CN117645568A - N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺类衍生物及其制备和应用 - Google Patents
N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺类衍生物及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
N‑([4,4’‑联吡啶]‑2‑基)肉桂酰胺类衍生物及其制备和应用，本发明公开的N‑([4,4’‑联吡啶]‑2‑基)肉桂酰胺类衍生物可以靶向Nur77，诱导Nur77核易位至线粒体，并增强Nur77‑Bcl‑2相互作用诱导线粒体相关凋亡抑制肿瘤细胞增殖，从而可以用于治疗癌症或其他Nur77相关疾病的治疗和预防。
Description
技术领域
本发明涉及化学药物技术领域，尤其涉及N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺类衍生物及其制备和应用。
背景技术
Nur77(NR4A1/TR3)是核受体家族中的一员，因未发现其内源性配体，也被称为孤儿核受体。现有研究证明，Nur77在肿瘤发生发展中发挥重要作用，靶向调控Nur77基因型与非基因型功能抑制肿瘤发生发展是肿瘤治疗的一种潜在策略。并且，越来越多具有抗肿瘤活性的Nur77小分子调控剂被报道。其中，双吲哚芳基类衍生物(C-DIMs)代表化合物C-DIM8可通过调控Nur77的基因型功能，抑制Nur77下游靶标PD-L1的表达进而抑制乳腺癌的侵袭与转移；C-DIMs衍生物BI1071被发现可调节Nur77的非基因型功能，诱导Nur77出核定位至线粒体，在线粒体与Bcl-2相互作用，使肿瘤细胞发生线粒体相关凋亡；4-(喹啉4-氨基)苯甲酰肼衍生物4-PQBH通过靶向Nur77并调控其核易位，激活内质网应激和自噬，导致不依赖caspase的细胞质空泡化和细胞死亡。总之，Nur77是肿瘤治疗的一个潜在靶点，新型Nur77调控剂的发现有助于开发肿瘤治疗的新型靶向药物。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供通式(I)、(II)所示的N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺衍生物或其在药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢产物、代谢前体或前药。
其中，R1为吗啉、4-甲基哌啶、2-甲氨基乙醇、N-甲基戊胺、4-羟基哌啶；R2为氢或甲基；R3为氢或甲基；X为C或N原子。
更进一步的，本发明通式所示(I)(II)N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺衍生物为以下30个结构式中任一种：
一种药物组合物，含有所述的N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺衍生物、或该类衍生物在药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
所述在药学上可接受的盐为通式(I)(II)化合物与酸生成的在药学上可接受的加成盐。其中用于成盐的酸包括无机酸及有机酸，优选的无机酸为盐酸、硫酸、磷酸和甲磺酸，有机酸为乙酸、三氯乙酸、丙酸、丁酸、马来酸、对甲苯磺酸、苹果酸、丙二酸、肉桂酸、柠檬酸、富马酸、樟脑酸、二葡糖酸、天冬氨酸和酒石酸。
所述药学上可接受的载体指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的赋形剂或稀释剂。
本发明所述的N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺衍生物或其在药学上可接受的盐在制备Nur77调控剂药物中的应用。
本发明所述的N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺衍生物Nur77调控剂可用于治疗癌症或肿瘤相关疾病，包括肺癌、乳腺癌、肝癌或宫颈癌。
本发明所述的N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺衍生物或其药学上可接受的盐，与Nur77蛋白有着良好的结合活性，具备抑制裸鼠异种移植瘤生长发展的作用。
相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：
本发明公开的N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺类衍生物通过靶向结合Nur77，诱导Nur77出核与Bcl-2于线粒体共定位并增强Nur77与Bcl-2的相互作用，诱导肿瘤细胞发生线粒体相关凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，从而可以用于癌症或肿瘤相关疾病的治疗和预防。
附图说明
图1为实施例3中10μM工作浓度的公开化合物与Nur77-LBD结合响应值的实验结果。
图2为实施例4中代表化合物对Nur77-LBD结合亲和力的实验结果。
图3为实施例5中化合物NCZ23的对不同核受体转录活性调节的能力实验结果。
图4为实施例7中化合物NCZ23体外抗肿瘤细胞增殖活性的实验结果。
图5为实施例8中化合物NCZ23影响肿瘤细胞有丝分裂进程的实验结果。
图6为实施例9中化合物NCZ23诱导肿瘤细胞凋亡的实验结果。
图7为实施例10中化合物NCZ23依赖Nur77发挥抗肿瘤活性的实验结果。
图8为实施例11中化合物NCZ23诱导肿瘤细胞发生线粒体相关凋亡的实验结果。
图9为实施例12中化合物NCZ23诱导Nur77出核定位至线粒体的实验结果
图10为实施例13中化合物NCZ23增强Nur77-Bcl-2相互作用的实验结果。
图11为实施例14中大鼠口服给药50mg/kg NCZ23的药-时曲线。
图12为实施例15中NCZ23显著抑制裸鼠体内MDA-MB-231移植瘤生长的检测结果。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。
本发明提供的N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺衍生物的制备方法如下：
1、以取代或未取代的肉桂酸为原料，氯化亚砜为溶剂，搅拌并升温至回流，生成取代或未取代肉桂酰氯，将2-氨基-4-溴吡啶、3-溴苯胺或3-溴-5-甲基苯胺与上述酰氯进行缩合得到取代或未取代的N-(4-溴吡啶-2-基)肉桂酰胺、N-(3-溴苯基)肉桂酰胺或N-(3-溴-5-甲基苯基)肉桂酰胺中间体(1)。
2、将4-溴-2-氟吡啶或4-溴-7-氮杂吲哚进行取代得到4-(4-溴吡啶-2-基)胺类衍生物或4-溴-1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶后与联硼酸频那醇酯反应制得中间体硼酸酯(2)和(3)。
3、将中间体(1)与中间体硼酸酯(2)和(3)分别进行Suzuki偶联得到目标化合物(I)(II)，具体合成路线如下：
在本发明优选实施方案中，其中，R1为吗啉、4-甲基哌啶、2-甲氨基乙醇、N-甲基戊胺、4-羟基哌啶；R2为氢或甲基；R3为氢或甲基；X为C或N原子。
实施例1：N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺(NCZ23)的制备
本实施例以NCZ23的合成为例来说明本发明N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺衍生物的合成，具体步骤如下：
(1)中间体肉桂酰氯的合成：在干燥的100mL反应瓶中，室温条件下加入肉桂酸(2.00g,13.50mmol)，氯化亚砜作为溶剂，加热至回流1h。TLC监测反应已结束，停止反应，将溶剂减压真空旋干后，得淡黄色油状物肉桂酰氯2.12g，收率94.6％。
(2)中间体N-(4-溴吡啶-2-基)-3-肉桂酰胺的合成：在干燥的50mL反应瓶中，冰浴条件下依次加入2-氨基-4-溴吡啶(1.00g,5.78mmol)，吡啶(1.4mL,17.34mmol)，THF(10mL)。于冰浴条件下搅拌0.5h。再在搅拌状态缓慢滴加肉桂酰氯(1.15g,6.94mmol)的THF混合溶液，在冰浴条件下反应1h。TLC监测反应已结束，停止反应，将溶剂减压真空浓缩后加入冰水搅拌，析出固体，抽滤，得滤饼(粗产物)。得到的粗产物用硅胶柱层析分离(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5:1,v/v)，得淡黄色N-(4-溴吡啶-2-基)-3-肉桂酰胺1.13g，收率66.5％。
(3)中间体1-(4-溴吡啶-2-基)哌啶-4-醇的合成：将4-溴-2-氟吡啶(4.00g，22.72mmol)与4-羟基哌啶(2.76g，27.26mmol)溶于25mL的DMF中，加入无水碳酸钾(9.42g，68.16mmol)，氮气置换反应体系后，升温至90℃反应3h，TLC检测原料反应完全后，停止加热，将反应液搅拌下倒入100mL冰水中，析出固体，抽滤，取滤饼，干燥后得白色固体1-(4-溴吡啶-2-基)哌啶-4-醇4.89g，收率84.1％。
(4)1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)吡啶-2-基)哌啶-4-醇的合成：将上步所得1-(4-溴吡啶-2-基)哌啶-4-醇(4g，15.62mmol)、联硼酸频那醇酯(4.76g，18.75mmol)、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.1mmol)、以及干燥的无水醋酸钾(4.59g，46.86mmol)加入25mL干燥的1,4-二氧六环中，置换氮气，于氮气保护下升温至110℃反应过夜，TLC检测1-(4-溴吡啶-2-基)哌啶-4-醇反应完全后，减压浓缩除去溶剂，用乙酸乙酯与水萃取三次(3*100mL)，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤后，有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相减压浓缩后的残留物硅胶拌样，再用柱层析硅胶色谱分离纯化(等度洗脱方法，二氯甲烷:甲醇＝15:1，v/v)，得黄色粉末中间体1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)吡啶-2-基)哌啶-4-醇4.17g，收率87.8％。
(5)N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺(NCZ23)的合成：取50mL圆底烧瓶，称取中间体N-(4-溴吡啶-2-基)-3-肉桂酰胺(302.0mg,1mmol)与中间体1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)吡啶-2-基)哌啶-4-醇(365.0mg,1.2mmol)以及无水碳酸钾(414mg，3mmol)和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(36.6mg,0.05mmol)溶于5mL溶剂(乙二醇二甲醚:水＝4:1)中，氮气置换3次，升温至80℃反应过夜，TLC检测反应已平衡，停止反应，减压浓缩除去溶剂后，残留物硅胶拌样，利用柱层析色谱分离纯化(等度洗脱方法，石油醚:乙酸乙酯＝2:3，v/v)，得到化合物N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺，淡黄色粉末206.7mg，收率51.7％。
实施例2：N-(4-(1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吡啶-2-基)肉桂酰胺(NCZ28)的制备
本实施例以NCZ28的合成为例来说明本发明N-(4-(1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吡啶-2-基)肉桂酰胺衍生物的合成，具体步骤如下：
(1)中间体4-溴-1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶的合成：将4-溴-7-氮杂吲哚(2.10g,10.00mmol)与NaH(800mg，20mmol)加入含有无水DMF(10mL)的100mL反应瓶中，冰浴条件下搅拌1h后加入碘甲烷(1.56g，11.00mmol)后继续冰浴反应1h。TLC监测反应已结束，停止反应，将反应液缓慢倒入预冷的饱和氯化铵溶液中并不断搅拌，抽滤收集滤饼，得浅棕色固体中间体4-溴-1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶2.00g，收率95.2％。
(2)1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶的合成：将上步所得4-溴-1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(2g，9.52mmol)、联硼酸频那醇酯(2.90g，11.43mmol)、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.1mmol)、以及干燥的无水醋酸钾(2.80g，28.56mmol)加入15mL干燥的1,4-二氧六环中，置换氮气，于氮气保护下升温至110℃反应过夜，TLC检测1-(4-溴吡啶-2-基)哌啶-4-醇反应完全后，减压浓缩除去溶剂，用乙酸乙酯与水萃取三次(3*100mL)，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤后，有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相减压浓缩后的残留物硅胶拌样，再用柱层析硅胶色谱分离纯化(等度洗脱方法，石油醚:乙酸乙酯＝5:1，v/v)，得白色粉末中间体1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶1.98g，收率80.1％。
(3)N-(4-(1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吡啶-2-基)肉桂酰胺(NCZ28)的合成：取50mL圆底烧瓶，称取中间体N-(4-溴吡啶-2-基)-3-肉桂酰胺(302.0mg,1mmol)与中间体1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(309.8mg,1.2mmol)以及无水碳酸钾(414mg，3mmol)和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(36.6mg,0.05mmol)溶于5mL溶剂(乙二醇二甲醚:水＝4:1)中，氮气置换3次，升温至80℃反应过夜，TLC检测反应已平衡，停止反应，减压浓缩除去溶剂后，残留物硅胶拌样，利用柱层析色谱分离纯化(等度洗脱方法，石油醚:乙酸乙酯＝6:1，v/v)，得到化合物N-(4-(1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吡啶-2-基)肉桂酰胺，白色粉末102.5mg，收率28.9％。
表1所列举的其他化合物：N-(3-(2-吗啉并吡啶-4-基)苯基)肉桂酰胺(NCZ1)、N-(3-甲基-5-(2-吗啉并吡啶-4-基)苯基)肉桂酰胺(NCZ2)、N-(2'-吗啉基-[4,4'-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺(NCZ3)、(E)-N-(3-甲基-5-(2-吗啉并吡啶-4-基)苯基)-3-(间甲苯基)丙烯酰胺(NCZ4)、(E)-N-(2'-吗啉基-[4,4'-联吡啶]-2-基)-3-(间甲苯基)丙烯酰胺(NCZ5)、N-(3-(2-(4-甲基哌啶-1-基)吡啶-4-基)苯基)肉桂酰胺(NCZ6)、N-(3-甲基-5-(2-(4-甲基哌啶-1-基)吡啶-4-基)苯基))肉桂酰胺(NCZ7)、N-(2'-(4-甲基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺(NCZ8)、(E)-N-(3-甲基-5-(2-(4-甲基哌啶-1-基)吡啶-4-基)苯基)-3-(间甲苯基)丙烯酰胺(NCZ9)、(E)-N-(2'-(4-甲基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-3-(间甲苯基)丙烯酰胺(NCZ10)、N-(3-(2-((2-羟乙基)(甲基)氨基)吡啶-4-基)苯基)肉桂酰胺(NCZ11)、N-(3-(2-((2-羟乙基)(甲基)氨基)吡啶-4-基)-5-甲基苯基)肉桂酰胺(NCZ12)、N-(2'-((2-羟乙基)(甲基)氨基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺(NCZ13)、(E)-N-(3-(2-((2-羟乙基)(甲基)氨基)吡啶-4-基)-5-甲基苯基)-3-(间甲苯基)丙烯酰胺(NCZ14)、(E)-N-(2'-((2-羟乙基)(甲基)氨基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-3-(间甲苯基)丙烯酰胺(NCZ15)、N-(3-(2-(甲基(戊基)氨基)吡啶-4-基)苯基)肉桂酰胺(NCZ16)、N-(3-甲基-5-(2-(甲基(戊基)氨基)吡啶-4-基)苯基)肉桂酰胺(NCZ17)、N-(2'-(甲基(戊基)氨基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺(NCZ18)、(E)-N-(3-甲基-5-(2-(甲基(戊基)氨基)吡啶-4-基)苯基)-3-(间甲苯基)丙烯酰胺(NCZ19)、(E)-N-(2'-(甲基(戊基)氨基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-3-(间甲苯基)丙烯酰胺(NCZ20)、N-(3-(2-(4-羟基哌啶-1-基)吡啶-4-基)苯基)肉桂酰胺(NCZ21)、N-(3-(2-(4-羟基哌啶-1-基)吡啶-4-基)-5-甲基苯基)肉桂酰胺(NCZ22)、(E)-N-(3-(2-(4-羟基哌啶-1-基)吡啶-4-基)-5-甲基苯基)-3-(间甲苯基)丙烯酰胺(NCZ24)、(E)-N-(2'-(4-羟基哌啶-1-基)-[4,4'-联吡啶]-2-基)-3-(间甲苯基)丙烯酰胺(NCZ25)与化合物NCZ23合成方法类似；N-(3-(1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)苯基)肉桂酰胺(NCZ26)、N-(3-甲基-5-(1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)苯基)肉桂酰胺(NCZ27)、(E)-N-(3-甲基-5-(1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)苯基)-3-(间甲苯基)丙烯酰胺(NCZ29)、(E)-N-(4-(1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)吡啶-2-基)-3-(间甲苯基)丙烯酰胺(NCZ30)与化合物NCZ28合成方法类似。
表1.本发明所述化合物的结构、氢谱(1H NMR)及高分辨质谱(HRMS)
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实施例3：本发明中化合物与Nur77-LBD结合亲和力评估
利用表面等离子共振(SPR)技术评估本发明化合物与Nur77-LBD结合相应值。将50μg纯化好的Nur77-LBD蛋白偶联到CM5传感芯片上，使用Biacore T200仪器，通过SPR检测器捕捉10μM待测化合物与芯片表面蛋白质结合解离的过程的变化，Nur77天然配体雷公藤红素(Celastrol)作为阳性对照。实验结果如图1所示，图1的结果显示本发明中的大部分化合物与Nur77-LBD蛋白具有一定结合能力。
实施例4：优选化合物NCZ3、NCZ8、NCZ13、NCZ18、NCZ23和NCZ28与Nur77-LBD的结合动力学分析
(1)表面等离子共振(SPR)：通过表面等离子技术(SPR)来测定NCZ3、NCZ8、NCZ18和NCZ23与Nur77-LBD结合的解离常数(KD)。实验方法同实施例3，通过SPR检测器捕捉不同浓度化合物与芯片表面蛋白质结合解离的过程的变化，结合图数据拟合采用动力学拟合方式。实验结果如图2中A～F所示。
图2中A显示不同浓度NCZ3(0.47-10μM)与芯片表面Nur77-LBD蛋白结合解离的过程，根据动力学拟合获得NCZ3与Nur77-LBD结合的解离常数KD为0.42μM；
图2中B显示不同浓度NCZ8(0.08-7.5μM)与芯片表面Nur77-LBD蛋白结合解离的过程，根据动力学拟合获得NCZ8与Nur77-LBD结合的解离常数KD为1.84μM；
图2中C显示不同浓度NCZ13(0.47-10μM)与芯片表面Nur77-LBD蛋白结合解离的过程，根据动力学拟合获得NCZ13与Nur77-LBD结合的解离常数KD为0.25μM；
图2中D显示不同浓度NCZ18(0.04-10μM)与芯片表面Nur77-LBD蛋白结合解离的过程，根据动力学拟合获得NCZ18与Nur77-LBD结合的解离常数KD为0.06μM；
图2中E显示不同浓度NCZ23(0.08-7.5μM)与芯片表面Nur77-LBD蛋白结合解离的过程，根据动力学拟合获得NCZ23与Nur77-LBD结合的解离常数KD为0.12μM；
图2中F显示不同浓度NCZ28(0.05-10μM)与芯片表面Nur77-LBD蛋白结合解离的过程，根据动力学拟合获得NCZ28与Nur77-LBD结合的解离常数KD为1.25μM。
(2)荧光滴定实验：通过荧光滴定实验分析NCZ18和NCZ23与Nur77-LBD的结合。取纯化后的Nur77-LBD蛋白溶液到比色皿中，逐滴加入NCZ18和NCZ23溶液。在25℃下，利用荧光分光光度计依次对不同浓度小分子-蛋白混合溶液的荧光强度进行检测，激发狭缝宽度为5nm，发射狭缝宽度为10nm，激发波长为280nm，发射光谱记录为285nm至450nm。将所得数据用Origin 2021软件作图并根据标准公式计算解离常数，实验结果如图2中G～H所示。
图2中G显示用4mM NCZ18滴定3.0mL浓度为2μM的Nur77-LBD溶液的荧光强度变化，NCZ18作用浓度从0.2μM到3.6μM，根据标准方程拟合得到NCZ18结合Nur77-LBD的解离常数为0.37±0.07μM；
图2中H显示用4mM NCZ23滴定3.0mL浓度为4μM的Nur77-LBD溶液的荧光强度变化，NCZ23作用浓度从0.2μM到7.2μM，根据标准方程拟合得到NCZ23结合Nur77-LBD的解离常数为0.33±0.02μM。
实施例5：优选化合物NCZ23选择性调控Nur77的转录活性
核受体作为转录因子，在其外源性配体的存在下，其转录活性可能会受到影响。通过双荧光素酶报告基因实验检测NCZ23对Nur77及其他核受体家族成员如RXRα和RARγ转录活性的影响。双荧光素酶报告基因系统是转录水平调控研究的重要实验方法。取对数期的293T细胞接种于48孔板，培养过夜，每孔同时转染50ng的pBind-Nur77-LBD(pBind-RXRα-LBD或pBind-RARγ-LBD)和50ng的PG5-Luciferase质粒，转染24h，以DMSO为阴性对照，1μM雷公藤红素(Celastrol)、0.1μM CD3254和0.1μM ATRA分别作为三种核受体的阳性对照。NCZ23处理细胞24h。随后利用双荧光素酶报告基因试剂盒(Promega)检测目标化合物作用后的报告基因表达情况，实验结果如图3所示。
图3中A的结果显示NCZ23以浓度依赖的方式抑制Nur77的转录激活；
图3中B～C的结果显示0.1μM NCZ23对RXRα、RARγ的转录活性无明显影响。
实施例6：本发明中化合物抗肿瘤细胞增殖活性评价
细胞株：人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人非小细胞肺癌细胞(A549)
细胞培养：MDA-MB-231，A549，HeLa使用DMEM培养基。
化合物溶液的配制：将化合物溶于DMSO，配制成10mM的母液供后续实验所需，母液保存于-20℃冰箱中。
MTT实验：取对数期细胞接种于96孔板，37℃培养过夜。将5μM待测化合物溶液加入各孔中，每组设置3个复孔，以同比例稀释DMSO溶液为对照，继续培养72h后，加入工作浓度为0.5mg/mL的MTT，37℃培养3～4h，弃上清，每孔加入100μL DMSO，振板10min以充分溶解甲臜，而后酶标仪检测492nm处吸光值。实验测得数据以公式：计算抑制率如表3所示。根据不同浓度下的细胞存活率计算各化合物抑制肿瘤细胞增殖的IC50如表2所示。表2～表3的结果表明本发明中化合物对肿瘤细胞增殖有着明显的抑制作用。
表2.化合物NCZ3、5、8、13、18、23和28抑制癌细胞增殖的IC50
表3.化合物NCZ1-30(5μM)对癌细胞增殖的抑制活性
实施例7：优选化合物NCZ23体外抗肿瘤细胞增殖活性评价
(1)细胞集落形成实验：
细胞株：MDA-MB-231(人乳腺癌细胞系)，A549(人非小细胞肺癌细胞系)，HepG2(人肝癌细胞系)。
通过细胞集落形成来测定化合物NCZ23抑制细胞增殖的能力。分别取1000～2000个对数期MDA-MB-231、A549、HepG2细胞接种于6孔板中，37℃培养48h，加入含不同浓度(1.95,7.81,31.25,125nM)NCZ23的培养基培养48h，更换正常培养基继续一周后，弃培养基，1×PBS洗3次，甲醇室温固定15min，弃甲醇，1×PBS洗3次，晾干后加入0.5％结晶紫溶液(用PBS稀释)染色，室温染色10～15min，移除染液，用超纯水洗至培养皿无背景颜色，用显微镜观察集落计数，拍照记录，实验结果如图4中A所示。
图4中A显示化合物NCZ23在体外能够显著抑制MDA-MB-231、A549和HepG2细胞增殖。
(2)MTT实验：
细胞株：MDA-MB-231、HCC1937、MCF-7(人乳腺癌细胞系)，A549(人非小细胞肺癌细胞系)，HeLa(人宫颈癌细胞系)，MCF-10A(人正常乳腺上皮细胞)，LO2(人正常肝细胞)，HaCaT(人永生化表皮细胞)，HK2(人肾皮质近曲小管上皮细胞)
细胞培养：MDA-MB-231，HCC1937，MCF-7，A549，HeLa，HaCaT，HK2使用DMEM培养基，LO2使用RPMI-1640培养基培养，MCF-10A使用MCF-10A专用培养基。
实验方法同实施例5。实验结果如图4中B所示。
图4中B显示化合物NCZ23对于各癌细胞系有着优良的抑制作用，IC50处于0.0067～2.5110μM之间，而对正常乳腺细胞系的抑制作用大大减弱，对MCF-10A细胞的IC50为3.3330±0.2447μM。
实施例8：优选化合物NCZ23干扰细胞周期进程
细胞周期实验：通过流式细胞仪检测化合物NCZ23对细胞周期进程的影响。取对数期肿瘤细胞MDA-MB-231和A549接种于6孔板中，37℃培养过夜，加入含不同浓度(7.81,31.25,125.0nM)NCZ23的培养基继续培养12h后，弃培养基，预冷1×PBS润洗，胰酶消化后将细胞收集至预冷的1.5mL ep管中，2500rpm，5min离心后移除上清，预冷PBS洗两次，离心后移除上清，轻轻弹击管壁以避免细胞成团，加入70％乙醇4℃固定4h以上，2500rpm，5min离心后移除上清，预冷1×PBS洗两次，离心后移除上清，轻轻弹击管壁以避免细胞成团，加入500μL工作浓度为1μg/mL DAPI溶液(2mg/mL DAPI储存液由超纯水配置，使用时用1×PBS稀释至工作浓度)或含RNase的PI溶液，轻轻混悬细胞，室温避光染色20min，用流式细胞仪检测细胞周期分布。实验结果如图5所示，化合物NCZ23以125nM作用于MDA-MB-231和A549细胞12h后，分别将78.55％和57.76％的细胞阻滞在G2/M期。
实施例9：优选化合物NCZ23诱导细胞凋亡
(1)Annexin V-FITC细胞凋亡检测试：通过流式细胞仪检测化合物NCZ23对细胞凋亡的影响。取对数期细胞MDA-MB-231和A549接种于6孔板中，37℃培养过夜，加入含15.6,62.5,250.0nM NCZ23的培养基处理MDA-MB-231细胞以及含31.2,125.0,500.0nM NCZ23的培养基处理A549细胞24h后，弃培养基，预冷1×PBS润洗，胰酶消化后将细胞收集至预冷的1.5mL ep管中，2500rpm，5min离心后移除上清，预冷PBS洗两次，离心后移除上清，轻轻弹击管壁以避免细胞成团，利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Yeasen)，室温避光染色20min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
图6中A显示化合物NCZ23以250nM作用于MDA-MB-231 24h后，导致42.87％细胞凋亡，化合物NCZ23以500nM作用于A549 24h后，导致41.39％细胞凋亡。
(2)蛋白免疫印迹检测细胞凋亡：细胞发生凋亡后，与其相关的蛋白表达会明显变化。PARP蛋白在细胞发生早期凋亡时，会产生切割型可将其作为早期凋亡的标志。Bcl-2和Mcl-1是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，对细胞生长、分化有重要调控作用。Bcl-2、Mcl-1均可通过抑制细胞色素C的释放来阻碍细胞凋亡。通过Western blot检测化合物NCZ23对凋亡标志蛋白PARP切割、Bcl-2和Mcl-1的表达。取对数期细胞MDA-MB-231接种于6孔板中，37℃培养过夜，加入含NCZ23的培养基继续培养相应时间后，弃培养基，预冷1×PBS润洗3次，加入细胞裂解液，冰上裂解30min，12000g，4℃离心15min，取上清，加入loading buffer，100℃，煮样10min，蛋白样品经Western blot检测。实验结果如图6中B～C所示。
图6中B显示了250nM NCZ23以时间依赖的方式诱导PARP切割；
图6中C显示NCZ23作用于MDA-MB-231细胞24h，以浓度依赖的方式上调PARP切割及下调Bcl-2和Mcl-1的表达。
实施例10：优选化合物NCZ23调控并依赖Nur77发挥抗肿瘤活性
将对照质粒和PX330-sgNur77质粒转染进A549细胞中。随后用免疫印迹法(Western Blot)检测细胞中的Nur77蛋白表达，用流式细胞仪检测A459-WT和A549-Nur77-/-细胞在化合物NCZ23(7.81,31.25,125.00nM)处理12h后的细胞周期分布；用Western blot检测A459-WT和A549-Nur77-/-细胞在500nM化合物NCZ23处理24h后的细胞凋亡情况；用MTT实验检测A459-WT和A549-Nur77-/-细胞在不同浓度NCZ23处理72h后的细胞活力。随后，结果示于图7中。
图7中A～B显示了NCZ23处理A549-WT和A549-Nur77-/-细胞12h后，细胞周期分布情况，在表达Nur77的A549细胞中，7.81,31.25,125.00nM NCZ23作用12h，分别使19.76％，44.22％和90.36％的A549细胞处于G2/M期；然而，当Nur77的表达被敲除时，7.81,31.25,125.00nM NCZ23分别将10.48％，26.64％和62.11％的细胞阻滞在G2/M期，说明NCZ23阻滞细胞周期能力在Nur77表达缺失后显著减弱；
图7中C～D显示用免疫印迹法(Western Blot)和实时荧光定量PCR(RT-QPCR)检测A549细胞中的Nur77蛋白表达和mRNA水平。结果显示PX330-sgNur77有效抑制了Nur77在A549细胞中的转录和翻译水平；
图7中E显示了转染sgRNA，且经不同浓度NCZ23处理72h的A549细胞增殖情况。结果显示，NCZ23抑制A549-WT细胞增殖的IC50值为0.0779±0.0250μM，而NCZ23抑制A549-Nur77-/-的IC50为0.3813±0.0019μM，说明NCZ23的体外抗增殖活性在Nur77表达被抑制后显著减弱；
图7中F显示了用Western blot实验检测NCZ23处理A549-WT和A549-Nur77-/-细胞24h后，细胞凋亡标志物PAPR切割情况。将A549-WT和A549-Nur77-/-接种于6孔板中，37℃培养过夜，加入含500nM NCZ23的培养基培养24h，弃培养基，预冷1×PBS润洗3次，收集细胞总蛋白，蛋白样品经Western blot检测。结果显示了在Nur77正常表达的A549-WT细胞中，500nM NCZ23显著上调PARP切割，而在Nur77表达敲低的A549-Nur77-/-中，NCZ23几乎不能诱导PARP切割，说明NCZ23诱导细胞凋亡的能力依赖Nur77。
实施例11：化合物NCZ23使细胞发生线粒体相关凋亡
线粒体膜电位的降低是线粒体相关凋亡的特点之一。为了评估NCZ23诱导的细胞凋亡是否与线粒体经典通路有关，本发明使用线粒体特异性染料JC-1检测线粒体膜电位的变化。用JC-1染色检测NCZ23处理的MDA-MB-231乳腺癌细胞。较高线粒体膜电位的是健康细胞，JC-1结合线粒体形成复合物而发出强烈的红色光。然而，在较低的细胞线粒体膜电位时，线粒体受损，JC-1结合线粒体发出绿色荧光。线粒体去极化表现为绿色/红色荧光强度比的增加。由于线体功能素乱的另一个标志是线粒体活性氧mito-ROS的升高，因此本发明利用流式细胞术对红色和绿色荧光发射物进行分析，利用共聚焦显微镜对细胞中的活性氧进行检测。结果如图8中A～C所示，结果提示NCZ23诱导癌细胞发生线粒体相关调亡。
图8中A显示，NCZ23以剂量依赖的方式诱导线粒体膜功能损伤。250nM NCZ23处理6h后绿色/红色荧光强度比由100％增加到188％。
图8中B～C显示，125nM NCZ23作用于MDA-MB-231细胞6h就能显著诱导mito-ROS累积。
实施例12：NCZ23促进Nur77出核并定位于线粒体
据报道Nur77的线粒体靶向性与其对调亡的调控息息相关，NCZ23诱导Nur77依赖的线粒体相关细胞调亡，由此本发明进一步探讨NCZ23是否通过促进Nur77核转位到线粒体而导致其Nur77依赖的细胞凋亡。实验结果如图9中A～D所示。
图9中A显示在NCZ23处理后，Nur77细胞核外分布增多；
图9中B显示在核质分离实验中，NCZ23会促使Nur77的核输出；
图9中C显示Nur77在NCZ23作用后出核，与线粒体探针Mito-Tracker产生广泛的共定位；
图9中D显示相比于未使用核输出抑制剂LMB的细胞，在与1nM LMB的共处理下，NCZ23抑制A549细胞增殖的IC50显著减弱。说明NCZ23通过调控Nur77出核发挥抗肿瘤作用。
实施例13：NCZ23增强Nur77与Bcl-2在线粒体的共定位和相互作用
据报导Nur77通常在其特异性配体的诱导下出核定位至线粒体并与Bcl-2发生相互作用，使Bcl-2构象改变，暴露其促凋亡的BH3结构域，使其由抗凋亡因子转换为促凋亡因子。本发明首先通过免疫荧光染色实验检验化合物NCZ23是否调控Nur77和Bcl-2的相互作用以发生线粒体相关凋亡途径。结果如图10中A～B所示。
图10中A显示了在NCZ23处理后肿瘤细胞中的Nur77出核并与核外的Bcl-2在线粒体上发生了明显的共定位；
图10中B显示了免疫共沉淀实验中在NCZ23处理后Nur77与Bcl-2的相互作用显著增强。
实施例14：优选化合物NCZ23的药代动力学研究
根据厦门大学动物护理和使用委员会的指导方针，批准了药代动力学研究方案。优选化合物NCZ23在10～14周龄(200-220g)的Sprague-Dawley大鼠中进行了药代动力学评估。化合物配制在10％ DMSO、2％ T-80和88％超纯水中，并以50mg/kg的剂量灌胃给药(PO)。雌性SD大鼠随机分为每组3只，给药后于0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h用含有肝素钠(10mg/mL，30μL)的试管储存血样。在4℃(100μL)下以4000r/min离心10分钟后，将血浆与血液分离。使用以正电喷雾模式运行的ABI 3200QTRAP三重四极杆系统，通过LC/MS/MS测定血浆样品中的化合物NCZ23水平。化合物NCZ23的药代动力学参数通过DAS3.0软件进行拟合。优选化合物NCZ23的药代动力学性质如表4所示。图11显示了优选化合物NCZ23的药代动力学性质与药-时曲线图。
表4.优选化合物NCZ23的药代动力学性质
实施例15：优选化合物NCZ23可以抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠异种移植瘤的生长
在裸鼠右侧前腋部皮下注射MDA-MB-231细胞悬液。设置对照组(溶剂)，低剂量给药组(25.0mg/kg)和高剂量给药组(50.0mg/kg)，连续给药15天。结果如图12的结果显示NCZ23能够在不引起明显毒副作用的情况下抑制裸鼠体内MDA-MB-231肿瘤的生长。
图12中A～B显示了优选化合物NCZ23能够显著抑制MDA-MB-231细胞异种移植瘤的生长；25.0和50.0mg/kg的肿瘤抑制率分别为64.99％和84.33％；
图12中C显示了优选化合物NCZ23能够显著性抑制MDA-MB-231细胞异种移植瘤的重量；
图12中D显示了优选化合物NCZ23在给药期间并没有引起裸鼠体重的显著减轻，没有明显毒性；
图12中E显示了对照组和优选化合物NCZ23处理的肿瘤组织的H&E染色，及其Ki67和Nur77的表达情况；
图12中F显示了对照组与给药组小鼠主要器官的H&E染色情况。
Claims (6)
1.N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺类衍生物，其特征在于，具有以下通式(I)或(II)所示的结构：
其中，R1选自吗啉、4-甲基哌啶、2-甲氨基乙醇、N-甲基戊胺、4-羟基哌啶；R2为氢或甲基；R3为氢或甲基；X为C或N原子。
2.权利要求1所述的N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺类衍生物，其特征在于，式(I)和式(II)所示结构的化合物选自如下：
3.权利要求1～2任一项所述的N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺类衍生物的制备方法，其特征在于包括如下合成路线：
4.一种药物组合，其特征在于：含有权利要求1～3中任一项所述的N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺类衍生物或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的载体。
5.权利要求1～3任一项所述的一种N-([4,4’-联吡啶]-2-基)肉桂酰胺衍生物及权利要求4所述的药物组合的应用，其特征在于：作为Nur77核易位诱导剂和Nur77与Bcl-2的相互作用增强剂用于制备治疗与Nur77相关疾病中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的疾病包括肺癌、乳腺癌、肝癌或宫颈癌。
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