CN117677631A - 用于治疗冠状病毒感染的新型组合物和方法 - Google Patents

Abstract

公开了适用于治疗冠状病毒感染的组合物和方法。更具体地，公开了预防或抑制SARS‑CoV病毒复制的蛋白质药剂，该SARS‑CoV病毒包括SARS‑CoV‑2病毒。还公开了这些药剂和分子用于治疗或预防个体的冠状病毒感染(包括SARS‑CoV‑2感染)的用途。

Description

用于治疗冠状病毒感染的新型组合物和方法

相关申请

本申请要求于2021年4月20日提交的澳大利亚临时申请号2021901169以及于2022年2月18日提交的澳大利亚临时申请号2022900358的优先权，这两项申请的名称均为“用于治疗冠状病毒感染的新型组合物和方法”，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及用于治疗冠状病毒感染的方法和组合物。更具体地，本发明涉及预防或抑制SARS-CoV病毒(包括SARS-CoV-2病毒)复制的蛋白质药剂。本发明还涉及这些药剂和分子用于治疗或预防个体的冠状病毒感染的用途。

背景技术

本说明书中对任何现有出版物(或来源于其的信息)或任何已知物质的引用，不是也不应被视为认可或承认或以任何形式暗示现有出版物(或来源于其的信息)或已知物质构成本说明书相关领域的公知常识的一部分。

冠状病毒是感染哺乳动物和鸟类的包膜RNA病毒。严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)都是β冠状病毒属的成员，分别造成亚洲和中东数百例死亡。随着人与人之间迅速传播和国际传播，新型SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)病原体立即引发了全球卫生紧急事件。作为回应，鉴于短短几个月内在110多个国家和地区出现大量SARS-CoV-2病例(COVID-19)并且存在进一步全球传播的持续风险，世界卫生组织(WHO)宣布疫情开始，随后全球都在努力寻找有效的治疗方法。迫切需要一种有效的冠状病毒疫苗来预防这种病毒的传播，同时也迫切需要新的治疗策略来降低全球死亡率。更糟糕的是，由于社区对这种病毒没有免疫力，这一问题变得更加复杂。此外，老年人和病人死亡风险最大，主要原因是他们的免疫系统被削弱。

确定治疗策略被认为是解决该疫情的最快方法。在治疗开发中采用的一种策略是结合已知的用于其他病原性疾病的药物，以确定在治疗冠状病毒感染中是否有效。前沿研究正在取得进展，包括使用HIV药物和氯喹(一种抗疟疾药物，因为疟疾病原体已经对它产生了耐药性，现在已很少使用)的组合；以及在两种现有药物洛匹那韦(lopinavir)和利托那韦(ritonavir)的组合(参见Cao等人，2020)。然而，由于意想不到的副作用，除了缺乏充分证据证明这些药物在治疗冠状病毒感染中的功效之外，临床上仍然亟需开发专门针对冠状病毒的新治疗方案。

冠状病毒是一个病毒家族，分成四个属，即α冠状病毒、β冠状病毒(β-CoV)、γ冠状病毒和δ冠状病毒。α冠状病毒和β冠状病毒感染多个物种，包括人类。在这方面，在人类中具有特别临床重要性的β-CoV包括A谱系的OC43和HKU1、B谱系的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和SARS-CoV-2(其引起COVID-19疾病)以及C谱系的中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)。

发明内容

本发明至少部分源于本发明人的意外发现，即宿主ACE2蛋白核定位在宿主细胞的SARS-CoV病毒感染中发挥重要作用。此外，宿主ACE2蛋白的核定位提供了一种分子机制，可破坏这种机制来预防SARS-CoV病毒在宿主细胞中复制。这些发现已经在用于治疗或预防冠状病毒感染(特别是SARS-CoV感染)的新型组合物和方法中付诸实践。

因此，在一个方面，本发明提供了减少或抑制ACE2蛋白的核定位的分离的或纯化的蛋白质分子。这些分子通常包含由式I表示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：

TGIRDRX₁X₂X₃NKARS

(式I)

其中X₁、X₂和X₃独立地选自K和Q氨基酸、或其修饰形式。

在一些优选的实施方案中，X₁、X₂和X₃各自为K氨基酸残基。

在一些特别优选的实施方案中，蛋白质分子包含氨基酸序列TGIRDRKKKNKARS[SEQID NO：3]、由其组成或基本上由其组成。

在一些替代的实施方案中，蛋白质分子包含氨基酸序列TGIRDRQQQNKARS[SEQ IDNO：4]、由其组成或基本上由其组成。在一些替代的实施方案中，蛋白质分子包含氨基酸序列TGIRDRKKQNKARS[SEQ ID NO：5]、由其组成或基本上由其组成。在一些替代的实施方案中，蛋白质分子包含氨基酸序列TGIRDRQKKNKARS[SEQ ID NO：6]、由其组成或基本上由其组成。在一些其他实施方案中，蛋白质分子包含氨基酸序列TGIRDRKQKNKARS[SEQ ID NO：7]、由其组成或基本上由其组成。在一些其他实施方案中，蛋白质分子包含氨基酸序列TGIRDRKQQNKARS[SEQ ID NO：8]、由其组成或基本上由其组成。在一些其他实施方案中，蛋白质分子包含氨基酸序列TGIRDRQKQNKARS[SEQ ID NO：9]、由其组成或基本上由其组成。在一些替代的实施方案中，蛋白质分子包含氨基酸序列TGIRDRQQKNKARS[SEQ ID NO：10]、由其组成或基本上由其组成。

在说明性实例中，蛋白质分子包含氨基酸序列TGIRDRKKKNKARS、由其组成或基本上由其组成。在一些相同的实施方案和一些替代的实施方案中，X₁、X₂和X₃中的一个、两个或每个是甲基化的K(赖氨酸)残基。因此，在一些实施方案中，蛋白质分子包含选自以下的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：TGIRDRK(Me2)KKNKARS；TGIRDRKK(Me2)KNKARS；以及TGIRDRKKK(Me2)NKARS。在一些相同的实施方案和/或一些替代的实施方案中，X₁、X₂和X₃中的一个、两个或每个是乙酰化的K残基。

在一些实施方案中，蛋白质分子包含由式II表示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：

Z1TGIRDRX₁X₂X₃NKARSZ₂

(式II)

其中X₁、X₂和X₃如上广泛定义；

Z₁不存在或选自包含约1至约50个氨基酸残基的蛋白质部分中的至少一种和保护部分；以及

Z₂不存在或选自包含约1至约50个氨基酸残基的蛋白质部分中的至少一种。

在一些相同的实施方案和一些替代的实施方案中，蛋白质分子包含泛素化位点。在一些优选的实施方案中，泛素化位点位于C末端尾部区域(即，SEQ ID NO：1中所示的全长人ACE2序列的氨基酸残基763-805)。在一些实施方案中，泛素化位点包含氨基酸残基K788。

作为说明性实例，蛋白质分子可以包含氨基酸序列DISKGENNPGFQNTDDVQTS[SEQID NO：11]、由其组成或基本上由其组成。

在一些相同的实施方案和一些其他实施方案中，蛋白质分子可以包含对应于甲基化位点和泛素位点的氨基酸序列。例如，蛋白质分子可以包含TGIRDRKKKNKARSGENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSF[SEQ ID NO：12]、由其组成或基本上由其组成。

在一些实施方案中，蛋白质分子包含对应于ACE2多肽的C末端尾部区域序列的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，该序列介于甲基化位点和泛素化位点之间。例如，ACE2肽可以包含对应于全长人ACE2蛋白的残基774-787的氨基酸序列(即，ARSGENPYASIDIS)、由其组成或基本上由其组成。

在另一个相关方面，本发明提供了一种用于治疗或预防冠状病毒感染的组合物，其包含选自蛋白质分子的药剂和药学上可接受的载体或稀释剂，其中该蛋白质分子如上述和/或本文其他地方所述。

在这种类型的一些实施方案中，该组合物包含蛋白质分子，该蛋白质分子包含由式I或式II表示的第一氨基酸序列以及由SEQ ID NO：11所示的第二氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

在一些实施方案中，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列位于同一多肽中。可替代地，在一些实施方案中，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列存在于不同的多肽上。

在一些相同的实施方案和一些其他实施方案中，组合物包含至少一种抗病毒剂。

在另一方面，本发明提供了用于预防或减少宿主细胞中冠状病毒复制的方法，该方法包含在足以预防或减少冠状病毒进入细胞的条件下，使细胞与上述和/或本文其他地方所述的蛋白质分子接触一段时间。

在又一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防个体中冠状病毒感染(例如，COVID-19)的方法，该方法包含向个体施用有效量的上述和/或本文其他地方所述的蛋白质分子。优选地，蛋白质分子具有如式I和/或式II所示的氨基酸序列。

在一些优选的实施方案中，冠状病毒是β冠状病毒。典型地，冠状病毒选自SARS-CoV和SARS-CoV-2。在这方面，在一些实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV-2。在一些优选的实施方案中，个体是人。

在另一方面，本发明提供了上述和/或本文其他地方所述的蛋白质分子用于治疗的用途。

在一些实施方案中，该方法包含向个体同时、依次或相继施用抗病毒剂。

在这种类型的一些实施方案中，抗病毒剂选自羟氯喹、氯喹、洛匹那韦、利托那韦、法匹拉韦和瑞德西韦。在一些相同的实施方案和一些其他实施方案中，抗病毒剂包含IFN-y多肽。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述和/或本文其他地方所述的ACE2肽和药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，药物组合物还包含抗病毒剂。

在另一方面，本发明提供了一种用于减少细胞中ACE2核定位的方法，该方法包含在足以减少细胞中核定位的条件下，使细胞与选自上述或本文其他地方所述的蛋白质分子或组合物的药剂接触一段时间。

在另一方面，本发明提供了一种用于减少或预防ACE2多肽与IMPα多肽结合的方法，该方法包含在足以减少、预防、抑制ACE2多肽与IMPα多肽结合的条件下，使细胞与选自上述或本文其他地方所述的蛋白质分子或组合物的药剂接触一段时间。

在一些实施方案中，当本发明的蛋白质分子施用于个体时，个体中的炎症(例如，肺部炎症)减少。在一些实施方案中，个体肺中表达CD3+的细胞水平增加。在一些相同的实施方案和一些不同的实施方案中，个体肺中表达穿孔素的细胞水平增加。

附图说明

现将参照附图描述本发明的实例，其中：

图1显示了在SARS-CoV-2易感细胞中，LSD1和ACE2在细胞表面上结合为复合物。(A)用ASI数字病理学系统成像的CaCo2细胞的代表性图像。细胞被透化(细胞内)或未透化(表面)，并对ACE2、LSD1和TRMPSS2的表达进行染色。比例尺代表10mm。(B)点状图显示了来自(A)的ACE2、LSD1和TRMPSS2在Caco-2细胞中的核荧光强度。计算LSD1和ACE2的PCC(r)(n＝20个单个细胞)。-1＝完全排除共定位；0＝无共定位；+1＝完全共定位。(C)代表性FACS图显示了Caco-2细胞中ACE2和LSD1的细胞表面和细胞内表达。每个象限中的数字表示总细胞群的百分比，也显示在点状图(D)中。点状图中的数据代表两个独立的生物学重复。(E)用ASI数字病理学系统成像的MRC5细胞的代表性图像，其被透化(细胞内)或未透化(表面)，并对ACE2、LSD1和TRMPSS2的表达进行染色。比例尺代表10mm。(F)点状图显示了来自(E)的ACE2、LSD1和TRMPSS2在MRC5细胞中的核荧光强度。每组计数超过50个细胞。数据代表平均值±SE。Mann-Whitney检验：**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001表示显著性差异。n.s.表示不显著。

图2提供了显示在SARS-CoV-2感染细胞中，LSD1和ACE2在细胞表面上的结合增加的图示。(A、B)显示了用ASI数字病理学系统成像的Caco-2-SARS-CoV-2感染细胞的代表性图像(未感染的MRC5/Caco-2未显示)，细胞或者(A)用0.5％ Triton X-100透化(细胞内)15分钟，或者(B)未透化(表面)并用抗ACE2、LSD1和SARS-CoV-2核衣壳蛋白的一抗染色。点状图显示来自(A)的ACE2、LSD1和SARS-CoV-2在Caco-2细胞中的核荧光强度。(C)显示了用ASI数字病理学系统成像的Caco-2或Caco-2-SARS-CoV-2感染细胞的代表性图像，细胞或者用0.5％ Triton X-100透化(细胞内)15分钟，或者不透化(表面)并用抗ACE2、LSD1和SARS-CoV-2刺突蛋白的一抗染色。点状图显示来自(C)的ACE2、LSD1和SARS-CoV-2在Caco-2细胞中的核荧光强度。计算LSD1和ACE2或LSD1和SARS-CoV-2的PCC(r)(n＝20个单个细胞)。-1＝完全排除共定位；0＝无共定位；+1＝完全共定位。(D)qRT-PCR分析以检测在病毒感染后指定时间点Caco-2和MRC5培养物上清液中SARS-CoV-2的生长动力学。虚线表示检测极限。(E)感染后48小时Caco-2细胞中SARS-CoV-2核衣壳蛋白、细胞表面ACE2和细胞内LSD1表达的FACS分析。y轴的单位表示总细胞群的百分比。数据代表平均值±SD，n＝2。(F)显示了用ASI数字病理学系统成像的Caco-2或Caco-2-SARS-CoV-2感染细胞的代表性图像，用0.5％Triton X-100透化(细胞内)细胞15分钟，并用抗H3k9me2和H3k4me2的一抗染色。(G)点状图显示来自(F)的ACE2、LSD1和SARS-CoV-2在CaCo2细胞中的核荧光强度。(H、I)显示了用ASI数字病理学系统成像CaCo2或CaCo2-SARS-CoV-2感染细胞的代表性图像，细胞或者(H)未透化(表面)或者(I)用0.5％ Triton X-100透化(细胞内)15分钟，或者用抗SETDB1、G9A和ACE2的一抗染色。(J)点状图显示来自(H、I)的ACE2、LSD1和SARS-CoV-2在Caco-2细胞中的核荧光强度。每组计数超过50个细胞。数据代表平均值±SE。Mann-Whitney检验：**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001表示显著性差异。n.s.表示不显著。比例尺代表12mm。

图3提供了显示LSD1直接与包含高亲和力LSD1去甲基化结构域的ACE2胞质尾部相互作用的图示。(A)ACE2的二聚体结构描述为示意图。我们已经使用高分辨率生物信息学工具在C末端柔性结构域序列中鉴定出一种结合IMPα的NLS。该基序还含有3个赖氨酸残基(红色)，是LSD1催化活性的高概率去甲基化靶标，SVM概率为0.72或更高。(B)进行微量热泳动(Microscale thermophoresis)以确定LSD1和ACE2之间通过C末端尾部区域的结合。分析揭示了1：1的结合亲和力，表明LSD1与ACE2之间的强相互作用。(C、D)显示了用ASI数字病理学系统成像的Caco-2细胞的代表性图像。显示了用溶媒对照或200mM苯乙肼处理Caco-2细胞，并用ASI数字病理学系统成像，细胞或者(C)用0.5％Triton X-100透化(细胞内)15分钟，或者(D)未透化(表面)并用抗ACE2、LSD1和SARS-CoV-2核衣壳蛋白的一抗染色。比例尺代表12mm。(E、F)点状图显示来自(分别为C、D)的Caco-2细胞中ACE2、LSD1和SARS-CoV-2的核荧光强度。每组计数超过50个细胞。数据代表平均值±SE。Mann-Whitney检验：**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001表示显著性差异。n.s.表示不显著。计算LSD1和ACE2(n＝20个单个细胞)的PCC(r)。-1＝完全排除共定位；0＝无共定位；+1＝完全共定位。

图4提供了全转录本分析的图示。用苯乙肼、GSK或L1处理Caco-2细胞，且全RNA转录组分析显示关键的抗病毒和转录过程受到影响。上方的热图聚焦于与ISG、IFN-I、细胞因子/趋化因子活性以及病毒进入、核输入/RNA合成、翻译和复制相关的DEG列表上。热图描绘了与对照细胞相比，经处理的抑制DEG的log2(倍数变化)。这些选定的DEG的log2(倍数变化)大于1并且FDR值小于0.01。

图5显示了感染细胞中细胞内ACE2相互作用的图示。(A)描绘了Caco-2或MRC5SARS-CoV-2感染细胞的代表性图像。比例尺代表15mm。(B)显示了用ASI数字病理学系统透化和成像的细胞，用抗SARS-CoV-2(核衣壳)、ACE2和LSD1的一抗对细胞进行染色。点状图显示Caco-2细胞中ACE2、LSD1的核荧光强度。每组计数20个或更多个细胞。(C)细胞未透化以追踪表面表达，并且用抗ACE2和LSD1的一抗染色。点状图显示了Caco-2细胞中ACE2、LSD1的核荧光强度。每组计数20个或更多个细胞。数据代表平均值±SEM。Mann-Whitney检验：*p<0.0181，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001表示显著性差异，n.s.表示不显著。核/细胞质荧光比(Fn/c)使用等式：Fn/c＝(Fn-Fb)/(Fc-Fb)，其中Fn是核荧光，Fc是细胞质荧光，且虚线表示背景荧光。使用Mann-Whitney非参数检验(GraphPad Prism，GraphPad软件，圣地亚哥，加利福尼亚州)来确定数据集之间的显著性差异。

图6：(A)显示了用ASI数字病理学系统成像的Caco-2细胞的代表性图像，该细胞未透化(表面染色)，用溶媒对照或25mM/50mMACE2新型肽抑制剂(用FAM5标记)处理，并对ACE2、LSD1的细胞表面表达进行染色。(B)点状图显示了来自(A)的ACE2和LSD1在Caco-2细胞中的核荧光强度。(C)显示了用ASI数字病理学系统成像的Caco-2细胞的代表性图像，用0.5％ Triton X-100透化，用溶媒对照或25mM/50mMACE2新型肽抑制剂(用FAM5标记)处理，并对ACE2、LSD1的细胞表面表达进行染色。(D)点状图显示了来自(C)的ACE2和LSD1在Caco-2细胞中的核荧光强度。核/细胞质荧光比(Fn/c)使用等式：Fn/c＝(Fn-Fb)/(Fc-Fb)，其中Fn是核荧光，Fc是细胞质荧光，且Fb是背景荧光。使用Mann-Whitney非参数检验(GraphPadPrism，GraphPad软件，圣地亚哥，加利福尼亚州)来确定数据集之间的显著性差异。(E)显示了用ASI数字病理学系统成像的Caco-2细胞的代表性图像，该细胞未透化(表面染色)，用溶媒对照或25mM/50mM ACE2新型肽抑制剂(无标记)处理，并对ACE2、LSD1的细胞表面表达进行染色。(F)点状图显示了来自(E)的ACE2和LSD1在Caco-2细胞中的核荧光强度。每组计数超过50个细胞。数据代表平均值±SE。Mann-Whitney检验：**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001表示显著性差异。n.s.表示不显著。计算LSD1和ACE2的PCC(r)(n＝20个单个细胞)。-1＝完全排除共定位；0＝无共定位；+1＝完全共定位。(G)显示了用ASI数字病理学系统成像的Caco-2细胞的代表性图像，用新型肽抑制剂(具有FAM5标记)处理，以证明新型ACE2抑制剂在培养基和靶细胞中随时间的稳定性。比例尺代表10mm。

图7显示了ACE2肽抑制剂对SARS-Cov-2的核衣壳和刺突蛋白的作用的图示。(A)显示了用ASI数字病理学系统成像的用苯乙肼(P400 mM)、GSK(G400 mM)、L1(50mM)或P604(ACE2肽50mM)处理的Caco-2-SARS-CoV-2感染细胞的代表性图像，比例尺代表15mm。(B)用0.5％ Triton X-100透化细胞15分钟，并用抗ACE2、TMPRSS2和SARS-CoV-2刺突蛋白的一抗染色。点状图显示了Caco-2细胞中ACE2、TMPRSS2和SARS-CoV-2刺突蛋白的核荧光强度。计算ACE2和SARS-CoV-2的PCC(r)。(C)显示了用ASI数字病理学系统成像的用苯乙肼(P400mM)、GSK(G400 mM)、L1(50mM)或P604(ACE2肽50mM)处理的Caco-2-SARS-CoV-2感染细胞的代表性图像，比例尺代表15mm。(D)用0.5％ Triton X-100透化细胞15分钟，并用抗ACE2、TMPRSS2和SARS-CoV-2核衣壳蛋白的一抗染色。点状图显示了Caco-2细胞中ACE2、TMPRSS2和SARS-CoV-2核衣壳的核荧光强度。每组计数超过50个细胞。数据代表平均值±SEM。Mann-Whitney检验：**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001表示显著性差异。n.s.表示不显著。

图8：用VO或LSD1 WT质粒转染Caco-2或MRC5细胞。将细胞用0.5％ Triton X-100透化(细胞内)15分钟，用抗(A)ACE2和(B)LSD1的一抗染色，并用ASI数字病理学系统成像。条形图显示每组计数的LSD1和Caco-2细胞>20个细胞的总平均荧光强度。数据代表平均值±SE。Mann-Whitney检验：**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001表示显著性差异。n.s.表示不显著。

图9提供了ACE2和刺突蛋白相互作用的图示。(A)与SARS-CoV-2刺突结构域(PDB6M17)结合的ACE2的结构。ACE2和刺突结构域的结合涉及Lys31(ACE2)和Gln493(刺突)相互作用。在卡通模式下，ACE2显示为黄色，刺突结构域显示为灰色。残留物以棒状形式显示。ACE2 Lys31的甲基化(右图)会破坏这种相互作用。(B)如图A所示的与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的ACE2的结构。还描述了靶向该区域的两种肽抑制剂(ACE2-01、ACE2-02)以及与SARS-CoV-2刺突蛋白的相互作用。(C)Caco-2对照和ACE2-01/ACE2-02处理的细胞在96小时时间段内的细胞增殖分析。使用WST-1试剂分析增殖，并在孵育2小时后读取吸光度。该图描绘了三个重复的相对细胞增殖，以对照细胞(未处理，0小时)的百分比表示。在每个时间点使用单向ANOVA计算统计显著性。(D)SARS-CoV-2感染示意图。Caco-2细胞接种24小时，然后在ACE2肽抑制剂(ACE2-01或ACE2-02)存在下用MOI 1.0的SARS-CoV-2感染1小时。取出病毒接种物，并加入含抑制剂的培养基。然后，在0或48hpi采集细胞培养上清液，并在48hpi收获感染的细胞。抗病毒活性通过三种病毒测定法进行评估：SARS-CoV-2qRT-PCR、中位组织培养感染剂量测定法(TCID₅₀)和通过数字病理学(ASI系统)定量的病毒刺突蛋白。(E)qRT-PCR分析，以在感染后的指定时间点检测Caco-2培养上清液和感染细胞中SARS-CoV-2RNA的复制。相对感染相对于未感染的对照组进行归一化。数据代表平均值±SEM，n＝3。单向ANOVA，***p<0.0001表示显著性差异。(F)TCID₅₀测定，用于测量感染细胞的培养上清液中的感染性病毒滴度。数据代表平均值±SEM，n＝3。单向ANOVA，**p<0.01表示显著性差异。(G)用ACE2-01或ACE2-02处理的SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞中SARS-CoV-2刺突和ACE2的荧光强度(细胞表面)的点状图定量。(H)用ACE2-01或ACE2-02处理的SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞中SARS-CoV-2刺突和ACE2的荧光强度(细胞内)的点状图定量。每组分析了超过50个细胞，并通过数字病理学(ASI系统)进行量化。计算PCC用于共定位(分析了n＝20个细胞)。Mann-Whitney检验：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001表示显著性差异。(I)对用SARS-CoV-2感染并用对照、GSK或ACE2-01或ACE2-01肽抑制剂处理的未透化的Caco-2细胞进行邻位连接实验，测量了蛋白质相互作用。测定在细胞内的每次相互作用中产生一个亮点。显示了ACE2和SARS-CoV-2刺突的代表性图像(左)。测定的PLA信号强度(右)显示为平均点强度(单个点)。数据代表n＝20个细胞，用Kruskal-Wallis ANOVA计算显著性差异(*p<0.05，***p<0.0001)。代表性图像以橙色表示，比例尺为10μM。

图10：(A)SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)序列显示与ACE2赖氨酸31结合的关键残基(Q；谷氨酰胺493)，并且该序列在不同物种中具有保守性。计算机预测给出了赖氨酸31处的甲基化/去甲基化特征(signature)的概率为0.7。(B)LSD1抑制减少了赖氨酸31处的ACE2去甲基化、单独的重组LSD1蛋白或与二甲基化ACE2肽预孵育的重组LSD1蛋白。

图11提供了ACE2肽抑制剂的突变研究的图示。(A)ACE2-01丙氨酸步移肽通过沿肽长度的丙氨酸取代产生。然后将每种肽用于预处理CaCo2细胞，随后用SARS-CoV-2刺突蛋白处理。然后用SARS-CoV-2刺突蛋白特异性抗体对样品进行染色，并使用ASI高分辨率显微镜进行观察。使用ASI数字病理学软件对非透化细胞上的刺突蛋白的荧光强度进行定量。数据代表每组n>300个细胞。红线以下的所有样品代表细胞表面的刺突蛋白显著减少(用Kruskal-Wallis ANOVA计算，p分值为****(p<0.0001，NS表示无显著性)。(B)ACE2-02丙氨酸步移肽通过沿肽长度的丙氨酸取代产生。然后将每种肽用于预处理CaCo2细胞，随后用SARS-CoV-2刺突蛋白处理。然后用SARS-CoV-2刺突蛋白特异性抗体对样品进行染色，并使用ASI高分辨率显微镜进行观察。使用ASI数字病理学软件对非透化细胞上的刺突蛋白的荧光强度进行定量。数据代表每组n>300个细胞。红线以下的所有样品代表细胞表面的刺突蛋白显著减少(用Kruskal-Wallis ANOVA计算，p分值为****(p<0.0001，NS表示无显著性)。

图12提供了P604 ACE2肽破坏核ACE2输入蛋白机制并在动物安全性研究中显示最小毒性的图示。(A)进行电泳迁移率变动测定以证实IMPα与ACE2之间通过C末端结构域的相互作用。ACE2 C末端结构域是FITC标记的。左图为考马斯亮蓝染色，右图为紫外线可见。(B)使用微量热泳动和荧光偏振来评估P604 ACE2肽对输入蛋白α与ACE2之间结合的抑制。每个实验都在n＝3的情况下进行，KD表示平均值和标准偏差。(C)在用溶媒对照或增加剂量的P604 ACE2肽抑制剂(3.125mM至150mM)处理的透化H1299细胞上进行邻位连接实验，测量了ACE2^unmod与IMPα1的蛋白质相互作用。DUOLINK测定在细胞内的每次相互作用中产生一个亮点。显示了溶媒和最低剂量(3.125mM)的P604 ACE2肽抑制剂的代表性图像。显示了每个细胞的总平均点强度(单个DUOLINK点)的测定的PLA信号强度图，计数的细胞n>20个。使用单向ANOVA Kruskal Willis计算差异：****<0.0001。

图13提供了显示在SARS-COV2金黄叙利亚仓鼠临床前动物模型中，P604 ACE2肽抑制剂治疗抑制病毒复制并预防与SARS-Cov-2感染相关的早期肺部炎症的图示。(A)qRT-PCR分析，以检测来自如上(A)所述处理的金黄叙利亚仓鼠的感染肺中的SARS-Cov-2RNA的复制。RNA产量表示为log10 TCID₅₀ eq/mL。(B)病毒载量％相对于溶媒表示。数据代表平均值±SEM，n＝7-8/组。Tukey事后检验，***p<0.0001表示显著性差异。(C)TCID₅₀测定，以测量受感染肺中的传染性病毒滴度。数据代表平均值±SEM，n＝5/组。Tukey事后检验，**p<0.01，***p<0.001表示显著性差异。(D)描绘了金黄叙利亚仓鼠SARS-CoV-2感染模型的染色肺FFPE切片的实例图像，该模型已被SARS-CoV-2感染，并且用溶媒对照、NACE2 IP或NACE2iIV处理，以黄色表示，比例尺为20mM。如方法中所述处理肺组织FFPE，并对SARS-CoV-2刺突蛋白进行染色。(E)点状图描绘了使用捕获图像的ASI数字分析进行的分析和成像(分析了n>1000个细胞)。数据用平均值±SEM表示，代表SARS-CoV-2刺突阳性细胞的群体动态和SARS-CoV-2刺突蛋白的荧光强度。使用单向ANOVA Kruskal-Wallis计算差异：NS＝不显著，***＝0.0005，***<0.0001。

图14提供了显示施用P604 ACE2肽抑制剂减少金黄叙利亚仓鼠肺中SARS-Cov-2病毒感染和炎症的图示。(A)来自溶媒和P604 ACE2肽抑制剂处理的动物的肺的苏木精和曙红(H&E)染色的组织切片。左图：伴有上皮细胞变性、坏死和脱落的细支气管炎，伴有透壁白细胞浸润(广泛凋亡)。中图：血管炎，其表征为嗜异细胞和单核细胞的边缘性和透壁迁移，伴有内皮细胞和平滑肌细胞损伤(箭头)。图中还可见轻度肺泡和间质白细胞积聚(星号)。右图：在血管或细支气管中未观察到炎症。无血管变化，包括无单核细胞或嗜异细胞浸润，无肺泡巨噬细胞积聚。比例尺＝200μm。(B)来自H&E染色组织切片的感染肺的病理学评分。注：所有样品的肺细胞增生记录为附加得分0分。数据代表平均值，n＝7-8/组。Tukey事后检验，*p<0.05表示显著性差异。

图15提供了显示P604 ACE2肽抑制剂诱导抗病毒特征/效应特征并消除核ACE2的图示。(A)描绘了已经用SARS-CoV-2感染并用溶媒对照、P604 ACE2肽抑制剂IP或P604 ACE2肽抑制剂IV处理的金黄叙利亚仓鼠SARS-CoV-2感染模型的染色肺FFPE切片的实例图像。如方法中所述处理肺组织FFPE，并对穿孔素和CD3进行染色。使用捕获图像的ASI数字分析进行分析和成像(分析了n>1000个细胞)。数据用平均值±SEM表示，并且代表CD3和穿孔素阳性细胞的群体动态。使用单向ANOVA Kruskal-Wallis计算差异：NS＝不显著，***＝0.0047，***＝0.0002。

具体实施方式

1.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义如下。

冠词“一(a)”和“一个(an)”在本文中用于指代一个或多于一个(即，至少一个)该冠词修饰的语法对象。例如，“一个细胞(a cell)”是指一个细胞或多于一个细胞。

本文使用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文提到的“约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。

术语“同时施用(administration concurrently或administeringconcurrently)”或“共同施用”等是指施用含有两种或更多种活性剂的单一组合物，或每种活性剂作为单独的组合物进行施用和/或在足够短的时间内同期(contemporaneously)或同时(simultaneously)或依次(sequentially)通过分开的途径进行施用，其有效结果相当于所有这些活性剂作为单一组合物施用时获得的效果。“同时”是指活性剂在基本上相同的时间施用，并且理想地在同一制剂中一起施用。“同期”是指活性剂在时间上紧密地施用，例如，一种药剂在另一种药剂前后约一分钟至约一天内施用。任何同期时间都是有用的。然而，通常的情况是，当不同时施用时，药剂将在约1分钟至约8小时内施用，并且合适地在少于约1至约4小时内施用。当同期施用时，药剂适宜在个体的同一部位施用。术语“同一部位”包括确切的部位，但可以在约0.5cm至约15cm内，优选在约0.5cm至约5cm内。本文所用的术语“分开(separately)”是指药剂以一定间隔施用，例如以约一天至几周或几个月的间隔。活性剂可以以任一顺序施用。本文所用的术语“依次”是指药物按顺序施用，例如间隔几分钟、几小时、几天或几周。如果合适的话，活性剂可以以定期重复周期进行施用。

术语“药剂(agent)”包括诱导所需药理和/或生理效应的化合物。该术语还涵盖本文具体提及的那些化合物的药学上可接受的及药理学活性的成分，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。当使用上述术语时，应当理解，这包括活性剂本身以及药学上可接受的、药理学活性的盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。术语“药剂”不应被狭义地解释，而是延伸到小分子、蛋白质分子(诸如肽、多肽和蛋白质以及包含它们的组合物)、遗传分子(诸如RNA、DNA及其模拟物和化学类似物)以及细胞药剂。术语“药剂”包括能够产生并分泌本文所指多肽的细胞，以及包含编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸。因此，术语“药剂”延伸至核酸构建体，其包括用于在一系列细胞中表达和分泌的载体，诸如病毒或非病毒载体、表达载体和质粒。

生物标志物的“量”或“水平”是样品中可检测的水平。这些可以通过本领域技术人员已知的方法进行测量，也公开于本文中。被评估的生物标志物的表达水平或量可用于确定对处理的反应。

如本文所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何及所有可能的组合，以及在替代(或)中解释时缺少组合。

术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指预防、阻断、抑制、中和或降低另一分子(诸如受体)的生物活性或作用的物质。

如本文所用，术语“结合”、“特异性结合”或“对……具有特异性”是指可测量且可重复的相互作用，诸如靶标与结合分子之间的结合，其在包括生物分子在内的异质分子群存在的情况下决定靶标的存在。例如，结合或特异性结合靶标(其可以是表位)的结合分子是以比结合其他靶标更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合该靶标的分子。在一个实施方案中，结合分子与不相关靶标的结合程度小于例如通过放射免疫测定(RIA)测量的分子与靶标结合的约10％。在某些实施方案中，特异性结合靶标的结合分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，结合分子特异性结合蛋白质上的区域，该区域在来自不同物种的蛋白质中是保守的。在另一个实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性结合。

在整篇说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(以及其各种词性)”应理解为包含所述步骤或要素或步骤或要素组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素组。因此，术语“包含”等的使用表示所列元素是必需的或强制性的，但是其他元件是可选的，并且可以存在也可以不存在。“由……组成”是指包括并限于短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列出的元素是必需的或强制性的，并且不存在其他元素。“基本上由……组成”是指包括在该短语之后列出的任何元素，并且限于不干扰或有助于在本公开中针对所列元素指定的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列元素是必需的或强制性的，但是其他元素是可选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列元素的活动或动作。

“对应于(以及其各种词性)”是指与参考氨基酸序列显示基本序列相似性或同一性的氨基酸序列。通常，氨基酸序列与参考氨基酸序列的至少一部分显示至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、97％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至高达100％的序列相似性或同一性。

“有效量”至少是实现特定障碍的可测量改善或预防所需的最小量。本文中的有效量可根据诸如疾病状态、年龄、性别和患者体重以及抗体在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。有效量也是治疗的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。对于预防性用途，有益或期望的结果包括诸如消除或降低风险、减轻严重程度或延迟疾病发作的结果，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和疾病发展过程中出现的中间病理表型。对于治疗用途，有益的或期望的结果包括临床结果，诸如减少由疾病引起的一种或多种症状，提高患有该疾病的人的生活质量，降低治疗该疾病所需的其他药物的剂量，诸如通过靶向增强另一种药物的效果，延缓疾病的进展，和/或延长生存期。在感染的情况下，有效量的药物可具有以下作用：减少循环或组织中的病原体(细菌、病毒等)滴度；减少病原体感染细胞的数量；抑制(即，在一定程度上减缓或理想地停止)器官的病原体感染；抑制(即，在一定程度上减缓并理想地停止)病原体生长；和/或在一定程度上缓解一种或多种与感染相关的症状。有效量可以一次或多次施用。出于本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接实现预防性或医疗性治疗的量。如在临床上下文中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效量可以与或不与另一种药物、化合物或药物组合物联合获得。因此，在施用一种或多种治疗剂的情况下，可以考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他药剂联合，可以或已经获得了期望的结果，则可以考虑以有效量给予单一药剂。

关于基因序列的术语“表达”是指基因的转录产生RNA转录本(例如，mRNA、反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA等)以及适当时将所得mRNA转录本翻译成蛋白质。因此，从上下文中可以清楚地看出，编码序列的表达源于编码序列的转录和翻译。相反，非编码序列的表达来自非编码序列的转录。

术语“感染”是指致病微生物对身体组织的入侵、它们的增殖以及身体组织对这些微生物及其产生的毒素的反应。“感染”包括但不限于由病毒、朊病毒、细菌、类病毒、寄生虫、原生动物和真菌引起的感染。然而，在本发明的上下文中，“感染”通常指冠状病毒科(例如，冠状病毒)的病毒感染。

如本文所用，“说明材料”包括出版物、录音、图表或可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的任何其他表达媒介。本发明试剂盒的说明材料可以例如固定在含有本发明治疗剂或诊断剂的容器上，或者与含有本发明治疗剂或诊断剂的容器一起运输。

本文中可互换使用的术语“患者”、“受试者”、“宿主”或“个体”是指任何个体，特别是脊椎动物个体，甚至更特别是哺乳动物个体，其需要治疗或预防。落入本发明范围内的合适的脊椎动物包括但不限于脊索动物亚门的任何成员，包括灵长类动物(例如，人类、猴子和猿，并且包括猕猴属(Macaca)的猴类物种(例如，食蟹猴(诸如Macaca fascicularis)和/或恒河猴(Macaca mulatta))和豚尾狒狒(Papio ursinus)，以及狨猴(来自狨属的物种)、松鼠猴(来自松鼠猴属的物种)和绢毛猴(来自柽柳猴属的物种)，以及猿类物种(诸如黑猩猩(Pan troglodytes))、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、兔形目动物(例如，兔、野兔)、牛科动物(例如，牛)、绵羊类动物(例如，绵羊)、山羊类动物(例如，山羊)、猪类动物(例如，猪)、马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、鸟类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟类诸如金丝雀、虎皮鹦鹉)、海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸鱼)、爬行动物(例如，蛇、青蛙、蜥蜴等)，以及鱼。优选的个体是需要治疗SARS-CoV感染(包括SARS-CoV-2感染)的人。然而，应当理解，上述术语并不是指存在症状。

术语“药物组合物”或“药物制剂”是指一种制剂，其形式可使活性成分的生物活性有效，并且不含对施用该组合物或制剂的个体具有不可接受毒性的另外的组分。此类制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(溶媒、添加剂)是那些可以合理地施用于受试哺乳动物以提供所用活性成分的有效剂量的赋形剂。

如本文所用，术语“预防(以及其各种词性)”是指增加个体对发展疾病或病症的抵抗力的预防性治疗，或换言之，降低个体发展疾病或病症的可能性，以及在疾病或病症开始后的治疗，以减少或完全消除疾病或病症或预防其恶化。这些术语在其范围内还包括预防可能易患该疾病或病症但尚未被诊断为患有该疾病或病症的个体发生该疾病或病症。

如本文所用，术语“序列同一性”是指序列在比较窗口内逐个核苷酸或逐个氨基酸相同的程度。因此，通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列来计算“序列同一性百分比”，确定两个序列中相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gin、Cys和Met)出现的位置数量，以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。出于本发明的目的，“序列同一性”将被理解为指通过适当方法计算的“匹配百分比”。例如，序列同一性分析可以使用DNASIS计算机程序(windows 2.5版；可从美国加利福利亚州南旧金山市的日立软件工程有限公司(Hitachi Software engineering Co.,Ltd.,South San Francisco,California,USA)获得)，使用软件随附的参考手册中使用的标准默认值进行。

如本文所用，“小分子”是指分子量小于3千道尔顿(kDa)、通常小于1.5kDa、更优选小于约1kDa的化合物。小分子可以是核酸、肽、多肽、肽模拟物、碳水化合物、脂类或其他有机(含碳)或无机分子。如本领域技术人员将理解的，基于本发明的描述，可以用本发明的任何测定法筛选化学和/或生物混合物(通常是真菌、细菌或藻类提取物)的大量文库，以鉴定调节生物活性的化合物。“有机小分子”是分子量小于3kDa、小于1.5kDa或甚至小于约1kDa的有机化合物(或与无机化合物(例如，金属)络合的有机化合物)。

杂交反应的“严格性”可由本领域普通技术人员容易地确定，并且通常依赖于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验进行计算。通常，较长的探针需要较高的温度来进行适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时，变性DNA重新退火的能力。探针与可杂交序列之间期望的同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。因此，较高的相对温度会使反应条件更严格，而较低的温度则不太严格。关于杂交反应严格性的其他细节和解释，参见Ausubel等人,《分子生物学实验室指南》(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience出版社,(1995))。

如本文所定义的，“严格性条件”或“高严格性条件”可通过以下条件来鉴定：(1)使用低离子强度和高温进行洗涤，例如15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中使用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5，750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)在使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(50pg/mL)、0.1％ SDS和10％硫酸葡聚糖的溶液中于42℃过夜杂交，在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中于42℃洗涤10分钟，然后在由含EDTA的0.1×SSC组成洗涤液中于55℃高度严格洗涤10分钟。

如本文所用，术语“治疗”是指设计用于在临床病理学过程中改变被治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预。理想的治疗效果包括降低疾病进展速度、改善或缓和疾病状态、缓解或改善预后。例如，如果与T细胞功能障碍性疾病相关的一种或多种症状被减轻或消除，则个体被成功地“治疗”，包括但不限于减少(或破坏)癌细胞的增殖、减少病原体感染、减少由疾病引起的症状、提高患有该疾病的人的生活质量、减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量和/或延长个体的生存期。

如本文所用，基因名称加下划线或斜体应表示该基因，与其蛋白质产物相反，蛋白质产物以没有任何下划线或斜体的基因名称表示。例如，“ACE2”应指ACE2基因，而“ACE2”应指由ACE2基因的转录和翻译和/或选择性剪接产生的蛋白质产物。

除非另有明确说明，否则本文所述的每个实施方案均适用于每个实施方案。

2.蛋白质分子

本发明部分基于确定SARS-CoV病毒利用宿主机制以进入宿主细胞，并且这些必需的宿主机制通过甲基化和泛素化在翻译后水平和转录水平受到调节。不希望被任何理论或操作模式所束缚，据认为翻译后甲基化/去甲基化在至少两个水平上发挥关键作用：(1)调节ACE2蛋白与核转运蛋白输入蛋白α(IMPα)蛋白的相互作用，从而调节核转位；以及(2)调节ACE2蛋白的泛素化，这是蛋白酶体降解蛋白的信号。

基于这一观察，本发明人提出，施用ACE2肽将导致SARS-CoV进入宿主细胞的能力降低，该ACE2肽包括对应于野生型ACE2蛋白的一个或多个甲基化/去甲基化位点的序列，从而为冠状病毒感染提供了一种新的治疗方法。

可替代地，或另外地，ACE2肽导致抑制ACE2与IMPα之间的相互作用，该ACE2肽包括对应于野生型ACE2蛋白的核定位基序的氨基酸序列。

根据本发明，提供了方法和组合物，该方法和组合物利用这些ACE2肽来减少或消除冠状病毒进入细胞所需的完整细胞机制的转录，以及减弱ACE2蛋白向蛋白酶体的信号传递。在一些实施方案中，ACE2肽与另外的抗病毒剂组合使用。因此，如下文所述，本发明的方法和组合物在冠状病毒感染(例如，SARS-CoV-2感染)的治疗或预防中特别有用。

2.1ACE2肽

本发明部分基于确定ACE2蛋白的C末端尾部区域在其从细胞表面的核转位中发挥关键作用。本发明人还确定，当将包含对应于ACE2蛋白C末端尾部区域序列的氨基酸序列的蛋白质分子(例如，肽和/或多肽)施用于个体时，这些分子作为SARS-CoV感染的治疗(包括预防性治疗)令人惊讶地有效。这种活性至少部分源于ACE2肽的许多功能，包括但不限于：(1)抑制宿主细胞ACE2蛋白的核转位；(2)抑制宿主细胞ACE2蛋白的泛素化；(3)预防ACE2肽或多肽和/或IMPα多肽之间的相互作用。

在一些实施方案中，ACE2肽包含对应于野生型人ACE2蛋白的至少一部分的氨基酸序列。在这种类型的一些实施方案中，野生型人ACE2蛋白氨基酸序列是以UniProt登记号Q9BYF1保藏的序列，如下所示：

在一些实施方案中，ACE2肽包含对应于全长人ACE2蛋白序列(如SEQ ID NO：1中所示)的C末端尾部区域(即，残基763-805)的氨基酸序列、由其组成、或基本上由其组成。

在一些实施方案中，ACE2肽包括一个或多个赖氨酸甲基化位点。例如，全长人ACE2蛋白序列的赖氨酸残基K26、K353、K769、K770和K771(如上所述，以及SEQ ID NO：1)被鉴定为甲基化残基，其在本文中显示为LSD-1介导的甲基化/去甲基化残基。因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种包含ACE2肽的蛋白质分子，该ACE2肽包含对应于全长野生型人ACE2蛋白的K26、K353、K769、K770和K771的一个或多个甲基化位点。在一些优选的实施方案中，蛋白质分子包含ACE2肽，该ACE2肽包含对应于全长ACE2蛋白的残基K769、K770和K771的一个、两个或所有甲基化位点。在一些相同的实施方案和一些其他实施方案中，ACE2肽还包含对应于野生型人ACE2蛋白的残基K773的氨基酸残基，其可以是另一个甲基化位点。

在一些实施方案中，对应于全长ACE2蛋白的K769、K770、K771和K773的至少一个氨基酸被甲基化。在一些实施方案中，对应于全长ACE2蛋白的K769、K770、K771和K773的至少两个氨基酸被甲基化。在一些实施方案中，对应于全长ACE2蛋白的K769、K770、K771和K773的至少三个氨基酸被甲基化。在一些实施方案中，对应于全长ACE2蛋白的K769、K770、K771和K773的每个氨基酸都被甲基化。在一些优选的实施方案中，对应于残基K769、K770和K771的氨基酸都被甲基化。

在一些实施方案中，对应于全长ACE2蛋白的K769、K770、K771和K773的至少一个氨基酸被乙酰化。在一些实施方案中，对应于全长ACE2蛋白的K769、K770、K771和K773的至少两个氨基酸被乙酰化。在一些实施方案中，对应于全长ACE2蛋白的K769、K770、K771和K773的至少三个氨基酸被乙酰化。在一些实施方案中，对应于全长ACE2蛋白的K769、K770、K771和K773的每个氨基酸被乙酰化。在一些优选的实施方案中，对应于残基K769、K770和K771的氨基酸都被乙酰化。

在一些相同的实施方案和一些替代的实施方案中，ACE2肽包含对应于野生型人ACE2蛋白的泛素化位点的残基。在这方面，众所周知，蛋白质降解受泛素化调节，且蛋白质甲基化以前曾被报道为蛋白质泛素化的前体。因此，在一个方面，预防或减少宿主ACE2蛋白质的去甲基化作为一种机制来增加蛋白质的泛素化，从而刺激蛋白质的降解。以前已经观察到这种调节，例如，关于通过LSD-1的DNMT1关键表观遗传酶稳定性(参见，Yang,Epigenetics)。因此，在一些实施方案中，ACE2肽还可以包含对应于全长野生型人ACE2蛋白的氨基酸残基K788的氨基酸残基。例如，在一些实施方案中，ACE2多肽可以包含选自以下的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：DISKGENNPGFQNTDDVQTSF；ASIDISKGENNPGFQNTDD；或VQTSFDISKGENNPGFQNTDDVQTSF)。

在一些相同的实施方案和一些其他实施方案中，蛋白质分子预防或以其他方式减少ACE2多肽与输入蛋白α(IMPα)多肽的结合。合适地，这种类型的蛋白质分子可以包含如上所述的任何ACE2肽、由其组成或基本上由其组成。例如，ACE2肽可以包含氨基酸序列TGIRDRKKKNKARS[SEQ ID NO：3]。

在一些替代的实施方案中，ACE2肽可以包含对应于野生型人ACE2蛋白的IMPα结合区的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：1中所示序列的残基774至787)、由其组成或基本上由其组成。在这种类型的一些实施方案中，ACE2肽包含氨基酸序列ARSGENPYASIDIS、由其组成或基本上由其组成。

还鉴定了天然蛋白质氨基酸序列的几种变体。

在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子通常包含由式III表示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：

X₁GIRX₂RX₃X₄X₅X₆X₇AX₈S

(式III)

X₁选自任何小氨基酸或极性氨基酸(优选T或S氨基酸)、或其修饰形式；

X₂选自D或N氨基酸、或其修饰形式；

X₃、X₄和X₅各自独立地选自K和Q氨基酸、或其修饰形式；

X₆选自任何极性氨基酸(例如，N、K或D氨基酸)、或其修饰形式；

X₇选自K或Q氨基酸、或其修饰形式；

X₈选自R、G或S氨基酸、或其修饰形式；以及

在一些优选的实施方案中，ACE2肽包含氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，该氨基酸序列包含TGIRDRKKKNKARS。

此类蛋白质分子适当地抑制或减少ACE2蛋白与IMPα之间的相互作用。因此，这种类型的肽降低了ACE2蛋白的核定位。这导致细胞中核ACE2蛋白水平降低。

本发明提供了用于预防或减少冠状病毒进入宿主细胞的组合物和方法中的ACE2肽。本发明还提供了用于预防或减少冠状病毒在个体细胞中复制的组合物和方法。

当包含在组合物中时，ACE2肽合适地与药学上可接受的载体或稀释剂组合。本发明的ACE2肽可通过任何合适的途径施用，例如，包括通过注射、通过局部或粘膜施用、通过吸入、或通过包括调节释放施用方式的口服途径，以治疗或预防个体的冠状病毒感染。

在一些实施方案中，使用重组DNA技术或通过化学合成获得ACE2肽。可替代地，可从哺乳动物细胞样品中获得(例如，纯化或分离)ACE2肽。

本发明的ACE2肽包括由于存在替代的翻译和翻译后事件而产生的肽或多肽。ACE2肽可以在系统(例如，培养的细胞)中表达，该系统导致当ACE2蛋白在天然细胞中表达时存在基本相同的翻译后修饰；或者在系统中表达，该系统导致当ACE2蛋白在天然细胞中表达时存在的翻译后修饰(例如，糖基化或切割)改变或省略。

本发明涵盖全长ACE2多肽及其生物活性片段。通常，全长ACE2多肽的生物活性片段可参与相互作用，例如分子内或分子间相互作用(例如，IMPα多肽之间的相互作用)。此类生物活性片段包括肽，该肽包含与(推定的)全长ACE2多肽的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列)足够相似或来源于该氨基酸序列。全长ACE2肽的生物活性片段可以是长度为例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或更多个氨基酸残基的肽。

N末端ACE2肽

在其他实施方案中，ACE2肽抑制剂含有对应于野生型人ACE2序列的赖氨酸残基31的序列。该赖氨酸残基是ACE2多肽的完整甲基化/去甲基化位点，其去甲基化是与病毒刺突蛋白相互作用所必需的。因此，ACE2的赖氨酸31去甲基化基序对于SARS-CoV-2复制而言至关重要，因此对应于该赖氨酸残基的肽抑制剂通过显著降低刺突蛋白与ACE2的共定位而具有抗病毒活性。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了蛋白质分子，该蛋白质分子包含具有由式IV表示的氨基酸序列的肽：

Z₁IEEQAKTFLDKZ₂

(式IV)

其中：

Z₁不存在或选自包含约1至约50个氨基酸残基的蛋白质部分中的至少一种和/或保护部分；以及

Z₂不存在或选自包含约1至约50个氨基酸残基的蛋白质部分中的至少一种。

例如，Z₁可以不存在，并且Z₂可以包含氨基酸序列FNHEAEDLFYQSSLASWNYNT。在一些优选的实施方案中，蛋白质分子包含以下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：IEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNT。

在一个替代实例中，Z₁可以包含氨基酸序列ST，并且Z₂可以不存在。因此，在一些优选的实施方案中，蛋白质分子可以包含以下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：STIEEQAKTFLDK。

在一些实施方案中，肽包含根据式IV的肽序列、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，该序列包含根据式IV的多肽序列，在IEEQAKTFLDK区域具有一个或多个单个氨基酸取代。在这种类型的实施方案中，不容许对应于野生型人ACE2氨基酸序列赖氨酸31的赖氨酸取代。因此，可能不会在对应于野生型人ACE2多肽序列赖氨酸31的赖氨酸处发生一个或多个取代。

变体ACE2肽

本发明还考虑了ACE2肽，其为野生型或天然存在的ACE2蛋白或其片段的变体。此类“变体”肽包括通过以下而来源于天然蛋白质的蛋白质：在天然蛋白质的N末端和/或C末端缺失(所谓的“截短”)或添加一个或多个氨基酸；在天然蛋白质的一个或多个位点处缺失或添加一个或多个氨基酸；或者在天然蛋白质中一个或多个位点处取代一个或多个氨基酸。

本发明涵盖的变体蛋白质具有生物活性，即，它们继续具有天然蛋白质的所需生物活性(例如，结合LSD1多肽；或结合IMPα多肽)。此类变体可能源于例如遗传多态性或人为操作。

ACE2肽或多肽可以以多种方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。此类操作的方法通常是本领域已知的。例如，可以通过DNA突变来制备ACE2肽或多肽的氨基酸序列变体。用于突变和核苷酸序列改变的方法是本领域众所周知的(例如，参见Kunkel(1985,《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)82:488-492)、Kunkel等人(1987,Methodsin Enzymol,154:367-382)、美国专利号4,873,192、Watson,J.D.等人(“MolecularBiology of the Gene”,第四版,Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)及其中引用的参考文献)。关于不影响目的蛋白质生物活性的适当氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人,(1978)《蛋白质序列和结构图谱》(Atlas of Protein Sequence and Structure)国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.),华盛顿特区)的模型中找到。用于筛选由点突变或截短产生的组合文库的基因产物的方法、以及用于筛选具有选定性质的基因产物的cDNA文库的方法是本领域已知的。此类方法适用于快速筛选由ACE2肽或多肽的组合突变产生的基因文库。递归整体突变(REM)是一种提高文库中功能突变体频率的技术，可与筛选试验结合使用，以鉴定ACE2变体(参见，Arkin和Yourvan(1992)《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:7811 -7815；Delgrave等人,(1993)《蛋白质工程》(ProteinEngineering),6:327-331)。保守取代(诸如将一个氨基酸与另一个具有相似性质的氨基酸进行交换)可能是可取的，如下面更详细讨论的。

与亲代(例如，天然存在的或参考)ACE2氨基酸序列相比，变体ACE2肽或多肽可在其序列的不同位置含有保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，通常可以细分如下：

酸性：由于在生理pH下失去H离子，残基具有负电荷，并且当肽在生理pH下的水性介质中时，残基被水溶液吸引以寻找含有该残基的肽的构象中的表面位置。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。

碱性：由于在生理pH下或在其一个或两个pH单位内与H离子缔合，残基具有正电荷(例如，组氨酸)，并且当肽在生理pH下的水性介质中时，残基被水溶液吸引以寻找含有该残基的肽的构象中的表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。

带电荷：残基在生理pH下带电，因此包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。

疏水性：残基在生理pH值下不带电荷，并且残基被水溶液排斥，以使当肽处于水性介质中时，残基会在含有残基的肽的构象中寻找内部位置。具有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

中性/极性：残基在生理pH下不带电荷，但残基不会被水溶液充分排斥，因此当肽处于水性介质中时，残基会在含有残基的肽的构象中寻找内部位置。具有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。

本说明书还将某些氨基酸描述为“小”的，因为它们的侧链不够大，即使缺少极性基团，也不足以赋予疏水性。除了脯氨酸，“小”氨基酸是指当侧链上具有至少一个极性基团时具有四个或更少个碳的氨基酸，而当侧链上没有极性基团时具有三个或更少个碳的氨基酸。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的二级氨基酸脯氨酸是一个特例，因为它对肽链的二级构象产生已知影响。脯氨酸的结构不同于所有其他天然存在的氨基酸，因为它的侧链与α-氨基的氮以及α-碳相连。然而，几种氨基酸相似性矩阵(例如，PAM120矩阵和PAM250矩阵，例如公开于Dayhoff等人,(1978),《蛋白质进化变化模型》(A model of evolutionary change in proteins)；用于确定距离关系的矩阵，参见M.O.Dayhoff,(编著)，《蛋白质序列和结构图谱》(Atlas of protein sequence andstructure)，第5卷，第345-358页，国家生物医学研究基金会(National BiomedicalResearch Foundation)，华盛顿特区；以及Gonnet等人(1992,Science,256(5062):14430-1445)包括与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸属于同一组的脯氨酸。因此，为了本发明的目的，脯氨酸被归类为“小”氨基酸。

分类为极性或非极性所需的吸引或排斥程度是任意的，因此，本发明特别考虑的氨基酸已被分类为一种或另一种。大多数没有具体命名的氨基酸可以根据已知的特性进行分类。

氨基酸残基可根据残基的侧链取代基进一步细分为环状或非环状、芳香族或非芳香族、小的或大的。如果残基包含总共四个或更少个碳原子，包括羧基碳，只要存在另外的极性取代基，则认为残基是小的；如果不是，则为三个或更少。当然，少量的残留物总是不含芳香成分的。根据它们的结构特性，氨基酸残基可以分为两类或更多类。对于天然存在的蛋白质氨基酸，表2中示出了根据该方案的子分类。

表2氨基酸子分类

保守氨基酸取代也包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。例如，有理由预期，用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸、或用结构相关氨基酸替换氨基酸的类似替换不会对所得变体多肽的性质产生重大影响。可通过测定多肽的活性来容易地确定氨基酸改变是否产生功能性ACE2肽多肽。表3示出了保守取代，标题为“示例性和优选的取代”。通常通过选择在保持(a)取代区域中肽骨架的结构、(b)靶位点分子的电荷或疏水性或(c)大部分侧链的效果上没有显著性差异的取代，来完成落入本发明范围内的氨基酸取代。引入取代后，筛选变体的生物活性。

表3示例性和优选的氨基酸取代

可替代地，基于侧链的同一性，用于进行保守取代的相似氨基酸可分为三类。第一组包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸，它们都有带电荷的侧链；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸，如Zubay,G.,《生物化学》(Biochemistry)第3版，Wm:C.Brown出版社(1993)中所述。

因此，ACE2肽或多肽中预测的非必需氨基酸残基通常被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。可替代地，可以沿着ACE2基因编码序列的全部或部分随机引入突变，诸如通过饱和突变，并且可以根据亲本多肽的活性筛选所得突变体，例如如本文所述，以鉴定保留该活性的突变体。编码序列突变后，编码的肽或多肽可以被重组表达并测定其活性。“非必需”氨基酸残基是可以由实施方案肽或多肽的野生型序列改变的残基，而不会消除或实质上改变其一种或多种活性。合适地，该改变基本上不改变这些活性之一，例如，活性是野生型的至少20％、40％、60％、70％或80％。相比之下，“必需”氨基酸残基是这样的残基，当由参考ACE2肽或多肽的野生型序列改变时，导致亲本分子活性消除，使得存在少于20％的野生型活性。例如，此类必需氨基酸残基包括在不同物种的ACE2肽或多肽中保守的那些。

因此，本发明还将天然存在的ACE2多肽序列或其生物活性片段的变体设想为ACE2肽或多肽，其中该变体通过一个或多个氨基酸残基的添加、缺失或取代而与天然存在的序列相区别。通常，变体将显示出与亲本或参考ACE2肽或多肽序列(例如，如SEQ ID NO：1中所示)至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的相似性，如本文别处描述的序列比对程序使用默认参数所确定的。期望地，变体将显示出与亲本ACE2肽或多肽序列(例如，如SEQID NO：1中所示)至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，如本文别处描述的序列比对程序使用默认参数所确定的。落入变体多肽范围内的野生型ACE2多肽的变体通常与野生型分子的差异可多达15、14、13、12或11个氨基酸残基，或合适地差异少至10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，变体多肽与SEQ ID NO：1中的相应序列至少有1处不同，但少于或等于15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸残基不同。在其他实施方案中，它与SEQ ID NO：1中任一个的相应序列的差异为至少1％但少于或等于20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％的残基不同。如果序列比较需要比对，则通常比对序列以获得最大的相似性或同一性。从缺失或插入或错配中“环出(looped)”的序列通常被认为是差异。合适地，差异是在非必需残基或保守取代上的差异或变化，如下文更详细讨论的。

本发明的ACE2肽还涵盖包含具有修饰侧链的氨基酸的ACE2肽或多肽，在肽、多肽或蛋白质合成期间掺入非天然氨基酸残基和/或其衍生物，并且使用交联剂以及对本发明的肽、部分和变体施加构象限制的其他方法。侧链修饰的实例包括氨基的修饰，诸如用乙酸酐进行酰化；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐对氨基进行酰化；用甲基乙酰亚胺酸进行酰胺化；用氰酸盐对氨基进行氨甲酰化；用吡哆醛-5-磷酸对赖氨酸进行吡啶氧基化，然后用NaBRt还原；通过与醛反应，然后用NaBH₄还原，进行还原性烷基化；以及用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基进行三硝基苯化。

可通过碳二亚胺活化、经由O-酰基异脲形成、随后衍生为例如相应的酰胺，来修饰羧基。

可通过与试剂如2,3-丁二酮、苯基乙二醛和乙二醛形成杂环缩合产物，来修饰精氨酸残基的胍基。

可通过以下方法来修饰巯基：诸如过甲酸氧化成半胱氨酸；使用4-氯汞苯磺酸、4-氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚、氯化苯基汞和其他汞，形成汞衍生物；与其他硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其他取代的马来酰亚胺进行反应；用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化；以及在碱性pH下用氰酸盐进行氨甲酰化。

例如，可通过用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤对吲哚环进行烷基化，或通过用N-溴琥珀酰亚胺进行氧化，来修饰色氨酸残基。

可通过用四硝基甲烷进行硝化，来修饰酪氨酸残基，以形成3-硝基酪氨酸衍生物。

可通过用焦碳酸二乙酯进行正碳乙氧基化或通过用碘乙酸衍生物进行烷基化，来修饰组氨酸残基的咪唑环。

在肽合成期间掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。表4中显示了本发明预期的非天然氨基酸列表。

表4非天然氨基酸

本发明的ACE2肽还包括由多核苷酸编码的那些，该多核苷酸在本文定义的严格性条件下，尤其是中等或高严格性条件下，与编码ACE2的多核苷酸序列或其非编码链杂交，如下所述。说明性的ACE2多核苷酸序列如下所示：

在一些实施方案中，序列之间的序列相似性或序列同一性的计算如下进行：

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，将序列进行比对以用于最佳比较的目的(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位，并且为了比较的目的，可以忽略非同源序列)。在一些实施方案中，为了比较目的而比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少30％，通常至少40％，更通常至少50％、60％，甚至更通常至少70％、80％、90％、100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的一个位置被第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，那么该分子在该位置是相同的。对于氨基酸序列比较，当第一序列中的一个位置被第二序列中相应位置的相同或相似的氨基酸残基占据时(即，保守取代)，则该分子在该位置是相似的。

两个序列之间的同一性百分比是序列在单个位置上共有的相同氨基酸残基的数量的函数，考虑了空位的数量和每个空位的长度，其需要被引入用于两个序列的最佳比对。相比之下，两个序列之间的相似性百分比是序列在单个位置上共有的相同和相似氨基酸残基数量的函数，考虑到空位的数量和每个空位的长度，其需要被引入用于两个序列的最佳比对。

可使用数学算法来完成序列的比较和序列间同一性百分比或相似性百分比的确定。在某些实施方案中，使用Needleman和Wunsch(1970,J.Mol.Biol.48:444-453)算法，该算法已被并入GCG软件包的GAP程序(查询网址：http://www.gcg.com)中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，且长度权重为1、2、3、4、5或6，来确定氨基酸序列之间的同一性百分比或相似性百分比。在具体的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(查询网址：http://www.gcg.com)，使用NWSgapdna.CMP矩阵、空位权重为40、50、60、70或80，且长度权重为1、2、3、4、5或6，来确定核苷酸序列之间的同一性百分比。一组非限制性的参数(除非另有说明，否则应该使用的参数)包括Blossum 62评分矩阵，其空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。

在一些实施方案中，可使用E.Meyers和W.Miller(1989,Cabios,4:1 1-17)的算法，该算法已被并入ALIGN程序(2.0版)，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12、空位罚分4，来确定氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比或相似性百分比。

本文所述的核酸和蛋白质序列可用作“查询序列”以在公共数据库中进行搜索，例如，以鉴定其他家族成员或相关序列。此类搜索可以使用Altschul等人(1990，J.Mol.Biol，215:403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。可用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的53010个核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序执行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的53010蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人(1997,NucleicAcids Res,25:3389-3402)所述使用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序的默认参数(例如，XBLAST和NBLAST)。

可通过筛选ACE2肽或多肽的突变体(例如，截短突变体)的组合文库，来鉴定参考ACE2肽或多肽的变体。ACE2编码序列的文库或片段，例如N末端、C末端或内部片段，可用于产生多样化的片段群体，用于筛选和随后选择参考ACE2的变体。

本领域已知筛选通过点突变或截短产生的组合文库的基因产物的方法，以及筛选具有选定性质的基因产物的cDNA文库的方法。此类方法适用于快速筛选通过ACE2肽或多肽的组合突变产生的基因文库。

可通过本领域技术人员已知的任何合适的程序制备本发明的ACE2肽和多肽。例如，ACE2肽或多肽可通过任何方便的方法生产，诸如通过从天然存在的储库中纯化肽或多肽。纯化方法包括尺寸排阻、亲和或离子交换色谱/分离。衍生的ACE2肽的身份和纯度例如通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或色谱法(诸如高效液相色谱(HPLC))来确定。可替代地，ACE2肽或多肽可通过化学合成来合成，例如，使用溶液合成或固相合成，例如Atherton和Shephard(见上文)的第9章和Roberge等人(1995,Science,269:202)中所述。

在一些实施方案中，通过重组技术制备ACE2肽或多肽。例如，本发明的ACE2肽或多肽可以通过包括以下步骤的程序来制备：(a)制备包含编码ACE2肽或多肽的多核苷酸序列的构建体，该多核苷酸序列与调控元件可操作地连接；(b)将该构建体引入宿主细胞；(c)培养宿主细胞以表达多核苷酸序列，从而产生编码的ACE2肽或多肽；以及(d)从宿主细胞中分离ACE2肽或多肽。在说明性实例中，核苷酸序列编码SEQ ID NO：3中所示序列的至少一个生物活性部分或其变体。重组ACE2肽或多肽可使用标准方案方便地制备，例如Sambrook等人(1989，见上文)，特别是第16和17节；Ausubel等人(1994，见上文)，特别是第10和16章；以及Coligan等人,《最新蛋白质科学实验指南》(Current Protocols in Protein Science，约翰·威利父子出版公司，1995-1997)，特别是第1、5和6章。

在一些实施方案中，ACE2肽是野生型人ACE2氨基酸序列的同源物或直系同源物。尽管在直系同源物之间存在高度的序列同一性，但是在C末端尾部的几个残基上对变体氨基酸残基有一定的耐受性。例如，ACE2肽可以包含下列序列中的任何一个：来自人的ACE2肽(TGIRDRKKKNKARSGENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSF)或其片段；来自北美小褐蝠(Myotislucifugus)的ACE2肽(TGIRDRKKKKQAGNEENPYSSVNLSKGENNPGFQNGDDVQTSF)或其片段；来自家猫(Felis catus)的ACE2肽(SGIRNRRKNNQARSEENPYASVDLSKGENNPGFQHADDVQTSF)或其片段；来自家犬亚种(Canis lupus familiaris)的ACE2肽(TGIRDRRKKKQASTEENNPYGSVDLSKGENSGFQNGDDVQTSF)或其片段；来自野双峰驼(Camelus feus)的ACE2肽(TGIRDRRKKKQASTEENNPYGSVDLSKGENSGFQNGDDVQTSF)或其片段；来自食蟹猴(Macaca fascicularis)的ACE2肽(TGIRDRRKKKQASTEENNPYGSVDLSKGENSGFQNGDDVQTSF)。

在对应于核转位位点(例如，对应于SEQ ID NO：1中所示的人ACE2蛋白序列的残基767-776)的区域内存在甚至更高的序列同一性。例如，在一些实施方案中，ACE2肽包含对应于来自人ACE2的ACE2蛋白NLS氨基酸序列的氨基酸序列(DRKKKNKARS)；来自北美小褐蝠ACE2的NLS肽(DRKKKKQAGN)；来自家猫ACE2的NLS肽(NRRKNNQARS)；来自家犬亚种ACE2的NLS肽(NRRKNDQARG)；来自野双峰驼ACE2的NLS肽(DRRKKKQAST)；或来自食蟹猴ACE2的NLS肽(DRKKKNQARS)。

编码本发明的ACE2肽和多肽的示例性核苷酸序列涵盖全长ACE2基因以及ACE2基因或其转录本或这些转录本的ACE2拷贝的全长或基本上全长核苷酸序列的部分。ACE2核苷酸序列的部分可编码保留天然多肽生物活性的多肽部分或片段(例如，核转位)。编码ACE2多肽的生物活性片段的ACE2核苷酸序列的一部分可编码至少约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸残基，或几乎多达全长ACE2多肽中存在的氨基酸总数。

本发明还考虑了ACE2核苷酸序列的变体。核酸变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体(相同基因座)、同源物(不同基因座)和直系同源物(不同生物体)，或者可以是非天然存在的。可以使用众所周知的分子生物学技术，诸如本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术，来鉴定天然存在的核酸变体(本文也称为多核苷酸变体)。非天然存在的多核苷酸变体可以通过突变技术来制备，包括应用于多核苷酸、细胞或生物体的突变技术。变体可以包含核苷酸取代、缺失、倒位和插入。

在编码区和非编码区中的任一个或两个中均可发生变异。这些变异可以产生保守和非保守氨基酸取代(与编码产物相比)。对于核苷酸序列，保守变体包括那些由于遗传密码的简并性而编码参考ACE2肽或多肽的氨基酸序列的序列。变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，例如，诸如通过使用定点突变产生的但仍编码ACE2肽或多肽的核苷酸序列。通常，特定ACE2核苷酸序列的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如本文别处描述的序列比对程序使用默认参数所确定的。在一些实施方案中，ACE2核苷酸序列与SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其互补序列显示至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。

ACE2核苷酸序列可用于从其他生物体(特别是其他病毒宿主)中分离相应的序列和等位基因。核酸序列杂交的方法在本领域中非常容易获得。来自其他生物体的编码序列可以根据众所周知的技术基于它们与本文所述编码序列的序列同一性来分离。在这些技术中，所有或部分已知编码序列被用作探针，该探针选择性地与来自选定生物体(例如，哺乳动物)的克隆基因组DNA片段或cDNA片段群体(即，基因组或cDNA文库)中存在的其他ACE2编码序列杂交。因此，本发明还考虑了在下述严格性条件下与参考ACE2核苷酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸。如本文所用，术语“在低严格性、中等严格性、高严格性或极高严格性条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可以在Ausubel等人(1998，见上文)第6.3.1 -6.3.6节中找到。该参考文献中描述了水性和非水性方法，可以使用任何一种方法。本文提及的低严格性条件包括并涵盖至少约1％v/v到至少约15％v/v甲酰胺和至少约1M到至少约2M盐用于42℃杂交，以及至少约1M到至少约2M盐用于42℃洗涤。低严格性条件还可包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、7％ SDS用于65℃杂交，以及(i)2×SSC、0.1％ SDS；或(ii)0.5％ BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、5％SDS用于室温洗涤。低严格性条件的一个实施方案包括于约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，随后至少于50℃在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次(对于低严格性条件，洗涤温度可以增加到55℃)。中等严格性条件包括并涵盖至少约16％v/v到至少约30％v/v甲酰胺和至少约0.5M到至少约0.9M盐用于42℃杂交，以及至少约0.1M到至少约0.2M盐用于55℃洗涤。中等严格性条件还可包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、7％ SDS用于65℃杂交，以及(i)2×SSC、0.1％ SDS或(ii)0.5％ BSA、1mM EDTA、40mMNaHPO₄(pH 7.2)、5％SDS用于60-65℃洗涤。中等严格性条件的一个实施方案包括于约45℃在6×SSC中杂交，然后于60℃在0.2×SSC、0.1％ SDS中洗涤一次或多次，高严格性条件包括并包含至少约31％v/v到至少约50％v/v甲酰胺和约0.01M至约0.15M盐用于42℃杂交，以及约0.01M至约0.02M盐用于55℃洗涤。高严格性条件还可包括1％ BSA、1mM EDTA、0.5MNaHPO₄(pH 7.2)、7％ SDS用于65℃杂交，以及(i)0.2×SSC、0.1％ SDS或(ii)0.5％ BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、1％ SDS用于在超过65℃的温度洗涤。高严格性条件的一个实施方案包括于约45℃在6×SSC中杂交，然后于65℃在0.2×SSC、0.1％ SDS中洗涤一次或多次。

在某些实施方案中，ACE2肽或多肽由在极高严格性条件下与公开的核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。极高严格性条件的一个实施方案包括于65℃在0.5M磷酸钠、7％ SDS中杂交，然后于65℃在0.2×SSC、1％ SDS中洗涤一次或多次。

其他严格性条件在本领域中是众所周知的，本领域技术人员将认识到，可以操控各种因素来优化杂交的特异性。优化最终洗涤的严格性可以确保高度杂交。关于详细的实例，参见Ausubel等人(见上文)第2.10.1至2.10.16页，以及Sambrook等人(见上文)第1.101至1.104节。

尽管严格洗涤通常在约42℃至68℃的温度进行，但本领域技术人员将理解，其他温度也可适用于严格条件。最大杂交率通常出现在比DNA-DNA杂交体形成的T_m低约20℃至25℃时。本领域众所周知，T_m是解链温度，或两个互补多核苷酸序列解离的温度。估计T_m的方法在本领域中是众所周知的(参见Ausubel等人，见上文，第2.10.8页)。通常，完全匹配的DNA双链体的T_m可以通过下式近似预测：

T_m＝81.5+16.6(log₁₀ M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)

其中：M是Na⁺的浓度，优选在0.01摩尔至0.4摩尔的范围内；％G+C是鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的总和占碱基总数的百分比，在30％和75％ G+C之间的范围内；％甲酰胺是甲酰胺体积百分比浓度；长度是DNA双链体中碱基对的数量。随机错配碱基对的数量每增加1％，双链DNA的T_m降低约1℃。对于高严格性，通常于T_m-15℃进行洗涤，对于中等严格性，通常于T_m-30℃进行洗涤。

在杂交程序的一个实例中，含有固定化DNA的膜(例如，硝酸纤维素膜或尼龙膜)于42℃在含有标记探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt溶液(0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％ BSA)、0.1％ SDS和200mg/mL变性鲑鱼精子DNA)中杂交过夜。然后对膜进行两次连续的中等严格性洗涤(即，2×SSC、0.1％ SDS、45℃15分钟，接着2×SSC、0.1％ SDS、50℃15分钟)，接着进行两次连续的较高严格性洗涤(即，0.2×SSC、0.1％ SDS、55℃12分钟，接着0.2×SSC和0.1％ SDS溶液、65-68℃12分钟)。

本发明还考虑使用ACE2嵌合或融合蛋白来治疗或预防不良或有害的免疫反应。如本文所用，ACE2“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括与非ACE2肽或多肽连接的ACE2肽或多肽。“非ACE2肽或多肽”是指具有氨基酸序列的肽或多肽，该氨基酸序列对应于不同于天然ACE2的蛋白质，并且该蛋白质来源于相同或不同的生物体。融合蛋白的ACE2肽或多肽可对应于ACE2多肽氨基酸序列的全部或部分，例如本文所述的片段。在一个具体实施方案中，ACE2融合蛋白包括ACE2多肽的至少一个生物活性部分。非ACE2肽或多肽可以融合到ACE2肽或多肽的N末端或C末端。

融合蛋白可包括对配体具有高亲和力的部分。例如，融合蛋白可以是GST-ACE2融合蛋白，其中ACE2序列融合到GST序列的C末端。此类融合蛋白可以促进重组ACE2肽或多肽的纯化。可替代地，融合蛋白可以是在其N末端含有异源信号序列的ACE2蛋白。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，可以通过使用异源信号序列来增加ACE2肽或多肽的表达和/或分泌。在一些实施方案中，融合蛋白可包括血清蛋白的全部或一部分，例如IgG恒定区或人血清白蛋白。

本发明的ACE2融合蛋白可掺入药物组合物中，并体内施用于个体。它们也可用于调节ACE2肽或多肽的生物利用度。

3.治疗组合物

本发明人已确定天然ACE2蛋白的C末端结构域(即，对应于SEQ ID NO：1中所示的天然人ACE2蛋白的氨基酸残基763-805)在对SARS-CoV感染至关重要的多种活性中发挥重要作用。即，这些活性包括：(i)促进病毒进入(例如，通过参与SARS-CoV刺突蛋白)；(ii)核转位(通过与核穿梭蛋白IMPα结合)；以及(iii)靶向ACE2蛋白进行蛋白酶体降解(通过E3连接酶的泛素化)。重要的是，这些功能中的每一种都直接或间接地受到ACE2蛋白C末端尾部区域甲基化位点的LSD1介导的甲基化/去甲基化的调节。

因此，根据本发明，可使用至少一种如上述或本文其他地方所述的ACE2肽，或可表达ACE2肽的多核苷酸，以及任选的抗病毒剂，来实现预防SARS-CoV病毒复制。

3.1药物制剂

根据本发明，选自ACE2肽或多肽的生物活性剂以及任选的抗病毒剂可用于治疗冠状病毒感染的组合物和方法中，更具体地，用于预防或减少冠状病毒在宿主细胞中的复制。因此，这些组合物可用于治疗或预防冠状病毒感染。

适用于本发明的药物组合物包括其中含有有效量的生物活性剂以实现其预期目的的组合物。施用于患者的活性化合物的剂量应足以在患者体内随时间推移实现有益的反应，诸如减少至少一种与不想要的或有害的免疫反应相关的症状，该免疫反应适宜地与选自过敏、自身免疫性疾病和移植排斥的病症相关。待施用的药物活性化合物的量或剂量频率可取决于待治疗的个体，包括其年龄、性别、体重和一般健康状况。在这方面，用于施用的活性化合物的精确量将取决于医生的判断。在确定用于治疗或预防不需要的或有害的免疫反应的活性化合物的有效量时，医师可以评估炎症、促炎细胞因子水平、淋巴细胞增殖、溶细胞性T淋巴细胞活性和调节性T淋巴细胞功能。在任何情况下，本领域技术人员可以容易地确定拮抗剂和抗原的合适剂量。

因此，生物活性剂以与剂型相容的方式，以预防和/或治疗有效的量，施用于待治疗的个体。待递送的组合物的量通常在每剂量0.01μg/kg至100μg/kg生物活性分子(例如，ACE2肽、抗病毒剂等)的范围内，取决于待治疗的个体。在一些实施方案中，根据预期的施用方式，含ACE2肽组合物通常含有约0.1％至90％、约0.5％至50％、或约1％至约25％重量的ACE2，其余为合适的药物载体和/或稀释剂等，以及任选的抗病毒剂。抑制剂的剂量取决于多种因素，诸如施用方式、受影响个体的物种、年龄和/或个体状况。在其他实施方案中，根据预期的施用方式，含抗病毒剂组合物通常含有约0.1％至90％、约0.5％至50％、或约1％至约25％重量的抗病毒剂，其余为合适的药物载体和/或稀释剂等以及ACE2肽或多肽。

根据所治疗的感染的特定性质，可全身、局部或局部配制和施用颗粒。制剂和施用技术可以在最新版的“《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)”，麦克出版公司,伊斯顿，宾夕法尼亚州中找到。合适的途径可以包括例如：口服、直肠、经粘膜或肠道施用；肠胃外施用，包括肌内、皮下、经皮、皮内、髓内施用(例如，注射)，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内施用(例如，注射)。对于注射，本发明的生物活性剂可以配制在水溶液中，适宜地配制在生理学相容的缓冲液中，诸如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液。对于经粘膜施用，在制剂中使用适合于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域通常是已知的。

本发明的组合物可配制成含有可接受的稀释剂(例如，盐水和无菌水)的液体形式施用，或可配制成含有可接受的稀释剂或载体的洗剂、霜剂或凝胶形式，以赋予所需的质地、稠度、粘度和外观。可接受的稀释剂和载体为本领域技术人员所熟知，包括但不限于乙氧基化和非乙氧基化表面活性剂、脂肪醇、脂肪酸、烃油(诸如棕榈油、椰子油和矿物油)、可可脂蜡、硅油、pH平衡液、纤维素衍生物、乳化剂(诸如非离子有机和无机碱)、防腐剂、蜡酯、类固醇醇、甘油三酯、磷脂(诸如卵磷脂和脑磷脂)、多元醇酯、脂肪醇酯、亲水羊毛脂衍生物和亲水性蜂蜡衍生物。

可替代地，本发明的生物活性剂可使用本领域众所周知的药学上可接受的载体容易地配制成适于口服施用的剂量，这也是本发明的实践所考虑的。此类载体使得本发明的生物活性剂能够被配制成诸如片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等剂型，用于被治疗的患者口服摄入。这些载体可选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和无热原水。

用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的颗粒水溶液。此外，生物活性剂的混悬剂可以制备成适当的油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油(诸如芝麻油)或合成脂肪酸酯(诸如油酸乙酯或甘油三酯)。含水注射剂混悬剂可含有增加混悬剂粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以包含合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度的溶液。

可通过将生物活性剂与固体赋形剂混合，并在添加合适的助剂(如果需要)后加工颗粒混合物以获得片剂或糖衣丸芯，来获得口服药物制剂。合适的赋形剂特别是：填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，诸如海藻酸钠。此类组合物可以通过任何药学方法制备，但是所有方法都包括将一种或多种如上所述的治疗剂与构成一种或多种必要成分的载体结合的步骤。通常，本发明的药物组合物可以以本身已知的方式制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、装胶囊、包埋或冻干工艺。

糖衣丸芯具有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖衣丸包衣中加入染料或色素，用于鉴定或表征不同的颗粒剂量组合。

可口服使用的药物包括由明胶制成的推入配合式(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂(诸如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊。推入配合式胶囊可含有与填充剂(诸如乳糖)、粘合剂(诸如淀粉)和/或润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体中，诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。

本发明的生物活性剂可在数小时、数天、数周或数月内施用，这取决于若干因素，包括所治疗疾病的严重程度、是否认为疾病有可能复发等。施用可以是持续的，例如持续输注几小时、几天、几周、几个月等。可替代地，施用可以是间歇性的，例如，生物活性剂可以在几天内每天施用一次、在几小时内每小时施用一次、或任何其他认为合适的时间间隔。

本发明的生物活性剂也可作为用于喷雾器的鼻或肺吸入气雾剂或溶液、或作为用于吹入的微细粉末、单独或与惰性载体(诸如乳糖)或其他药学上可接受的赋形剂组合施用于呼吸道。

在其他特定颗粒实施方案中，颗粒递送的途径是通过胃肠道，例如口服。可替代地，可以将颗粒引入器官(诸如肺)中(例如，通过吸入粉末状微粒或含有微粒的雾化或气雾化溶液)，其中颗粒被肺泡巨噬细胞拾取，或者可以经鼻或经口施用。一旦吞噬细胞吞噬了颗粒，ACE2肽和任选的抗病毒剂被释放到细胞内部。

4.预防ACE2核转位和SARS-CoV宿主细胞进入和/或复制的方法

本发明人已确定翻译后修饰在调节病毒细胞进入受体多肽、特别是ACE2蛋白的功能活性中发挥重要作用。例如，在(i)ACE2蛋白的核定位序列(NLS)和(ii)ACE2蛋白的催化结构域鉴定了多个甲基化位点。因此，施用本发明的ACE2肽降低了对宿主ACE2蛋白的去甲基化活性(例如，通过对LSD1蛋白的竞争性抑制)，这产生许多有利的活性(例如，允许ACE2的泛素化发出蛋白酶体降解的信号；抑制/减少ACE2蛋白与IMPα的结合；从而减少ACE2蛋白的核转位等)。因此，在一些实施方案中，向个体施用ACE2肽(或包含ACE2肽序列的蛋白质分子)以预防或减少SARS-CoV在宿主细胞中的病毒复制。

因此，在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子通过抑制或减少ACE2与IMPα的结合来预防ACE2核转位。在这种类型的一些优选实施方案中，本发明包含对应于ACE2的NLS的多肽(即，SEQ ID NO：3中的氨基酸序列集)。

可替代地或另外地，本发明延伸至抑制β冠状病毒进入宿主细胞的方法，该方法包括向个体施用如上所述和/或本文其他地方所述的ACE2肽。不希望受任何特定理论或机制的束缚，通过抑制宿主ACE2蛋白的LSD1去甲基化，蛋白被靶向蛋白酶体降解(通过E3连接酶随后的泛素化)而不是被转运到细胞核。ACE2蛋白的核翻译对于ACE2在SARS-CoV的病毒复制中发挥其活性是必不可少的。

在本发明的一些特别重要的实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV-2。

5.治疗和预防用途

根据本发明，建议抑制LSD1介导的ACE2蛋白的去甲基化的蛋白质分子(例如，上述和/或本文其他地方描述的ACE2肽)可用作治疗或预防病毒感染(例如，SARS-CoV感染)的活性物质和/或药物组合物。在此类实施方案中，认为治疗或预防包括当对有需要的个体施用时，预防引发症状、检查这些症状或治疗与SARS-CoV感染相关的现有症状。

当施用于个体(例如，哺乳动物)时，本发明的蛋白质分子降低ACE2核定位(例如，通过预防ACE2和IMPα之间的相互作用)，导致肺中CD3⁺穿孔素⁺细胞的表达增加。此外，将这些蛋白质分子施用于SARS-CoV-2感染的个体(例如，哺乳动物)导致炎症减少。在一些实施方案中，个体肺部的炎症减少。优选地，个体是哺乳动物，甚至更优选地，是人。

上述或本文其他地方描述的任何ACE2肽均可用于本发明的组合物和方法中，前提是抑制剂具有药物活性。“药物活性”的ACE2肽是一种形式，当施用于有需要的个体时，其导致治疗和/或预防SARS-CoV感染，特别是SARS-CoV-2感染，包括预防引发症状、检查这些症状或治疗与感染相关的现有症状。

用于本发明方法的施用方式、施用的ACE2肽的量和ACE2肽制剂是常规的，并且处于本领域从业者的技能范围内。与合适的对照相比，通过测量指示疾病过程的一个或多个诊断参数来确定是否已经治疗了SARS-CoV感染，特别是SARS-CoV-2感染。在动物实验的情况下，“合适的对照”是未用ACE2肽治疗的动物，或用不含ACE2肽的药物组合物治疗的动物。在人类个体的情况下，“合适的对照”可以是治疗前的个体，或者可以是用安慰剂治疗的人(例如，年龄匹配的或类似的对照)。根据本发明，SARS-CoV感染的治疗包括并涵盖但不限于：(1)预防SARS-CoV病毒(例如，SARS-CoV-2病毒)被摄入宿主细胞中；(2)治疗个体中的SARS-CoV感染(例如，SARS-CoV-2感染)；(3)在具有SARS-CoV感染倾向但尚未被诊断为SARS-CoV感染的个体中预防SARS-CoV感染(例如，SARS-CoV-2感染)，因此，该治疗构成对SARS-CoV感染的预防性治疗；或(iii)引起SARS-CoV感染(例如，SARS-CoV-2感染)的消退。

因此，本发明的组合物和方法适用于治疗已被诊断患有冠状病毒感染、疑似患有SARS-CoV感染、已知易感且被认为可能发展为SARS-CoV感染、或被认为可能发展为先前治疗的SARS-CoV感染复发的个体。典型地，冠状病毒感染是SARS-CoV-1或SARS-CoV-2感染。在一些优选的实施方案中，冠状病毒感染是SARS-CoV-2感染。

在一些实施方案中，根据预期的施用方式，含ACE2肽的组合物通常含有约0.000001％至90％、约0.0001％至50％或约0.01％至约25％重量的ACE2肽，其余为合适的药物载体或稀释剂等。ACE2肽的剂量可取决于多种因素，诸如施用方式、受影响个体的物种、年龄、性别、体重和一般健康状况，并且可由本领域技术人员使用标准方案容易地确定。剂量还将考虑ACE2肽与其靶分子(例如，IMPα、LSD1等)的结合亲和力、其生物利用度及其体内和药物代谢动力学性质。在这方面，用于施用的药剂的精确量也取决于医生的判断。在确定治疗或预防病原性感染的有效施用量时，医生或兽医可以评估疾病或病症随时间的进展。在任何情况下，本领域技术人员无需过多的实验就可以容易地确定LSD1抑制剂的合适剂量。施用于患者的活性物质的剂量应足以在患者体内随时间产生有益的反应，诸如损害、消除或预防病毒摄入宿主细胞，和/或治疗和/或预防SARS-CoV感染(例如，冠状病毒感染，例如SARS-CoV-2感染)。可以以合适的时间间隔施用这些剂量，以改善血液恶性肿瘤的症状。此类间隔可以使用本领域技术人员已知的常规程序来确定，并且可以根据所用活性剂的类型及其制剂而变化。例如，时间间隔可以是每天、每隔一天、每周、每两周、每月、每两个月、每季度、每半年或每年。

可分别调整剂量和间隔，以提供足以维持其抑制作用的活性剂血浆水平。全身施用的患者常用剂量范围为1-2000mg/天，通常为1-250mg/天，通常为10-150mg/天。就患者体重而言，通常的剂量范围为0.02-25mg/kg/天，通常为0.02-3mg/kg/天，通常为0.2-1.5mg/kg/天。就患者体表面积而言，通常的剂量范围为0.5-1200mg/m²/天，通常为0.5-150mg/m²/天，通常为5-100mg/m²/天。

根据本发明的实践，ACE2肽对LSD(例如，LSD1和LSD2)的抑制将导致细胞表面上ACE2蛋白水平的降低，并因此降低宿主细胞对病毒的摄取。这将反过来导致更少的病毒感染细胞。因此，预计将会出现用辅助癌症疗法或药剂对病毒感染进行更有效的治疗。因此，本发明进一步考虑将ACE2肽与至少一种抗病毒剂同时施用。ACE2肽可在抗病毒剂后用于治疗，或可在抗病毒剂施用前使用，或与抗病毒剂一起使用。因此，本发明考虑了联合治疗，其采用ACE2肽并同时施用抗病毒剂，抗病毒剂的非限制性实例包括：广谱抗病毒剂和冠状病毒特异性抗病毒剂。

上述或本文其他地方描述的ACE2肽是在治疗SARS-CoV感染中用于单一治疗或联合治疗的特别有效的抗病毒剂。此类联合治疗的一个好处是可以施用较低剂量的其他抗病毒剂，同时仍然达到类似水平的抗病毒功效。此类较低的剂量对于已知具有遗传毒性和线粒体毒性的药物(例如，一些核苷类似物)可能特别有利。相反，使用治疗剂量的两种药物可能比仅使用一种药物获得更大的疗效。

抗病毒剂

抗病毒剂适当地选自抗微生物剂，其包括但不限于杀死或抑制微生物(包括病毒)生长的化合物和抗病毒药物。

示例性抗病毒药物包括硫酸阿巴卡韦、阿昔洛韦钠、盐酸金刚烷胺、安普那韦、氯喹、西多福韦、甲磺酸地拉韦定、去羟肌苷、依法韦仑、法匹拉韦、泛昔洛韦、福米韦生钠、膦甲酸钠、更昔洛韦、羟氯喹、氢醌、硫酸茚地那韦、拉米夫定、拉米夫定/齐多夫定、洛匹那韦、甲磺酸奈非那韦、奈韦拉平、磷酸奥司他韦、利巴韦林、瑞德西韦、盐酸金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、甲磺酸沙奎那韦、司他夫定、盐酸伐昔洛韦、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。

在一些替代的实施方案中，ACE2肽可与抗微生物剂(包括氯喹、羟氯喹和/或氢醌)共同施用。

在一些相同的实施方案和一些替代的实施方案中，抗病毒剂包含重组IFN-γ多肽(UniProt登记号P01574)。在这种类型的一些实施方案中，抗病毒剂包含IFN-γ多肽或IFN-γ多肽变体的至少一部分。

如上所述，本发明包括ACE2肽与其他药物的共同施用。应当理解，在包括将ACE2肽与其他药物一起施用的实施方案中，组合中的活性物质的剂量本身可以包括有效量，并且其他药物可以进一步增加对患者的治疗或预防益处。可替代地，ACE2肽和其他试剂可以一起构成预防或治疗SARS-CoV-2感染的有效量。还应当理解，有效量可以在特定治疗方案的背景下定义，包括例如施用的时间和次数、施用方式、制剂等。在一些实施方案中，ACE2肽和任选的抗病毒剂按例行时间表施用。可替代地，抗病毒剂可以在症状出现时施用。如本文所用，“例行时间表(routine schedule)”是指预定的指定时间段。只要时间表是预先确定的，例行时间表可以包含长度相同或不同的时间段。例如，例行时间表可包括每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每月或其间任何设定天数或周数、每两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月等施用ACE2肽。可替代地，预定的例行时间表可包括在第一周每天同时施用ACE2肽和抗病毒剂，随后在几个月内每月施用一次，之后每三个月施用一次。只要提前确定适当的时间表涉及某一天的施用，例行时间表将涵盖任何特定的组合。

此外，本发明提供了用于减少或消除宿主细胞摄取病毒(例如，SARS-CoV-2)的药物组合物，该药物组合物包含ACE2肽和任选的用于治疗感染的抗病毒剂。本发明的制剂以药学上可接受的溶液施用，该溶液通常含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、佐剂和任选的其他治疗成分。根据所治疗的具体情况，制剂可以全身或局部施用。制剂和施用技术可以在最新版的“《雷明顿药物科学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)”,麦克出版公司,伊斯顿，宾夕法尼亚州中找到。合适的途径可以包括例如：口服、直肠、经粘膜或肠道施用；肠胃外施用，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。对于注射，本发明的活性剂或药物可以配制在水溶液中，适宜地配制在生理学相容的缓冲液中，诸如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液。对于经粘膜施用，在制剂中使用适合于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域通常是已知的。

本发明药物的剂型还可包括专门为此目的设计的注射或植入控释装置，或经改良以此方式另外发挥作用的其他形式的植入物。本发明药物的控释可以通过例如用疏水性聚合物包衣来实现，该疏水性聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸以及某些纤维素衍生物，诸如羟丙基甲基纤维素。此外，可以通过使用其他聚合物基质、脂质体或微球来实现控制释放。

本发明的药物可作为具有药学上相容的抗衡离子的盐提供。可与许多酸形成药学上相容的盐，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐倾向于更易溶于相应的游离碱形式的水或其他质子溶剂中。

对于本发明方法中使用的任何化合物，可最初从细胞培养测定中估计治疗有效剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量，以实现包括在细胞培养中测定的IC50的循环浓度范围(例如，活性剂的浓度，其实现ACE2肽活性的半数最大抑制)。此类信息可用于更准确地确定人类的有效剂量。

可通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定此类药物的毒性和治疗功效，例如，用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为LD50:ED50的比值。优选显示大治疗指数的化合物。从这些细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于配制一系列用于人类的剂量。此类化合物的剂量优选在包括ED50的循环浓度范围内，几乎没有或没有毒性。剂量可以在此范围内变化，这取决于所用的剂型和所用的施用途径。具体的制剂、施用途径和剂量可以由个体的医生根据患者的情况进行选择(例如，参见Fingl等人,1975,《治疗学的药理学基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)第1章)。

可替代地，可以局部而非全身方式施用化合物，例如，通过将化合物直接注射到组织中，该组织优选为皮下或网膜组织，通常为储库或持续释放制剂。

此外，可在靶向药物递送系统中施用药物，例如，在涂有组织特异性抗体的脂质体中。脂质体将靶向组织并被该组织选择性吸收。

在局部施用或选择性摄取的情况下，药剂的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。

为便于理解本发明并付诸实践，现将通过以下非限制性实施例描述特定优选实施方案。

实施例

实施例1

测定ACE2上PTM位点

两种ACE2蛋白内的一系列蛋白质结构域被鉴定为对SARS-CoV-2进入细胞至关重要。这些蛋白质结构域受到表观遗传翻译后修饰(赖氨酸甲基化、去甲基化、SUMO化(sumoylation)和磷酸化)。

因此，使用生物信息学分析来鉴定对LSD1或PKCtheta和E3连接酶独特的特异性翻译后修饰(PTM)。多项研究现已证明，翻译后PTM是调节包括p53在内的关键蛋白质的动态调节的关键和常见机制。

因此，假设这些ACE2 PTM对于与SARS-CoV-2的相互作用和病毒进入细胞至关重要。病毒复制过程的一部分包括将蛋白质运输到细胞核中，以利用它们作为转录调节因子进行更有效的转录。因此，鉴定了ACE2蛋白中推定的核定位信号(NLS)。这种肽对靶蛋白质具有选择性和特异性，并且对每个蛋白质内的特定结构域具有选择性。

使用设计用于分析和鉴定蛋白质序列内翻译后基序(磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化、泛素化等)的软件进行广泛的生物信息学序列分析，还采用了用于鉴定核定位序列(NLS)的生物信息学软件，其对蛋白质序列内规范和非规范NLS的概率进行评分。所有分析都包括临界值，以减少假阳性并增加严格性。使用的软件包括NLS-mapper用于鉴定NLS基序(Kosugi等人，2008；Kosugi等人，2009a；Kosugi等人，2009b)，PSSMe用于鉴定甲基化/去甲基化的潜在位点(Wen等人，2016)，Phosphorylation NetPhos 3.1Server用于鉴定潜在的磷酸化基序(Blom等人，2004)，Predict-Protein用于进一步的蛋白质结构域分析(Su等人，2019；Ofran等人，2007)。

该信息被每个分析的蛋白质内的已知蛋白质结构域所覆盖。最后，蛋白质化学家检查这些信息，以最终确定肽抑制剂序列和靶标。

我们已经用ACE2蛋白序列鉴定了一系列被PKCq磷酸化的关键丝氨酸残基和关键赖氨酸甲基化位点，这些甲基化的赖氨酸残基也代表LSD1介导的去甲基化的位点。其他蛋白质已被证明受赖氨酸甲基化和去甲基化或磷酸化的动态调节，包括p53。LSD1在单个赖氨酸残基上调节p53，赋予p53精细的调节控制(Huang等人,2007)。因此，所有此类PTM位点都有可能显著影响这些蛋白质的调节。

实施例2

LSD1和ACE2在细胞表面结合

LSD1是一种关键的消除酶，其使关键组蛋白和关键蛋白质(诸如转录因子)去甲基化，由此这种去甲基化/甲基化翻译后修饰已导致靶蛋白质(诸如p53)表达的诱导、抑制或稳定。基于这些数据，研究了LSD1作为受体ACE2和TMPRSS2的关键调节因子的作用，该受体负责将SARS-CoV-2运送到细胞中。

ASI数字病理学分析用于检测监测细胞表面表达的非透化Caco-2细胞和监测细胞内区室化的透化细胞。细胞对ACE2、TMPRSS2和LSD1蛋白染色呈阳性。引人注意的是，传统上被描述为细胞质或核蛋白的LSD1在细胞表面也呈阳性染色(参见图1)。LSD1与ACE2显著共定位，如PCC(r)系数所证明的，该系数决定了两种蛋白质靶标之间的共定位程度。该分析显示ACE2和LSD1在细胞表面上强烈共定位。Caco-2细胞的FACS分析进一步证实了这一点。抗SARS-CoV-2感染的MRC5细胞不表达ACE2或TRMPSS2。然而，这些细胞在细胞表面表达LSD1，尽管与SARS-CoV-2易感细胞系Caco-2相比低至后者的四分之一。

本发明人随后研究了SARS-CoV-2感染对LSD1和ACE2/TRMPSS2共表达的影响。高分辨率定量成像和FACS分析用于检测SARS-CoV-2感染的Caco-2或Caco-2/αMRC5细胞。细胞用ACE2染色；以及表观遗传酶LSD1或LSD1和SARS-CoV-2的核衣壳或刺突蛋白的抗体(参见图2A-C)。与未感染的CaCo2和MRC5细胞(其对SARS-CoV-2感染不敏感)中的ACE2/LSD1表达相比，LSD1在SARS-CoV-2感染细胞中与ACE2显著共定位更高，这由决定两种蛋白质靶标之间共定位程度的PCC(r)系数以及在感染细胞中LSD1和ACE2的显著上调表达所证明。MRC5没有表达ACE2，也没有病毒蛋白质染色(图2D)。有意思的是，LSD1与SARS-CoV-2刺突蛋白和核衣壳蛋白共定位。此外，如通过H3k9me2和H3k4me2表达的减少所测量的，LSD1核活性增加(图2F、G)。引人注意的是，当比较两种关键的甲基转移酶(G9A和SETDB1)时，在SARS-CoV-2感染后，细胞表面几乎没有表达或没有增加(图2H-J)。

这些结果清楚地证明了LSD1和ACE2在细胞表面上的结合增加。

材料和方法

显微镜方法

为了检测感染细胞或未感染细胞(未处理或用MAOis或EPI-111(肉豆蔻基-RRTSRRKRAKV-OH)处理)中的LSD1、ACE2、TMPRSS2和SARS-CoV-2的特征，通过与0.5％Triton X-100一起孵育15分钟来透化MRC5细胞，用溶于PBS中的1％ BSA阻断，并且用LSD1(兔宿主)、ACE2(缀合至AF594)、TMPRSS2(小鼠宿主)以及在感染细胞的情况下的SARS-CoV-2(小鼠宿主)探测，并且用驴抗小鼠AF 488或驴抗兔647观察，或者将抗体初次缀合至合适的AF荧光染料(AF 594)。将盖玻片安装在具有Prolong玻璃抗淬灭试剂(LifeTechnologies)的玻璃显微镜载玻片上。通过数字病理学激光扫描显微镜定位蛋白质靶标。使用运行ASI软件的100×油浸透镜的ASI数字病理显微镜获得单个0.5μm切片。通过对同一切片的四幅连续图像求平均来获得最终图像。使用自动化ASI软件(实用光谱影像(AppliedSpectral Imaging)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))分析数字图像以利用平均核荧光强度(NFI)的自动阈值和背景校正自动确定分布和强度，从而允许特异性靶向目的蛋白质的表达。还使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH,Bethesda,MD,USA))分析数字图像，以确定未透化细胞的总细胞荧光或仅细胞表面荧光。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH,Bethesda,MD,USA))分析了数字图像，以测定总核荧光强度(TNFI)、总细胞质荧光强度(TCFI)。使用ImageJ软件，该软件具有自动阈值，并且手动选择对细胞核特异性的目的区域(ROI)以计算每对抗体的皮尔逊系数相关性(PCC)。PCC值的范围如下：-1＝完全排除共定位，0＝无共定位，+1＝完全共定位。使用Mann-Whitney非参数检验(GraphPad Prism，加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad Software公司(GraphPad Software,San Diego,CA))来确定数据集之间的显著性差异。

实施例3

LSD1抑制剂消除ACE2表达并抑制SARS-CoV-2表达

基于上述发现，假设LSD1与ACE2复合并对ACE2进行去甲基化以稳定表达。

生物信息学分析清楚地显示，在ACE2中，有三个高概率的赖氨酸残基被LSD1翻译后修饰，并且这些赖氨酸残基是C末端结构域和新的推定核定位序列(NLS)的一部分。ACE2的C末端结构域是高度灵活的无序结构域，适合蛋白质-蛋白质相互作用(参见图3A)。本发明人在体外用重组LSD1和ACE2 C末端结构域证实了它们确实以1：1的比例直接相互作用(参见图3B)。接着，本发明人证明了用苯乙肼(一种双重靶向脱甲基酶和核LSD1抑制剂)抑制LSD1消除了LSD1与ACE2和TMRPSS2的表达和共定位(图3C-F)。此外，对ACE2转录的影响很小。这些结果表明，与TMPRSS2相反，LSD1抑制通过抑制去甲基化来干扰ACE2蛋白在细胞表面的表达，而TMPRSS2则通过LSD1作为表观遗传调节子的传统作用来调节。

材料和方法

微量热泳动方法

在Monolith NT.115(NanoTemper Technologies)上进行结合亲和力测量。荧光素-Ahx标记的ACE2肽序列RDRKKKNKARSGEN由Genescript制造。每个反应由10μL浓度为444nM的标记肽组成，与所示浓度的未标记LSD1混合。所有实验均于25℃测量，激光关/开/关时间为5/30/5秒。实验在20％发光二极管功率和20-40％ MST红外激光功率下进行。使用来自热泳+T-Jump的信号，通过NT分析软件1.5.41版(NanoTemper Technologies)将来自三个独立进行的实验的数据拟合到单一结合模型。

实施例4

全转录本分析

为了鉴定在SARS-Cov-2感染CaCo2细胞中受LSD1抑制影响的无偏全基因表达程序，进行全RNA测序分析以允许鉴定此类基因簇。

尽管程度不同，但LSD1抑制对关键抗病毒过程、负责病毒进入的关键蛋白质以及SARS-CoV-2病毒在宿主细胞中的转录和复制产生影响(参见图4)。LSD1抑制剂对这些途径的不同程度影响可归因于每种抑制剂的不同作用模式，其中苯乙肼影响催化、核和结构功能。

实施例5

细胞内ACE2在感染细胞中的相互作用

在感染细胞中检测细胞内ACE2的特征，包括ACE2的细胞核和细胞质部分，以了解ACE2在SARS-CoV-2感染中的作用。

易受SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞在透化细胞中显示出ACE2的细胞质和细胞核表达增加(图5A-C)。ACE2的Fn/c比率(得分>1表示核偏向)在感染后也显著增加。对于LSD1，观察到类似的模式。

材料和方法

RNA Seq分析

RNA-seq数据获自用SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞系。测试了三种不同的处理(命名为Phe、Gsk和L1)，每种处理都以不同的方式靶向相同的基因。总共从四个实验组采集了8个样品：

·用SARS-CoV-2对照感染的Caco-2细胞(2×重复)；

·用Phe处理的SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞(2×重复)；

·用Gsk处理的SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞(2×重复)；和

·用L1处理的SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞(2×重复)。

目的是使用edgeR在对照组和每个处理组之间进行差异表达分析，以找到差异表达的基因。然后，本发明人比较了处理组之间的基因，以发现共同的和独特的基因，并进行途径分析。

生成RNA-seq数据，将fastq数据下载到QIMR伯格霍夫医学研究所(BerghoferMedical Research Institute)服务器，然后由Scott Wood存档到HSM。使用Cutadapt(1.9版；Martin(2011))对序列读段的接头序列进行修剪，并使用STAR(2.5.2a版；Dobin等人(2013))与GRCh37组装体进行比对，该组装体具有Ensembl(89版)基因模型的基因、转录本和外显子特征，且SARS-CoV-2RefSeq登记号为NC_045512。使用RNA-SeQC(1.1.8版；DeLuca等人(2012))计算质量控制指标，并使用RSEM(1.2.30版；Li和Dewey(2011))评估表达。

质量控制

RNA-seq样品的质量控制是保证质量和可再现分析结果的重要步骤。为此目的运行了RNA-SeQC，其结果可在HPC集群上找到。另一个常见的质量指标是RNA样品是否被线粒体DNA(mtDNA)污染，或者样品中是否有大量的核糖体RNA(rRNA)。我们确定了Ensembl生物型的读段数量，包括蛋白质编码基因、rRNA和线粒体。假设我们使用95％的阈值的读段映射到蛋白质编码区，7个样品通过了该QC测量。

归一化

归一化的目的是消除基于系统技术影响的样品之间的差异，以保证这些技术偏差对结果的影响最小。文库大小对于校正至关重要，因为测序的初始RNA量的差异会影响测序的读段。与其他样品相比，RNA在一个样品中比过度呈现时，就会出现RNA序列组成的差异。在这些样品中，其他RNA将被欠采样，这将导致预测差异表达基因时假阳性率更高。

归一化方法

在我们的分析中，我们通过将每个样品的基因计数除以映射的百万个读段来校正文库大小。这种程序是一种常见的方法，称为每百万计数(CPM)。我们使用Robinson和Oshlack(2010a)提出的称为M值的修剪平均值(TMM)的方法进一步校正了RNA组成的差异。我们使用edgeR软件包(Robinson、McCarthy和Smyth(2010b))中的函数calcNormFactors()来获得TMM因子，并使用这些因子来校正RNA组成的差异。

差异表达分析

使用R软件包edgeR(Robinson、McCarthy和Smyth(2010b))进行了差异表达(DE)分析。注意，DE分析的输入是过滤的但未归一化的读段计数，因为edgeR在内部进行归一化(文库大小和RNA组成)。glmQLFit()函数用于将拟似然负二项式广义对数线性模型拟合到每个基因的读段计数。使用glmQLFTestO函数，我们对给定的对比度进行了逐基因的经验贝叶斯拟似然F检验(gene-wise empirical Bayes quasi-likelihood F-tests)。根据edgeR用户指南，“强烈建议将拟似然法用于批量RNA-seq数据的差异表达分析[相对于似然比检验]，因为它通过考虑离散度估计的不确定性，提供了更严格的错误率控制。”

实施例6

新型P604 ACE2肽抑制剂

在确定ACE2的C末端结构域似乎是由LSD1脱甲基酶活性介导的ACE2在细胞表面稳定性的关键位点后，本发明人提议开发一种竞争性肽抑制剂，其干扰和阻断靶向该位点的LSD1，这将消除ACE2表达。此外，本发明人提出C末端结构域中的核定位序列(NLS)(即，RKKKNK)是IMPα(一种关键的核穿梭蛋白)的结合位点。据推测，IMPα多肽在该位点的相互作用通过去甲基化而增强，这将允许ACE2和任何结合的病毒转移到细胞核。本发明人还认为ACE2在直接调节转录中具有新的核作用，类似于现在鉴定的传统上作为细胞质蛋白发挥作用的关键信号激酶。

构建肽序列(P604)以靶向ACE2的C末端结构域上的LSD1介导的去甲基化基序和NLS(TGIRDRKKKNKRS；SEQ ID NO：3)。还显示该结构域与IMPα相互作用。用靶向LSD1和ACE2的相互作用结构域(也是ACE2的推定NLS)的ACE2肽处理的Caco-2细胞使ACE2在细胞表面的表达不稳定(参见图6)，抑制了ACE2的表达，结果降低了细胞表面LSD1的表达(参见图6A-F)。LSD1和ACE2的PCC(r)也显著消除，这测量了两种蛋白质标志物之间的共定位程度(参见图6)。

实施例7

P604 ACE2肽抑制剂对SARS-COV-2的影响

然后，本发明人研究了P604 ACE2肽抑制剂的效果是否影响宿主ACE2基因或TMPRSS2基因和SARS-CoV-2的刺突蛋白的表达，或SARS-CoV-2的核衣壳的表达。

图7显示ACE2肽抑制剂(P604)能够显著抑制和下调宿主ACE2以及SARS-CoV-2的核衣壳和刺突蛋白的表达。

实施例8

使用Neon转染系统，用VO(仅质粒载体)或LSD1-WT(具有LSD1 WT基因的质粒载体)转染MRC5或Caco-2细胞。用抗ACE2或LSD1的抗体进行免疫荧光分析。根据上面提供的数据，正如所预期的，与VO相比，用LSD1-WT转染的细胞中的LSD1也有显著增加(图8)。分析显示，在用LSD1-WT转染的细胞中LSD1的过表达显著增加了Caco-2细胞中ACE2的表达，以及显著增加了MRC5细胞中ACE2的表达。

材料和方法

使用NEON电穿孔转染系统(Life Technologies)用LSD1 WT质粒或VO构建体转染Caco-2或MRC5细胞。通过与0.5％ Triton X-100一起孵育15分钟来透化转染的细胞，并用兔抗LSD1和小鼠抗ACE2抗体进行探测。将盖玻片安装在具有Prolong NucBlue抗淬灭试剂(Life Technologies)的玻璃显微镜载玻片上。通过共聚焦激光扫描显微镜定位蛋白质靶标。使用ASI数字病理学平台，使用运行ASI软件的100×油浸透镜，获得单个0.5μm切片。通过对同一切片的四幅连续图像求平均来获得最终图像。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH,Bethesda,MD,USA))分析数字图像，以确定平均荧光强度(平均FI)。使用Mann-Whitney非参数检验(GraphPad Prism，加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad Software公司(GraphPad Software,San Diego,CA))来确定数据集之间的显著性差异。

实施例9

SARS-COV-2患者BALC、PBMC和血浆的采集和保存

支气管肺泡灌洗细胞(BALC)和外周血单核细胞(PBMC)的采集和储存；血浆采集、SARS-CoV2病毒检测和安全储存。

材料和方法

仅患有SARS-CoV-2感染的患者(第1组，n＝5)；患有SARS-CoV-2感染的早期和晚期实体瘤癌症患者(第2组，n＝5)；以及健康供体(第3组，n＝5)。将获得参与研究的书面同意书，并将根据标准国家/地方指南对患者进行随访，并定期进行临床检查。血液样品(总共40mL)将由临床试验护士采集，作为标准血液采集的一部分。临床病理/病毒学数据将由临床团队采集。PBMC将根据我们制定的方案进行分离，并储存在液氮中。将采集血浆用于通过RT-PCR进行SARS-CoV-2检测，并储存在-80℃用于病毒感染测定。将在2小时内在BSL-3实验室获得并处理BALF(20mL/名患者)。BALC将通过过滤和离心得以分离，然后重新悬浮在培养基中以备将来使用。

将通过针对ACE2的qRT-PCR和流式细胞术以及使用靶向ACE2的抗体的数字病理学来测定经抑制剂处理/未经抑制剂处理的SARS-CoV-2感染细胞。

将使用抑制剂对PBMC进行预处理，并使用实时细胞分析仪进行杀伤测定。实施例10

新型细胞可透过性肽抑制ACE2-剌突相互作用和SARS-CoV-2进入细胞

为了检测去甲基化ACE2赖氨酸31与SARS-CoV-2剌突蛋白在细胞表面的相互作用的影响，通过结构分析和靶序列建模(图9A)、肽长度优化和丙氨酸步移确定关键残基，开发了两种新型ACE2肽抑制剂(ACE2-01和ACE2-02，参见表5)。ACE2-01与剌突相互作用区重叠，向下游延伸超过赖氨酸去甲基化基序，而ACE2-02延伸并终止于赖氨酸31，以促进对这一关键残基的研究(图9B)。预测这两种肽都竞争性地阻断剌突蛋白与赖氨酸31之间的相互作用，或者通过干扰ACE2/剌突蛋白的相互作用，或者通过结合剌突蛋白作为诱饵。这些肽也竞争性地阻断赖氨酸31的酶促进入作为诱饵相互作用，通过模拟ACE2/剌突结合结构域/赖氨酸d-甲基化基序干扰赖氨酸31的去甲基化，意味着LSD1催化袋部或RBD剌突结构域与肽而非靶蛋白相互作用，以预防赖氨酸31的去甲基化或剌突-ACE2相互作用。

表5

新的ACE2肽序列

ACE2-01	IEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNT
		ACE2-02	STIEEQAKTFLDK

与未处理的对照细胞相比，在长达96小时的处理中，ACE2肽抑制剂均未改变细胞增殖(图9C)。为了评估ACE2-01和ACE2-02对SARS-CoV-2复制的影响，用SARS-CoV-2(MOI1.0)感染Caco-2细胞，然后用肽抑制剂处理48小时(图9D)。使用培养物上清液和感染细胞的qRT-PCR，ACE2-01和ACE2-02处理在48hpi下分别显著降低了细胞培养物上清液中的感染(图9E)，降低倍数分别为6.6倍和4.6倍。在48hpi下用ACE2-01和ACE2-02处理后，感染细胞中的病毒RNA也分别减少了，减少倍数分别为3.3倍和2倍(图9E)。

接着，通过来自用ACE2-01和ACE2-02处理的感染细胞的上清液的中值组织培养感染剂量(TCID₅₀)来定量感染性病毒滴度，这进一步证实了病毒载量降低了，降低倍数分别为4.5倍和3.2倍(图9F)。此外，使用数字病理学检测剌突蛋白强度来评估对SARS-CoV-2感染的抑制(图9G和9H)。两种抑制剂都显著降低了感染细胞表面和细胞内的SARS-CoV-2剌突蛋白(图9G和9H)，剌突蛋白和ACE2的共定位也显著降低(图9G)。最后，使用邻位连接实验来评估ACE2和剌突蛋白在SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞表面的共定位。GSK处理显著降低了ACE2剌突蛋白之间的相互作用，而ACE2-01和ACE2-02肽抑制剂进一步破坏了细胞表面的ACE2/刺突复合物(图PN 234091)。这表明通过抑制LSD1活性使ACE2甲基化有助于阻断SARS-CoV-2刺突蛋白对ACE2的作用。此外，用肽抑制剂竞争性阻断对赖氨酸31基序的接近抑制了刺突蛋白对ACE2的接近。总之，这些数据证明了病毒刺突蛋白与ACE2的赖氨酸31去甲基化基序之间的相互作用对于SARS-CoV-2复制是重要的，并且我们的肽抑制剂通过显著降低刺突蛋白与ACE2的共定位而具有抗病毒活性。

上述数据显示，在SARS-CoV-2感染后，LSD1在细胞表面与ACE2结合。此外，预计ACE2赖氨酸31将经历去甲基化/甲基化(图10A)，并与SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域(RBD)中的谷氨酰胺493相互作用(Shang等人，2020)。因此，本发明人利用模拟甲基化赖氨酸31基序的肽，通过LSD1活性测定，研究了LSD1在赖氨酸31处直接去甲基化ACE2的能力。为了评估LSD1抑制是否减少了赖氨酸31处的ACE2去甲基化，将单独的重组LSD1蛋白或与二甲基化ACE2肽预孵育的重组LSD1蛋白(表6和图10B)用作底物，通过体外LSD1活性测定来测量去甲基化反应。该肽含有使用计算机预测软件PSSme预测进行甲基化/去甲基化的基序(Sheng等人，2018)，并且还代表SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)中的谷氨酰胺493和ACE2之间的结合区域(Shagn等人，2020)：QAKTFLD{Lys(Me2)}FNHEAED，在位置31处具有二甲基化的赖氨酸。LSD1有效地使ACE2肽在赖氨酸31处去甲基化。

表6

ACE2me2肽序列总结

ACE2肽	序列	长度
			ACE2me2	QAKTFLD{Lys(Me2)}FNHEAED	15
PEP1	TGIRDR{Lys(Me2)}KKNKARS	14
			PEP2	TGIRDRK{Lys(Me2)}KNKARS	14
PEP3	TGIRDRKK{Lys(Me2)}NKARS	14
			PEP4	TGIRDR{Lys(Me2)}K{Lys(Me2)}NKARS	14

实施例11

ACE2肽抑制剂的丙氨酸突变

上述数据清楚地表明，ACE2-01和ACE2-02肽均能够显著抑制刺突蛋白与CaCo2细胞的细胞表面结合。因此，发明人下一步的动机是研究被测试的肽抑制剂的基本残基。丙氨酸突变步移实验显示，在赖氨酸31处的丙氨酸取代显著降低了抑制效果，表明该赖氨酸残基是关键的(图11)。虽然总体上没有其他丙氨酸取代具有类似的效果，但与其他取代相比，赖氨酸26处的丙氨酸取代降低了肽的有效性(但没有消除抑制)。

根据两种肽抑制剂之间的重叠序列并基于病毒感染工作，这证明较短的肽(ACE2-02)与较长的肽序列(ACE2-01)一样有效。只要其他残基的总电荷/大小保持不变，对抑制效果就没有明显的影响。

材料和方法

Caco-2细胞(8×10⁴)在盖玻片上接种48小时，然后用来自ACE2-01或ACE2-02的丙氨酸步移的肽(每种肽10mM)处理24小时，接着用20μL纯化的SARS-CoV-2755刺突蛋白S1(Glu14-Ser680)处理24小时，该纯化的SARS-CoV-2755刺突蛋白在C末端含有多聚组氨酸标签(1.52mg/mL)。然后用对SARS-CoV-2刺突蛋白特异的抗体对未透化样品进行染色，并用靶向宿主一抗的二抗进行观察。通过数字病理学激光扫描显微镜定位蛋白质靶标。使用运行ASI软件的100×油浸透镜，使用ASI数字病理显微镜获得单个0.5μm切片(ASI数字病理学既表征了正常免疫荧光成像的荧光强度，也表征了对抗体阳性或阴性的细胞群体进行计数的能力，允许使用强大的定制设计算法和自动化载物台研究群体动态。这也允许对大细胞数进行成像和计数以获得统计功效。)通过对同一切片的四幅连续图像求平均来获得最终图像。使用如前所述的自动化ASI软件63(实用光谱影像(Applied Spectral Imaging)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))来分析数字图像，以利用平均荧光强度(FI)的自动阈值和背景校正来自动确定分布和强度，从而允许特异性靶向目的蛋白质的表达。

实施例12

P604 ACE2肽抑制剂破坏核ACE2输入蛋白机制

P604 ACE2肽抑制剂通过在体外(图12A、B)和SARS-CoV-2易感细胞系中(图12C、D)直接抑制ACE2-输入蛋白复合物，来抑制ACE2的核穿梭。重要的是，这些数据证实了这种肽抑制剂特异性靶向核ACE2，并且不影响由输入蛋白途径靶向的其他关键核蛋白。检测两种蛋白靶标(未修饰的ACE2(ACE2unmod)或IMPα1)的密切相互作用的DUOLINK分析在用对照或增加浓度的P604肽处理的H1299(肺细胞系)上进行。分析显示，在溶媒对照样品中，ACE2和IMPα1形成了显著的相互作用，表明ACE2unmod能够与输入蛋白核运输机制发生强烈的相互作用。引人注目的是，即使是最低浓度的P604肽也显著地全部消除了这种相互作用(图12C)。综合上述实施例，本发明人清楚地表明，P604ACE2肽是核ACE2-输入蛋白途径(SARS-Cov2复制的关键途径)的选择性抑制剂。

材料和方法

荧光偏振竞争实验

使用由GeneScript Biotech(新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway,NJ))制造的荧光素-Ahx标记的ACE2肽序列RDRKKKNKARSGEN(即，SEQ ID NO：1中列出的序列的残基776-779)、由Mimitopes公司(澳大利亚墨尔本(Melbourne,Australia))制造的P604 ACE2肽序列肉豆蔻基-TGIRDRKKKNKARS-OH以及重组表达的输入蛋白αΔIBB蛋白，使用CLARIOstarPlus酶标仪(BMG Labtech)进行荧光偏振实验。每个实验含有50nMACE2FITC、10μM输入蛋白αΔIBB蛋白和两倍系列稀释的P604 ACE2肽(起始浓度400μM)，跨越10个孔，总体积为200μL。使用96孔黑色Fluotrac微孔板(Greiner Bio-One；澳大利亚克雷姆斯明斯特(Kremsmünster,Australia))。重复实验三次，并含有阴性对照(无抑制剂)和空白(无输入蛋白αΔIBB蛋白)。使用GraphPad Prism将三份数据归一化并拟合到单一抑制曲线。

电泳迁移率变动实验

将FITC-Ahx标记的ACE2肽(90μM)与输入蛋白αΔIBB蛋白(100μM)和P604ACE2肽抑制剂(500μM)混合，并通过溶于TB缓冲液(45mM硼酸，45mM Tris碱，pH 8.5)中的1％琼脂糖凝胶在40V电泳90分钟。单独的ACE2肽、单独的P604 ACE2肽抑制剂和单独的输入蛋白αΔIBB用作对照。在使用考马斯亮蓝染色之前，凝胶首先使用Gel Doc XR+系统在紫外光下成像。

邻位连接实验

使用PLA探针抗小鼠PLUS(DU092001)、PLA探针抗兔MINUS(DU092005)和DUOLINK原位检测试剂红色试剂盒(DU092008)(Sigma Aldrich)进行DUOLINK邻位连接实验。将细胞固定、透化，并且细胞与靶向未修饰ACE2(ACE2unmod)和IMPα1的一抗一起孵育。根据制造商的建议处理细胞。最后，将盖玻片安装在载玻片上，并如上所述进行检测。

实施例13

P604 ACE2肽抑制剂减少肺部炎症

在仓鼠模型中，在用P604 ACE2肽抑制剂(氨基酸序列TGIRDRKKKNKARS)处理的动物的肺中观察到病毒RNA显著减少，分别通过IV和IP注射施用(图13A)。当相对于溶媒组归一化时，用P604 ACE2肽通过IV和IP施用处理的动物显示病毒载量分别显著降低了88％和96％(图13B)。与溶媒组相比，如通过TCID50测定所测量的，P604 ACE2肽IV和IP处理的动物的肺感染滴度分别降低(图13C)。图13D ASI数字病理学成像证明，通过IV或IP途径的P604ACE2肽处理，支气管肺切片中SARS-CoV-2刺突蛋白阳性细胞群显著减少。此外，即使细胞对SARS-CoV-2刺突蛋白呈阳性，对刺突蛋白表达的分析显示，在IP和IV施用处理组中，信号的总体强度也显著降低。

为了评估P604 ACE2肽抑制剂处理对SARS-Cov-2诱导的肺病理的影响，由对处理不知情的单个兽医病理学家对苏木精和伊红(H&E)染色的肺切片进行评分，如前所述(图14A)。使用0-4/0-5等级对以下参数的组织学得分进行评分：总体病变范围、支气管炎、肺泡炎、血管炎、间质性炎症和肺细胞增生，并对每个肺的得分进行求和以获得总组织病理学得分(图14B)。当在2dpi时在炎症的早期阶段分离肺，观察到轻度-中度的肺变化(图14A-B)，最显著的是在细支气管内，并且没有观察到肺细胞增生。在肺损伤的早期阶段，在具有上皮内白细胞浸润和广泛的凋亡溶媒组中可见支气管上皮细胞严重变性和坏死的证据(图14，第一张图)。溶媒组的早期血管变化包括嗜异细胞和单核细胞的边缘化，随后透壁迁移导致内皮内层和平滑肌的破裂(图14A中间照片，图14B)。相比之下，大多数P604 ACE2肽抑制剂IV和IP处理的动物在细支气管或血管中显示出最小的变化(图14A，右图，图14B)。此外，嗜异细胞和肺泡巨噬细胞的早期轻度肺泡积聚在溶媒组中最为常见。总体而言，处理动物的平均积聚分数显著低于溶媒组，这表明P604 ACE2肽抑制剂处理可预防与SARS-Cov-2感染相关的早期肺部炎症。

材料和方法

仓鼠耐受性和功效研究

雌性金黄叙利亚仓鼠(6-8周)获自Janiver Labs(Le Genest-Saint-lsle，法国)并由Biotechnology(Dijon Cedex，法国)进行研究。对于耐受性实验，动物(每组3只)通过腹膜内注射接受递增剂量的P604 ACE2肽抑制剂或ACE2肽。剂量每天递增(第1天：25mg/kg；第2天：50mg/kg；第3天：100mg/kg)，并在第4天处死之前监测的动物。在施用后的6小时内，每2小时记录一次动物的生存力、行为和直肠温度，每天测量体重。对于P604 ACE2肽抑制剂功效研究，通过静脉内(IV，15mg/kg，第0天一次和第1天两次，间隔8小时)或腹膜内(IP，100mg/kg，第0、1、2天每天)注射，用溶媒(IP，第0、1和2天每天)(氯化钠0.9％，法国巴黎的Osalia公司(Paris，France))或P604 ACE2肽抑制剂处理动物(每组8只)。对于P604 ACE2肽抑制剂功效研究，用溶媒或P604 ACE2肽抑制剂(30mg/kg，IN，每天两次，第0天，间隔18小时)处理动物。对于所有功效研究，在SARS-Cov-2感染前1小时，在第0天对动物施用肽(10⁴PFU；IN施用)与最初由欧洲病毒档案库全球库(European VirusArchive global)提供的SARS-CoV-2毒株“Slovakia/SK-BMC5/2020”进行比较。所有关于金黄叙利亚仓鼠的程序都提交给了经法国当局批准的CEA机构动物护理和使用委员会。

基因组RT-qPCR检测肺部病毒载量

使用病毒ORFlab基因(正向：CCGCAAGGTTCTTCTTCGTAAG；反向：TGCTATGTTTAGTGTTCCAGTTTTC；探针：AAGGATCAGTGCCAAGCTCGTCGCC[5']Hex[3']BHQ-1)通过RT-qPCR进行肺病毒载量的定量。使用96病毒核心试剂盒(德国迪伦县的Macherey Nagel公司(Duren，Germany))进行病毒RNA的提取，并于-80℃冷冻直至qRT-PCR。使用Superscript^TMIIIOne-Step qRT-PCR系统试剂盒(货号#1732-020，LifeTechnologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))进行完整的qRT-PCR，其中引物和qRT-PCR条件靶向ORFlab基因。使用Bio-Rad CFX 384^TM(加利福尼亚州赫拉克勒斯市的Bio-Rad公司(Hercules，CA))和邻近的软件进行扩增。

肺部病毒TCID₅₀测定

在检测前两小时，将Vero E6/TMPRSS2细胞以每孔25000个细胞的密度在200μL体积的完全生长培养基中铺于96孔板中，(DMEM 10％ FCS)中。在37℃，用第2天肺匀浆的系列稀释液(三次重复)感染细胞1小时。然后加入新鲜培养基72小时。细胞感染后，根据供应商方案(货号G5430，威斯康星州麦迪逊市的Promega(Madison，WI))进行MTS/PMS分析。简而言之，在丢弃100μL上清液后，将20μL体积的MTS/PMS试剂加入剩余的100μL上清液中。4小时后，用Elisa酶标仪读板并记录数据。

实施例14

P604ACE2肽诱导抗病毒特征并消除核ACE2

本发明人接下来希望解决CD3阳性T淋巴细胞的存在，因为先前研究已显示在5dpi时在支气管周围区域中检测到CD3+T淋巴细胞，这可促进受感染细胞的快速清除。

通过IP或IV途径用P604 ACE2肽抑制剂处理能够显著诱导穿孔素阳性细胞增多，并诱导更多CD3+细胞表达穿孔素。用P604 ACE2肽抑制剂处理显著增强了效应标志物穿孔素的表达，穿孔素是抗病毒活性所必需的。总体而言，P604 ACE2肽抑制剂能够通过增加穿孔素和CD3浸润来诱导强烈的抗病毒特征。

材料和方法

免疫荧光

使用之前建立和优化的方案进行IFA成像和分析。用甲醛(3.7％)固定细胞，然后用靶向SARS-CoV-2病毒刺突的抗体进行免疫染色，定制抗体ACE2me1、ACE2unmod。通过与0.5％ Triton X-100一起孵育15分钟来透化细胞，用溶于PBS中的1％ BSA阻断，并用一抗探测，随后用与Alexa Fluor 488、568或647缀合的二级驴抗兔、小鼠或山羊抗体进行可视化。用ProLong Glass Antifade试剂(Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))将盖玻片固定在玻璃显微镜载玻片上。通过数字病理学激光扫描显微镜定位蛋白质靶标。使用运行ASI软件的使用100×油浸透镜的ASI数字病理显微镜获得单个0.5μm切片(ASI数字病理学既表征了正常免疫荧光成像的荧光强度，也表征了对抗体阳性或阴性的细胞群体进行计数的能力，允许使用强大的定制设计算法和自动化载物台研究群体动态。这也允许对大细胞数进行成像和计数以获得统计功效。)通过对同一切片的四幅连续图像求平均来获得最终图像。使用如前所述的自动化ASI软件63(实用光谱影像(AppliedSpectral Imaging)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))来分析数字图像，以利用平均荧光强度(FI)的自动阈值和背景校正来自动确定分布和强度，从而允许特异性靶向目的蛋白质的表达。通过对同一切片的四幅连续图像求平均来获得最终图像。使用如前所述的自动化ASI软件(实用光谱影像(Applied Spectral Imaging)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))分析数字图像，以利用平均核荧光强度(NFI)的自动阈值和背景校正自动确定分布和强度，允许特异性靶向目的蛋白质的表达。还使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH,Bethesda,MD,USA))分析数字图像，以确定未透化细胞的总细胞荧光或仅细胞表面荧光。所有实验均使用适当的对照，包括无抗体对照、仅一抗对照或仅二抗对照。

与传统IFA不同，Opal Tyramide染色允许使用来自相同宿主物种的抗体。使用先前建立和优化的透化和抗原修复方案进行成像和分析。所有FFPE切片用Opal Tyramide染色法染色。使用decloaking chamber对样品进行脱蜡，并使用0.1％ Triton X-100 20分钟、Biocare医用变性溶液或用于的抗原修复Dako pH6.0/pH 9.0进行制备。Sniper+BSA用于阻断(10分钟)。采用的一抗包括CD3、穿孔素、SARS-CoV-2刺突和定制抗体ACE2me1与VGY或DVG缓冲液。用MACH2 HRP检测一抗，用Opal荧光染料520、570或650检测二抗。然后按照上述免疫荧光染色和分析进行成像和分析，使用ASI数字病理学平台进行自动计数和强度分析。

本文引用的每项专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用整体并入本文。

本文引用的任何参考文献不应解释为承认这些参考文献可作为本申请的“现有技术”。

在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而非将本发明限制于任何一个实施方案或特定的特征集合。因此，本领域的技术人员将会理解，根据本发明，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对示例的特定实施方案进行各种修改和改变。所有这些修改和变化都旨在包括在所附权利要求的范围内。

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Claims (54)

1.一种分离的或纯化的蛋白质分子，其包含式I所示的氨基酸序列或基本上由其组成：

TGIRDRX₁X₂X₃NKARS

(式I)

其中X₁、X₂和x₃独立地选自K、A和Q氨基酸、或其修饰形式。

2.根据权利要求1所述的蛋白质分子，其中X₁是赖氨酸(K)残基。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的蛋白质分子，其中X₂是赖氨酸(K)残基。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质分子，其中X₃是赖氨酸(K)残基。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质分子，其中X₁、X₂和X₃各自为K残基。

6.根据权利要求5所述的蛋白质分子，其中X₁、X₂和X₃各自为乙酰化的K残基。

7.根据权利要求5所述的蛋白质分子，其中X₁、X₂和X₃各自为甲基化的K残基。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质分子，其由式II表示：

Z₁TGIRDRX₁X₂X₃NKARSZ₂

(式II)

其中X₁、X₂和X₃如上广泛定义；

Z₁不存在或选自包含约1至约50个氨基酸残基的蛋白质部分中的至少一种和保护部分；和

Z₂不存在或选自包含约1至约50个氨基酸残基的蛋白质部分中的至少一种。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的蛋白质分子，其中Z₁包含由式III表示的氨基酸序列：

B₁X₄X₅X₆

(式III)

其中：

B₁不存在或是N末端封闭残基；

X₄不存在或选自任何氨基酸；

X₅不存在或选自任何氨基酸；和

X₆不存在或选自任何氨基酸。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的蛋白质分子，其中所述分子包含以下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：

TGIRDRKKKNKARSGENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSF。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的蛋白质分子，其包含与以下氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：

TGIRDRKKKNKARSGENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSF。

12.一种分离的或纯化的蛋白质分子，其包含以下氨基酸序列或基本上由其组成：DISKGENNPGFQNTDDVQTS。

13.一种分离的或纯化的蛋白质分子，其包含对应于SARS-CoV-2ACE-2氨基酸序列的氨基酸序列或基本上由其组成，其中所述氨基酸序列包括对应于天然人ACE-2氨基酸序列的Lys31的赖氨酸残基。

14.根据权利要求13所述的蛋白质分子，其包含以下氨基酸序列、或由其组成、或基本上由其组成：IEEQAKTFLDK。

15.根据权利要求13或权利要求14所述的蛋白质分子，其包含具有由式IV表示的氨基酸序列的肽：

Z₁IEEQAKTFLDKZ₂

(式IV)

其中：

z₁不存在或选自包含约1至约50个氨基酸残基的蛋白质部分中的至少一种和保护部分；和

Z₂不存在或选自包含约1至约50个氨基酸残基的蛋白质部分中的至少一种。

16.根据权利要求15所述的蛋白质分子，其中z₁不存在，并且z₂包含氨基酸序列FNHEAEDLFYQSSLASWNYNT。

17.根据权利要求15或16所述的蛋白质分子，其包含以下氨基酸序列、或由其组成或基本上由其组成：

IEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNT。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的蛋白质分子，其中z₁包含氨基酸序列ST，并且Z₂不存在。

19.根据权利要求18所述的蛋白质分子，其包含以下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：STIEEQAKTFLDK。

20.一种用于治疗或预防冠状病毒感染的组合物，其包含药剂，所述药剂选自蛋白质分子和药学上可接受的载体或稀释剂，其中所述蛋白质分子在权利要求1至19中任一项中定义。

21.一种用于治疗SARS-CoV感染的组合物，所述组合物包含根据权利要求1至19中任一项所述的蛋白质分子。

22.一种用于治疗SARS-CoV感染的药物组合物，所述组合物包含具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含由式I表示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：

TGIRDRX₁X₂X₃NKARS

(式I)

其中X₁、X₂和X₃独立地选自K、A和Q氨基酸、或其修饰形式。

23.根据权利要求22所述的组合物，其中X₁是赖氨酸(K)残基。

24.根据权利要求22或权利要求23所述的组合物，其中X₂是赖氨酸(K)残基。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的组合物，其中X₃是赖氨酸(K)残基。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的组合物，其中X₁、X₂和X₃各自为赖氨酸(K)残基。

27.根据权利要求20至26中任一项所述的组合物，其还包含至少一种抗病毒剂。

28.根据权利要求20至27中任一项所述的组合物，其中所述SARS-CoV感染为SARS-CoV-2感染。

29.一种用于减少SARS-CoV在细胞中复制的方法，所述方法包含在足以减少冠状病毒进入所述细胞的条件下，使所述细胞与选自根据权利要求1至28中任一项所述的蛋白质分子或组合物的药剂接触一段时间。

30.一种用于治疗或预防个体中SARS-CoV感染的方法，所述方法包含向所述个体施用有效量的药剂，所述药剂选自根据权利要求1至28中任一项所述的蛋白质分子或组合物。

31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其包含向所述个体同时施用抗病毒剂。

32.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述SARS-CoV感染为SARS-CoV-2感染。

33.选自根据权利要求1至28中任一项所述的蛋白质分子或组合物的药剂用于治疗的用途。

34.选自根据权利要求1至28中任一项所述的蛋白质分子或组合物的药剂用于治疗或预防SARS-CoV感染的用途。

35.一种用于预防或减少SARS-CoV进入个体细胞的方法，所述方法包含向所述个体施用有效量的药剂，所述药剂选自根据权利要求1至28中任一项所述的蛋白质分子或组合物。

36.一种用于预防或减少SARS-CoV在个体细胞中复制的方法，所述方法包含向所述个体施用有效量的药剂，所述药剂选自根据权利要求1至28中任一项所述的蛋白质分子或组合物。

37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其还包含抗病毒剂。

38.根据权利要求27至37中任一项所述的组合物或方法，其中所述抗病毒剂选自包含以下各项的组：羟氯喹、洛匹那韦、瑞德西韦、氢醌、硫酸阿巴卡韦、阿昔洛韦钠、盐酸金刚烷胺、安普那韦、氯喹、西多福韦、甲磺酸地拉韦定、去羟肌苷、依法韦仑、法匹拉韦、泛昔洛韦、福米韦生钠、膦甲酸钠、更昔洛韦、硫酸茚地那韦、拉米夫定、拉米夫定/齐多夫定、甲磺酸奈非那韦、奈韦拉平、磷酸奥司他韦、利巴韦林、盐酸金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、甲磺酸沙奎那韦、司他夫定、盐酸伐昔洛韦、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。

39.一种蛋白质分子，其包含对应于ACE-2蛋白C末端尾部区域的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

40.根据权利要求39所述的蛋白质分子，其中所述分子包含少于50个氨基酸残基。

41.根据权利要求39所述的蛋白质分子，其中所述分子包含少于25个氨基酸残基。

42.根据权利要求39所述的蛋白质分子，其中所述分子包含少于15个氨基酸残基。

43.根据权利要求39至43中任一项所述的蛋白质分子，其中所述氨基酸序列包含核定位序列。

44.根据权利要求39所述的蛋白质分子或组合物，其中所述C末端尾部区域对应于野生型人ACE-2蛋白的至少第763至805位残基(如SEQ ID NO：1中所示)。

45.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质分子或组合物，其中所述蛋白质组合物包含保护部分，任选地Myr。

46.一种用于减少细胞中ACE2核定位的方法，所述方法包含在足以减少所述细胞中核定位的条件下，使所述细胞与选自根据权利要求1到28中任一项所述的蛋白质分子或组合物的药剂接触一段时间。

47.一种用于减少或预防ACE2多肽与IMPα多肽结合的方法，所述方法包含在足以减少、预防、抑制ACE2多肽与IMPα多肽结合的条件下，使所述细胞与选自根据权利要求1至28中任一项所述的蛋白质分子或组合物的药剂接触一段时间。

48.一种治疗个体的冠状病毒感染的方法，所述方法包含向所述个体施用抑制或减少ACE2蛋白与IMPα蛋白结合的组合物。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述组合物包含对应于ACE2的核定位序列(NLS)的氨基酸序列。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述组合物是前述权利要求中任一项所述的蛋白质分子或组合物。

51.根据权利要求49或权利要求50所述的方法，其中所述组合物包含氨基酸序列TGIRDRKKKNKARS(如SEQ ID NO：3中所示)。

52.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体中的炎症(例如，肺部炎症)减少。

53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体的肺中表达CD3+的细胞水平增加。

54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体的肺中表达穿孔素的细胞水平增加。