CN117645655A - 一种肺炎球菌多糖-rsv重组蛋白结合疫苗及其制备方法 - Google Patents
一种肺炎球菌多糖-rsv重组蛋白结合疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于预防肺炎球菌感染及RSV感染的肺炎球菌多糖‑RSV重组蛋白结合疫苗及其制备方法。本发明的肺炎球菌多糖‑RSV重组蛋白结合疫苗，其中的RSV重组蛋白是经过氨基酸突变修饰稳定性增强的RSV Pre‑F重组蛋白，所述的RSV重组蛋白具有免疫原性，并作为肺炎球菌多糖的载体蛋白。本发明的肺炎球菌多糖‑RSV重组蛋白结合疫苗，通过对RSV PreF蛋白载体进行氨基酸突变修饰，可使得蛋白在不同环境下，包括高温、酸性、及高渗透压下仍然保持其结构稳定性及抗原簇功能。本发明的结合疫苗具有双重免疫原性，一种疫苗可同时有效预防由肺炎球菌和RSV引起的疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于预防肺炎球菌感染及RSV感染的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗及其制备方法。
背景技术
肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）是一种革兰氏阳性菌，细菌外膜由一层荚膜多糖包裹，依据不同荚膜多糖化学结构的不同，并以特异性抗血清进行分类，现发现有91种不同血清型肺炎球菌。该细菌可以引起多种疾病，对人类健康构成严重威胁。肺炎、发热性菌血症和脑膜炎是侵袭性肺炎球菌病最常见的表现，而细菌在呼吸道内传播可导致中耳炎、鼻窦炎或复发性支气管炎。与侵袭性疾病相比，非侵入性疾病通常不严重，但更为常见。
在欧洲和美国，肺炎球菌性肺炎是最常见的社区性细菌性肺炎，每年每10万名成年人中约有100人感染。发热性菌血症和脑膜炎分别为每10万名成年人中约有15-19人和每10万人1-2人感染。在婴幼儿和老年人以及任何年龄的免疫缺陷者中，出现其中一种或多种这些疾病的风险要高很多。即使在经济发达地区，侵袭性肺炎球菌导致的疾病死亡率也很高；患有肺炎球菌性肺炎的成人的死亡率约为10-20％，而高危人群的死亡率可能超过50％。据世界卫生组织(WHO)数据显示，每年全球有约150万人死于肺炎球菌感染，其中包括数百万的儿童。肺炎是迄今世界范围内导致肺炎球菌感染者死亡的最常见原因。
在中国，65岁以上老年人的肺炎发病率为1.6％(每10万名成年人中约有1600人)，随着年龄的增长，肺炎的发病率急剧上升，75岁以上老年人肺炎的发病率高达11.6％；老年人不仅仅肺炎发病率高，感染肺炎后往往病程长，不易痊愈，严重者可导致死亡。有资料显示，46％-76％的社区获得性肺炎均由肺炎球菌所致。
目前，针对肺炎球菌感染的预防措施主要包括接种疫苗和使用抗生素。然而，由于抗生素的广泛使用，肺炎球菌对抗生素的耐药性逐年上升，使得抗生素在治疗肺炎球菌感染方面的效果受到严重影响。因此，研发新型疫苗成为预防肺炎球菌感染的重要途径。
当前已上市的肺炎球菌疫苗主要有两种：肺炎球菌多糖疫苗和多糖结合疫苗，如23价肺炎球菌多糖疫苗(PPSV23)和13价肺炎球菌结合疫苗(PCV13)。虽然目前预防肺炎球菌感染的疫苗产品已经向多价多糖结合疫苗方向开发，不同厂商生产的PCV13也使用了不同的载体蛋白。例如，美国辉瑞生产的沛儿13使用的载体蛋白为无毒白喉类毒素突变体（CRM197），而国产云南沃森生产的沃安欣使用的载体蛋白为破伤风类毒素（TT）。另外，国产北京民海生产的维民菲宝则使用了破伤风类毒素和白喉类毒素突变体双载体蛋白。但是，这些结合疫苗有一个共同的不足之处，就是载体蛋白没有赋予免疫原性的保护功能；也就是说，尽管结合疫苗载体能够刺激机体产生抗体，但疫苗设计者并没有能够利用载体蛋白产生的抗体来预防疾病，同时这些疫苗并不能覆盖所有的肺炎球菌血清型，并且接种后需要多次加强免疫，其保护效果仍有待提高。
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是一种常见的病毒，主要通过空气传播，是婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体。RSV感染可导致轻度至重度的呼吸道疾病，包括支气管炎、肺炎、哮喘发作等。尤其对于早产儿、低出生体重儿和免疫系统较弱的儿童，RSV感染可能导致严重的并发症，甚至死亡。
据统计，2019年全球RSV相关的急性下呼吸道感染次数高达3300万人次，因RSV所致的急性下呼吸道感染住院次数和死亡病例分别为360万人次、26300例；在0-6月龄的婴儿中，RSV所致急性下呼吸道感染发生次数、住院次数及住院死亡病例分别约为660万人次、140万人次、13300例。其中，中国是因RSV 导致儿童罹患急性下呼吸道感染人数较多的国家之一,而全球因RSV急性下呼吸道感染住院的5岁以下患儿中,99%的死亡病例来自发展中国家。成年人的RSV感染率随年龄的增加而升高,老年人是易感人群之一，且老年感染者的预后较差、经济负担较重,65岁以上老年人的住院病死率最高,每年每10万人中约有7.2万人死于RSV感染,且发展中国家患者的RSV感染病死率达9.1%。
RSV是一种有包膜的非节段性单股负链RNA病毒，属于单胞病毒目、肺炎病毒科、正肺病毒属。其基因组由编码11种蛋白（包括9种结构蛋白（3种糖蛋白和6种内部蛋白）和2种非结构蛋白）的单链负义RNA分子组成。结构蛋白包括3种跨膜表面糖蛋白：附着蛋白G、融合蛋白F和小疏水SH蛋白。存在两种RSV亚型：A和B，其差异主要在于G糖蛋白，而F糖蛋白的序列在两种亚型之间更保守。
RSV融合蛋白（F蛋白）属于I类跨膜蛋白，由574个氨基酸残基组成。在宿主细胞内最初生成为F蛋白的前体F0，F0蛋白在高尔基体上糖基化，随后通过细胞内弗林蛋白酶水解释放出27个氨基酸组成的多肽pep27，在该肽段的N和C端切割位点分别产生F1和F2两个亚基，F2亚基由信号肽SP和七肽重复序列HRC组成，F1亚基由融合肽FP、七肽重复区HRA和HRB、Domain I和Domain II跨膜区TM以及胞质域CP组成，F1和F2通过二硫键连接，形成一个异二聚体。三个异二聚体组装成一个成熟的F蛋白三聚体。RSV F蛋白三聚体不稳定，存在融合前(prefusion)和融合后(postfusion)两种构象。在病毒包膜表面的F蛋白最初为亚稳态的pre-F构象，当病毒吸附到细胞膜表面后，pre-F蛋白在细胞受体、温度和离子浓度等因素的触发下，其构象发生改变，生成高度稳定的post-F三聚体，该过程释放能量，可介导病毒包膜与细胞膜发生融合。由于pre-F的构象高度不稳定，因此，在体外分离纯化得到的蛋白通常为post-F。但研究表明亚稳态的pre-F构象是病毒介导膜融合过程所必需，也是诱导人体产生免疫应答的重要抗原。
对于具有高感染率、高重症发病率及死亡率的RSV感染，尚无针对RSV的特效药物。疫苗开发的一个主要障碍是20世纪60年代临床试验中使用福尔马林灭活（FI）RSV疫苗的疫苗强化疾病的遗留问题。FI-RSV接种疫苗的儿童未能免受自然感染的影响，并且受感染的儿童比未接种疫苗的儿童患有更严重的疾病，其中包括两人死亡。这种现象被称为“强化疾病”。自从使用FI-RSV疫苗进行试验以来，已经开始探索产生RSV疫苗的各种方法。尝试包括RSV的经典活减毒冷传代的或温度敏感性突变株、(嵌合的)蛋白亚单位疫苗、脑疫苗和由重组病毒载体(包括腺病毒载体)表达的RSV蛋白。尽管这些疫苗中的一些显示出有希望的临床前数据，但在保护效果、安全性及稳定性等方面仍有许多不足之处。因此，研究新型RSV疫苗具有重要意义。
PreF蛋白作为RSV的主要抗原之一，具有较好的免疫原性。但是由于天然的PreF蛋白在高温、高压、重金属离子、氧化剂、极端pH等条件下容易遭到破坏，蛋白结构稳定性差，难以保证其较好的抗原性，因此需要根据对PreF蛋白结构和功能作进一步研究。研究表明对PreF蛋白进行氨基酸突变修饰，可提高其免疫原性和稳定性。然而，如何获得稳定且高表达的pre-F蛋白也成为RSV抗体类药物和疫苗开发面临的重要难题。
此外，如何获得稳定且高表达的pre-F蛋白，同时将稳定且高表达的PreF蛋白与其他免疫原性物质结合，如肺炎球菌多糖，制备具有双重免疫原性的疫苗，提高疫苗的保护效果，也具有十分重要的研究开发价值。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于预防肺炎球菌感染及RSV感染的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗及其制备方法。
本发明解决技术问题的技术方案如下：
在本发明的第一方面，提供了一种RSV重组蛋白，所述的RSV重组蛋白是经过氨基酸突变修饰稳定性增强的RSV Pre-F重组蛋白，所述的氨基酸突变修饰为以下两种方式中的任意一种：
(1)在序列如SEQ ID NO.1所示的野生型pre-F蛋白全长序列基础上进行氨基酸点突变，将第28位的I突变为C，将第464位的G突变为C；
(2)先将序列如SEQ ID NO.1所示的野生型pre-F蛋白全长序列中的跨膜区/胞内区删除，并在其C末端连接fibritin/Throm/6his/Stretaq序列，得到序列如SEQ ID NO.2所示的突变体，再在SEQ ID NO .2序列基础上再进行氨基酸点突变，将第28位的I突变为C，将第464位的G突变为C。此方式可以得到氨基酸序列如SEQ ID No：3所示的RSV重组蛋白。
在本发明的第二方面，提供了含有如第一方面所述RSV重组蛋白的两种疫苗。
第一种疫苗，是以RSV重组蛋白作为唯一免疫原的疫苗。所述疫苗能够用于预防RSV感染。
进一步地，在所述以RSV重组蛋白作为唯一免疫原的疫苗中，RSV重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。
第二种疫苗，是以RSV重组蛋白作为载体蛋白的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗。所述的结合疫苗以RSV重组蛋白作为载体蛋白，包括肺炎球菌多糖和RSV重组蛋白两种免疫原。也就是说，所述结合疫苗中的RSV重组蛋白不仅作为结合疫苗的载体蛋白,还具有免疫原性，可作为结合疫苗的免疫原，因此所述结合疫苗具有双重免疫原性，能够用于预防肺炎球菌感染及RSV感染。
进一步地，所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗中，RSV重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示，所述的肺炎球菌荚膜多糖选自24种血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F中的一种或多种。
在本发明的一个优选实施方式中，所述结合疫苗为24价肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其中RSV重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示，所述的肺炎球菌荚膜多糖包括24种血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F。
进一步地，所述的肺炎球菌荚膜多糖以共价键与RSV重组蛋白相连接。
进一步地，所述的结合疫苗，其制剂形式为水剂或冻干剂。
进一步地，所述的结合疫苗中含有佐剂。
进一步地，所述的佐剂为CpG、QS21、磷酸铝、CpG与磷酸铝混合物、或QS21与磷酸铝混合物中的任意一种。
在本发明的第三方面，提供了编码如第一方面所述RSV重组蛋白的核苷酸序列。
在本发明的第四方面，提供了含有如第三方面所述的核苷酸序列的重组表达载体。
所述的重组表达载体的构建方法如下：
1）RSV Pre-F目的基因的合成
根据氨基酸序列SEQ ID NO .3确定对应的编码序列（即DNA序列），在该区段基因C端加入限制性核酸内切酶EcoRI序列，N端加入限制性核酸内切酶XbaI序列，化学合成设计的核苷酸序列。
2）质粒扩增及目的基因提取
pUC19质粒载体经EcoRI和XbaI限制酶双酶切后与合成的基因连接，导入扩增宿主DH5α，用LB(Amp+)琼脂固体培养基筛选单克隆；含有目的基因的单克隆接种于LB(Amp+)液体培养基中，37℃，200rpm培养扩增，利用Sigma-Aldrich GenEluteTMHP质粒中量制备试剂盒提取质粒pUC19-preF；利用EcoRI和XbaI限制酶双酶切提取的质粒，利用TaKaRaMiniBestAgarose Gel Extraction Kit回收目的基因片段。
3）真核表达载体的构建
利用EcoRI和XbaI限制酶双酶切哺乳动物细胞表达质粒pGN-M，该质粒包含CMV启动子和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，利用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment PurificationKit Ver.4.0回收载体DNA片段；载体DNA片段与目的基因片段通过粘末端方式连接并导入DH5α扩增宿主，筛选获得包含真核表达质粒pGN-M_preF的单克隆；接种于LB(Amp+)进行扩增培养，利用无内毒素质粒中提试剂盒TaKaRa MidiBEST Endo-free PlasmidPurificationKit抽提扩增的质粒，命名该质粒为RSV pre-F。
在本发明的第五方面，提供了利用如第四方面所述的重组表达载体制备RSV重组蛋白的表达方法，所述的表达方法采用CHO细胞表达系统或昆虫杆状病毒表达系统。
在本发明的第六方面，提供了如第二方面所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗的制备方法，包括如下步骤：将所述的肺炎球菌荚膜多糖和RSV重组蛋白是在缓冲液或有机溶剂中，通过化学合成反应得到的结合物。
进一步地，所述的有机溶剂选自二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。
进一步地，所述化学合成反应选自还原胺法、1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate法，己二酰二肼法或1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐法中的一种。
进一步地，所述的制备方法还包括肺炎球菌荚膜多糖的前处理、RSV重组蛋白的表达和纯化以及结合物的纯化。
进一步地，所述的多糖前处理包括降解和活化，所述的降解方法选自高压均质机降解、酸水解法或酶消化法。
本发明具有如下技术效果：
1）本发明利用经氨基酸突变修饰获得稳定性增强的RSV Pre-F蛋白作为载体蛋白，制备一种新型的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗。该疫苗通过对RSV PreF蛋白载体进行氨基酸突变修饰，可使得蛋白在不同环境下，包括高温、酸性、及高渗透压下仍然保持其结构稳定性及抗原簇功能，即使经历化学反应后，仍然能够保存其抗原性。本发明的结合疫苗具有双重免疫原性，一种疫苗可同时有效预防由肺炎球菌和RSV引起的疾病，进一步提高疫苗的保护效果和安全性，大大减少了接种疫苗的次数，减轻婴幼儿的痛苦及家长的精神负担，降低免疫接种成本，并提高免疫覆盖率，为预防婴幼儿和老年人呼吸道感染提供了新的手段。本发明的优势在于它可以提供更高效、更安全、更广泛、更稳定的保护作用，有望成为预防肺炎球菌和RSV感染的有效手段。
2）采用修饰后的RSV Pre-F蛋白作为结合疫苗载体蛋白，能够制备一种新型的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，能够实现蛋白载体产生有效保护性抗体，达到一种疫苗同时预防两种疾病的目的。从实施例11可以看出，本发明的RSV pre-F重组蛋白作为载体蛋白制备的肺炎多糖结合疫苗，相比于现有的采用其他载体蛋白的肺炎多糖结合疫苗（如辉瑞PCV13）的抗原性增强效果更好。从实施例12可以看出，将本发明制备的24价肺炎球菌多糖RSV Pre-F重组蛋白结合疫苗注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，血清中和滴度显著高出单独的RSV Pre-F重组蛋白注射小鼠的血清。
附图说明
图1为修饰后Pre-F蛋白纯度检测SDS-PAGE胶图。
图2为修饰后Pre-F蛋白对温度稳定性图。
图3为修饰后Pre-F蛋白对pH稳定性图。
图4为修饰后Pre-F蛋白对渗透压稳定性图。
图5为与肺炎球菌血清型6A、23F、1、4多糖Pre-F蛋白偶合物与PA1抗体亲和性检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案作进一步详细说明，但不应理解为对申请待批的权利要求保护范围的限制。
实施例1：制备RSV重组蛋白
(一)蛋白的构建
本发明中所使用的术语“野生型”表示自然界中存在，未经过人工的任何修饰或加工产物。本领域技术人员了解，野生RSV F蛋白可以是多种序列，这些序列可能存在细微差别，但生物活性基本一致。本发明中提及的野生型全长F蛋白参照GenBank提供的序列，具体序列为SEQ ID NO .1所示(Fusion glycoprotein F0 OS=Human respiratory syncytialvirus A (strain A2) OX=11259 GN=F PE=1 SV=1)。
（1）氨基酸的突变修饰
本发明提供的经氨基酸突变修饰获得稳定性增强的RSV Pre-F蛋白，其氨基酸突变方式可以选择以下两种方式中的任意一种：
(1)在野生型pre-F蛋白全长序列基础上进行氨基酸点突变；
(2)将野生型pre-F蛋白全长序列中的跨膜区/胞内区删除，并在其C末端连接fibritin/Throm/6his/Stretaq序列，得到突变体序列如SEQ ID NO .2所示，在SEQ ID NO.2序列基础上再进行氨基酸点突变。
本实施例中，具体的突变方式采用第二种，将序列如SEQ ID NO .2所示的突变体中的第28位的I突变为C，第464位的G突变为C，得到氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示的pre-F重组蛋白。
SEQ ID NO .1-3氨基酸序列表如下：
SEQ ID NO .1：
>sp|P03420|FUS_HRSVA Fusion glycoprotein F0 OS=Human respiratorysyncytial virus A (strain A2) OX=11259 GN=F PE=1 SV=1
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
SEQ ID NO .2：
>RSVF
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHGSWSHPQFEK
SEQ ID NO .3：
>RSV F I28C G464C
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNCTEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQECKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHGSWSHPQFEK。
（2）RSV Pre-F目的基因的合成
根据氨基酸序列SEQ ID NO .3确定对应的编码序列（即DNA序列），在该区段基因C端加入限制性核酸内切酶EcoRI序列，N端加入限制性核酸内切酶XbaI序列，化学合成设计的核苷酸序列。
（3）质粒扩增及目的基因提取
pUC19质粒载体经EcoRI和XbaI限制酶双酶切后与合成的基因连接，导入扩增宿主DH5α，用LB(Amp+)琼脂固体培养基筛选单克隆；含有目的基因的单克隆接种于LB(Amp+)液体培养基中，37℃，200rpm培养扩增，利用Sigma-Aldrich GenEluteTMHP质粒中量制备试剂盒提取质粒pUC19-preF；利用EcoRI和XbaI限制酶双酶切提取的质粒，利用TaKaRaMiniBestAgarose Gel Extraction Kit回收目的基因片段。
（4）真核表达载体的构建
利用EcoRI和XbaI限制酶双酶切哺乳动物细胞表达质粒pGN-M，该质粒包含CMV启动子和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，利用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment PurificationKit Ver.4.0回收载体DNA片段；载体DNA片段与目的基因片段通过粘末端方式连接并导入DH5α扩增宿主，筛选获得包含真核表达质粒pGN-M_preF的单克隆；接种于LB(Amp+)进行扩增培养，利用无内毒素质粒中提试剂盒TaKaRa MidiBEST Endo-free PlasmidPurificationKit抽提扩增的质粒，命名该质粒为RSV pre-F。
(二)蛋白的表达和克隆筛选
以ATCC采购的CHO K1细胞为宿主细胞，细胞复苏后培养于10％新生牛血清的DMEM培养基(Sigma-Aldrich)中，每3天传代1次。代传2代后，观察细胞长势良好，然后CHO K1细胞按0 .75×106细胞/孔的三个9 .6cm2孔中，其中加有Iscove’s优化DMEM培养基(Sigma-Aldrich)，并加有10％胎牛血清(IMEM+FBS) (Gibco)。细胞在湿度饱和的培养箱中，5％CO2和37℃下，每个孔中加有4μg的pcDNAVZVE载体，DNA与Lipofectamine 2000 (Sigma-Aldrich)混合后加至其中两个孔中，Lipofectamine 2000单独加至第三个孔中作为阴性对照。48小时后，去除培养基，以200×g离心5分钟，将离心上清液储存在-20℃。加入IMDM+FBS培养液及10μg/mL的Blasticidin-HCl(Invitrogen)至转染细胞的一个孔中，用PBS洗另一个转染细胞孔，然后用50mM的 Tris-HCl，pH8 ,150mM NaCl，1％ (v/v) Triton X-100containing complete,EDA-free蛋白酶抑制剂混合液了溶解细胞 (Roche Diagnostics)。在4℃下，以16000×g速度离心10分钟，将裂解液储存于-20℃。用Western blot来检测上清液和裂解液中是否有重组蛋白。在选择性培养基中培养5天后，用胰蛋白酶(Invitrogen)洗脱细胞，然后再接种至9cm的Petri培养皿上进行系列稀释来分离单克隆细胞。再在后继7-11天中，挑选出42个单颗克隆，转移至一个96孔板上的孔中。用Westernblot来检测培养上清液，筛选高表达蛋白。分泌最高量RSV pre-F蛋白的克隆进行下一轮筛选，最终扩增细胞，并筛选30个新克隆保存。
将所选的克隆扩增至三个T175瓶(NETS)中。加入胰蛋白酶消化，用PBS洗涤，再悬浮于250mL旋转瓶中装有100mL的ProCHO4(Lonza)，加有1×ProHT、4mM L-谷氨酰胺和2％FBS(Lonza)。在37℃的加湿培养箱中37℃下，5％CO2下，搅拌速度为90rpm，盖稍微打开以确保空气扩散进行培养。每日取样，用台盼蓝染色(Sigma-Aldrich)，对细胞进行计数，并每3-5天传代一次，当活细胞浓度高于0 .3×106细胞/mL，活细胞数超过90％时的平台期后。当细胞适应并生长良好，逐渐去除BFS，此时细胞被认为完全适合无血清悬浮生长。
(三)在生物反应器中生产RSV pre-F蛋白
在3升生物反应器中配置1.5升灌流培养，配置旋转过滤(10μm)分离器。培养参数设置为：通过加热毯控制温度在37℃，通过CO2或0.3M氢氧化钠调节pH在6.9，搅拌速度为200-300RPM，用最大流量为200mL/min的N2和O2混合气体调节溶氧(dO2)为饱和空气的40％。灌注率为0.3至0.8V稀释/每天，每天从培养液中取样进行细胞计数。采用台盼蓝染色，并用离线检测上清液中葡萄糖和乳酸浓度。
总共收集12.5升无细胞培养液，在4℃下，以8000×g离心30分钟，用0.45μm膜过滤，再用10kDa膜包进行超滤浓缩。用缓冲液进行超滤洗滤，并浓缩样品溶液体积至0.5升，
加入0.5升PBS后，再浓缩至0.5升。以上步骤重复5次。
(四) RSV pre-F蛋白纯化
将样品溶液上样Q-Sepharose fast flow(GE Bioscience)柱，用20mM Tris-HClpH7.5洗柱。然后用加入了200mM氯化钠的20mM Tris-HCl pH7.5洗柱，进一步去除被吸附的蛋白杂质。用增加氯化钠溶液浓度至300mM的溶液洗脱pre-F蛋白。在合并液中加入硫酸铵至浓度为800mM，上样至Butyl-Sepharose (GE Bioscience)柱，用磷酸盐缓冲液 (PBS，6mMNa2HPO4，1 .5mM KH2PO4，0 .15M氯化钠pH 6.8)加入了800mM硫酸铵洗柱，用含有400mM硫酸铵的PBS溶液洗柱，最终用纯化水洗脱pre-F蛋白。最终上样 Sephacryl S-400HR (GEBioscience) ,用PBS洗柱，收集蛋白峰，加入助溶剂，在真空冻干机上冻干，储存于-70℃下，待用。
图1的检测结果显示：本发明制备的RSV preF重组蛋白检测纯度达87.27%（SEC-280nm），其还原纯度（SDS-PAGE）在95%以上，说明本发明制备的疫苗中RSV preF重组蛋白纯度较高。
实施例2：对实施例1获得的修饰后Pre-F蛋白进行温度稳定性检测
1）用1*PBS pH7.4缓冲液将待测试蛋白（分别为参考实施例1制备得到的修饰前Pre-F蛋白和实施例1制备得到的修饰后Pre-F蛋白）稀释为20 ug/mL，放置于1.5 mL离心管中，总体积为1 mL。
2）按照下表进行不同温度孵育。
3）孵育结束后各样本放置于4℃暂存。
4）按照方案进行ELISA测试：
将保存于4℃的样本用1*PBS pH7.4稀释为1 ug/mL，100 uL/孔加入酶标板（NUNC442404），4℃包被过夜。甩干酶标板，按照150 uL/孔加入1% BSA-PBS，37℃孵育2小时。洗板机按照程序洗板3次，按照设计加入检测用抗体（PA1），100 uL/孔，37℃孵育2小时。洗板机按照程序洗板3次，按照1：2000稀释加入AP标记羊抗人二抗，100 uL/孔，37℃孵育1小时。洗板机按照程序洗板3次，加入pNPP底物液，100 uL/孔，酶标仪设定波长405 nm，读数。
检测结果如图2所示，结果显示：修饰前后的Pre-F蛋白在不同温度处理后的抗原结合活性具有显著的差异，修饰后的Pre-F蛋白在4℃、50℃、70℃的OD值均明显高于修饰前蛋白，说明本发明制备的修饰后Pre-F蛋白在不同温度处理后依旧可以保持较高的抗原结合活性，即该修饰蛋白的温度稳定性较好。
实施例3：对实施例1获得的修饰后Pre-F蛋白进行pH稳定性检测
1）配液
①25 mM醋酸盐缓冲液，pH3.5。
配制方法（以配制100 mL容量计算）：
1.准确称取98.953 mg醋酸钠加入200 mL烧杯中。
2.准确称取1.429 g醋酸加入5 mL的离心管中。
3.向醋酸钠中加入约80 mL纯化水充分溶解，将醋酸加入。
4.调节溶液pH至3.5。
5.定容至100 mL，室温保存，有效期3个月。
②25 mM醋酸盐缓冲液，pH5.0。
配制方法（以配制100 mL容量计算）：
1.准确称取1.381 g醋酸钠加入200 mL烧杯中。
2.准确称取490.3 mg醋酸加入5 mL的离心管中。
3.向醋酸钠中加入约80 mL纯化水充分溶解，将醋酸加入。
4.调节溶液pH至5.0。
5.定容至100 mL，室温保存，有效期3个月。
③25 mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0。
配制方法（以配制100 mL容量计算）：
1.在200 mL烧杯中加入80 mL纯化水。
2.准确量取302.85 mg Tris加入。
3.取1 mL 1 N盐酸加入（理论值1.42 mL），然后微量加入，调节溶液pH值为8.0。
4.定容至100 mL，室温保存，有效期3个月。
④25 mM Tris-HCl缓冲液，pH10.0。
配制方法（以配制100 mL容量计算）：
1.在200 mL烧杯中加入80 mL纯化水。
2.准确量取302.85 mg Tris加入。
3.取20 uL 1 N盐酸加入（理论值33 uL），然后微量加入，调节溶液pH值为10.0。
4.定容至100 mL，室温保存，有效期3个月。
⑤25 mM PBS缓冲液对照，pH7.5。
配制方法（以配制100 mL容量计算）：
1.在200 mL烧杯中加入80 mL纯化水。
2.准确量取Na2HPO4 142mg、 KH2PO4 27mg、 NaCl 800mg、KCl 20mg加入。
3.取HCl微量加入，调节溶液pH值为7.5。
4.定容至100 mL，室温保存，有效期3个月。
2）用不同pH值缓冲液将待测试蛋白（分别为参考实施例1制备得到的修饰前Pre-F蛋白和实施例1制备得到的修饰后Pre-F蛋白）稀释为20 ug/mL，放置于1.5 mL离心管中，总体积为1 mL。
3）按照下表对样本进行不同pH孵育。
4）孵育结束后将各样本pH值用酸或碱中和至7.5（pH试纸测定），放置于4℃暂存。
按照方案进行ELISA测试（操作同温度稳定性试验）。
检测结果如图3所示，结果显示：修饰前后的Pre-F蛋白在不同pH处理后的抗原结合活性具有显著的差异，修饰后的Pre-F蛋白在pH3.5、pH5.0、pH7.5、pH8.0及pH10的OD值均明显高于修饰前蛋白，说明本发明制备的修饰后Pre-F蛋白在不同pH处理后依旧可以保持较高的抗原结合活性，即该修饰后Pre-F蛋白具备较好的pH稳定性。
实施例4：对实施例1获得的修饰后Pre-F蛋白进行渗透压稳定性检测
1）配液
①10 mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5。
配制方法（以配制25 mL容量计算）：
1.取10 mL的25 mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0）加入50 mL离心管中。
2.加入纯化水至体积为25 mL。
3.取1 N盐酸加入，调节溶液pH值为7.5。
4.定容至25 mL，室温保存，有效期3个月。
②80 mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5。
配制方法（以配制100 mL容量计算）：
1.在200 mL烧杯中加入80 mL纯化水。
2.准确量取969.12 mg Tris加入。
3.取6 mL 1 N盐酸加入（理论值6.45 mL），然后微量加入，调节溶液pH值为7.5。
4.定容至100 mL，室温保存，有效期3个月。
③1.5 M MgCl2溶液
配制方法（以配制100 mL容量计算）：
1.准确量取20 mL的3 M MgCl2溶液加入50 mL离心管中。
2.加入纯化水至20 mL，充分混合。
3.室温保存，有效期3个月。
④3 M MgCl2溶液
配制方法（以配制100 mL容量计算）：
/>
1.准确量取60.99 g 六水氯化镁加入200 mL烧杯中。
2.加入纯化水至80 mL左右，搅拌充分溶解。
3.定容至100 mL，室温保存，有效期3个月。
⑤ 150mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5。
配制方法（以配制100 mL容量计算）：
1.在200 mL烧杯中加入80 mL纯化水。
2.准确量取1.815 mg Tris加入。
3.取1 N盐酸加入，调节溶液pH值为7.5。
4.定容至100 mL，室温保存，有效期3个月。
⑥ 4 M NaCl溶液
配制方法（以配制125 mL容量计算）：
1.准确称取29.22 g 氯化钠加入200 mL烧杯中。
2.加入100 mL纯化水充分搅拌溶解。
3.定容至125 mL，室温保存，有效期3个月。
2）用不同渗透压值缓冲液将待测试蛋白（分别为参考实施例1制备得到的修饰前Pre-F蛋白和实施例1制备得到的修饰后Pre-F蛋白）稀释为20 ug/mL，放置于1.5 mL离心管中，总体积为1 mL。
3）按照下表对样本进行不同渗透压值孵育。
4）10 mM及80 mM组用Tris缓冲液稀释，1500 mM及3000 mM组用MgCl2缓冲液分别稀释。
5）孵育结束后，10 mM及80 mM组用4 M NaCl缓冲液调节至150 mM，1500 mM 及3000 mM组分别用纯化水稀释10倍及20倍，放置于4℃暂存。
按照方案进行ELISA测试。（操作同温度稳定性试验）。
结果如图4所示，结果显示：修饰前后的Pre-F蛋白在不同渗透压值孵育处理后的抗原结合活性具有显著的差异，修饰后的Pre-F蛋白在10mM、80mM、150mM、1500mM及3000mM的OD值均明显高于修饰前蛋白，说明本发明制备的修饰后Pre-F蛋白在不同渗透压值孵育处理后依旧可以保持较高的抗原结合活性，即该修饰蛋白对不同渗透压的稳定性较好。
实施例5：肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F荚膜多糖制备
(1)主种子和工作种子制备
肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F的发酵液中纯化荚膜多糖，具体方法如下：
肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)获得，将冻干种子管中的菌种接种于5ml酵母-酸水解酪素培养液，36℃±2℃培养18小时，当细菌生长至OD600读数为1.0时，将菌液转接种至150ml的新鲜酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃±2℃下，培养5-10小时至指数生长期，停止培养，分装冻干，储存于2-8℃为主种子。
肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F的主种子冻干管的菌种接种于5mL酵母-酸水解酪素培养液，36℃±2℃培养18小时，当细菌生长至OD600读数为1.0时将菌液转接种至150mL新鲜酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃±2℃下，培养8小时至指数生长期，停止培养，分装冻干，储存于4℃为血清型的工作种子。
(2)细菌发酵
从工作种子库取出种子管接种至5mL母-酸水解酪素培养液中，在36℃±2℃培养至细菌生长指数中期。将菌液转接种至150mL新鲜酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃±2℃培养下，培养5-10小时至指数生长期，将50mL菌液转接种至2L酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃±2℃下，培养至指数生长期中期而制备成发酵种子液，将发酵种子液接种至装有30升酵母-酸水解酪素培养液的50L发酵罐中。用氢氧化钠来维持发酵液pH在6.8±0.2，待细菌生长至指数后期。
(3)荚膜多糖纯化
1、通过碟片式离心机进行离心，离心速度9600rpm，收集离心上清液，丢弃排渣部分；
2、用微滤膜对离心液进行微滤，以去除其中的残留细胞碎片和不溶小颗粒物质，用0.22μm膜微滤发酵离心上清液，收集过滤液；
3、对微滤液进行浓缩及洗滤，获得粗制细菌荚膜多糖溶液，再用缓冲液，以30Kd膜超滤洗滤15个样品体积；
4、采用50kD膜包对多糖溶液进一步洗滤10样品体积，浓缩多糖样品溶液；
5、收集纯化多糖溶液至冻干瓶中，在真空冻干机上冻干，在-70℃下储存。
实施例6：肺炎球菌血清型Pn1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F多糖-RSV重组蛋白结合物的制备(CDAP-CYS法)
1）分别称取相应血清型纯化荚膜多糖17.5mg，溶解4mL于磷酸钠缓冲液中；
2）加入12mg的1-氰基-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸盐(CDAP) (Sigma-Aldrich)至多糖溶液中，搅拌，室温下反应1小时；
3）加入3Eqm胱胺，室温下反应1小时；
4）加入1M赖氨酸(Sigma-Aldrich)溶液0.3mL进行淬灭反应，室温下反应1-2小时；
5）加入8Eqm的3(2-氯乙基)磷酸酯至多糖溶液中，还原多糖中的二硫键；
6）将活化多糖溶液转移至透析袋，在4℃下，对磷酸盐缓冲液透析，换液四次；
7）称取30mg载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，蛋白浓度10mg/mL；
8）加入8mg溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)(Sigma-Aldrich)至载体蛋白溶液中，室温下反应2小时，将活化蛋白溶液转移至透析袋(Thermo Scientific)，在4℃下，对磷酸盐缓冲液透析，换液四次；
9）取活化多糖溶液4mL与活化蛋白溶液4mL混合，在室温下反应4小时；
10）加入4Eqm的N-乙酰-L半胱氨酸(Sigma-Aldrich)，在2-8℃下，反应4小时，加入12Eqm碘乙酰胺(Sigma-Aldrich)，在2-8℃下，反应4小时；
11）将多糖结合物反应液转移至透析袋，在4℃下，对磷酸盐缓冲液透析；
12）将样品溶液上样Sepharose CL-4B，过程纯化，收集外水体积结合物；
13）用0.22μm滤膜过滤后，置于2-8℃下保存待制剂。
实施例7：肺炎球菌血清型Pn1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F多糖-RSV重组蛋白结合物的制备(还原胺法(水相))
1)分别称取相应血清型纯化荚膜多糖500mg，溶解500mL于纯化水中；
2)通过高压均质机，在压力600bar，循环三次进行降解，加入0.12eqm高碘酸钠(Sigma-Aldrich)，避光，反应18小时；
3)用超滤洗滤，分子量为50Kd膜包，对纯化水进行超滤洗滤，并浓缩，冻干；
4)称取18mg活化多糖，加入4mL的DMSO，搅拌溶解完全；
5)加入19mg载体蛋白至DMSO(Sigma-Aldrich)溶液4mL，加入2Eqm氰基硼氢化钠(Sigma-Aldrich)，室温下反应22小时；
6)加入2Eqm硼氢化钠(Sigma-Aldrich)淬灭反应4小时后，转移合成反应液至透析袋中，对缓冲液透析，换液四次；
7)将样品溶液上样Sepharose CL4B，收集外水体积的结合物部分；
8)用0.22μm滤膜过滤后，置于4℃下保存待制剂；
9)取样检测结合物分子量，多糖蛋白浓度及比率。
实施例8：与肺炎球菌血清型6A、23F、1、4多糖Pre-F蛋白偶合物与PA1抗体亲和性检测
1）将96孔板进行预处理，包括加入洗涤缓冲液(PBS)，并在4℃下过夜。
2）弃去孔内液体，用洗涤缓冲液(PBS)洗涤3次，每次5分钟。
3）将肺炎球菌血清型6A、23F、1、4多糖Pre-F蛋白偶合物（参照实施例6制备，另外也可以参考实施例7制备）分别稀释至适当浓度，分别加入96孔板中，每孔100μL，在37℃下孵育1小时。
4）用洗涤缓冲液(PBS)洗涤3次，每次5分钟。
5）加入PA1（Medimmune origion）抗体，每孔100μL，在37℃下孵育1小时。
6）用洗涤缓冲液(PBS)洗涤3次，每次5分钟。
7）加入二抗(AP标记羊抗人)，每孔100μL，在37℃下孵育1小时。
8）用洗涤缓冲液(PBS)洗涤3次，每次5分钟。
9）加入TMB底物溶液，每孔100μL，在37℃下孵育15分钟。
10）加入终止液(2mol/L 硫酸)，每孔50μL，在室温下反应5分钟，而后立即测定OD值。
结果如图5所示，结果显示：与RSV Pre-F蛋白抗体亲和性相比，四种多糖Pre-F蛋白偶合物与PA1抗体亲和性检测结果均达到Pre-F蛋白抗体亲和性的75%以上，其中6A-PreF蛋白偶合物抗体亲和性达Pre-F蛋白抗体亲和性的90.7%，23F-PreF蛋白偶合物抗体亲和性达Pre-F蛋白抗体亲和性的86.8%，1-PreF蛋白偶合物抗体亲和性达Pre-F蛋白抗体亲和性的88.3%。由此可见，多糖Pre-F蛋白偶合物的抗体亲和性较好。
实施例9：24价肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗+CpG+Alum(制剂A)和RSV重组蛋白结合疫苗+CpG+Alum(制剂C)
制剂A的制备方法如下：
检测单价结合物中多糖浓度，分别量取相当于2.2μg多糖量(除Pn6B多糖量为4.4μg)的RSV重组蛋白结合物溶液(见实施例6或7)，包括Pn1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F至无菌容器中，取样检测蛋白含量为39.2μg ，加入 CpG(Genscript)，最终量为0.1mg，加入磷酸盐缓冲液pH5.8缓冲液，用0.22μm膜除菌过滤；加入无菌磷酸铝胶(Benetag)，最终铝离子量为0.125mg，在4℃下搅拌1小时，无菌分装0.5mL/瓶，4℃下保存，待免疫用。
制剂C的制备方法如下：
利用实施例1获得的修饰后Pre-F蛋白取样含量为5μg ，加入 CpG(Genscript)，最终量为0.1mg，加入磷酸盐缓冲液pH5.8缓冲液，用0.22μm膜除菌过滤；加入无菌磷酸铝胶(Benetag)，最终铝离子量为0.125mg，在4℃下搅拌1小时，无菌分装0.5mL/瓶，4℃下保存，待免疫用。
实施例10：制剂免疫兔及采血
取2.5-3.5公斤新西兰大白兔10只，5只一组，其中一组免疫制剂A（实施例9制备），另一组免疫制剂B（PCV13辉瑞），每只兔注射0.5mL/次，分0周，2周各免疫一次；采血时间为0周免疫前，免疫后1周，第二次免疫后1周，共三次。一部分血液制备成PBMC，在干冰上速冻后低温保存，另一部分血液室温下放置4小时，在10000RPM，室温下离心，吸取离心上清血清，-70℃下保存待检测。
实施例11：ELISA法检测实施例9的24价肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗兔免疫血清中多糖抗体滴度
分别配制不同血清型肺炎球菌多糖(1×PBS溶液)，存储于4℃冰箱。稀释待检血清型肺炎球菌多糖4μg/mL，加100μL包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板，在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次，加入100μL封闭缓冲液，在室温下孵育2小时，用洗板缓冲液洗4次，可在4℃下保存一周。
将兔注射疫苗及对照样品获得的相应待测血清1:10稀释成工作样品血清，稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，总体积200μL，从第一排开始向下进行二倍系列稀释，在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μL碱性磷酸酶标记羊抗兔抗体(1:2000稀释)，在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μL磷酸-4-硝基苯酯二钠盐底物(Sigma-Aldrich)溶液，在405nm读盘。
表1：24价肺炎球菌多糖-RSV pre-F重组蛋白结合疫苗兔免疫抗血清IgG滴度检测结果
制剂A和制剂B的主要区别在于载体蛋白的不同。多糖和载体蛋白抗体IgG检测结果显示，免疫前，各血清型多糖抗体滴度无显著性差异，免疫第一针后，制剂A(24价肺炎多糖蛋白结合疫苗)和制剂B(PCV13辉瑞)刺激动物产生相应血清型多糖抗体IgG滴度根据血清型不同有所差异，如血清型1、3、4、9V、14、18C、19A、19F及23F结果显示制剂A要高于制剂B，占69％组分；血清型5、6A、6B及7F制剂B稍高于制剂A，占31％组分。由此可见，采用RSVpre-F重组蛋白作为载体蛋白制备的制剂A要优于PCV13辉瑞以CRM197为载体蛋白的制剂B。免疫二针后，抗体IgG检测结果显示制剂A与制剂B差异更显著，血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A及23F结果显示制剂A要高于制剂B，占77％组分，血清型3和19F无显著性差异，占15.3％组分；血清型6A检测结果显示制剂B略高于制剂A，占7.7％组分。由此可见，用RSVpre-F重组蛋白作为载体蛋白，对多糖的抗原性增强效果更好。
对于24价肺炎多糖RSV pre-F蛋白结合疫苗抗体滴度检测结果来看，随着免疫次数增加，抗体滴度显著增强，第二针免疫后的IgG滴度显著高于第一针免疫后的IgG滴度。
实施例12：检测实施例9的RSV重组蛋白疫苗与24价肺炎多糖-RSV重组蛋白结合疫苗鼠免疫血清中pre-F蛋白抗体滴度
（1）ELISA检测IgG抗体滴度（Eu）
取4-6周雌性BALB/c小白鼠 ,随机分组，每组8只，每隔两周皮下免疫一次，其中一组免疫制剂A，另一组免疫制剂C(RSV Pre-F蛋白疫苗+CpG+Alum)，每次0.1mL，共免疫两次。
免疫一周后采血,采血时间为0周免疫前，免疫后2周，第二次免疫后4周，共三次。一部分血液制备成PBMC，在干冰上速冻后低温保存，另一部分血液室温下放置4小时，在10000RPM，室温下离心，吸取离心上清血清，-70℃下保存待检测。
配制纯化pre-F蛋白储备液1mg/mL(1×PBS溶液)，存储于4℃冰箱。稀释蛋白储液至包被缓冲液4μg/mL，加100μL包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板，在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次，加入100μL封闭缓冲液，在室温下孵育2小时，用洗板缓冲液洗4次，可在4℃下保存一周。
将鼠注射疫苗及对照样品获得的相应待测血清1:10稀释成工作样品血清，稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，总体积200μL，从第一排开始向下进行二倍系列稀释，在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μL碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体(1:2000稀释)，在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μL磷酸-4-硝基苯酯二钠盐底物溶液，在405nm读盘。
（2）RSV A2病毒中和滴度
使用 Hep-2 细胞在含有10%牛血清的 DMEM 培养基中培养 RSV 病毒 A 型。选取上述各组小鼠血清各 8 份，使用含有 2%牛血清的DMEM 培养基进行稀释。从 40 倍稀释开始，按照 3 倍稀释梯度稀释至 29160 倍，然后与等体积200 TCID50 的病毒液混合，37℃放置 1 小时，每孔 200μl 铺到 Hep-2 细胞板，每只小鼠血清设置 3 个复孔，37℃培养5-7 天，观察细胞病变情况。
表2：RSV Pre-F蛋白和24价肺炎球菌多糖RSV Pre-F结合疫苗小鼠免疫血清IgG抗体滴度几何平均值(Eu)
检测结果显示，24价肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗小鼠免疫血清IgG抗体滴度几何平均值(Eu)显著高于RSV Pre-F重组蛋白疫苗。其中，第一次免疫及第二次免疫后24价结合物（Pn-RSV Pre-F）免疫血清中IgG抗体滴度都明显高出RSV Pre-F疫苗约1.5倍。
对RSV A2病毒中和滴度试验检测结果显示，24价结合物（Pn-RSV Pre-F）小鼠血清中和滴度均值为 8303， 显著高出RSV Pre-F小鼠血清中和滴度约1.3倍。由此可见，将本发明制备的24价肺炎球菌多糖RSV Pre-F重组蛋白结合疫苗注射至小鼠，可以获取到高保护效价的血清，且小鼠血清针对 RSV主要流行毒株 A 型可产生较高的中和抗体滴度。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在申请待批本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (18)
1.一种RSV重组蛋白，其特征在于，所述的RSV重组蛋白是经过氨基酸突变修饰稳定性增强的RSV Pre-F重组蛋白，所述的氨基酸突变修饰为以下两种方式中的任意一种：
(1)在序列如SEQ ID NO.1所示的野生型pre-F蛋白全长序列基础上进行氨基酸点突变，将第28位的I突变为C，将第464位的G突变为C；
(2)先将序列如SEQ ID NO.1所示的野生型pre-F蛋白全长序列中的跨膜区/胞内区删除，并在其C末端连接fibritin/Throm/6his/Stretaq序列，得到序列如SEQ ID NO.2所示的突变体，再在SEQ ID NO .2序列基础上再进行氨基酸点突变，将第28位的I突变为C，将第464位的G突变为C。
2.含有如权利要求1所述RSV重组蛋白的疫苗，其特征在于，所述的疫苗是以RSV重组蛋白作为唯一免疫原的疫苗。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于,所述RSV重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo：3所示。
4.含有如权利要求1所述RSV重组蛋白的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的结合疫苗以RSV重组蛋白作为载体蛋白，包括肺炎球菌多糖和RSV重组蛋白两种免疫原，RSV重组蛋白具有免疫原性。
5.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于,所述RSV重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示，所述的肺炎球菌荚膜多糖选自24种血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于,所述结合疫苗为24价肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其中RSV重组蛋白的氨基酸序列如SEQID No：3所示，所述的肺炎球菌荚膜多糖包括24种血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F。
7.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的肺炎球菌荚膜多糖以共价键与RSV重组蛋白相连接。
8.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的结合疫苗，其制剂形式为水剂或冻干剂。
9.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的结合疫苗中含有佐剂。
10.根据权利要求9所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的佐剂为CpG、QS21、磷酸铝、CpG与磷酸铝混合物、或QS21与磷酸铝混合物中的任意一种。
11.编码如权利要求1所述的RSV重组蛋白的核苷酸序列。
12.含有如权利要求11所述的核苷酸序列的重组表达载体。
13.利用如权利要求12所述的重组表达载体制备RSV重组蛋白的表达方法，其特征在于，所述的表达方法采用CHO细胞表达系统或昆虫杆状病毒表达系统。
14.如权利要求4-10任一项所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述的肺炎球菌荚膜多糖和RSV重组蛋白是在缓冲液或有机溶剂中，通过化学合成反应得到的结合物。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。
16.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述化学合成反应选自还原胺法、1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate法，己二酰二肼法或1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐法中的一种。
17.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括肺炎球菌荚膜多糖的前处理、RSV重组蛋白的表达和纯化以及结合物的纯化。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述的多糖前处理包括降解和活化，所述的降解方法选自高压均质机降解、酸水解法或酶消化法。
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-
2024
- 2024-01-26 CN CN202410112460.7A patent/CN117645655B/zh active Active
Patent Citations (6)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN117645655B (zh) | 2024-05-24 |
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