CN117679392A - 缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊、制备方法 - Google Patents

缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊、制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊、制备方法，其中，该缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊的制备方法，包括：制备携载抗原的纳米球；将携载抗原的纳米球与海藻酸钠溶液进行混合，得到混悬液；利用喷雾干燥器的喷枪将混悬液喷入固化剂溶液中，持续搅拌固化，得到携载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊。本发明还提供了一种缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊在制备单剂注射疫苗或口服疫苗中的应用。

Description

缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊、制备方法
技术领域
本发明属于微胶囊技术领域，尤其涉及一种缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊、制备方法及应用。
背景技术
传统疫苗多为病原体或其裂解物，免疫原性强。但随着现代生物技术的发展，基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗等新型疫苗抗原的纯度越来越高，但免疫原性通常较弱，在免疫的过程中，通常需要进行多次免疫。因此，对于新型疫苗来讲，如何改善或提高其在体内的免疫应答性，逐渐成为大家关注的重点。
发明内容
针对上述存在的技术问题，本发明提供了一种缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊、制备方法及应用，以期至少部分地解决上述技术问题。
为了解决上述技术问题，作为本发明的一个方面，提供了一种缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊的制备方法，包括：
制备携载抗原的纳米球；
将上述携载抗原的纳米球与海藻酸钠溶液进行混合，得到混悬液；
利用喷雾干燥器的喷枪将上述混悬液喷入固化剂溶液中，持续搅拌固化，得到携载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊。
在其中一个实施例中，上述携载抗原的纳米球是通过如下步骤制备得到：
采用纳米沉淀技术制备聚乳酸类阳离子脂质纳米球；
将抗原和上述纳米球相混合，上述抗原通过静电吸附携载至上述纳米球上，得到上述携载抗原的纳米球。
在其中一个实施例中，上述携载抗原的纳米球与上述海藻酸钠溶液的质量比包括：1∶10～1∶25；
上述海藻酸钠溶液的浓度包括：0.5～3.0wt％；
上述固化剂的浓度包括：0.5～1.5M。
在其中一个实施例中，上述固化剂包括以下至少一种：CaCl2、FeCl2、MnCl2。
在其中一个实施例中，上述喷雾干燥器喷枪的气体流量包括450～750L/h；
上述喷雾干燥器喷枪的液体流速包括：1.0～4.0mL/min。
在其中一个实施例中，上述抗原至少包括以下任意一种：
灭活口蹄疫抗原、灭活猪圆环抗原、灭活猪蓝耳抗原、口蹄疫蛋白抗原、猪圆环蛋白抗原、猪蓝耳蛋白抗原、人重组带状疱疹蛋白抗原、人重组乙肝蛋白抗原、人重组乳头瘤蛋白抗原、流感病毒裂解抗原、合成的多肽抗原、DNA疫苗、RNA疫苗。
作为本发明的另一个方面，提供了一种缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊，包括：
包埋在海藻酸盐微胶囊中携载抗原的纳米球，
上述海藻酸盐微胶囊粒径范围包括10～80μm；
上述海藻酸盐微胶囊粒径分散系数范围包括0.005～0.3。
在其中一个实施例中，上述携载抗原纳米球的包埋率40～90％；
上述抗原的装载率0.45～20μg/mg。
在其中一个实施例中，上述海藻酸盐微胶囊在体外生理环境35天下，上述抗原累积释放率不高于60％。
作为本发明的又一个方面，提供了一种缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊在制备单剂注射疫苗或口服疫苗中的应用，其中，上述单剂注射疫苗或口服疫苗包括冻干粉形式。
基于上述技术方案，本发明提供的一种缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊、制备方法及应用至少包括以下之一的有益效果：
(1)在本发明的实施例中，将抗原吸附至纳米球上，得到携载抗原的纳米球，将携载抗原的纳米球与海藻酸钠溶液相混合，利用喷雾干燥器将混悬液喷入至固化剂中，得到携载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊。通过将携载抗原的纳米球和抗原包埋进海藻酸盐微胶囊中，可以调控抗原的释放行为，即一部分游离抗原在前期释放出来，而载抗原的纳米球则在后期随着微胶囊崩解而释放，较好地调控了抗原释放行为，使其能更好地模拟传统多针免疫，解决了传统方法制备的仅包埋抗原的海藻酸盐微胶囊释放抗原速度快，需要进行多针免疫的问题；此外，通过喷雾干燥器制备的海藻酸钙微胶囊的粒径为10-80μm，尺寸均一且可控，解决了现有技术中制备的纳微球粒径大小不均匀的问题；而且，海藻酸盐微囊具有pH敏感释放行为，能过够在胃部保护抗原免受降解或酶解，到达肠道部位释放载抗原纳米球，促进抗原被肠道免疫细胞摄取，提升口服免疫应答水平。
(2)在本发明的实施例中，制备的海藻酸盐微胶囊可与抗原或载抗原的纳米球复配形成单剂疫苗制剂，载抗原的纳米球和/或突释的抗原模拟传统疫苗的第一针免疫，后续缓释的抗原模拟传统疫苗的第二针免疫，海藻酸盐微胶囊崩解释放载抗原的纳米球模拟传统疫苗的第三针免疫。
(3)在本发明的实施例中，制备的载抗原纳米球的海藻酸盐微囊在作为口服免疫制剂时，通过pH敏感释放行为、载抗原纳米球的尺寸与表面电荷效应，能够促进抗原被肠道免疫细胞摄取，进而诱导强有力的免疫效应。
(4)在本发明的实施例中，制备的海藻酸盐微胶囊所形成的单剂疫苗制剂或口服疫苗制剂，可以用于重组或亚单位抗原、多肽疫苗、灭活病毒抗原、DNA疫苗等多种疫苗，例如：灭活口蹄疫抗原、灭活猪圆环抗原、灭活猪蓝耳抗原、口蹄疫蛋白抗原、猪圆环蛋白抗原、猪蓝耳蛋白抗原、人重组带状疱疹蛋白抗原、人重组乙肝蛋白抗原、人重组乳头瘤蛋白抗原、流感病毒裂解抗原、合成的多肽抗原、RNA疫苗等。
(5)在本发明的实施例中，制备的海藻酸盐微胶囊中携载抗原纳米球的包埋可以达到40～90％，抗原的装载率0.45～20μg/mg，且海藻酸盐微胶囊在体内生理环境35天下，抗原累积释放率不高于60％，抗原释放缓慢。
附图说明
图1是本发明实施例8中海藻酸钙微胶囊包埋携载抗原纳米球的制备流程示意图；
图2A-B是本发明公实施例8中包埋了HBsAg-DDAB-PLA纳米球的海藻酸钙微胶囊在不同放大倍数下的光学显微镜照片；
图3A是本发明实施例8、15-16中喷雾干燥器喷枪中不同气体流量对海藻酸钙微胶囊的包埋率和粒径的影响；
图3B是本发明实施例8和实施例17-19中喷雾干燥器喷枪的不同液体流速对海藻酸钙微胶囊的包埋率和粒径的影响；
图3C是本发明实施例8和实施例20-22中携载抗原的纳米球与海藻酸钠溶液的质量比对海藻酸钙微胶囊的包埋率和装载率的影响；
图4是本发明实施例8包埋了HBsAg-DDAB-PLA纳米球的海藻酸钙微胶囊在不同pH的抗原释放行为；
图5A是本发明实施例8中的海藻酸钙微胶囊与其它不同组抗原在不同时间点注射部位荧光成像图；
图5B是本发明实施例8中不同组抗原在注射部位荧光总量随时间变化图；
图5C是本发明实施例8中不同组抗原在注射部位荧光总量24小时内的变化图；
图6是本发明实施例8中的海藻酸钙微胶囊与纯抗原、传统铝佐剂免疫的血清中特异性抗体IgG抗体滴度比较图；
图7是本发明实施例8中的海藻酸钙微胶囊与纯抗原、传统铝佐剂免疫的小鼠脾细胞中γ-干扰素(IFN-γ)的分泌量比较图；
图8是本发明实施例8中的海藻酸钙微胶囊与纯抗原、传统铝佐剂免疫的小鼠脾细胞中颗粒酶B(Granzyme-B)的分泌量比较图；
图9是本发明实施例3中载OVA/PLGA-DDAB纳米球的海藻酸钙微囊与不同OVA免疫组的小鼠的小肠灌洗液的IgA分泌水平对比图；
图10是本发明实施例3中载OVA/PLGA-DDAB纳米球的海藻酸钙微囊与不同OVA免疫组的小鼠的趋化因子CCL-2分泌水平的对比图；
图11A-B是本发明实施例3中载OVA/PLGA-DDAB纳米球的海藻酸钙微囊与不同OVA免疫组的小鼠肠道免疫细胞增殖水平对比图；
图12A-B是本发明实施例3中载OVA/PLGA-DDAB纳米球的海藻酸钙微囊与不同OVA免疫组的小鼠肠道DC募集水平对比图；
图13A-B是本发明实施例3中载OVA/PLGA-DDAB纳米球的海藻酸钙微囊与不同OVA免疫组的小鼠肠道DC活化水平对比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。
乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重的全球性公共卫生问题，在HBV感染的漫长病程中，部分患者因病情反复而造成肝炎、肝硬化、肝功能衰竭和肝癌等肝脏损害。目前全球约有20亿HBV感染者，每年约有100万人死于慢性乙肝引起的肝硬化和肝癌。我国是HBV高流行区，普通人群的感染率约9.75％。接种疫苗是预防HBV感染的有效方法。现有乙肝疫苗(铝佐剂)因接种针次较多(0、1、6个月)且条件限制，很难保证全程免疫3针，疫苗接种的漏种率高达70％。因此，研发新型乙肝疫苗，减少接种次数，简化免疫方式，提高免疫成功率势在必行。
微胶囊等在药物的控制释放、基因传送、组织工程等领域的应用前景较为诱人，其主要是利用天然或合成高分子材料，将分散的固体、液体，甚至是气体物质包裹起来，形成具有半透性或密封囊膜的微小粒子的技术，包囊的过程即微胶囊化过程，形成的微小粒子称为微胶囊。使用微胶囊技术可以实现以下之一的目的：①保护芯材，有效地防止外界环境因素例如pH值、氧气、湿度、热、光和其他物质等对芯材的破坏等不良影响；②隔离不相容组分，阻止成分之间发生化学反应，提高各自稳定性，使品质保持时间更持久；③控制释放，能人为而有效地控制芯材的释放，使芯材原有的效能得到最大限度发挥；④屏蔽味道和气味，掩盖芯材的异味，改善芯材的口感和味觉；⑤改变芯材的物理和化学性质，能将液体或半固体流质体转化为自由流动的固体粉末，便于贮藏和运输等。
因此，本发明采用喷雾固化的方法制备尺寸均一、携载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊，可以实现缓慢释放抗原的效果，且所将制备的海藻酸盐微胶囊可实现在制备单剂注射疫苗或口服疫苗中的应用。
根据本发明的实施例，缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊的制备方法，包括：制备携载抗原的纳米球；将携载抗原的纳米球与海藻酸钠溶液进行混合，得到混悬液；利用喷雾干燥器的喷枪将混悬液喷入固化剂溶液中，持续搅拌固化，得到携载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊。
通过本发明的实施例，将抗原吸附至纳米球上，得到携载抗原的纳米球，将携载抗原的纳米球与海藻酸钠溶液相混合，利用喷雾干燥器将混悬液喷入至固化剂中，得到携载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊。将携载抗原的纳米球和抗原包埋进海藻酸盐微胶囊中，通过调控抗原的释放行为，解决了传统方法制备的仅包埋抗原的海藻酸盐微胶囊释放抗原速度快，需要进行多针免疫的问题。此外，通过喷雾干燥器制备的海藻酸盐微胶囊的粒径大小均一，解决了现有技术中制备的纳微球粒径不均一的问题。
根据本发明的实施例，携载抗原的纳米球是通过如下步骤制备得到：采用纳米沉淀技术制备聚乳酸类阳离子脂质纳米球；将抗原和纳米球相混合，得到携载抗原的纳米球，其中，抗原是通过静电吸附携载至纳米球上。
根据本发明的实施例，采用纳米沉淀技术制备聚乳酸类阳离子脂质纳米球，包括：准确称取一定量的阳离子脂质和聚乳酸类材料，加入一定体积的乙醇和丙酮混合溶剂，作为油相。量取一定体积去离子水置于烧杯中，作为水相；在磁力搅拌下，将油相缓慢滴加到水相中，持续匀速磁力搅拌过夜，制备得到聚乳酸类阳离子脂质纳米球的混悬液。
根据本发明的实施例，聚乳酸类材料为聚乳酸、乳酸乙醇酸共聚物、乳酸乙二醇共聚物、聚已交酯丙交酯中的任意一种。聚乳酸类材料的分子量为10kDa-70kDa。
根据本发明的实施例，乙醇和丙酮的比例包括5∶1-1∶3，例如可以是5∶1、3∶1、1∶1、1∶2、1∶3、2∶3，优选为3∶1-1∶1。
通过本发明的实施例，将乙醇与丙酮的比例限定在此范围内使所制备出的纳米球具有较好的分散性和成球性。
根据本发明的实施例，制备携载抗原的纳米球包括：准确称取一定量的聚乳酸类阳离子脂质纳米球于离心管中，用一定体积pH＝6.5的PBS(磷酸缓冲盐溶液)重悬纳米球，超声分散使其形成均匀的混悬液，然后向此混悬液中加入一定体积的已知浓度的抗原溶液，并在25℃或4℃下垂直混合吸附3-5h，从而制备得到表面吸附抗原的纳米球混悬液。
根据本发明的实施例，采用喷雾-固化法制备携载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊包括，首先是将表面吸附抗原的纳米球混悬液与海藻酸钠溶液按一定质量比混合；然后，通过喷雾干燥器的喷枪将混悬液喷入固化剂缓冲溶液中，持续固化搅拌，制备得到海藻酸盐微胶囊。
根据本发明的实施例，携载抗原的纳米球与海藻酸钠溶液的质量比包括：1∶10～1∶25，其中，可选为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25等，更优选为1∶15-1∶20。
根据本发明的实施例，海藻酸钠溶液的浓度包括：0.5～3.0wt％，其中，可选为0.5、1、1.5、2.0、3.0wt％等，更优选为1.0-2.0wt％。
在本发明的实施例中，将海藻酸钠溶液的浓度限定在0.5-3.0wt％中可以避免因海藻酸钠溶液太稀，在与固化剂进行固化时导致所形成海藻酸盐微胶囊的内壁较薄，不能较好地包埋携载抗原的纳米球；以及避免因海藻酸钠溶液浓度过高过于黏稠，导致喷雾干燥器不易喷出海藻酸钠溶液。此外，将携载抗原的纳米球与海藻酸钠溶液的质量比限定在1∶10-1∶25，可以获得较高的包埋率的抗原，满足疫苗应用时的药效。
根据本发明的实施例，固化剂的浓度包括：0.5～1.5M，其中，可选为0.5、0.8、1.0、1.2、1.5M，更优选1.0M。
根据本发明的实施例，固化剂包括以下至少一种：CaCl2、FeCl2、MnCl2。在本发明的实施例中，固化剂的选择可以是能够与海藻酸钠溶液中的钠离子发生置换的二价离子，固化剂的选择不局限于本发明所列举出的种类。
根据本发明的实施例，喷雾干燥器喷枪的气体流量包括450～750L/h，其中，可选为450、500、600、750L/h等，更优选为550-650L/h；喷雾干燥器喷枪的液体流速包括：1.0～4.0mL/min，其中，可选为1.0、2.0、3.0、4.0mL/min等等，更优选为1.0-2.0mL/min。
在本发明的实施例中，通过调整喷雾干燥器的进料速度、气体流速以及喷雾干燥器喷嘴的尺寸可以调控海藻酸钙微胶囊的尺寸大小。
根据本发明的实施例，抗原至少包括以下任意一种：灭活口蹄疫抗原、灭活猪圆环抗原、灭活猪蓝耳抗原、口蹄疫蛋白抗原、猪圆环蛋白抗原、猪蓝耳蛋白抗原、人重组带状疱疹蛋白抗原、人重组乙肝蛋白抗原、人重组乳头瘤蛋白抗原、流感病毒裂解抗原、合成的多肽抗原、DNA疫苗、RNA疫苗。
通过本发明的实施例，在海藻酸盐微胶囊中包埋携载上述抗原的纳米球可以用于免疫注射，用单针免疫即可实现传统的两针或三针免疫，也可进行口服免疫，拓宽疫苗的应用。
根据本发明的实施例，还提供了一种缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊，包括：包埋在海藻酸盐微胶囊中的携载抗原的纳米球。
根据本发明的实施例，海藻酸盐微胶囊粒径范围包括10～80μm，其中，海藻酸盐微胶囊粒径可选为10、20、30、40、50、60、70、80μm等，更优选为20～50μm。本发明提供的方法制备的海藻酸盐微胶囊的粒径较小，可以用于口服疫苗或单剂注射疫苗的应用。
根据本发明的实施例，海藻酸盐微胶囊粒径分散系数范围包括0.005～0.3，其中，分散系数可选为0.005、0.008、0.01、0.015、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.1、0.15、0.2、0.3等，更优选为0.1-0.2。本发明提供的方法制备的海藻酸盐微胶囊的尺寸较为均一，解决现有技术中纳微球粒径不均一的问题。
根据本发明的实施例，携载抗原的纳米球的包埋率40～90％，其中，可选为40、50、54、65、68、60、70、80、90％等；抗原的装载率为0.45～20μg/mg，其中，可选为0.45、0.48、0.50、0.53、0.68、0.75、0.97、1.0、10、20μg/mg等。
根据本发明的实施例，海藻酸盐微胶囊在体外生理环境35天下，抗原累积释放率不高于60％，说明本发明的海藻酸盐微胶囊具有缓慢降解的特性，可缓慢释放抗原。其中，体外生理环境是指pH＝7.2～7.4。
根据本发明的实施例，还提供了一种海藻酸盐微胶囊在制备单剂注射疫苗或口服疫苗中的应用，其中，应用中的单剂注射疫苗或口服疫苗包括冻干粉形式。
通过本发明的实施例，采用海藻酸盐微胶囊包埋携载抗原(如HBsAg)纳米球作为单剂疫苗，或将此海藻酸盐微胶囊与载抗原的纳米球复配作为单剂疫苗制剂。利用游离的抗原或突释的抗原模拟传统疫苗的第一针免疫，后续缓释的抗原模拟传统疫苗的第二针免疫，海藻酸盐微胶囊崩解释放的载抗原纳米球模拟传统疫苗的第三针免疫。解决了传统仅包埋抗原的微胶囊在体内释放快、需要多次免疫的技术问题。
本发明的海藻酸盐微胶囊的缓、控释放抗原主要表现过程为：其内部包埋的载抗原的纳米球随着海藻酸盐微胶囊的降解过程而逐渐暴露于体内，促进抗原呈递细胞对抗原摄取，进而刺激机体产生持久的细胞和体液免疫应答。例如，载抗原纳米颗粒被抗原呈递细胞摄取后，释放到内体、溶酶体的部分抗原能够逃逸到胞质中，模拟内源性抗原，使其循MHCI途径(内源性抗原)呈递抗原，增强Th1型细胞免疫应答；而溶酶体内的抗原则以外源性抗原途径，循MHC II途径(外源性抗原)被加工、提呈，增强体液免疫应答。因此，本发明的携载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊作为单剂疫苗制剂时，能够通过携载抗原的纳米球来调控抗原的释放，同时纳米球也可增强抗原呈递细胞对抗原的摄取，进而诱导持久的体液与细胞免疫应答，并产生强有力的免疫记忆。
另外，采用本发明实施例中海藻酸盐微胶囊在作为口服免疫制剂时，海藻酸盐微囊具有pH敏感释放行为，在胃酸条件下形成致密表面，能够保护抗原免受降解或酶解，当海藻酸盐微胶囊到达肠道后，能够崩解释放出载抗原纳米球，并被肠道免疫细胞有效识别和摄取，纳米球的尺寸和表面电荷效应能够促进其被肠道免疫细胞摄取，并有效诱导免疫细胞活化，增强免疫效应。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加的清晰明确，以下通过具体实施例结合附图对本发明的技术方案做进一步的阐述说明。需要说明的是，下述列举的具体实施例仅是作为举例说明，本发明的保护范围不局限于此。
本发明实施例中包埋率以及载药量测定方法(索氏提取法萃取油相)，具体步骤如下：
a)将冻干后的微胶囊取部分称重得质量m1，并用滤纸将其包好，置入索氏提取器中；
b)用石油醚(沸程30～60℃)萃取油相，回流4h，干燥后称重得萃取油相后微球质量m2；
c)准备一洁净的恒重瓶，记录其质量m3，并同时将富集在烧瓶中的206油佐剂用石油醚溶解转移至恒重瓶恒重后测量其质量m4；
d)比较m1-m2与m4-m3的差值，两者相差不大时结果可用。
实施例
实施例1
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLA(聚乳酸)和30mg的阳离子脂质DDAB(双十二烷基二甲基溴化铵)，将其溶解于15mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为1∶1，量取90mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，具体粒径为133.1nm，PDI为0.127。
取一定量上述制备的纳米球，将其加入至OVA(卵白蛋白)溶液中，其中，OVA的浓度为250μg/mL，纳米球的浓度为10mg/mL，抗原吸附率为95％，抗原携载率为23.75μg/mg。
将上述携载OVA的纳米球悬液分散于1.5％wt％的海藻酸钠溶液中，海藻酸钠溶液与携载OVA的纳米球的质量比为15∶1，将含携载OVA的纳米球悬液的海藻酸钠在气体流量为600L/h、液体流速1.00mL/min下喷射到含1.0M氯化钙的溶液中，固化3h后，离心洗涤并收集携载OVA纳米球的海藻酸钙微胶囊。微胶囊对OVA的包埋率为70％，OVA载量为2.5μg/mg。
实施例2
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)和30mg的阳离子脂质DOTAP(2，3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵)，将其溶解于15mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为2∶3，量取90mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，具体粒径为162.1nm，PDI为0.134。
采用与实施例1中相同的方法制备载OVA纳米球的海藻酸钙微胶囊，唯一不同的是加入的OVA浓度为5mg/mL，所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对OVA的包埋率为47.6％，OVA装载率为1.7μg/mg。
实施例3
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLGA和30mg的阳离子脂质DDAB，将其溶解于20mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为1∶1，量取100mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，其具体粒径为123.1nm，PDI为0.211。
采用与实施例1中相同的方法制备载OVA纳米球的海藻酸钙微胶囊，唯一不同的是加入的OVA浓度为10mg/mL，所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对OVA的包埋率为47.2％，OVA装载率为2.0μg/mg。
实施例4
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLA和30mg的阳离子脂质DOTAP，将其溶解于20mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为2∶3，量取100mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，其具体粒径为142.1nm，PDI为0.117。
采用与实施例1中相同的方法制备载OVA纳米球的海藻酸钙微胶囊，唯一不同的是加入的OVA浓度为15mg/mL，所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对OVA的包埋率为50.2％，OVA装载率为3.2μg/mg。
实施例5
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLA和30mg的阳离子脂质DDAB，将其溶解于20mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为2∶3，量取100mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，其具体粒径为138.6nm，PDI为0.152。
采用与实施例1中相同的方法制备载OVA纳米球的海藻酸钙微胶囊，唯一不同的是加入的OVA浓度为15mg/mL，所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对OVA的包埋率为52.2％，OVA装载率为2.8μg/mg。
实施例6
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLGA和30mg的阳离子脂质DOTAP，将其溶解于20mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为1∶1，量取100mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，其具体粒径为143.7nm，PDI为0.228。
采用与实施例1中相同的方法制备载OVA纳米球的海藻酸钙微胶囊，唯一不同的是加入的OVA浓度为10mg/mL，所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对OVA的包埋率为54.3％，OVA装载率为5.1μg/mg。
实施例7
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLA和30mg的阳离子脂质DOTAP，将其溶解于20mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为2∶3，量取100mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，其具体粒径为137.9nm，PDI为0.164。
采用与实施例1中相同的方法制备载OVA纳米球的海藻酸钙微胶囊，唯一不同的是加入的OVA浓度为15mg/mL，所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对OVA的包埋率为53.7％，OVA装载率为4.2μg/mg。
实施例8
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLA和30mg的阳离子脂质DDAB，将其溶解于20mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为1∶1，量取100mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，其具体粒径为122.8nm，PDI为0.136。
取一定量上述制备的纳米球，将其加入至乙肝表面抗原HBsAg溶液中得到吸附HBsAg的纳米球，其中，HBsAg浓度为5mg/mL，纳米球的浓度为10mg/mL。
将上述携载HBsAg的纳米球悬液分散于1.5％wt％的海藻酸钠溶液中，海藻酸钠溶液与携载HBsAg纳米球的质量比为15∶1，将含携载HBsAg的纳米球悬液的海藻酸钠在气体流量为600L/h、液体流速1.00mL/min下喷射到含1.0M氯化钙的溶液中，固化3h后，离心洗涤并收集携载HBsAg纳米球的海藻酸钙微胶囊(HBsAg-DDAB-PLA纳米球的海藻酸钙微胶囊)。所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对HBsAg的包埋率为48.9％，HBsAg装载率为3.5μg/mg，具体制备流程如图1所示。
图1是本发明实施例8中海藻酸钙微胶囊包埋携载抗原纳米球的制备流程示意图。
图2A-B是本发明实施例8中包埋了HBsAg-DDAB-PLA纳米球的海藻酸钙微胶囊在不同放大倍数下的光学显微镜照片。
如图2A-B所示，海藻酸钙微胶囊中包含了纳米球，纳米球中携载抗原。
实施例9
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLA和30mg的阳离子脂质DDAB，将其溶解于15mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为2∶3，量取90mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，其具体粒径为119.6nm，PDI为0.157。
采用与实施例8中相同的方法制备了载HBsAg纳米球的海藻酸钙微胶囊，唯一不同的是加入的HBsAg浓度为10mg/mL，所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对HBsAg的包埋率为46.7％，HBsAg装载率为4.5μg/mg。
实施例10
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLGA和30mg的阳离子脂质DDAB，将其溶解于20mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为1∶1，量取100mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，其具体粒径为143.6nm，PDI为0.125。
采用与实施例8中相同的方法制备载HBsAg纳米球的海藻酸钙微胶囊，唯一不同的是加入的乙肝表面抗原HBsAg浓度为15mg/mL，所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对HBsAg的包埋率为43.5％，HBsAg装载率为1.6μg/mg。
实施例11
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLGA和30mg的阳离子脂质DDAB，将其溶解于20mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为2∶3，量取100mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，其具体粒径为139.2nm，PDI为0.174。
采用与实施例8中相同的方法制备载HBsAg纳米球的海藻酸钙微胶囊，唯一不同的是加入的乙肝表面抗原HBsAg浓度为20mg/mL，所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对HBsAg的包埋率为42.7％，HBsAg装载率为1.5μg/mg。
实施例12
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLGA和30mg的阳离子脂质DDAB，将其溶解于20mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为1∶3，量取100mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，其具体粒径为142.2nm，PDI为0.129。
采用与实施例8中相同的方法制备载HBsAg纳米球的海藻酸钙微胶囊，唯一不同的是加入的乙肝表面抗原HBsAg浓度为30mg/mL，所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对HBsAg的包埋率为52.7％，HBsAg装载率为3.5μg/mg。
实施例13
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLA和30mg的阳离子脂质DDAB，将其溶解于15mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为1∶1，量取100mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，其具体粒径为141.3nm，PDI为0.144。
采用与实施例1中相同的方法制备载HBsAg纳米球的海藻酸钙微胶囊，唯一不同的是加入的乙肝表面抗原HBsAg浓度为20mg/mL，所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对HBsAg的包埋率为51.2％，HBsAg装载率为2.7μg/mg。
实施例14
采用纳米沉淀技术制备纳米球，分别称取100mg的PLA和30mg的阳离子脂质DDAB，将其溶解于10mL乙醇与丙酮的混合油相中，乙醇与丙酮的体积比为1∶1，量取100mL的去离子水为水相，将油相缓慢倒入水相中，随后置于通风橱中在400-600rpm转速下搅拌固化过夜(12h)，固化的微球采用超纯水在20000g、15min条件下离心洗涤3-5次，即制得粒径在100nm左右的均一聚乳酸纳米球，其具体粒径为128.6nm，PDI为0.201。
采用与实施例1中相同的方法制备载OVA抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊，唯一不同的是加入的OVA抗原浓度为10μg/mL，所得载抗原纳米球的海藻酸钙微胶囊对OVA的包埋率为46.9％，OVA装载率为3.2μg/mg。
实施例15
实施例15中HBsAg-DDAB-PLA-ALG微胶囊的制备方法与实施例8中相同，唯一不同的是携载HBsAg的纳米球悬液的海藻酸钠在气体流量为450L/h。
实施例16
实施例16中HBsAg-DDAB-PLA-ALG微胶囊的制备方法与实施例8中相同，唯一不同的是携载HBsAg的纳米球悬液的海藻酸钠在气体流量为750L/h。
图3A是本发明实施例8、15-16中喷雾干燥器喷枪喷出不同气体流量对海藻酸钙微胶囊的包埋率和粒径的影响。
如图3A所示，海藻酸钙微胶囊的包埋率(EE)和粒径随着气体流量的增大而降低，气体流量的增加，气体在喷嘴处的剪切力也随之增大，有利于形成粒径较小的微胶囊。当气体流量为600L/h和750L/h时，微胶囊粒径小于50μm。但是当气体流量过大时，在剪切成较小粒径微胶囊过程中，会导致HBsAg-DDAB-PLA纳米球泄露，使得包埋率降低。综合考虑微胶囊和抗原的包埋率，选择600L/h的气体流量可以获得较高的包埋率和较小粒径的微胶囊。
实施例17
实施例17中HBsAg-DDAB-PLA-ALG微胶囊的制备方法与实施例8中相同，唯一不同的是携载HBsAg的纳米球悬液的海藻酸钠在喷雾干燥器喷枪的液体流速为2.0mL/min。
实施例18
实施例18中HBsAg-DDAB-PLA-ALG微胶囊的制备方法与实施例8中相同，唯一不同的是携载HBsAg的纳米球悬液的海藻酸钠在喷雾干燥器喷枪的液体流速为3.0mL/min。
实施例19
实施例19中HBsAg-DDAB-PLA-ALG微胶囊的制备方法与实施例8中相同，唯一不同的是携载HBsAg的纳米球悬液的海藻酸钠在喷雾干燥器喷枪的液体流速为4.0mL/min。
图3B是本发明实施例8和实施例17-19中喷雾干燥器喷枪的不同液体流速对海藻酸钙微胶囊的包埋率和粒径的影响。
如图3B所示，液体流速越大，微胶囊的平均粒径和抗原包埋也随之增大。但是，过大的粒径不利于疫苗的注射给药，当微胶囊的粒径大于50μm时，肌肉注射免疫较为困难。当液体流速为1.0-2.0mL/min时，微胶囊粒径在50μm以下，抗原包埋率在50-60％，两者差别不大。因此，后续选用1.0mL/min的液体流速。
实施例20
实施例20中HBsAg-DDAB-PLA-ALG微胶囊的制备方法与实施例8中相同，唯一不同的是海藻酸钠溶液与携载HBsAg抗原纳米球的质量比为10∶1。
实施例21
实施例21中HBsAg-DDAB-PLA-ALG微胶囊的制备方法与实施例8中相同，唯一不同的是海藻酸钠溶液与携载HBsAg抗原纳米球的质量比为20∶1。
实施例22
实施例22中HBsAg-DDAB-PLA-ALG微胶囊的制备方法与实施例8中相同，唯一不同的是海藻酸钠溶液与携载HBsAg抗原的纳米球的质量比为25∶1。
图3C是本发明实施例8和实施例20-22中携载HBsAg抗原的纳米球与海藻酸钠溶液的质量比对海藻酸钙微胶囊的包埋率和装载率的影响。
如图3C所示，当海藻酸钠溶液和携载HBsAg抗原的纳米球的质量比为15∶1及以上时，微胶囊的抗原包埋率均超过了80％，随着海藻酸钠溶液和携载HBsAg抗原的纳米球的质量比的增加，微胶囊的抗原包埋率略有增大，而抗原装载率略有下降。
本发明实施例也对装载HBsAg抗原的PLA海藻酸钙微胶囊在不同pH的环境下释放行为研究，以模拟体内免疫过程。
先采用实施例8中的方法制备了海藻酸钙微胶囊包埋携载抗原(HBsAg抗原)的纳米球，然后配制pH为7.2-7.4的0.1mM PBS溶液2mL，将HBsAg-DDAB-PLA-ALG微胶囊纳米球悬浮在1mL(浓度为5mg/mL)的缓冲液中，将其置于37℃恒温箱中，垂直混合搅拌，防止微胶囊沉淀聚集，间隔一定时间取样，测定微胶囊释放抗原的行为。
图4是本发明实施例8包埋了HBsAg-DDAB-PLA纳米球的海藻酸钙微胶囊在不同pH的抗原释放行为。
如图4所示，在24天后，包埋了HBsAg-DDAB-PLA-ALG微胶囊在pH为7.2-7.4的环境中释放率达到了50％以上，随着时间的推移，抗原最终累积释放率不低于60％。
为了能够直观的考察包埋了载乙肝重组抗原的PLA纳米球的海藻酸钙微胶囊与纯抗原、现有的铝佐剂疫苗在注射部位滞留时间的比较情况，本发明通过活体成像技术检测不同的疫苗制剂组在注射部位的荧光信号强度变化。
本发明对包埋了HBsAg-DDAB-PLA纳米球的海藻酸钙微胶囊、纯抗原(Ag)、铝佐剂疫苗组(NPs-Ag)在不同升温注射部位滞留时间进行了比较。
图5A是本发明实施例8中的海藻酸钙微胶囊与其它不同组抗原在不同时间点注射部位荧光成像图；图5B是本发明实施例8中不同组抗原在注射部位荧光总量随时间变化图；图5C是本发明实施例8中不同组抗原在注射部位荧光总量24小时内的变化图。
如图5A-C所示，纯抗原组(Ag)动物免疫24h后，抗原的荧光强度较弱，48h后已观察不到荧光信号，表明抗原被降解或被转运至次级淋巴器官。铝佐剂疫苗组(NPs-Ag)的荧光强度可持续到96h，到144h后荧光信号也消失；而单剂免疫疫苗制剂组即包埋了携载抗原的纳米球海藻酸钙微胶囊(NPs+NPs/MCs-Ag)有明显的抗原储库效应，抗原在注射部位的停留时间长达312h之久。通过比较总荧光强度可知，携载抗原的纳米球海藻酸钙微胶囊(NPs+NPs/MCs-Ag)具有最强的储库效应，能够引起抗原的持续释放，诱导长期、有效的免疫反应。
本发明还将实施例8制备的海藻酸钙微胶囊与纯抗原、传统的铝佐剂疫苗免疫的血清中IgG抗体效价比较，以探究本发明提供的海藻酸钙微胶囊的免疫效果，具体的实验方案如下：
称取一定量包埋载重组乙肝抗原的PLA微球的海藻酸钙微胶囊(HBsAg-DDAB-PLA纳米球的海藻酸钙微胶囊)悬浮于pH7.4的PBS缓冲液中，用于小鼠免疫。选用BALB/c小鼠，6-8周(体重18～20g)，雌性。取血时间为14、28和42天各免疫一次，二次免疫时间为第28天。上述微胶囊制剂疫苗每只小鼠的免疫剂量为100μL，相应的抗原量为0.2μg。对照组市售铝佐剂疫苗的免疫剂量为100μL，含重组乙肝抗原0.2μg。分别于第21、28和35天收集小鼠血清，用于IgG抗体效价测定，第42天无菌条件下取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，体外培养并收集细胞上清，用于细胞因子水平的测定。
图6是本发明实施例8中的海藻酸钙微胶囊与纯抗原、传统铝佐剂免疫的血清中特异性抗体IgG抗体滴度比较图。
如图6所示，在注射不同类型的疫苗制剂后，经一次免疫后的21、28、35天，免疫结果证实本发明的实施例8中包埋了HBsAg-DDAB-PLA纳米球的海藻酸钙微胶囊(微胶囊组)释放的抗原，相比铝佐剂疫苗和纯抗原，能够显著提升血清中特异性IgG抗体。微胶囊组与传统铝佐剂产生的抗原特异性IgG抗体水平相当，均明显高于纯抗原组的抗体水平，其主要原因可能是包埋HBsAg-DDAB-PLA纳米球的海藻酸钙微胶囊单剂免疫疫苗制剂，经免疫后，在生理条件下微胶囊缓慢降解，游离的抗原和载有抗原的纳米球同时缓慢释放出来，促进抗原被抗原提呈细胞摄取和活化，更有效地激活T细胞和B细胞，发挥免疫功能，其中，载抗原纳米球或抗原被抗原提呈细胞摄取后，一部分抗原循MHC II途径加工提呈，激发体液免疫应答；一部分抗原可分布到胞质中，循MHC I途径加工提呈，增强细胞免疫功能。微胶囊作为单剂免疫疫苗制剂，既能保护抗原天然的构象，增强抗原的免疫原性，使抗原进入机体产生较强的免疫应答反应，同时减慢抗原的释放，延长抗原在体内的代谢时间，持续的促进机体产生免疫应答。
此外，本发明还进一步考察了单剂免疫疫苗制剂、纯抗原、铝佐剂的细胞因子γ-干扰素和颗粒酶B分泌水平。
图7是本发明实施例8中的海藻酸钙微胶囊与纯抗原、传统铝佐剂免疫的小鼠脾细胞中γ-干扰素(IFN-γ)的分泌量比较图。
如图7所示，微胶囊疫苗置及能够促进脾细胞分泌γ-干扰素(IFN-γ)，与三次免疫的纯抗原和传统铝佐剂相比，单次免疫的微胶囊组诱导脾细胞分泌的细胞因子最高，可以显著提高脾细胞分泌Th1型因子，产生更强的细胞免疫。
此外，脾细胞中细胞因子颗粒酶B(Granzyme-B)的分泌水平与CD8T细胞介导的细胞免疫密切相关，各免疫组Granzyme-B的分泌水平如图8所示。
图8是本发明实施例8中的海藻酸钙微胶囊与纯抗原、传统铝佐剂免疫的小鼠脾细胞中颗粒酶B(Granzyme-B)的分泌量比较图。
如图8所示，与三次免疫的纯抗原组和传统铝佐剂相比，单次免疫的微胶囊疫苗置及组能够分泌较高的Granzyme-B，且差异较为显著。可见，微胶囊单剂疫苗制剂组随着海藻酸钙微胶囊囊壁材料的降解，其内部的载抗原纳米球释放出来，能够在体内显著诱导、增强细胞免疫应答，解决了传统仅包埋抗原微胶囊体内释放快、抗原摄取率低及免疫水平不高的问题，尤其细胞免疫反应弱的问题。
采用实施例3中的载OVA/PLGA-DDAB纳米粒的海藻酸钙微囊开展小鼠口服免疫效应评价，共分为6组：生理盐水组(PBS)、OVA组(OVA)、载OVA纳米球组(OVA-NPs)、载OVA海藻酸钙微囊组(OVA-Cas)、载OVA纳米球+空白微囊组(OVA-NPs+Cas)、载OVA-NPs的海藻酸钙微囊组(OVA-NPs/CAs)，每组6只6～8周龄小鼠，对小鼠分别于第0天、14天开展2次口服免疫给药，OVA剂量为100μg/100μL/只。初免后第35天取小肠，制备小肠灌洗液，开展IgA和趋化因子CCL-2监测，并对小肠淋巴细胞染色，分析淋巴细胞增殖水平。
小肠灌洗液的IgA分泌水平结果如图9所示，结果表明，本发明的载OVA纳米球的海藻酸钙微囊口服免疫制剂，能够很好地诱导肠道IgA的分泌，显著高于其他各组；小肠灌洗液中CCL-2的分泌水平结果如图10所示，结果表明，本发明的载OVA纳米球的海藻酸钙微囊口服制剂，能够有效提升CCL-2的分泌水平；肠道免疫细胞增殖水平结果如图11A-B所示，结果表明，本发明的口服免疫制剂能够显著提升肠道免疫细胞的增殖能力，如提升增殖细胞核抗原抗体的增殖能力；进一步对肠道树突状细胞(DC细胞)及其活化水平进行了检测，结果分别如图12A-B和图13A-B所示，结果表明，本发明的口服免疫制剂能够显著促进DC增殖和活化，因此，能够诱导有效的免疫保护水平。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊的制备方法，包括：
制备携载抗原的纳米球；
将所述携载抗原的纳米球与海藻酸钠溶液进行混合，得到混悬液；
利用喷雾干燥器的喷枪将所述混悬液喷入固化剂溶液中，持续搅拌固化，得到携载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述携载抗原的纳米球是通过如下步骤制备得到：
采用纳米沉淀技术制备聚乳酸类阳离子脂质纳米球；
将抗原和所述纳米球相混合，所述抗原通过静电吸附携载至所述纳米球上，得到所述携载抗原的纳米球。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述携载抗原的纳米球与所述海藻酸钠溶液的质量比包括：1∶10～1∶25；
所述海藻酸钠溶液的浓度包括：0.5～3.0wt％；
所述固化剂的浓度包括：0.5～1.5M。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述固化剂包括以下至少一种：CaCl2、FeCl2、MnCl2。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述喷雾干燥器喷枪的气体流量包括450～750L/h；
所述喷雾干燥器喷枪的液体流速包括：1.0～4.0mL/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗原至少包括以下任意一种：
灭活口蹄疫抗原、灭活猪圆环抗原、灭活猪蓝耳抗原、口蹄疫蛋白抗原、猪圆环蛋白抗原、猪蓝耳蛋白抗原、人重组带状疱疹蛋白抗原、人重组乙肝蛋白抗原、人重组乳头瘤蛋白抗原、流感病毒裂解抗原、合成的多肽抗原、DNA疫苗、RNA疫苗。
7.一种缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊，包括：
包埋在海藻酸钙微胶囊中的携载抗原的纳米球，
所述海藻酸钙微胶囊粒径范围包括10～80μm；
所述海藻酸钙微胶囊粒径分散系数范围包括0.005～0.3。
8.根据权利要求7所述的海藻酸盐微胶囊，其中，所述携载抗原的纳米球的包埋率40～90％；
所述抗原的装载率0.45～20μg/mg。
9.根据权利要求7所述的海藻酸盐微胶囊，其中，所述海藻酸钙微胶囊在体外生理环境35天下，所述抗原累积释放率不高于60％。
10.一种权利要求7-9中任一项所述的缓、控释载抗原纳米球的海藻酸盐微胶囊在制备单剂注射疫苗或口服疫苗中的应用，其中，所述单剂注射疫苗或口服疫苗包括冻干粉形式。
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