-4小时，用酶标仪在450nm波长下测的96孔的吸光度。结果如图4所示，从图中可以看出，VEGF+Ang-2 siRNA、VEGF+Cox-2 siRNA和Ang-2+Cox-2 siRNA对BxPC3细胞活力的抑制效果明显优于VEGF siRNA、COX-2 siRNA、Ang-2 siRNA单独使用，其中，Ang-2+Cox-2 siRNA组合可以显著抑制BxPC3细胞活力，VEGF+Ang-2 siRNA组合对BxPC3细胞活力的抑制效果次之。
进一步重复VEGF+Ang-2 siRNA组合对BxPC3细胞活力的影响，如图5所示，VEGF+Ang-2 siRNA组合也可以显著抑制BxPC3细胞的活力，说明这一组合物具有切实明确的肿瘤杀伤活性。
实施例3.所选siRNA组合对胰腺癌、乳腺癌、肺癌活力抑制效果
本实施例用于检测VEGF siRNA、COX-2 siRNA分别和Ang-2 siRNA联合使用时在体外对胰腺癌细胞BxPC3、乳腺癌MCF-7、肺癌细胞A549、胃癌细胞AGS的细胞活力抑制效果。
(1)siRNA组合对胰腺癌细胞BxPC3活力抑制效果
与实施例2实施步骤的区别在于，转染分组为：(a)VEGF+Ang-2 siRNA转染实验组(50nM+50nM)；(b)Ang-2+COX-2 siRNA转染实验组(50nM+50nM)；(c)siNC阴性对照转染组；(d)只加Lipo2000的空白对照组。通过CCK8试剂盒分别检测转染了VEGF+Ang-2 siRNA、Ang-2+COX-2 siRNA、siNC、Lipo2000的BxPC3的细胞活力。结果如图6所示，从图中可以看出，VEGF+Ang-2siRNA联合，或者Ang-2+Cox-2 siRNA联合，均可以显著抑制胰腺癌BxPC3细胞活力。
(2)siRNA组合对乳腺癌细胞活力抑制效果
与检测siRNA组合对胰腺癌细胞活力抑制效果的实施步骤的区别在于，采用乳腺癌细胞MCF-7替换胰腺癌细胞BxPC3。通过CCK8试剂盒检测细胞活力，结果如图7所示，从图中可以看出，VEGF+Ang-2 siRNA联合，或者Ang-2+Cox-2 siRNA联合，均可以显著抑制乳腺癌MCF-7细胞活力。
(3)siRNA组合对肺癌细胞活力抑制效果
与检测siRNA组合对胰腺癌细胞活力抑制效果的实施步骤的区别在于，采用肺癌细胞A549替换胰腺癌细胞BxPC3。通过CCK8试剂盒检测细胞活力，结果如图8所示，从图中可以看出，VEGF+Ang-2 siRNA联合，或者Ang-2+Cox-2 siRNA联合，可以有效抑制肺癌A549细胞活力。
(4)siRNA组合对胃癌细胞活力抑制效果
与检测siRNA组合对胰腺癌细胞活力抑制效果的实施步骤的区别在于，采用胃癌细胞AGS替换胰腺癌细胞BxPC3。通过CCK8试剂盒检测细胞活力，结果如图9所示，从图中可以看出，与阴性对照组相比，VEGF+Ang-2 siRNA联合，或者Ang-2+Cox-2 siRNA联合，可以有效抑制胃癌AGS细胞活力。
实施例4.VEGF+Ang-2 siRNA组合对细胞内凋亡基因的抑制效果
将人类乳腺癌细胞MCF-7用含有10％肽牛血清的RPMI 1640完全培养基接种于12孔板，接种密度为2-5×105细胞/孔，每孔1mL培养基，37℃培养过夜。将12孔板中的细胞培养液吸弃，每孔加入0.5mL无血清的1640培养基。
取20μM的VEGF siRNA和Ang-2 siRNA各3μL稀释于594μLOpti-MEM无血清培养基中；取60μL的Lipo2000稀释于5940μL的Opti-MEM无血清培养基，混匀后室温孵育5分钟；将稀释的siRNA和稀释的Lipo200混合，轻轻混匀，室温放置20分钟，以便形成纳米复合物。转染分组如下：(1)VEGF+Ang-2 siRNA转染组；(2)GFP-NC/siNC阴性对照转染组；(3)只加Lipo2000的对照转染组。其中，GFP-NC为针对GFP(绿色荧光蛋白)基因的siRNA，siNC为不针对任何基因的siRNA，两种siRNA组联合，作为阴性对照siRNA组合物。然后在接种有MCF-7细胞的12孔板中按照每孔400μL加入上述最终混合溶液。细胞于37℃培养4-6小时，再向每孔中加入1mL含有10％肽牛血清的1640完全培养基，继续在37℃下培养24-48小时。
转染后的细胞形态如图10所示，从图中可以看出，转染VEGF+Ang-2 siRNA组合后，乳腺癌MCF-7细胞出现了核质固缩的现象并出现了细胞大面积死亡。通过实时荧光定量PCR分别检测转染了Lipo2000、GFP-NC/siNC、VEGF+Ang-2 siRNA的MCF-7细胞中Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表达量。Bcl-2是细胞凋亡抑制基因，Bax不仅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且具有促进细胞凋亡的功能。结果如图11所示，从图中可以看出，经过VEGF+Ang-2 siRNA组合处理后，Bcl-2基因相对表达水平显著降低(A)，凋亡标志基因——Bax基因相对表达水平显著升高(B)，表明VEGF+Ang-2 siRNA组合可以促进细胞凋亡。
实施例5.VEGF+Ang-2 siRNA组合和Ang-2+Cox-2 siRNA组合对细胞的侵袭和扩散的抑制效果
本实施例用于检测VEGF+Ang-2 siRNA组合和Ang-2+Cox-2 siRNA组合在体外抑制肺癌或乳腺癌细胞侵袭和扩散的能力。具体实施方式如下：
将人类乳腺癌细胞系MCF-7或乳肺癌细胞系A549用含有10％胎牛血清的DMEM培养基或RPMI 1640完全培养基接种于12孔板(提前用marker笔在12孔板背后用直尺画2条平行直线)，接种密度为2-5×105细胞/孔，每孔1mL培养基，37℃培养过夜。将12孔板中的细胞培养液吸弃，每孔加入0.5mL无血清的DMEM培养基或1640培养基。
各取20μM的Ang-2 siRNA和VEGF siRNA、或Cox-2 siRNA和Ang-2 siRNA各3μL稀释于594μL的Opti-MEM培养基中，得到200nM的溶液600μL，轻轻混匀，室温孵育5min；将60μL的Lipo2000稀释于5940μL的Opti-MEM培养基中(稀释100倍)，轻轻混匀，室温孵育5min，将稀释后的siRNA和稀释后的Lipo2000各取600μL混合，轻轻混匀，室温放置20分钟，以便形成纳米复合物，转染分组包括：Ang-2+Cox-2 siRNA转染实验组；VEGF+Ang-2 siRNA转染实验组；GFP-NC/siNC阴性转染对照组，即阴性对照siRNA组。
将上述纳米复合物添加到上述的12孔板中，将12孔板放入培养箱4-6小时，更换完全培养基，继续培养。第二天用10μL枪头比着直尺沿着此前画的直线划两条平行线，用PBS将细胞洗3次，去除划下的细胞加入培养基，放入细胞培养箱中培养，在不同时间点(第0天、第1天、第5天、第7天)进行显微镜观察取图。
乳腺癌细胞的结果如图12所示，从图中可以看出，阴性转染对照组中，MCF-7乳腺癌细胞在5天时已经开始大量增殖，第7天刮痕已经接近消失，而VEGF+Ang-2 siRNA转染实验组中，第7天细胞依然存在刮痕，表明VEGF+Ang-2 siRNA具有显著抑制乳腺癌细胞侵袭和扩散的能力。
肺癌结果如图13所示，其中，新增不同浓度的分组，分析siRNA组合的剂量依赖效应，可以看出，正常组和阴性对照组，在48小时(2天)后，细胞增殖显著，刮痕明显变小。而VEGF+Ang-2 siRNA组合和Ang-2+Cox-2 siRNA组合显著抑制细胞增殖和迁移，48小时后的刮痕依然非常明显，且高浓度的siRNA组合效果比低浓度更好，呈现良好的剂量效应。
实施例6.动物实验测定VEGF+Ang-2 siRNA药物组合物对胰腺癌的抑制效果
本实施例用于检测在体内BxPC3异种移植小鼠肿瘤模型中由VEGF+Ang-2 siRNA与药学上可接受的载体制备的纳米药物制剂对胰腺癌的抑制效果。异种移植小鼠肿瘤模型是将人源的细胞系经过体外培养后，通过皮下、静脉或者原位的方式接种到免疫缺陷的小鼠体内的一种异种移植模型。待肿瘤生长到一定大小开始进行药物干预，根据肿瘤体积和重量变化来判断药物在体内对肿瘤的抑制效果。具体实施方式如下：
(1)小鼠造模
PBS洗涤细胞后，将培养好的BxPC3细胞用Hank’s平衡盐溶液制备细胞悬液5×106个细胞/0.2mL，每只动物注射0.2mL(皮下，小鼠右侧侧翼)。当肿瘤长到超过100mm3大小后，随机分组。
(2)小鼠给药方法
将5-6周龄的BALB/c nude mice(雌性)随机分成3组，每组6只，分组如下：(1)BxPC3细胞肿瘤组(生理盐水)；(2)siNC组(阴性对照siRNA)；(3)VEGF+Ang-2 siRNA组。所有动物采用瘤内注射方式通过尾静脉注射进行给药，按每只小鼠2mg/kg，其中siRNA给药剂量为0.4mg/kg，给药体积为每只小鼠50μL，每周给药2次，所有组的动物给药时间持续31天。每次给药前测定肿瘤体积，完成给药后，继续饲养动物，根据肿瘤生长情况，当观察到各组之间肿瘤大小有显著性差异后，记为试验终点。末次给药后继续饲养动物，根据肿瘤生长情况，继续饲养2-3周采集肿瘤、全血及肝脏组织，分离后的肿瘤组织如图14所示，从上到下分别为肿瘤组、阴性对照siRNA组(NC)和VEGF+Ang-2 siRNA组合物治疗组(VA组)，与肿瘤组、NC组相比，VA组的离体肿瘤明显缩小，表明肿瘤生长减缓。
(3)组织切片分析
石蜡玻片烤片脱蜡后，加热修复抗原，灭活内源性酶及封闭内源性生物素，用BSA封闭，一抗4度孵育过夜，二抗孵育，分别用DAB和苏木素染色，之后脱水树胶封片，10倍显微镜下拍摄结果。
肿瘤体积
肿瘤体积变化如图15所示，从图中可以看出，与BxPC3肿瘤组动物的肿瘤体积相比，VA组动物的肿瘤体积在给药后11天开始减少。在所有其他时间点，治疗后15天、18天、22天、25天、28天、31天，VA组动物的肿瘤体积值均低于BxPC3肿瘤组和siNC组，给药完成时(第31天)，VA组动物的肿瘤体积已经显著低于BxPC3肿瘤组和siNC组，可见，VA药物组合物可显著抑制BxPC3肿瘤细胞的生长。
肿瘤重量
在研究结束时(第31天)，小鼠安乐死后，称量肿瘤的重量，结果如图16所示，从图中可以看出，经VA组(0.4mg/kg，瘤内注射)给药治疗后，肿瘤重量均显著低于肿瘤组和NC组。
H&E染色
图17是肿瘤组(胰腺癌BxPC3细胞)、siNC组(NC组)和VEGF+Ang-2 siRNA组(VA组)的肿瘤切片H&E染色情况。肿瘤切片上的小空隙表示坏死区域和肿瘤细胞的缺乏，在裸鼠BxPC3皮下移植瘤模型中，与参照组(BxPC3肿瘤组和siNC组)相比，VEGF+Ang-2 siRNA药物组合物(0.4mg/kg，瘤内注射)给药治疗后，肿瘤组织内部形成明显的空隙，而参照组没有这种显著的空隙形成，表明VEGF+Ang-2 siRNA药物组合物可以促进肿瘤细胞凋亡，具有较好的抑制肿瘤细胞的能力。
采用与上述相同的方法，重复一次动物实验，证实了VEGF+Ang-2 siRNA药物组合物可以显著抑制胰腺癌BxPC3细胞皮下移植瘤的生长(图18)。图18C中，从上到下分别为肿瘤组、阴性对照NC组和VA组(VEGF+Ang-2 siRNA)，VEGF+Ang-2 siRNA药物组合物治疗组肿瘤生长显著减缓，实验重点的肿瘤重量明显低于未治疗组(Tumor)或阴性siRNA对照组(NC)。H&E染色见.图18D，从左到右分别为肿瘤组、阴性对照NC组和VA组(VEGF+Ang-2siRNA)，可见VEGF+Ang-2 siRNA药物组合物治疗组肿瘤组织内有明显空隙。
实施例7.动物实验分析VEGF+Ang-2或VEGF+COX-2的siRNA药物组合物对肺癌移植瘤的抑制效果
(1)小鼠造模
PBS洗涤细胞后，用Hank’s Balanced Salt Solution制备细胞(A549)悬液5×106个细胞/0.2mL，每只动物注射0.2mL(皮下，小鼠右侧侧翼)。当肿瘤长到超过100mm3大小后(预计1-2周)，随机分组。
(2)小鼠给药方法
成模后，随机分组，药物采用肿瘤内注射，每周两次，连续给药6次(三周)，20g小鼠给药体积为50uL。每次给药前称量动物体重，并测定肿瘤体积；完成给药后，继续饲养动物，根据肿瘤生长情况，当观察到各组之间肿瘤大小有显著性差异后(预计给药后2-3周)，算为试验终点。药前测定体重和肿瘤大小，后续至少每周测定两次；实验结束时，每组小鼠并排拍照；肿瘤分离，将每组肿瘤并排拍照记录。
肿瘤体积变化如图19左侧所示，从图中可以看出，与A549肿瘤组动物(未治疗组)的肿瘤体积相比，VEGF+Ang-2 siRNA组(VA组)和Ang-2+COX-2 siRNA组(AC组)动物的肿瘤体积在给药后14天明显低于模型组。在所有其他时间点，治疗后17天、20天、24天、27天、31天，VEGF+Ang-2 siRNA组和Ang-2+COX-2 siRNA组动物的肿瘤体积值均低于A549肿瘤组。实验结束时(第31天)，VEGF+Ang-2 siRNA组和Ang-2+COX-2 siRNA组动物的肿瘤重量显著低于A549肿瘤组，可见，VEGF+Ang-2 siRNA药物组合物和Ang-2+COX-2 siRNA药物组合物可显著抑制A549肿瘤的生长。
尽管本发明描述了上述组合物和方法的某些实施例，并且出于说明的目的已经阐述了很多细节，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些组合物和方法易受其他实施例的影响，并且某些细节在不脱离本发明的基本原理的情况下，可以随本文中描述的实施方式进行改变。
Claims (12)
1.一种抑制实体瘤发生发展的siRNA药物组合物，其特征在于，所述siRNA药物组合物包括能够结合至编码Ang-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子、能够结合至编码VEGF的mRNA并抑制其表达的siRNA分子、能够结合至编码COX-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子中的至少两种。
2.根据要求1所述的siRNA药物组合物，其特征在于，所述siRNA药物组合物至少包括能够结合至编码Ang-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子。
3.根据权利要求1所述的siRNA药物组合物，其特征在于，所述能够结合至编码Ang-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子，由如下序列的正义链和反义链组成：
正义链：5’-GAGAUCAAGGCCUACUGUGACAUGG-3’，
反义链：5’-CCAUGUCACAGUAGGCCUUGAUCUC-3’。
4.根据权利要求1所述的siRNA药物组合物，其特征在于，所述能够结合至编码VEGF的mRNA并抑制其表达的siRNA分子，由如下序列的正义链和反义链组成：
正义链：5’-CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’，
反义链：5’-UGUAUGUGGGUGGGUGUGUCUACAG-3’。
5.根据权利要求1所述的siRNA药物组合物，其特征在于，所述能够结合至编码COX-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子，由如下序列的正义链和反义链组成：
正义链：5’-GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3’，
反义链：5’-ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC-3’。
6.根据权利要求1所述的siRNA药物组合物，其特征在于，所述能够结合至编码Ang-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子和能够结合至编码VEGF的mRNA并抑制其表达的siRNA分子的摩尔比为1:2-2:1；所述能够结合至编码Ang-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子和能够结合至编码COX-2的mRNA并抑制其表达的siRNA分子的摩尔比为1:2-2:1。
7.一种siRNA药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括权利要求1-6中任一项所述的siRNA药物组合物以及药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的siRNA药物制剂，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括组氨酸-赖氨酸多肽纳米导入载体。
9.根据权利要求8所述的siRNA药物制剂，其特征在于，所述的组氨酸-赖氨酸多肽纳米导入载体为HKP和/或HKP(+H)。
10.根据权利要求8所述的siRNA药物制剂，所述siRNA药物组合物与所述组氨酸-赖氨酸多肽纳米导入载体以N/P质量比为1:2-1:6的比例混合自组装成纳米药物。
11.根据权利要求7所述的siRNA药物制剂，其特征在于，所述siRNA药物制剂为冻干粉制剂；和/或，所述实体瘤包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、结肠直肠癌中的一种或多种。
12.权利要求1-6中任一项所述的siRNA药物组合物或权利要求7-11中任一项所述的siRNA药物制剂在抑制哺乳动物的实体瘤的发生发展中的应用。
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