CN117677632A - 新型嵌合抗原受体和表达该嵌合抗原受体的免疫细胞 - Google Patents

新型嵌合抗原受体和表达该嵌合抗原受体的免疫细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及：一种新型嵌合抗原受体，包括含有死亡结构域的受体的胞内结构域作为胞内信号传导结构域；以及表达该嵌合抗原受体的免疫细胞。在存在正常细胞的环境中，根据本发明的表达嵌合抗原受体的免疫细胞很少或不表现出细胞毒性，并且表现出免疫细胞的细胞死亡，从而确保了正常细胞的稳定性。相反，在存在靶细胞的环境中，免疫细胞表现出比使用单一嵌合抗原受体的传统技术更强的细胞毒性。

Description

新型嵌合抗原受体和表达该嵌合抗原受体的免疫细胞
技术领域
本发明涉及一种新型嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括含有死亡结构域的受体的胞内结构域作为胞内信号传导结构域，还涉及一种表达该嵌合抗原受体的免疫细胞。
背景技术
治疗癌症的方法经历了一个不断发展变化的过程，至今仍在不断利用诸如手术、化疗、放疗等技术。然而，现有的这些治疗癌症的方法存在一个问题，即大多只在癌症未发生转移的早期阶段有效，如果在癌症已经发生转移的阶段进行手术，以后复发的可能性也很大。因此，最近不断有研究开发出利用免疫反应治疗癌症的方法。
其中，人们对利用免疫细胞来强化免疫细胞或对免疫细胞进行基因修饰并将其注射回患者体内的细胞治疗方法越来越感兴趣。例如，研究了诸如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)等技术。特别是嵌合抗原受体，它是一种旨在向T细胞或自然杀伤细胞(NK细胞)递送抗原特异性的人工受体，该受体由可通过与癌细胞特异性抗原结合来激活免疫细胞并提供特异性免疫的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。此外，表达这种嵌合抗原受体的T细胞被命名为CAR-T细胞(Kershaw等人，Nat.Rev.Immunol.，5(12)：928-940(2005)；Restifo等人，Nat.Rev.Immunol.，12(4)：269-281(2012))，自然杀伤细胞被命名为CAR-NK细胞。
嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域主要基于T细胞受体(第一代CAR)的信号传导亚基CD3ζ的胞内信号传导结构域。此外，它还发展为在嵌合抗原受体中加入促进免疫细胞生长和分化的共刺激分子的胞内信号传导结构域。例如，目前可用的CAR-T细胞疗法已分别采用了CD28和4-1BB共刺激分子的胞内信号传导结构域(第二代CAR)，此后又尝试同时采用包含CD28和4-1BB胞内信号传导结构域的CAR(第三代CAR)(Stegen等人，Nat.Rev.DrugDiscov.，14(7)：499-509(2015))。
然而，CAR-T等疗法对癌细胞有效，但在某些情况下会对健康组织造成部分非特异性攻击，从而产生副作用。为了克服这一问题，人们继续开展研究，通过提高癌细胞的抗原识别能力，尽量使攻击正常细胞的副作用最小化。然而，仍然存在一个问题，即一旦注射了CAR-T，即使癌细胞被清除，有毒T细胞仍会继续发挥其功能，从而导致非特异性攻击的副作用，如对正常细胞的细胞毒性。此外，由于癌症复发的原因是癌症中存在的抗原特异性的缺乏，以及抗原的多样性和异质性，因此，为了提高抗癌疗效，防止癌症复发，还需要开发一种“逻辑门控CAR推进”技术，即设计一种多靶点抗原的CAR技术，以提高抗癌疗效，并确保正常细胞的安全性。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种新型嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体在免疫细胞中表达时，可以放大对癌细胞的细胞毒性活性，而不显示对正常细胞的细胞毒性。
此外，本发明的目的是提供一种表达嵌合抗原受体的多核苷酸和表达载体。
此外，本发明的目的是提供一种免疫细胞，该免疫细胞在其表面上表达嵌合抗原受体，对癌症具有优异的治疗效果，同时对正常细胞具有安全性，因此该免疫细胞可作为癌症治疗的有用细胞。
更进一步地，本发明的目的还在于提供一种使用该免疫细胞治疗癌症的药物组合物。
技术方案
为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包括：含有抗原结合位点的胞外结构域(胞外结合结构域)；跨膜结构域；以及胞内信号传导结构域，其包括含有死亡结构域的受体的胞内结构域。
本发明的另一方面提供了含有编码嵌合抗原受体的碱基序列的多核苷酸，以及含有该多核苷酸的表达载体。
本发明的另一方面提供了一种免疫细胞，该免疫细胞在免疫细胞的表面上表达嵌合抗原受体作为第一嵌合抗原受体；并在免疫细胞的表面上表达第二嵌合抗原受体，第二嵌合抗原受体包括：含有抗原结合位点的胞外结构域，该抗原结合位点特异性结合癌细胞中表达的抗原；跨膜结构域；和胞内信号传导结构域。
本发明的另一方面还提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含免疫细胞。
有益效果
本发明的嵌合抗原受体可通过在正常细胞和癌细胞两者中均表达的抗原传递信号，其中，当单独传递信号时，表达该受体的免疫细胞不显示细胞毒性或显示较少的细胞毒性。此外，如果嵌合抗原受体与抗原的结合时间较长，则可诱导免疫细胞凋亡，因此具有对正常细胞而不是癌症细胞不显示细胞毒性的优点，从而确保了稳定性。
同时，当嵌合抗原受体与癌细胞中表达的抗原结合时，通过与另一种能够识别并结合癌细胞特异性抗原的嵌合抗原受体共同作用而发生信号传递，使得嵌合抗原受体具有发挥协同作用的特性，与癌细胞特异性的单一嵌合抗原受体相比，能够表现出更大的细胞毒性，从而可非常有效地用于治疗癌症。
然而，本发明的效果并不局限于上述效果，本领域技术人员可以通过以下描述清楚地了解本发明未提及的其他效果。
附图说明
图1是显示将EGFR作为靶抗原的本发明的嵌合抗原受体的结构示意图，以及显示用于插入编码该嵌合抗原受体的多核苷酸以表达该嵌合抗原受体的载体的结构示意图。
图2显示了通过在表达抗可替宁嵌合抗原受体的自然杀伤细胞(α-Cot-CAR NK92(M2))上表达本发明的嵌合抗原受体而产生的双CAR NK92细胞1的Myc和zsGreen的表达水平的确认结果。在图2中，“M2-EGFR-P75NTR”是表达双嵌合抗原受体的自然杀伤细胞，#1、#2、#3、#5是将表达M2-EGFR-P75NTR双嵌合抗原受体的自然杀伤细胞分离成单个细胞的细胞。
图3a和图3b显示了通过在表达抗EphA2嵌合抗原受体的自然杀伤细胞(α-EphA2-CAR NK92(79-14))上表达本发明的嵌合抗原受体而产生的双CAR NK92细胞2的Myc和zsGreen的表达水平的确认结果。
图4显示了使用双CAR NK92细胞1和α-Cot-CAR NK92(M2)细胞与表达EGFR的乳腺癌细胞AU565共培养后确定的细胞毒性比较，其中A是比较所有细胞的细胞毒性的图，B是比较单个细胞的细胞毒性的图。
图5a和图5b是使用双CAR NK92细胞1和α-Cot-CAR NK92(M2)细胞与表达EGFR的乳腺癌细胞AU565共培养后，测量和比较共培养时间内细胞凋亡发生率的图。
图6显示了使用双CAR NK92细胞1和α-Cot-CAR NK92(M2)细胞将表达EGFR和HER2的乳腺癌细胞AU565与HER2-Cot缀合物共培养后确定的细胞毒性的比较，其中A是比较所有细胞的细胞毒性的图，B是比较单个细胞的细胞毒性的图。
图7显示了使用双CAR NK92细胞2和α-α2-CAR NK92(79-14)细胞与表达EGFR和EphA2两者的乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养后确定的细胞毒性的比较。
图8显示了使用双CAR NK92细胞2和α-α2-CAR NK92(79-14)细胞与表达EGFR和EphA2两者的乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养17小时后，测量和比较细胞凋亡发生率的图。
图9a和图9b分别是显示了本发明的嵌合抗原受体中去除了p75NTR胞内结构域的死亡结构域的嵌合抗原受体(p75NTR DDD)的结构示意图；以及显示了用于插入编码该嵌合抗原受体的多核苷酸以表达该嵌合抗原受体的载体的结构示意图。
图10显示了在表达抗可替宁嵌合抗原受体的自然杀伤细胞(α-Cot-CAR NK92(M2))上，对通过表达嵌合抗原受体(p75NTR DDD)而产生的双CAR NK92细胞的Myc表达水平进行确认的结果，在本发明的嵌合抗原受体中已经从该嵌合抗原受体(p75NTR DDD)中去除了p75NTR的胞内结构域的死亡结构域。
图11显示了使用通过表达嵌合抗原受体(p75NTR DDD)制备的双CARNK92细胞，双CARNK92细胞1和α-Cot-CARNK92(M2)细胞将表达EGFR和HER2两者的乳腺癌细胞AU565与HER2-Cot缀合物共同培养后确定的细胞毒性的比较，该嵌合抗原受体(p75NTR DDD)中p75NTR的胞内结构域的死亡结构域已被去除。
图12A和12B是使用通过表达嵌合抗原受体(p75NTR DDD)制备的双CAR NK92细胞，双CAR NK92细胞1和α-Cot-CAR NK92(M2)细胞与表达EGFR的乳腺癌细胞AU565共同培养后，测量和比较共培养时间内细胞凋亡发生率的图，该嵌合抗原受体(p75NTR DDD)中p75NTR的胞内结构域的死亡结构域已被去除。
图13是示意性显示了表达本发明的嵌合抗原受体的双CAR NK92的工作原理图。
具体实施方式
下面，将对本发明进行详细描述。
1.新型嵌合抗原受体(CAR)，以及表达该嵌合抗原受体的多核苷酸和表达载体
本发明的一方面提供了一种新型嵌合抗原受体，该受体对正常细胞表现出安全性，同时与其他嵌合抗原受体一起放大针对癌细胞的细胞毒性。
在本发明中，术语“嵌合抗原受体(CAR)”是一种合成复合物，当它识别并结合到靶抗原和表达抗原的细胞时，可诱导免疫应答。嵌合抗原受体可包括胞外结构域(胞外结合结构域)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。嵌合抗原受体表达在免疫细胞的表面上，通过胞外结构域中包含的抗原结合位点，识别并结合特异性抗原，如特异性表达在癌细胞表面上的抗原，从而使嵌合抗原受体可以在免疫细胞内传递信号，以改变免疫细胞的活性，从而只针对特异性抗原引起免疫应答。
本发明的嵌合抗原受体包括：含有抗原结合位点的胞外结构域(胞外结合结构域)；跨膜结构域；以及含有死亡结构域的受体的胞内结构域的胞内信号传导结构域。
含有死亡结构域的受体是指作为胞内结构域，具有参与诱导细胞凋亡的活性的氨基酸序列的受体分子。含有死亡结构域的受体包括Fas、TNFRI、p75NTR、DR3、DR4、DR5、DR6、EDAR等，但不限于此。特别地，其中，p75NTR(p75神经营养素受体)是一种与神经细胞分化有关的神经营养素受体，被称为低亲和性神经生长因子受体(LNGFR)。p75NTR由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域组成，本发明采用的是p75NTR的胞内结构域。p75NTR的胞内结构域可以是球样结构域，具体可以是含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质，但不限于此。上述氨基酸序列可包括因氨基酸残基的缺失、插入、取代或组合而具有不同序列的变体，但以不影响含有这些氨基酸序列的蛋白质的结构、功能、活性等为限。此外，氨基酸序列可包括经过本领域已知的常见修饰的氨基酸，其中氨基酸的修饰可包括，例如磷酸化、硫化、丙烯化、糖基化、甲基化、法尼基化等。本发明的p75NTR的胞内结构域不仅包含上述氨基酸序列，还包含与之实质上相同的氨基酸序列或其变体。实质上相同的氨基酸序列可以是指上述氨基酸序列是具有90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.5％或以上同源性的氨基酸序列，但不限于此。
当本发明的嵌合抗原受体在免疫细胞的表面上表达时，靶抗原与受体结合，信号传输仅通过p75NTR的胞内结构域发生，这可能导致免疫细胞的细胞毒性降低和/或促进免疫细胞的凋亡。细胞毒性的降低可能意味着免疫细胞不表现出细胞毒性，或者免疫细胞表现出的细胞毒性低于没有抗原时免疫细胞的细胞毒性，或者与被抗原激活的免疫细胞相比，免疫细胞表现出的细胞毒性较低。与没有抗原的免疫细胞相比，促进免疫细胞的细胞凋亡可能会导致更多的细胞凋亡。仅发生信号传递可能意味着信号传递不通过其他嵌合抗原受体发生，更具体地说，可能意味着信号传递不通过产生促进免疫细胞对癌细胞的细胞毒性的信号的嵌合抗原受体发生，而仅通过本发明的嵌合抗原受体发生。
胞外结构域包含抗原结合位点，可特异性地与所需的靶抗原结合，但不限于其类型。只要胞外结构域具有能够特异性识别和结合生物分子(如细胞表面受体、肿瘤蛋白、脂质、多糖或其他细胞表面靶分子)的结构，就可以应用胞外结构域，而不受任何限制。例如，胞外结构域可以是具有上述特征的蛋白质、多肽或其变体。术语“特异性结合”可指与另一分子的结合亲和力大于背景结合，例如，可指胞外结构域与靶抗原的结合亲和力约为10-5M或更高，或Ka(具有1/M单位的特异性结合相互作用的平衡解离常数)。亲和力可指具有M单位的特异性结合相互作用的平衡解离常数(Ka)为10-5M至10-13M或小于此范围。
抗原结合位点可与癌细胞和正常细胞中都表达的抗原特异性结合。具体来说，在癌细胞和正常细胞中都表达的抗原可能不是癌细胞特异性抗原，也就是说，它可能不是用于预防、治疗、改善或诊断癌症的癌症特异性标志物。因此，本发明的嵌合抗原受体可以识别癌细胞和正常细胞并与之结合，从而在表达嵌合抗原受体的免疫细胞中产生信号传递。例如，抗原结合位点可以特异性地与EGFR结合，但不限于此。
抗原结合位点可以是抗体或其抗原结合片段。更具体地说，抗原结合位点可以是抗体的单链可变片段(scFv)。具体地说，抗原结合位点可以是特异性结合EGFR的抗体的单链可变片段，更具体地说，可以包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
抗体是指通过特异性结合抗原表位而产生免疫反应的免疫球蛋白分子。抗体可以包括单克隆抗体、多克隆抗体、具有全长链结构的抗体(全长抗体)、至少具有抗原结合功能的功能片段(抗原结合片段)以及重组抗体。具体来说，本发明的抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。单克隆抗体是指从实质上相同的抗体群中获得的单一分子组成的抗体分子，这种单克隆抗体对特定表位具有单一的结合特异性和亲和力。全长抗体具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，每条轻链可通过二硫键与重链相连。抗体可包括重链(HC)和轻链(LC)多肽，重链和轻链可包括可变区和恒定区。
恒定区是介导抗体与免疫系统的各种细胞(T细胞等)或含有补体系统成分的宿主组织等结合的位点。无论抗原的类型如何，如果是来自同一物种的同一类型抗体，且形成该抗体的氨基酸序列也相同或具有高度相似性，则恒定区具有相同的功能。恒定区可分为重链恒定区(可缩写为CH)和轻链恒定区(可缩写为CL)。重链恒定区有γ、μ、α、δ和/或ε型，又可细分为γ1、γ2、γ3、γ4、α1和/或α2型。轻链恒定区有κ和λ类型。IgG又分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
可变区是对抗原具有特异性的抗体位点，可分为重链可变区(可缩写为VH)和轻链可变区(可缩写为VL)。可变区可包括三个互补决定区(CDR)和四个框架区(FR)。CDR可以是参与抗原识别的环形位点，对抗原的特异性可根据CDR的氨基酸序列来确定。CDR可依次称为CDR1、CDR2和CDR3。根据CDR属于重链多肽还是轻链多肽，重链可变区可称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链可变区可称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。同样，重链可变区的FR可称为FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4，轻链可变区的FR可称为FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4。
抗原结合片段是指抗体中保留抗体的抗原结合功能的任何片段。抗原结合片段可与“片段”或“抗体片段”等术语互换使用，抗原结合片段可以是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv等，但不限于此。
Fab是一种包括轻链和重链的可变区、轻链的恒定区以及重链的第一恒定区(CH1结构域)的结构，并具有一个抗原结合位点。Fab'与Fab的不同之处在于，它在重链CH1结构域的C端具有含有一个或多个半胱氨酸残基的铰链区。当Fab'铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键时，就会产生F(ab')2。Fv指的是仅包含重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链可变片段通过非共价键连接重链可变区和轻链可变区。单链可变片段(scFv)一般通过肽接头以共价键将重链可变区和轻链可变区连接起来，或者像双链可变片段一样直接在C端将它们连接起来形成二聚体。抗原结合片段可以通过使用蛋白水解酶产生(例如，Fab可以通过木瓜蛋白酶对整个抗体进行限制性消化得到，F(ab')2片段可以通过胃蛋白酶消化得到)，也可以通过基因重组技术产生，但不限于此。
接头可以是肽接头，长度约为10至25个氨基酸。例如，接头可包括亲水性氨基酸，如甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)。例如，接头可包括(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n或(GnS)m(n和m分别为1至10)，还可包括例如(GnS)m(n和m分别为1至10)，但不限于此。
胞外结构域可进一步包括至少一个选自由铰链结构域和间隔结构域组成的组。胞外结构域的抗原结合位点可通过铰链结构域和/或间隔结构域与跨膜结构域相连。
铰链结构域是允许抗原结合位点与表达嵌合抗原受体的免疫细胞表面有物理间隔的部分，以便使细胞/细胞适当接触、抗原/抗原结合位点适当结合以及嵌合抗原受体适当活化，并可以在确定胞外结构域的位置方面发挥重要作用。嵌合抗原受体可在胞外结构域和跨膜结构域之间包含一个或多个铰链结构域。铰链结构域可来自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或修饰的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。修饰的铰链区是指：(a)具有氨基酸修饰达30％(例如，氨基酸取代或缺失高达25％、高达20％、高达15％、高达10％，或高达5％)的天然存在的铰链区；(b)长度至少为10个氨基酸(例如至少12、13、14或15个氨基酸)的天然存在的铰链区的一部分，其氨基酸修饰达高达30％(例如，氨基酸取代或缺失达高达25％、高达20％、高达15％、高达10％，或高达5％)；或(c)含有核心铰链区(长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸，或长度至少为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)的天然铰链区的一部分。在某个实施方式中，天然存在的免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基可被一个或多个其他氨基酸残基(如一个或多个丝氨酸残基)取代。修饰的免疫球蛋白铰链区可替代性地或额外地具有另一个氨基酸残基，例如，野生型免疫球蛋白铰链区的脯氨酸残基被半胱氨酸取代。铰链区可以是源自1型膜蛋白(如CD8、CD4、CD28和CD7)胞外结构域的铰链区，但只要抗原结合位点、跨膜结构域和胞内信号传导结构域可以在细胞膜之间连接，则可以使用任何铰链区而不受任何限制。此外，铰链结构域可以是这些分子的野生型铰链区，也可以经过修饰。
间隔结构域可称为连接结构域，可包括例如源自CD28的铰链结构域和/或源自CD8的铰链结构域。间隔结构域可包括源自CD28的铰链结构域和/或源自CD8的铰链结构域的全部或部分。
铰链结构域和/或间隔结构域可选自由Myc表位、CD8铰链结构域和Fc组成的组中的至少一种，并可具体包括Myc表位和CD8铰链结构域。更具体地说，Myc表位可包括SEQ IDNO：5的氨基酸序列，CD8铰链结构域可包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
跨膜结构域是指结构域的一部分，其作用是连接和融合胞外结构域和胞内信号传导结构域，并将嵌合抗原受体固定在免疫细胞的质膜上。跨膜结构域可来自天然、合成、半合成或重组来源。跨膜结构域可以是选自由T细胞受体(TCR)的α、β或ζ链；CD28；CD3ε；CD45；CD4；CD5；CD8；CD9；CD16；CD22；CD33；CD37；CD64；CD80；CD86；CD134；CD137和CD154所组成的组中的任何一个，但不限于此。
跨膜结构域可通过接头连接到胞外结构域。例如，接头可以是长度为2至10个氨基酸的短寡肽或多肽接头，例如甘氨酸(G)-丝氨酸(S)双肽，但不限于此。
本发明的具体实施方式设计了一种嵌合抗原受体，其中单链可变片段(scFv)和CD28与Myc和铰链结构域连接，其中胞外结构域包含特异性结合EGFR的抗体的单链可变片段，跨膜结构域包含CD28。然后，通过将包含死亡结构域的受体之一p75NTR的胞内结构域与跨膜结构域和胞内信号传导结构域连接，制备出本发明的嵌合抗原受体。
如上所述，本发明的嵌合抗原受体可在通过含有死亡结构域的受体如p75NTR的胞内结构域单独发生信号传递时，诱导免疫细胞的细胞毒性降低和/或免疫细胞的凋亡促进。因此，当正常细胞存在且嵌合抗原受体的抗原结合位点识别并结合来自正常细胞表达的抗原时，可通过信号传递诱导免疫细胞的细胞毒性降低和/或免疫细胞的凋亡促进，从而本发明的嵌合抗原受体可作为对正常细胞不具有细胞毒性且显示稳定性的嵌合抗原受体而有效使用。
本发明的另一方面提供了一种表达嵌合抗原受体的多核苷酸和表达载体。
多核苷酸包括编码嵌合抗原受体的碱基序列。
在本发明中，术语“多核苷酸”全面地包括DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子，而核苷酸作为基本的结构单元，不仅包括天然核苷酸，还包括具有糖或碱基位点修饰的类似物。
编码嵌合抗原受体是指多核苷酸编码的遗传信息能够通过转录和翻译等典型的蛋白质表达过程合成具有本发明的嵌合抗原受体的氨基酸序列的蛋白质。在这种情况下，本发明的范围甚至可以包括不仅编码具有与嵌合抗原受体完全相同的氨基酸序列的蛋白质，而且编码具有与上述蛋白质实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或具有与上述蛋白质相同和/或相似活性的蛋白质的多核苷酸。
具体地说，本发明的多核苷酸可以包括含有死亡结构域的受体的胞内结构域，例如，可以包括编码p75NTR的胞内结构域的碱基序列，更具体地说，可以包括SEQ ID NO：2的碱基序列。
进一步地，本发明的多核苷酸可以包括含有死亡结构域的受体的胞内结构域，并且例如，可以包括编码p75NTR的胞内结构域的碱基序列以及编码跨膜结构域和/或与其相连的胞外结构域的碱基序列。
嵌合抗原受体如含有死亡结构域的受体(如p75NTR)的胞内结构域的胞内信号传导结构域、跨膜结构域和胞外结构域的描述与之前描述的相同。
多核苷酸可包括SEQ ID NO：13的碱基序列。本发明的具体实施方式设计了一种嵌合抗原受体，其中单链可变片段(scFv)和CD28与Myc和铰链结构域相连，含有死亡结构域的受体之一p75NTR的胞内结构域与跨膜结构域和胞内信号传导结构域相连，其中胞外结构域含有特异性结合EGFR的抗体的单链可变片段，跨膜结构域含有CD28。为此，制备了包含SEQID NO：13的碱基序列的多核苷酸来表达嵌合抗原受体。
本发明的多核苷酸可包括与上述碱基序列实质上相同的碱基序列。实质上相同的碱基序列包括例如转录和翻译时可合成相同氨基酸的碱基序列，可以是与上述碱基序列具有90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.5％或以上同源性的碱基序列，但不限于此。
编码嵌合抗原受体的多核苷酸可包括优化的碱基序列，这取决于打算导入和表达该受体的生物体类型，以及生物体的转录和翻译等表达系统。这是由密码子的简并性引起的，因此可能存在可编码表达蛋白的各种核苷酸序列组合，所有这些组合都属于本发明的范围。根据密码子优化对多核苷酸的修饰，可根据本发明的嵌合抗原受体要表达和应用的生物类型来确定。例如，本发明的多核苷酸可以是经过修饰的多核苷酸，以优化选择用于哺乳动物和灵长类动物的密码子，更具体地说，可以经过优化和修饰以适合来自人类的表达和功能。
本发明的表达载体包括上述多核苷酸。
由于该多核苷酸含有编码本发明的嵌合抗原受体的碱基序列，因此包含该多核苷酸的表达载体可用于表达和生产嵌合抗原受体，并可用于将该多核苷酸转移至特定细胞或生物体，从而表达嵌合抗原受体，或可用于保存和储存该多核苷酸。
表达载体可以使用原核细胞或真核细胞作为宿主构建。
例如，在表达载体使用原核细胞作为宿主的情况下，一般包括能够推进转录的强启动子(例如、tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子和T7启动子等)、用于启动翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。在大肠杆菌(如HB101、BL21、DH5α等)作为宿主细胞时，可使用大肠杆菌色氨酸生物合成途径的启动子和操纵子位点(Yanofsky，C,JBacteriol，(1984)158：1018-1024)，以及噬菌体λ的左手启动子(pLλ启动子，Herskowitz，I和Hagen，D,AnnRevGenet，(1980)14：399-445)作为调节位点。在使用芽孢杆菌(Bacillusbacteria)作为宿主细胞时，则可使用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒素蛋白基因的启动子(Appl Environ Microbiol(1998)64：3932-3938；Mol Gen Genet(1996)250：734-741)或任何可在芽孢杆菌中表达的启动子作为调节位点。表达载体可通过工程化在本领域中经常使用的质粒(如pCL、pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列和pUC19等)、噬菌体(如λgt4·λB、λ-Charon、λΔz1和M13等)或病毒(例如SV40等)来生产。
在表达载体使用真核细胞作为宿主的情况下，可使用来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子和人肌酸启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、疫苗病毒75K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒启动子、Epstein-Barr病毒(EBV)启动子和鲁氏肉瘤病毒(RSV)启动子)。表达载体一般可以具有多腺苷酸化序列作为转录终止序列。表达载体可具有CMV启动子。
此外，表达载体可与其他序列融合，以促进纯化其中表达的抗体。需要融合的序列包括，例如，谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(NEB，美国)、FLAG(IBI，美国)、6xHis(己糖苷；Quiagen，美国)等。此外，由于本发明的表达载体表达的蛋白是人源化抗体或其抗原结合片段，考虑到其特性，表达的蛋白可以很容易地通过蛋白A柱等纯化，而不需要额外的纯化序列。
表达载体可以含有本领域常用的抗生素抗性基因作为选择标记，例如可以含有氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、基因素、新霉素和四环素的抗性基因。
2.表达双嵌合抗原受体(双CAR)的免疫细胞
本发明的另一方面提供了一种免疫细胞，该免疫细胞对癌细胞表现出增强的细胞毒性，同时对正常细胞不表现出细胞毒性。
免疫细胞在免疫细胞的表面上表达上述本发明的嵌合抗原受体作为第一嵌合抗原受体；并在免疫细胞的表面上表达第二嵌合抗原受体，第二嵌合抗原受体包括含有特异性结合癌细胞中表达的抗原的抗原结合位点的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
第一嵌合抗原受体与上述“1.新型嵌合抗原受体(CAR)，以及表达该嵌合抗原受体 的多核苷酸和表达载体”中所述的嵌合抗原受体相同。具体来说，第一嵌合抗原受体可以包括抗原结合位点，其能够特异性地与正常细胞和癌细胞中都表达的抗原结合，并且第一嵌合抗原受体结合的抗原可以不同于第二嵌合抗原受体结合的抗原。
第二嵌合抗原受体可描述如下。
第二嵌合抗原受体在本领域中通常用于靶向癌症并激活免疫细胞以诱导免疫应答，因此可以使用任何可作为癌症治疗的第二嵌合抗原受体，而不考虑其类型。
具体地说，第二嵌合抗原受体的胞外结构域包含抗原结合位点，其能与癌细胞中表达的抗原特异性结合。具体来说，抗原可以是癌细胞特异性抗原，可以是用于预防、治疗、改善或诊断癌症的癌症特异性标志物。换句话说，癌细胞特异性抗原可能是一种抗原，据统计在癌细胞中的表达频率明显高于正常细胞，因此，第二嵌合抗原受体可以特异性地识别癌细胞而不是正常细胞并与之结合。
第二嵌合抗原受体的抗原结合位点只要能特异性地与癌细胞特异性抗原结合，就可以不受限制地应用，可以特异性地与例如HER2、EphA2、ErbB3、IL-13Rα2、DLK1、B7H3、PD-L1、GPC3、CEACAM6、CD5等结合。
第二嵌合抗原受体的胞外结构域与“1.新型嵌合抗原受体(CAR)，以及表达该嵌合 抗原受体的多核苷酸和表达载体”中描述的第一嵌合抗原受体的胞外结构域相同，只是描述了抗原结合位点特异性结合的抗原类型。例如，第二嵌合抗原受体的抗原结合位点可以是抗体的单链可变片段。
第二嵌合抗原受体的跨膜结构域的描述也与“1.新型嵌合抗原受体(CAR)，以及表 达该受体的多核苷酸和表达载体”中第一嵌合抗原受体的跨膜结构域的描述相同。
第二嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域负责将嵌合抗原受体与抗原结合产生的信号传递到免疫细胞内部，从而触发免疫细胞的功能(例如激活，包括针对第二嵌合抗原受体和抗原结合的靶细胞释放细胞毒性因子、产生细胞因子、增殖和细胞毒性活性，或由抗原结合诱导的其他细胞反应)。胞内信号传导结构域可以是传递功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质的一部分。
第二嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域可以是之前开发嵌合抗原受体时使用的胞内信号传导结构域。具体来说，它可以只包括第一代CAR(嵌合抗原受体)中使用的CD3ζ。此外，在第二代CAR中使用的CD3ζ可包括共刺激结构域(CD28或CD137/4-1BB)和CD3ζ的结合形式，以改善对免疫细胞的响应性。此外，它还可包括两个或更多个共刺激结构域，如第三代CAR所用，其中共刺激结构域可与4-1BB、CD28或OX40等结合，以实现含CAR的免疫细胞在体内的扩增和持久性。此外，如在第四代CAR中使用的，胞内信号传导结构域可使包括编码细胞因子的额外基因的细胞因子如IL-12或IL-15的CAR基免疫蛋白额外表达，如在第五代CAR中使用的，可额外包括白细胞介素受体链，例如IL-2Rβ，以强化免疫细胞。
更具体地说，胞内信号传导结构域对免疫细胞的激活可由两类不同的胞内信号传导结构域介导。例如，免疫细胞的激活可由共刺激信号传导结构域介导，该信号传导结构域以抗原独立的方式起作用，提供启动抗原依赖性初级激活的初级信号传导结构域，以及次级信号。相应地，胞内信号传导结构域可包括初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。
初级信号传导结构域是指以刺激或抑制方式调节免疫细胞活化的信号传导结构域。以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可包含称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。含有初级信号传导结构域的ITAM可包括但不限于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d等。更具体地说，初级信号传导结构域可以是CD3ζ(ζ)，但不限于此。
共刺激信号传导结构域是指共刺激分子的胞内信号传导结构域。共刺激信号传导结构域可包括选自由与CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、LFA-1(CD11a/CD18)、GITR、MyD88、DAP10、DAP12、PD-1、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83等特异性结合的配体组成的组中的共刺激信号传导结构域，但不限于此。具体来说，共刺激分子可以是DAP10，但不限于此。
根据本发明的一实施方式，第二嵌合抗原受体可以通过使用DAP10和CD3ζ作为胞内信号传导结构域，使自然杀伤细胞表现出高活性杀伤癌细胞的效果。
第二嵌合抗原受体可以包括两个或更多个胞内信号传导结构域。在包括两个或更多个胞内信号传导结构域的情况下，胞内信号传导结构域可以相互串联。或者，可以通过由2至10个氨基酸组成的多肽接头连接，接头序列可以是例如甘氨酸-丝氨酸连续序列。该接头可包括例如(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n或(GnS)m(n、m分别为1至10)，例如(GnS)m(n、m分别为1至10)，但不限于此。
第二嵌合抗原受体可进一步包含免疫细胞的免疫功能促进因子。例如，免疫细胞的免疫功能促进因子可以是白细胞介素信号序列。白细胞介素信号序列的特征可以是诱导白细胞介素(IL)-12、IL-8、IL-2等的表达，但不限于此。另外，在免疫细胞是T细胞的情况下，免疫功能促进因子可以是IL-7、CCL19等，但不限于此。
免疫细胞只要是能够诱导免疫并引起所希望的治疗效果的细胞，就可以不加任何限制地使用，例如，可以是选自由自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、巨噬细胞和树突状细胞组成的组中的任意一种，但不限于此。因此，在细胞表面上表达根据本发明的第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体的免疫细胞可以包括CAR-NK细胞(嵌合抗原受体自然杀伤细胞)、CAR-T细胞(嵌合抗原受体T细胞)、CAR-NKT细胞(嵌合抗原受体自然杀伤T细胞)、CAR-巨噬细胞(嵌合抗原受体巨噬细胞)等。
T细胞可以是(但不限于)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、从外周血单核细胞(PBMC)分离的T细胞等。
CAR-NK细胞是指将嵌合抗原受体引入自然杀伤细胞的细胞。CAR-NK细胞的优点是通过能够靶向各种癌细胞进行通用治疗，并通过开关反应解决当使用现有的基于T细胞的CAR-T治疗时癌症免疫疗法的持续毒性问题、自身免疫性疾病的风险、异种细胞移植中的移植物抗宿主疾病(GVHD)问题、脱靶毒性问题等。
本发明的免疫细胞可以在免疫细胞的表面上表达第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体，第二嵌合抗原受体含有特异性结合癌细胞特异性抗原的抗原结合位点，其中第一嵌合抗原受体包括作为胞内信号传导结构域的含有死亡结构域的受体(如p75NTR)的胞内结构域，以及特异性结合正常细胞和癌细胞中均表达的抗原的抗原结合位点。在这种情况下，如果只有正常细胞存在，双嵌合抗原受体中只有第一嵌合抗原受体能识别正常细胞表面的抗原并与之结合，因此，如上所述，可以降低免疫细胞的细胞毒性或促进免疫细胞的凋亡，从而不能对正常细胞产生免疫应答。另一方面，在癌细胞存在的情况下，可被第一嵌合抗原受体识别的抗原和可被第二嵌合抗原受体识别的抗原都可在癌细胞表面表达，从而在两个嵌合抗原受体中都发生信号传递。如果信号传递同时发生在第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体中，与仅通过第二嵌合抗原受体的信号传递激活免疫细胞相比，免疫细胞的细胞毒性可进一步增强。因此，与现有嵌合抗原受体对癌细胞的细胞毒性相比，本发明的免疫细胞可以表现出对正常细胞的稳定性，并表现出更强的细胞毒性，从而提高攻击和治疗癌细胞的功效。
在本发明的一具体实施方式中，通过使用全部表达能够与正常细胞和癌细胞中均表达的EGFR特异性结合的第一嵌合抗原受体和能够与癌细胞中特异性表达的HER2或EphA2特异性结合的第二嵌合抗原受体的自然杀伤细胞，确认对表达EGFR和HER2的乳腺癌细胞或表达EGFR和EphA2的乳腺癌细胞的细胞毒性的结果，可以确认与仅表达第二嵌合抗原受体的自然杀伤细胞相比，双重表达第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体的自然杀伤细胞的细胞毒性更高。因此，可以确认本发明的免疫细胞对治疗癌症非常有用。
同时，本发明的免疫细胞可以在其表面上表达多个额外的嵌合抗原受体，例如，除了上述的第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体之外，还可以表达第三、第四、第五嵌合抗原受体等。多个额外的嵌合抗原受体可以特异性地结合与第一嵌合抗原受体或第二嵌合抗原受体完全不同类型的抗原，多个嵌合抗原受体也可以分别特异性地结合不同类型的抗原。如果上述多个额外的嵌合抗原受体在免疫细胞表面上表达，则本发明的免疫细胞就可以同时靶向多个抗原。最终，本发明的免疫细胞可以通过同时表达第二、第三、第四嵌合抗原受体等以及作为胞内信号传导结构域含有死亡结构域的受体(如p75NTR)的胞内结构域的第一嵌合抗原受体一起，改善由第二、第三、第四嵌合抗原受体等引起的免疫细胞对含有第二、第三、第四嵌合抗原受体等特异性抗原的靶细胞的细胞毒性，从而能够进一步扩大本发明的免疫细胞能够表现出细胞毒性的靶细胞的范围。
3.本发明的免疫细胞在治疗癌症中的用途
本发明的另一方面提供了一种治疗癌症的药物组合物，其含有免疫细胞。
由于本发明的免疫细胞、其表达的嵌合抗原受体等与“1.新型嵌合抗原受体(CAR) 以及表达该受体的多核苷酸和表达载体”和“2.表达双嵌合抗原受体(双CAR)的免疫细胞”中所述的相同，为避免重复描述，省略其描述。
在本发明中，术语“癌症”和“肿瘤”的含义相同，通常是指或意指哺乳动物的一种生理状况，其特征是细胞生长/增殖不受调控。
可以用本发明的组合物治疗的癌症或癌肿并没有特别的限制，包括全部实体癌和血液癌。例如，上述癌可以是选自由肺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、肝癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、血癌、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、恶性淋巴瘤、胸腺癌、骨肉瘤、纤维瘤和脑癌组成的组中的至少一种，但不限于此。任何含有可被第二嵌合抗原受体识别的抗原的癌细胞都可应用于本发明，而不受限制。
在本发明中，术语“治疗”是指抑制癌症的发展，减轻或消除症状。
与待治疗受试者的肿瘤细胞数量相比，药物组合物可含有1至10倍、2至10倍或5至8倍的免疫细胞数量，但不限于此。
除了药物组合物，本发明的组合物还可以是准药物组合物、保健食品组合物等形式。
用于治疗癌症的本发明的组合物可进一步包含其药学上可接受的载体。所谓“药学上可接受的”，是指要应用(处方)的受试者在不抑制活性成分活性的情况下，不具有超出依从性的毒性，而“载体”则是指易于添加到细胞或组织中的化合物。
本发明的药物组合物可以单独给药，也可以与任何方便的载体等混合给药，给药的制剂可以是单一剂型，也可以是重复剂型。药物组合物可以是固体制剂或液体制剂。固体制剂包括但不限于粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、栓剂等。固体制剂可包含但不限于载体、调味剂、粘合剂、防腐剂、崩解剂、润滑剂、填充剂等。液体制剂包括但不限于水和丙二醇溶液、悬浮液和乳液等溶液，可通过添加适当的着色剂、调味剂、稳定剂、粘稠剂等制成。例如，粉剂可通过简单地将多不饱和脂肪酸的三羟基衍生物(本发明的活性成分)与合适的药学上可接受的载体如乳糖、淀粉或微晶纤维素混合来制备。颗粒剂可通过将本发明的多不饱和脂肪酸的三羟基衍生物、药学上可接受的载体和合适的药学上可接受的粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基纤维素)混合，然后使用水、乙醇或异丙醇等溶剂进行湿法制粒，或使用压缩力进行干法制粒来制备。此外，还可以将颗粒剂与合适的药学上可接受的润滑剂(如硬脂酸镁)混合，然后使用压片机将混合物压制成片剂。
药物组合物可以口服制剂、注射制剂(如肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、输液、皮下注射、植入)、吸入制剂、鼻腔给药制剂、阴道给药制剂、直肠给药制剂、舌下给药制剂、透皮制剂、局部给药制剂等形式给药，具体取决于要治疗的疾病和受试者的状况，但不限于此。根据给药途径，可将其配制成适当的剂量单位形式，其中包含常用的、无毒的、药学上可接受的载体、赋形剂和载体。
药物组合物的日给药量可为约0.0001mg/kg至约10g/kg，日给药量可为约0.001mg/kg至约1g/kg。然而，用量可根据混合物的纯化程度、患者的状况(年龄、性别、体重等)以及所治疗疾病的严重程度而变化。必要时，为方便起见，每日总用量可在一天内分几次服用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
然而，以下实施例旨在具体说明本发明，本发明不受以下实施例的限制。
[实施例1]
设计包括含有死亡结构域的受体的胞内结构域的嵌合抗原受体
嵌合抗原受体(CAR)可包括胞外结构域(胞外区)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(胞内区)。本发明的嵌合抗原受体被设计为将含有死亡结构域的受体之一p75NTR的胞内结构域作为胞内信号传导结构域。
胞外结构域包含抗原结合位点，本发明的嵌合抗原受体的制备不受抗原类型或抗原结合位点类型的限制。本实施例采用了能特异性结合EGFR的抗体的单链可变片段(scFv)。它的构造是：使用CD28作为跨膜结构域，EGFR的scFv和CD28与Myc和铰链结构域相连，p75NTR的胞内结构域与跨膜结构域相连，从而将含有编码受体的SEQ ID NO：13的碱基序列的基因构建体插入pLVX-EF1a-IRES-zsGREEN载体(图1)。
[实施例2]
在免疫细胞表面上表达双嵌合抗原受体(双CAR)的免疫细胞的制备
[2-1]共表达含有α-Cot-CAR和p75NTR的胞内结构域的CAR的免疫细胞的制备
制备了一种能够在其表面上表达实施例1所设计的本发明的嵌合抗原受体的免疫细胞。在这种情况下，将实施例1所设计的载体导入表达抗可替宁嵌合抗原受体的自然杀伤细胞(NK细胞)-α-Cot-CAR NK92细胞(M2)中，从而制备出能够表达两种嵌合抗原受体的自然杀伤细胞-双CAR NK92细胞1。
α-Cot-CAR NK92细胞是根据韩国专利第2,122,546号所述方法生产和/或获得的自然杀伤细胞，具有在其表面上表达嵌合抗原受体的特性，嵌合抗原受体含有能特异性结合可替宁的scFv作为胞外结构域。具体来说，通过自动高速流式细胞仪(FacsAria fusion)将α-Cot-CAR NK92细胞分离成单细胞(M2)，利用慢病毒将实施例1设计的编码本发明的嵌合抗原受体的载体导入α-Cot-CAR NK92细胞。因此，在成功导入载体的自然杀伤细胞中，不仅可以在细胞表面表达先前表达的抗可替宁嵌合抗原受体，还可以表达含有p75NTR的胞内结构域的本发明嵌合抗原受体。
在引入编码本发明的嵌合抗原受体的载体后，鉴定了自然杀伤细胞系是否表达嵌合抗原受体。具体来说，为了检测嵌合抗原受体中含有的标记蛋白Myc，使用荧光Myc抗体对细胞系进行染色，并通过流式细胞术确认细胞表面的表达。此外，通过流式细胞术测量插入载体表达的zsGreen的荧光，也可确认EGFR-p75NTR的表达，结果表明这两种嵌合抗原受体成功表达(图2)。
[2-2]共表达含有α-EphA2-CAR和p75NTR的胞内结构域的CAR的免疫细胞的制备
此外，制备了能够在免疫细胞表面表达实施例1设计的本发明的嵌合抗原受体的其他免疫细胞。
首先，用含有抗EphA2单链可变片段(scFv)作为抗原结合位点的胞外结构域来设计要引入到自然杀伤细胞中的嵌合抗原受体(CAR)。具体来说，本发明的嵌合抗原受体被设计为具有嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域，这被归类为所谓的第三代CAR，其将含有scFv作为抗原结合位点的胞外结构域与Myc和以CD28为跨膜结构域的铰链结构域相连接，并在跨膜结构域上添加CD3-zeta作为胞内信号传导结构域和CD28 DAP10作为协同刺激分子(图3a)。然后，将编码嵌合抗原受体的基因构建体的碱基序列插入慢病毒载体，并与病毒包装载体(pMDLG/RRE、pRSV/REV、VSVG)一起转化到HEK293T细胞中。从中获得表达EphA2-CAR1的慢病毒，用超高速离心机浓缩，然后用旋接法(360g，90min，RT)感染自然杀伤细胞，使感染复数(MOI)达到30。按上述方法感染的自然杀伤细胞在5％的CO2条件下于37℃下培养5小时，然后更换为新鲜的培养基，3天后用3μg/ml浓度的嘌呤霉素处理，以选择适当感染的自然杀伤细胞。进行连续培养。未感染的自然杀伤细胞作为对照组，也用嘌呤霉素处理，使用嘌呤霉素处理过的培养基，连续进行培养，直到对照组的所有自然杀伤细胞都被嘌呤霉素杀死。当对照组的自然杀伤细胞全部死亡后，选择受感染的自然杀伤细胞进行实验。通过自动高速流式细胞仪(79-14)将如上所述选择的α-EphA2-CAR NK92细胞分离成单细胞后，按照与实施例[2-1]相同的方法导入实施例1设计的载体，制备出在细胞表面上既能表达先前表达的抗EphA2嵌合抗原受体又能表达本发明的含有p75NTR的胞内结构域的嵌合抗原受体的自然杀伤细胞-双CAR NK92细胞2。
作为确认在上述通过与实施例[2-1]相同的方法制备的双CAR NK92细胞2中是否表达嵌合抗原受体的结果，可以确定成功表达了两种类型的嵌合抗原受体(图3b)。
[实施例3]
当只有在癌细胞和正常细胞都表达的抗原存在时，自然杀伤细胞中p75NTR信号功 能的确认
实施例[2-1]制备的自然杀伤细胞具有这样的特征：在其表面上表达含有作为信号传导结构域的p75NTR的胞内结构域的嵌合抗原受体(第一CAR)和含有能特异性结合可替宁的抗原结合位点的嵌合抗原受体(第二CAR)。在这种情况下，第一CAR含有抗体的单链可变片段(scFv)，可识别并结合正常细胞和癌细胞中都表达的EGFR，因此表面表达EGFR的正常细胞或癌细胞可在自然杀伤细胞内进行信号传递。
因此，为了确定自然杀伤细胞在仅激活含有p75NTR的胞内结构域的本发明的嵌合抗原受体(第二CAR)情况下的活性，使用了表面表达EGFR的乳腺癌细胞AU565作为靶细胞，在不添加AU565和可替宁缀合物以防止第二CAR的信号传递的条件下用钙黄绿素染色，并与实施例[2-1]的自然杀伤细胞(双CAR NK92)或α-Cot-CAR NK92细胞(M2)按1：3(靶细胞：自然杀伤细胞)的比例共培养4小时。自然杀伤细胞的细胞毒性通过共培养4小时后上清液中分泌的钙蓝蛋白量来确认。结果，α-Cot-CAR NK92细胞(M2)未能与EGFR结合，并且由于缺少钙黄绿素缀合物而没有产生信号传递，从而也没有显示出自然杀伤细胞的细胞毒活性。同样，实施例[2-1]的表达含有p75NTR的胞内结构域的嵌合抗原受体的自然杀伤细胞(双CARNK92)也没有显示出自然杀伤细胞的细胞毒活性(图4)。
此外，将自然杀伤细胞与AU565细胞进行培养后，分别在6小时和24小时后确认自然杀伤细胞的凋亡程度。将AU565细胞与实施例[2-1]的自然杀伤细胞(双CAR NK92)或M2细胞分别以1:0.2的比例(靶细胞：自然杀伤细胞)共培养6或24小时后，对细胞凋亡进行测定。在对每种细胞进行共培养后，用膜联蛋白V和7AAD对细胞进行染色，然后通过流式细胞术确认细胞凋亡的程度。在这种情况下，用表达CD56-FITC荧光的抗体对M2细胞进行染色，并用自身表达的zsGreen将实施例[2-1]的自然杀伤细胞与靶细胞AU565区分开来，从而只对自然杀伤细胞进行分区，以确认细胞凋亡的程度。结果，当实施例[2-1]的自然杀伤细胞(双CAR NK92)长时间暴露于表达EGFR的AU565细胞时，证实与α-Cot-CAR NK92细胞(M2)相比，自然杀伤细胞的凋亡程度增加(图5)。
考虑上述结果，当含有p75NTR的胞内结构域的嵌合抗原受体在自然杀伤细胞表面表达，且信号传递仅由嵌合抗原受体单独激活时，可以确认自然杀伤细胞的细胞毒活性未被观察到，相反，当长期暴露于抗原时，自然杀伤细胞的凋亡被诱导，从而使自然杀伤细胞无法正常发挥作用。由于本发明的含有p75NTR的胞内结构域的嵌合抗原受体被设计可识别并结合在癌细胞和正常细胞中都表达的抗原，因此，如果只有正常细胞存在，自然杀伤细胞不会对正常细胞产生毒性并诱导细胞凋亡。因此，可以确认在其表面表达本发明的嵌合抗原受体的自然杀伤细胞具有不攻击正常细胞的特性。
[实施例4]
表达双CAR的自然杀伤细胞在癌细胞特异性抗原存在下的细胞毒性的验证
除了从实施例3中验证，当含有p75NTR的胞内结构域的嵌合抗原受体发生单信号传递时，自然杀伤细胞的细胞毒性降低，细胞凋亡增加外，还考察了由于癌细胞特异性抗原的存在，自然杀伤细胞的双CAR全部发生信号传递时，自然杀伤细胞的活性如何变化。
具体来说，以同时表达EGFR和HER2两者的乳腺癌细胞AU565细胞为靶细胞，分别共培养α-Cot-CAR NK92细胞(M2)和实施例[2-1]的自然杀伤细胞(双CAR NK92)。在这种情况下，HER2-可替宁(HER2-cot)缀合物一起用于识别从AU565细胞表达的HER2，使其能够被α-Cot-CAR NK92细胞(M2)和实施例[2-1]中的自然杀伤细胞(双CAR NK92)表面表达的嵌合抗原受体识别并结合(见韩国专利第2,122,546号)。
自然杀伤细胞与AU565细胞共培养的细胞毒性是用与实施例3相同的方法证实的。
结果可以证实，与仅表达抗可替宁嵌合抗原受体的α-Cot-CAR NK92细胞(M2)的细胞毒性相比，实施例[2-1]的自然杀伤细胞(双CAR NK92)在HER2-可替宁缀合物存在下的细胞毒性显著增加。每个单细胞确认的结果也显示，与α-Cot-CAR NK92细胞(M2)相比，所有双CAR NK92细胞的细胞毒性更高(图6)。
表达抗可替宁嵌合抗原受体的自然杀伤细胞通过HER2-可替宁缀合物识别癌细胞表面的HER2，从而通过信号传递产生细胞毒性，提高攻击癌细胞的活性。不过，从上述实验结果可以看出，如果含有p75NTR的胞内结构域的嵌合抗原受体被双重表达，使癌细胞表面的EGFR产生信号传递，自然杀伤细胞的细胞毒性就会进一步提高。
[实施例5]
双CAR表达的自然杀伤细胞的细胞毒性的进一步验证
再次验证了当仅使用实施例3中鉴定出的含有p75NTR的胞内结构域的嵌合抗原受体单独进行信号传递时，自然杀伤细胞本身的凋亡率会提高，以及当从实施例4鉴定的癌症特异性抗原一起存在以在两种CAR中产生信号传递时，通过使用具有不同类型胞外结构域的表达CAR的自然杀伤细胞(α-EphA2-CARNK92细胞)，而不是使用表达α-Cot-CAR的自然杀伤细胞，自然杀伤细胞的细胞毒性得到改善。
具体地说，i)NK92细胞，ii)通过将实施例1设计的编码本发明的嵌合抗原受体的载体以与实施例[2-1]相同的方法导入NK92细胞而产生的EGFR-p75NTR NK92细胞，iii)通过实施例[2-2]产生的α-EphA2-CAR NK92细胞(79-14)和iv)实施例[2-2]制备的双CAR NK92细胞2(79-14-75)，分别以同时表达EGFR和EphA2的乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞作为靶细胞的方式进行共培养，并用与实施例3相同的方法检测各自然杀伤细胞的细胞毒性。结果确定了，通过比较i)NK92细胞和ii)EGFR-p75NTR NK92细胞的细胞活性，发现在仅使用含有p75NTR的胞内结构域的嵌合抗原受体单独进行信号传递的情况下，i)NK92细胞和ii)EGFR-p75NTRNK92细胞的细胞毒性没有增加，与只表达抗EphA2嵌合抗原受体的iii)α-Epha2-CAR NK92细胞(79-14)相比，iv)双CAR NK92细胞2(79-14-75)的细胞毒性改善更多(图7)。
另外，如实施例3一样，用MDA-MB-231细胞培养上述自然杀伤细胞，并在17小时后检测其凋亡情况。结果确定了，i)与靶细胞共培养后的NK92细胞与共培养前相比，凋亡率没有增加，但ii)EGFR-p75NTR NK92细胞与靶细胞共培养后，凋亡率增加(图8)。
上述结果与α-Cot-CAR NK92细胞的双CAR NK92细胞1的结果相同。从这些结果可以看出，使用含有p75NTR的胞内结构域作为信号传导结构域的本发明的嵌合抗原受体的双CAR甚至对可替宁以外的抗原也具有相同的功效。
[实施例6]
P75NTR的胞内结构域的死亡结构域对细胞凋亡作用的确认
P75NTR的胞内结构域含有死亡结构域，已知该结构域参与细胞凋亡。通过本发明的实施例3和5证实，仅通过p75NTR的信号传递就能增加细胞凋亡。本发明还研究了这种效应是否实际上是由p75NTR的胞内结构域中存在的死亡结构域产生的。
具体来说，为了确定死亡结构域的功能，设计了一种嵌合抗原受体(p75NTR DDD)，即从实施例1设计的嵌合抗原受体中去除p75NTR的胞内结构域的死亡结构域，并将编码它的基因构建体插入pBlueScript SK(-)载体中(图9)。除此之外，还将编码实施例1所设计的嵌合抗原受体的基因构建体插入pBlueScript SK(-)载体中，并通过体外转录从这两种载体中分别制备出EGFR-p75NTR CAR和EGFR-p75NTR DDD的mRNA。将按上述方法制备的mRNA转化到α-Cot-CAR NK92细胞(M2)中，然后在17小时后，用与实施例2相同的方法检测标记蛋白Myc，确认引入的嵌合抗原受体的表达。结果证实，去除了p75NTR和死亡结构域的两种嵌合抗原受体表达成功(图10)。
按照与实施例4相同的方法，使用表达上述各嵌合抗原受体的双CAR NK92细胞，以1:1、1:0.5和1:0.25(靶细胞：自然杀伤细胞)的比例共培养靶细胞、AU565细胞和各双CARNK92细胞，鉴定细胞毒性。结果，无论是否去除死亡结构域，双CAR NK92细胞都比α-Cot-CARNK92细胞显示出更高的细胞毒性。如果只激活含有p75NTR的胞内结构域的嵌合抗原受体，而不添加HER2-可替宁(HER2-cot)缀合物，则可以证实无论是否去除死亡结构域，细胞毒性都不会增加(图11)。可见，这与实施例3至5的结果相同。
同时，由于已知死亡结构域会影响细胞凋亡，因此在双CAR NK92细胞与靶细胞AU565共培养24小时后，确定了双CAR NK92细胞的凋亡程度。在不添加HER2-可替宁(HER2-cot)缀合物以便只传递p75NTR的胞内信号的情况下，按照与实施例3相同的方法，以0.5:1的比例共培养双CAR NK92细胞和靶细胞，从而确定细胞凋亡的程度。结果发现，虽然未与AU565共同培养的各双CAR NK92细胞的凋亡程度相似，但与AU565共同培养时，表达含有p75NTR的胞内结构域的嵌合抗原受体的双CAR NK92细胞与缺乏p75NTR的胞内结构域的α-Cot-CAR NK92细胞相比，凋亡程度增加。此外，发现表达去除了含有死亡结构域的嵌合抗原受体的双CAR NK92细胞的凋亡程度也降低(图12)。从上述结果可以看出，当胞内信号传导仅由p75NTR激活时就会诱导细胞凋亡，而这种凋亡的诱导是由存在于p75NTR的胞内结构域中的死亡结构域引起的。
因此，可以确认，本发明的嵌合抗原受体包括含有死亡结构域的受体(如p75NTR)的胞内结构域作为胞内信号传导结构域，对正常细胞没有细胞毒性或细胞毒性很小，并能诱导自然杀伤细胞凋亡，因此嵌合抗原受体既能确保正常细胞的稳定性，又能对癌细胞表现出比使用单一嵌合抗原受体的现有技术更强的细胞毒性。因此，嵌合抗原受体和自然杀伤细胞被证实可有效地用于癌症治疗，且具有优异的疗效。
如上所述，仅通过说明书实施例对本发明进行了详细描述，但对于本领域技术人员而言，在本发明的技术范围内显然可以进行各种改变和修改，这种改变和修改也自然落入所附权利要求书的范围内。

Claims (16)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，包括：
含有抗原结合位点的胞外结构域(胞外结合结构域)；
跨膜结构域；和
胞内信号传导结构域，包括含有死亡结构域的受体的胞内结构域。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述含有死亡结构域的受体是选自由Fas、TNFRI、p75NTR、DR3、DR4、DR5、EDAR和DR6组成的组中的任一种。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗原结合位点与癌细胞和正常细胞两者中都表达的抗原特异性结合。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗原结合位点与EGFR特异性结合。
5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗原结合位点是抗体的单链可变片段(scFv)。
6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述胞外结构域进一步包含选自由铰链结构域和间隔结构域组成的组中的至少一个。
7.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中，所述铰链结构域或间隔结构域选自由Myc表位、CD8铰链结构域和Fc组成的组中的至少一个。
8.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述跨膜结构域是选自由T细胞受体(TCR)的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154组成的组中的任一个。
9.一种多核苷酸，包含编码根据权利要求1至8中任一项所述的嵌合抗原受体的碱基序列。
10.一种表达载体，包含根据权利要求9所述的多核苷酸。
11.一种免疫细胞，在所述免疫细胞的表面上表达根据权利要求1至8中任一项所述的嵌合抗原受体作为第一嵌合抗原受体；和
在所述免疫细胞的表面上表达第二嵌合抗原受体，所述第二嵌合抗原受体包括：胞外结构域，所述胞外结构域含有与癌细胞中表达的抗原特异性结合的抗原结合位点；跨膜结构域；和胞内信号传导结构域。
12.根据权利要求11所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞是选自由自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、巨噬细胞和树突状细胞组成的组中的任一种。
13.根据权利要求11所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞在其表面上进一步表达至少一个嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：胞外结构域，所述胞外结构域含有与不同于第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体的抗原特异性结合的抗原结合位点；跨膜结构域；和胞内信号传导结构域。
14.根据权利要求11所述的免疫细胞，其中，所述第二嵌合抗原受体的抗原结合位点特异性结合选自由HER2、EphA2、ErbB3、IL-13Rα2、DLK1、B7H3、PD-L1、GPC3、CEACAM6和CD5组成的组中的任一个。
15.一种用于治疗癌症的药物组合物，包含根据权利要求11所述的免疫细胞。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中，所述癌症选自由肺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、肝癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、血癌、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、恶性淋巴瘤、胸腺癌、骨肉瘤、纤维瘤和脑癌组成的组中的至少一种。
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