CN117660424A - 一种肺炎克雷伯菌KPC-Pal重组蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肺炎克雷伯菌KPC‑Pal重组蛋白，其由截取自肺炎克雷伯菌KPC‑2蛋白的KPC肽段与截取自肺炎克雷伯菌Pal蛋白的Pal肽段通过多肽linker连接构成，所述肺炎克雷伯菌KPC‑2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述肺炎克雷伯菌Pal蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。本发明还提供了其表达载体和重组工程菌，以及在制备用于诊断、预防或治疗肺炎克雷伯菌感染的制剂中的应用。本发明提供的肺炎克雷伯菌KPC‑Pal重组蛋白能够有效激发机体引起保护性免疫应答，从而抵御肺炎克雷伯菌的致死性感染。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肺炎克雷伯菌KPC-Pal重组蛋白及其应用。
背景技术
肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae，KP)常定植于人体肠道和呼吸道，是临床上常见的条件致病菌之一(Martin RM,,et al.Front Cell Infect Microbiol,2018)，其可在全身各部位导致感染发生，常见于老年患者、营养不良、慢性酒精中毒、慢性疾病和全身衰竭的患者，可引起肺炎、尿路感染、脑膜炎、全身败血症等全身或局部感染，严重时危及患者生命安全(Akova M,et al.Clin Microbiol Infect,2012)。近年来，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)在临床上检出率逐年增加，因其超强的耐药性和致病性被称为“超级细菌之王”，给临床治疗制造巨大的阻碍，因此也成为目前研究关注的热点(Munoz-PriceLS,et al.Lancet Infect Dis,2013)。严重威胁人类健康，考虑到其日益严峻的耐药形势，研发新的防治手段迫在眉睫。疫苗接种能有效保护机体免受细菌侵害，并且不受抗生素耐药机制的影响，是一种非常有潜力的防治手段。
肺炎克雷伯菌的灭活疫苗由于安全性有限，当前没有获批上市的相关药物产品。随着免疫学、分子生物学、纳米科学等学科的不断发展，细菌疫苗的类型、组成都发生了很大变化，出现了多糖疫苗、多糖结合疫苗、蛋白疫苗、纳米疫苗等新型疫苗(Hackett RJ,etal.Infect Immun,1970)。全菌及灭活疫苗发挥作用的组分较为复杂且安全性较低，单纯的多糖组分免疫原性较差，可通过与其他组分如载体蛋白结合来提高免疫效果。重组亚单位疫苗是很有前景的疫苗类型。
KPC-2和Pal是课题组前期通过反向疫苗学技术筛选出的两个肺炎克雷伯菌疫苗候选抗原，前者属于A类丝氨酸碳青霉烯酶，位于细菌表面，是全球肠杆菌科细菌尤其肺炎克雷伯菌中流行最广泛的碳青霉烯酶，由质粒上携带的bla-KPC基因编码，可导致细菌对碳青霉烯类抗生素在内的大多数β-内酰胺类抗生素产生耐药性(Wei ZQ,et al.AntimicrobAgents Chemother,2007)。KPC碳青霉烯酶于1996年首次在美国发现，之后产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌在美国爆发流行，目前在全球多个国家包括中国均有传播蔓延报道。在传播的同时，KPC编码基因也在不断的发生突变，目前共发现100多种亚型，我国以blaKPC-2为主，超过70％以上(Hobson CA,et al.Clin Microbiol Infect,2021)。KPC编码基因位于质粒上，质粒的自我复制及水平传播能力使该类耐药基因的传播变得更加高效迅速，目前在鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等常见等临床常见革兰阴性菌中都以检出KPC碳青霉烯酶，给临床治疗带来了极大挑战(Porreca AM,et al.Curr Infect Dis Rep,2018)。Pal是肺炎克雷伯菌的一种肽聚糖相关脂蛋白，属于OmpA家族蛋白，与细菌毒力相关，鲍曼不动杆菌来源的Pal已被用于抗原进行疫苗研究，但肺炎克雷伯菌的Pal蛋白尚无相关报导。
发明内容
本发明通过基因拼接技术通过将KPC-2和Pal蛋白融合制备重组蛋白KPC-Pal，该蛋白与铝佐剂制备疫苗后在动物实验中表现出良好的免疫原性，动物实验中对致死剂量的肺炎克雷伯菌攻毒具有良好的保护效果。
抗原KPC-Pal是从基因水平上由肺炎克雷伯菌重组蛋白抗原KPC和Pal肽链拼接而成，其在pGEX-6p-1质粒载体系统中能在BL21(DE)感受态细胞中表达高、纯度更好，在动物攻毒保护实验中能够诱导高效的体液免疫应答，明显提高肺炎克雷伯菌感染小鼠的存活率，可作为有效的疫苗候选抗原。
本发明的创新点在于：(1)构建了两个抗原的融合抗原KPC-Pal，这两个抗原尚未见用于肺炎克雷伯菌疫苗研究的相关报导；(2)首次采用耐药靶点作为疫苗候选抗原，该靶点产生的抗体一方面可以通过与KPC-2结合，抑制或阻断KPC-2的水解活性，降低或阻断细菌的耐药性；另一方面也可能通过ADCC或CDC等作用直接杀灭细菌；(3)KPC-2可通过质粒在不同菌种之间传播，且KPC不同亚型之间序列高度保守，因此靶向KPC-2的疫苗可能具有良好的通用性。而且基于耐药靶标的疫苗研究策略也可以非常容易地推广至其他耐药靶标，为多耐药靶标通用疫苗的研究提供了理论依据。
本发明提供了本发明提供了一种肺炎克雷伯菌重组抗原蛋白，由截取自肺炎克雷伯菌KPC-2蛋白的KPC肽段与截取自肺炎克雷伯菌Pal蛋白的Pal肽段通过多肽linker连接构成，所述肺炎克雷伯菌KPC-2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述肺炎克雷伯菌Pal蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；优选地，所述KPC肽段包含氨基酸序列为SEQ ID NO:5的多肽；所述Pal蛋白包含氨基酸序列为SEQ ID NO:6的多肽；所述多肽linker由4个甘氨酸(G)和1个丝氨酸(S)；优选地，所述多肽linker的氨基酸序列为SEQ ID NO:7GGGGS。
在根据本发明的一个实施方案中，其氨基酸酸序列为SEQ ID NO:2其氨基酸酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明还提供了上述的重组抗原蛋白的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
本发明进一步提供了一种表达载体，其包含骨架质粒和所述的编码基因。
在根据本发明的一个实施方案中，所述编码基因的一端连接蛋白纯化标签的编码序列；所述蛋白纯化标签选自His、GST、MBP、NusA或SUMO中的任一种；优选为GST。
在根据本发明的一个实施方案中，所述骨架质粒选自pGEX系列载体、pET系列载体或pQE系列载体中的任一种；优选为pGEX-6p-1质粒。采用原核表达质粒pGEX-6p-1来构建重组表达质粒，该载体具有氨苄青霉素抗性，可用于阳性重组子的筛选。在蛋白两端引入GST标签序列。
本发明进一步提供了一种重组工程菌，其含有上述的表达载体。
在根据本发明的一个实施方案中，宿主菌为大肠杆菌XL1-blue、BL21(DE)系列或HMS174系列，优选为大肠杆菌BL21(DE)。
本发明还提供一种肺炎克雷伯菌重组蛋白抗原KPC-Pal的纯化方法。主要技术方案是：收集表达KPC-Pal的基因工程菌；按照高压破菌、离心、亲和层析、酶切的顺序组合对KPC-Pal进行纯化。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。
本发明的再一方面提供了上述的重组抗原蛋白在制备用于诊断、预防或治疗肺炎克雷伯菌感染的制剂中的应用；优选地，所述制剂还包含药学上可接受的佐剂，更优选地，所述佐剂选自佐剂氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和分枝杆菌卡介苗佐剂中的任一种；优选氢氧化铝佐剂。
本发明还进一步提供了一种用于预防或治疗肺炎克雷伯菌感染的亚单位疫苗，其含有上述的重组抗原蛋白；优选地，还包含药学上可接受的佐剂，更优选地，所述佐剂选自佐剂氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和分枝杆菌卡介苗佐剂中的任一种
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
1)重组蛋白抗原KPC-Pal能够有效激发机体引起保护性免疫应答，从而抵御肺炎克雷伯菌的致死性感染。
2)重组蛋白抗原KPC-Pal可在原核表达系统－大肠杆菌中表达，成本低，产量高；
3)选择pGEX-6p-1载体时，重组蛋白抗原KPC-Pal以可溶形式表达；
4)KPC-Pal蛋白的纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂，并且容易放大、重复性好，回收率较好。
5)重组蛋白抗原KPC-Pal能够诱导动物产生特异性的抗体：利用本发明KPC-Pal重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，能够激发机体产生高滴度IgG抗体，证实其具有良好的免疫原性。
附图说明
图1为重组质粒pGEX-6p-1-KPC-Pal的双酶切鉴定结果图谱；其中，
泳道M为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp，500bp、250bp、100bp；泳道1为重组表达质粒pGEX-6p-1-KPC-Pal经Xho1和BamHI双酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约为1146bp(泳道一)和5000bp(泳道二)；
图2为重组蛋白KPC-Pal扩大诱导表达鉴定结果图谱；其中，
泳道M为蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：180kDa、130kDa、100kDa、70kDa、50kDa、40kDa、35kDa、25kDa；泳道1为KPC-Pal的GST重组蛋白；泳道2为使用PP酶酶切后的可溶目的蛋白：KPC-Pal；泳道2为使用PP酶酶切后的GST-Tag亲和填料沉淀。
图3为重组蛋白KPC-Pal在第7、14、21天时血清特异性抗体滴度水平的图谱。
图4为重组蛋白KPC-Pal在小鼠攻毒保护实验的生存率结果图谱。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
若未进行特别说明，本实施例中所用的试剂均为分析纯，所有化学反应进度均以薄层色谱进行检测。
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明所使用的菌株与各种试剂如下：
质粒pGEX-6p-1购自GE Healthcare公司；
大肠杆菌菌株BL21(DE)购自上海生工生物工程科技有限公司；
限制性内切酶XhoI和BamHI、蛋白Marker购自大连宝生物(TakaRa)有限公司；
质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自美国Omega公司；
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4F购自美国GE Healthcare。
实施例1：基因的合成和亚克隆
1.编码KPC-Pal重组蛋白的DNA序列(SEQ ID NO:1)的合成以及DNA序列与pGEX-6p-1的连接均委托上海生工生物工程有限公司完成。
2.重组质粒的转化
从-80℃冰箱取1管大肠杆菌BL21(DE)感受态细胞(上海超研生物科技有限公司)，加入0.5μL合成的pGEX-6p-1-KPC-Pal质粒。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600μL的LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rpm振摇1h。各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300μL上清，再重悬菌体，取200μL涂布于带有氨苄西林抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
3.双酶切鉴定
取37℃摇床培养过夜的菌液，按照说明书的步骤，通过快速质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取阳性克隆的质粒。使用XhoI(Takara公司)和BamHI(Takara公司)进行酶切，37℃水浴半小时。体系如下：
灌制1.0％琼脂糖凝胶，其中含0.01％的GenRed核酸染料(北京金百特生物技术有限公司)，将上述酶切反应体系中各加入1μl的6×Loading buffer，通过凝胶80V电泳20min后，UV扫描仪观察酶切的结果。结果过发现阳性克隆的质粒被切成2个片段，大片段约5000bp为表达载体pGEX-6p-1部分，小片段约1146bp，为插入的编码KPC-Pal的KPC-Pal片段(图1)。
4.原始菌株保存
取鉴定后37℃摇床培养过夜的菌液，与无菌的30％甘油按1:1比例均匀混于保菌管中，保存于-80℃，有效期3年。
实施例2：KPC-Pal抗原蛋白表达形式的鉴定和制备
1.获取蛋白
取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6p-1-KPC-Pal/BL21菌液100μL加入到100mL含氨苄抗性的LB培养基中进行一次活化，在200rpm 37℃下培养过夜后，将活化的100mL菌液加入到2L含氨苄西林抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3–4h至OD600为1.2时，加入400μL的IPTG(终浓度为200μM)置于25℃摇床中诱导6h后，在6000rpm条件下离心15min收集菌体,再加80mL PBS重悬菌体后，将菌液进行超声裂解30min。在12000rpm条件下离心20min收集破菌上清，即为包含KPC-Pal的蛋白溶液。
2.亲和层析和蛋白酶切
KPC-Pal的蛋白溶液与4mL谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4F混合无亲和层析柱，在室温下结合2h，先用1M NaCl-0.5％ Tween-20-20mM PBS按40个柱体积(160mL)洗涤三次，接着用300mM NaCl-20mM PBS按40个柱体积(160mL)洗涤三次，最后勇20mM PBS按40个柱体积(160mL)洗涤三次，即获得大量的含有GST标签的KPC-Pal重组蛋白。加入4mL PBS和1mLPreScission protease(PP酶)，4℃垂直旋转酶切过夜，分别用5mL的PBS洗涤2次，最终收集15mL酶切后的可溶蛋白溶液。
3.SDS-PAGE电泳
将10％分离胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入浓缩胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。将处理好的样品分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80V电泳30min，再调至180V，电泳40min后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，pGEX-6p-1-KPC-Pal/BL21(DE)在25℃条件下能表达出分子量大小约为65kDa的含有GST标签的KPC-Pal蛋白，且重组蛋白均在超声裂解的上清中，因此所述重组蛋白在上述诱导温度条件为可溶性蛋白，而且在25℃表达量很高。如图2所示：泳道2是酶切后获取的目的蛋白。
实施例3：动物的免疫和抗体检测
用组氨酸稀释KPC-Pal抗原，加入浓度为10mg/mL的氢氧化铝佐剂制备疫苗，使每只小鼠每次免疫佐剂量为0.5mg；在0、7、14天用5号半型针头，双侧大腿肌肉注射免疫BALB/C小鼠，每只小鼠注射量为200μL，抗原含量为50μg，空白对照组采用相同体积的组氨酸免疫；末次免疫后第7天，采集BALB/C小鼠的眼球血，用ELISA检测小鼠免疫后抗原特异性IgG应答水平。
1.制备液体
1)包被液的配制：称取1.6g Na2CO3，2.9g NaHCO3，溶于1L ddH2O，将pH调至9.6；
2)封闭液的配制：1g牛血清白蛋白，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；
3)抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH2O，再加入500μL Tween-20，pH调至7.4；
4)洗涤液的制备：同抗体稀释液；
5)显色液(TMB)，为天根公司产品；
6)终止液(含2M H2SO4)：为天根公司产品。
2.ELISA检测KPC-Pal重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价
1)用包被液将纯化后的KPC-Pal重组蛋白稀释为1ug/mL；
2)包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；
3)封闭：酶标板加封闭液200μL/孔，置于37℃孵育箱中2h，洗涤3遍；
4)将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释；
5)取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤3遍，空干；
6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，起始稀释1：1000或1:10000，制成抗体工作液；
7)加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱40min，洗涤三遍，空干；
8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应5min；
9)加入终止液(2M H2SO4)，2h内置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；
10)结果判断：A样品/A阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释)。
结果如图3所示，KPC-Pal蛋白抗原免疫小鼠产生的KPC-Pal特异性IgG抗体效价几何平均滴度为1:128000；末次免疫后第7天的抗体阳性率达到100％，说明本发明构建的KPC-Pal重组蛋白具有良好的免疫原性。
实施例4：通过免疫小鼠确定KPC-Pal重组蛋白免疫动物的攻毒保护
纯化好的抗原用BCA试剂盒进行定量检测，用氢氧化铝佐剂吸附免疫BALB/C小鼠，每剂含50ug抗原蛋白和0.5mg的佐剂，总免疫体积为200μL(组氨酸缓冲液补齐)，免疫感染流程：每组10只老鼠，第0、7、14天进行肌注免疫，同时以组氨酸免疫组作为阴性对照，第三次免疫完后7天采用肺炎克雷伯菌YBQ经口气管插管感染，每只小鼠的感染菌量为8×106CFU/20μL，感染完连续7天观察小鼠生存率，如图4所示。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种肺炎克雷伯菌KPC-Pal重组蛋白，其特征在于，由截取自肺炎克雷伯菌KPC-2蛋白的KPC肽段与截取自肺炎克雷伯菌Pal蛋白的Pal肽段通过多肽linker连接构成，所述肺炎克雷伯菌KPC-2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述肺炎克雷伯菌Pal蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；优选地，所述KPC肽段包含氨基酸序列为SEQ ID NO:5的多肽；所述Pal蛋白包含氨基酸序列为SEQ ID NO:6的多肽；所述多肽linker由4个甘氨酸(G)和1个丝氨酸(S)；优选地，所述多肽linker的氨基酸序列为SEQ ID NO:7GGGGS。
2.如权利要求1所述的重组蛋白，其氨基酸酸序列为SEQ ID NO:2。
3.如权利要求2所述的重组蛋白的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
4.一种用于表达KPC-Pal重组蛋白的表达载体，其包含骨架质粒和如权利要求3所述的编码基因。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述编码基因的一端连接有蛋白纯化标签的编码序列；所述蛋白纯化标签选自His、GST、MBP、NusA或SUMO中的任一种；优选为GST标签。
6.一种用于表达KPC-Pal重组蛋白的重组工程菌，其特征在于，包含如权利要求4或5所述的表达载体。
7.如权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，宿主菌选自大肠杆菌XL1-blue、BL21(DE)系列或HMS174系列，优选为大肠杆菌BL21(DE)。
8.一种用于诊断肺炎克雷伯菌感染的组合物，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的KPC-Pal重组蛋白。
9.一种用于预防或治疗肺炎克雷伯菌感染的亚单位疫苗，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的KPC-Pal重组蛋白；优选地，还包含药学上可接受的佐剂，更优选地，所述佐剂选自佐剂氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和分枝杆菌卡介苗佐剂中的任一种。
10.如权利要求1或2所述的KPC-Pal重组蛋白在制备用于诊断、预防或治疗肺炎克雷伯菌感染的制剂中的应用；优选地，所述制剂还包含药学上可接受的佐剂，更优选地，所述佐剂选自佐剂氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和分枝杆菌卡介苗佐剂中的任一种；优选氢氧化铝佐剂。
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