CN117642506A - 无义密码子的特定寡核苷酸编程的通读 - Google Patents

无义密码子的特定寡核苷酸编程的通读 Download PDF

Info

Publication number
CN117642506A
CN117642506A CN202280040327.4A CN202280040327A CN117642506A CN 117642506 A CN117642506 A CN 117642506A CN 202280040327 A CN202280040327 A CN 202280040327A CN 117642506 A CN117642506 A CN 117642506A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligomer
cftr
stop codon
composition
premature stop
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280040327.4A
Other languages
English (en)
Inventor
D·苏索罗夫
A·科罗斯特列夫
S·扎赫拉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Massachusetts UMass
Original Assignee
University of Massachusetts UMass
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Massachusetts UMass filed Critical University of Massachusetts UMass
Publication of CN117642506A publication Critical patent/CN117642506A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程领域。具体地，其涉及治疗基于遗传的疾病和病症的组合物和方法。例如，预期了促进产生非功能性蛋白质的提前终止密码子的翻译通读的核酸寡聚体。在提前终止密码子下游的+4至+8(+4、+5、+6、+7和+8)核苷酸位置处结合的DNA和修饰的核酸寡核苷酸成功促进了囊性纤维化基因中提前终止密码子的通读。

Description

无义密码子的特定寡核苷酸编程的通读
政府支持声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的GM127094下由政府支持完成的。政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明涉及基因工程领域。具体地，其涉及用于治疗基于遗传的疾病和病症的组合物和方法，所述疾病和病症是由从具有无义终止密码子的mRNA翻译非功能性蛋白质引起的。例如，预期了促进提前mRNA终止(无义)密码子的翻译通读的DNA和修饰的核酸(NA)寡聚体。无义密码子通读产生全长蛋白质并恢复蛋白质功能。例如，在提前mRNA终止密码子的第一个核苷酸(+1位置，参见图1)下游的+4至+8核苷酸位置(即+4、+5、+6、+7、+8位置)处开始结合的DNA寡聚体成功促进通读。
背景技术
导致提前无义(即终止)密码子的突变引起超过10％的人类遗传疾病。终止密码子通常导致蛋白质从核糖体中物理释放。因此，提前终止密码子导致短的(例如截短的)通常无功能的蛋白质的翻译，从而导致疾病。
大多数测试的药物(例如氨基糖苷，例如G418)可以提供无义或终止密码子的全局通读，但诱导许多细胞mRNA的错误编码，从而导致临床上不可接受的毒性水平。
本领域需要的是增加特定mRNA分子中提前终止密码子的通读的组合物和方法。
发明内容
本发明涉及基因工程领域。具体地，其涉及用于治疗基于遗传的疾病和病症的组合物和方法，所述疾病和病症是由从具有无义终止密码子的mRNA翻译非功能性蛋白质引起的。例如，预期了促进提前mRNA终止(无义)密码子的翻译通读的DNA和修饰的核酸(NA)寡聚体。无义密码子通读产生全长蛋白质并恢复蛋白质功能。例如，在提前mRNA终止密码子的第一个核苷酸(+1位置，参见图1)下游的+4至+8核苷酸位置(即+4、+5、+6、+7、+8位置)处开始结合的DNA寡聚体成功促进通读。相比之下，位于第一个无义终止密码子的第一个核苷酸下游更远处(+9位置等)的核苷酸不会促进通读。
在一个实施方案中，本发明涉及一种脱氧核糖核酸(DNA)反义寡聚体，其从信使RNA(mRNA)分子内提前终止密码子中的第一个核苷酸下游+4至+8核苷酸位置之间开始与核糖核酸(RNA)序列互补。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAC(RNA)。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAG。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAA。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAU。在一个实施方案中，DNA寡聚体的解链温度(Tm)包括但不限于32℃、34℃、40℃、47℃、53℃、57℃或66℃。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTC(CFTR+4(60))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(49))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是GACCTCCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(60))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(32))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是ACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(34))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(47))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(66))。
在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTGAAGCTGACCCTCAGGCC(Mecp2+8(57)255X)。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CGGGGAGTGTGGTGGCAG(Mecp2+8(57)270X)。在一个实施方案中，DNA寡聚体是TGCAGGAGACCGTACTCCCC(Mecp2+8(57)294X)。在一个实施方案中，反义寡聚体包含至少一个具有修饰的核苷酸。在一个实施方案中，这些修饰包括但不限于2’-氟化物(F)修饰、2’-O-甲基(Ome)修饰和硫代磷酸酯(PS)键联修饰。在一个实施方案中，反义寡聚体是CFTR+8(47)寡核苷酸，包括氟化物修饰的CFTR+8(47)寡核苷酸。在一个实施方案中，氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCACF。在一个实施方案中，氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是UFCCACFTCAGFTGTGFATTCFCACF。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含：i)脱氧核糖核酸(DNA)或修饰的核酸反义寡聚体；和ii)编码RNA序列和提前终止密码子的信使核糖核酸(mRNA)分子，其中反义寡聚体从提前终止密码子的第一个核苷酸下游+4至+8核苷酸位置之间开始与RNA序列互补。在一个实施方案中，反义寡聚体与RNA序列杂交。在一个实施方案中，mRNA分子编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。在一个实施方案中，mRNA分子编码甲基胞嘧啶结合蛋白2(Mecp2)。在一个实施方案中，所述组合物还包含氨基糖苷。在一个实施方案中，所述组合物还包含比促进翻译通读的常规氨基糖苷浓度低5倍的氨基糖苷浓度。在一个实施方案中，氨基糖苷是G418。在一个实施方案中，氨基糖苷包括但不限于庆大霉素(gentamicin)、阿米卡星(amikacin)、妥布霉素(tobramycin)、卡那霉素(kanamycin)、链霉素(streptomycin)或新霉素(neomycin)。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAC。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAG。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAA。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAT。在一个实施方案中，DNA寡聚体的解链温度(Tm)包括但不限于32℃、34℃、40℃、47℃、53℃或66℃。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTC(CFTR+4(60))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(49))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是GACCTCCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(60))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(32))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是ACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(34))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(47))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(66))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTGAAGCTGACCCTCAGGCC(Mecp2+8(57)255X)。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CGGGGAGTGTGGTGGCAG(Mecp2+8(57)270X)。在一个实施方案中，DNA寡聚体是TGCAGGAGACCGTACTCCCC(Mecp2+8(57)294X)。在一个实施方案中，反义寡聚体包含至少一个具有修饰的核苷酸。在一个实施方案中，这些修饰包括但不限于2’-氟化物(F)修饰、2’-O-甲基(Ome)修饰和硫代磷酸酯(PS)键联修饰。在一个实施方案中，反义寡聚体是CFTR+8(47)寡核苷酸，包括氟化物修饰的CFTR+8(47)寡核苷酸。在一个实施方案中，氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCACF。在一个实施方案中，氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是UFCCACFTCAGFTGTGFATTCFCACF。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，包括：a)提供；i)包含具有提前终止密码子的信使核糖核酸(mRNA)分子并且表现出医学病症的至少一种症状的患者；和ii)药学上可接受的组合物，其包含从所述提前终止密码子的第一个核苷酸下游+4至+8核苷酸位置之间开始与mRNA序列互补的脱氧核糖核酸(DNA)或修饰的核酸反义寡聚体；和b)向患者施用药学上可接受的组合物，使得所述医学病症的所述至少一种症状减轻。在一个实施方案中，医学病症是由提前终止密码子引起的。在一个实施方案中，医学病症是囊性纤维化或Rett综合征。在一个实施方案中，药学上可接受的组合物还包含氨基糖苷。在一个实施方案中，施用不会导致氨基糖苷副作用。在一个实施方案中，氨基糖苷是G418。在一个实施方案中，氨基糖苷包括但不限于庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、链霉素或新霉素。在一个实施方案中，mRNA分子编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白。在一个实施方案中，mRNA分子编码甲基胞嘧啶结合蛋白2。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAC。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAG。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAA。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAT。在一个实施方案中，DNA寡聚体的解链温度(Tm)包括但不限于32℃、34℃、40℃、47℃、53℃或66℃。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTC(CFTR+4(60))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(49))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是GACCTCCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(60))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(32))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是ACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(34))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(47))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(66))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTGAAGCTGACCCTCAGGCC(Mecp2+8(57)255X)。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CGGGGAGTGTGGTGGCAG(Mecp2+8(57)270X)。在一个实施方案中，DNA寡聚体是TGCAGGAGACCGTACTCCCC(Mecp2+8(57)294X)。在一个实施方案中，反义寡聚体包含至少一个具有修饰的核苷酸。在一个实施方案中，这些修饰包括但不限于2’-氟化物(F)修饰、2’-O-甲基(Ome)修饰和硫代磷酸酯(PS)键联修饰。在一个实施方案中，反义寡聚体是CFTR+8(47)寡核苷酸，包括氟化物修饰的CFTR+8(47)寡核苷酸。在一个实施方案中，氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCACF。在一个实施方案中，氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是UFCCACFTCAGFTGTGFATTCFCACF。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，包括：a)提供；i)包含具有提前终止密码子的信使核糖核酸(mRNA)分子并且表现出医学病症的至少一种症状的患者；和ii)药学上可接受的组合物，其包含氨基糖苷和从所述提前终止密码子的第一个核苷酸下游+4至+8核苷酸位置之间开始与mRNA序列互补的脱氧核糖核酸(DNA)或修饰的核酸反义寡聚体；和b)向患者施用药学上可接受的组合物，使得所述医学病症的所述至少一种症状减轻。在一个实施方案中，与单独的所述氨基糖苷相比，所述施用具有所述至少一种症状的协同减轻。在一个实施方案中，医学病症是由提前终止密码子引起的。在一个实施方案中，医学病症是囊性纤维化或Rett综合征。在一个实施方案中，药学上可接受的组合物还包含氨基糖苷。在一个实施方案中，施用不会导致氨基糖苷副作用。在一个实施方案中，氨基糖苷是G418。在一个实施方案中，氨基糖苷包括但不限于庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、链霉素或新霉素。在一个实施方案中，mRNA分子编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白。在一个实施方案中，mRNA分子编码甲基胞嘧啶结合蛋白2。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAC。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAG。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAA。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAT。在一个实施方案中，DNA寡聚体的解链温度(Tm)包括但不限于32℃、34℃、40℃、47℃、53℃、66℃或70℃。在一个实施方案中，DNA寡聚体具有解链温度(Tm)，包括但不限于32℃、34℃、40℃、47℃、53℃或66℃。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTC(CFTR+4(60))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(49))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是GACCTCCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(60))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(32))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是ACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(34))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(47))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(66))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTGAAGCTGACCCTCAGGCC(Mecp2+8(57)255X)。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CGGGGAGTGTGGTGGCAG(Mecp2+8(57)270X)。在一个实施方案中，DNA寡聚体是TGCAGGAGACCGTACTCCCC(Mecp2+8(57)294X)。在一个实施方案中，反义寡聚体包含至少一个具有修饰的核苷酸。在一个实施方案中，这些修饰包括但不限于2’-氟化物(F)修饰、2’-O-甲基(Ome)修饰和硫代磷酸酯(PS)键联修饰。在一个实施方案中，反义寡聚体是CFTR+8(47)寡核苷酸，包括氟化物修饰的CFTR+8(47)寡核苷酸。在一个实施方案中，氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCACF。在一个实施方案中，氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是UFCCACFTCAGFTGTGFATTCFCACF。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，包括：a)提供；i)表现出囊性纤维化的至少一种症状的患者；和ii)药学上可接受的组合物，其包含从mRNA分子内提前终止密码子的第一个核苷酸下游+4至+8核苷酸位置之间开始与信使核糖核酸(mRNA)序列互补的脱氧核糖核酸(DNA)或修饰的核酸反义寡聚体；和b)向患者施用药学上可接受的组合物，使得所述囊性纤维化的至少一种症状减轻。在一个实施方案中，药学上可接受的组合物还包含氨基糖苷。在一个实施方案中，施用不会导致氨基糖苷副作用。在一个实施方案中，氨基糖苷是G418。在一个实施方案中，氨基糖苷包括但不限于庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、链霉素或新霉素。在一个实施方案中，mRNA序列编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAC。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAG。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAA。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAT。在一个实施方案中，DNA寡聚体的解链温度(Tm)包括但不限于32℃、34℃、40℃、47℃、53℃或66℃。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTC(CFTR+4(60))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(49))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是GACCTCCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(60))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(32))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是ACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(34))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(47))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(66))。在一个实施方案中，反义寡聚体包含至少一个具有修饰的核苷酸。在一个实施方案中，这些修饰包括但不限于2’-氟化物(F)修饰、2’-O-甲基(Ome)修饰和硫代磷酸酯(PS)键联修饰。在一个实施方案中，反义寡聚体是CFTR+8(47)寡核苷酸，包括氟化物修饰的CFTR+8(47)寡核苷酸。在一个实施方案中，氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCACF。在一个实施方案中，氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是UFCCACFTCAGFTGTGFATTCFCACF。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，包括：a)提供；i)表现出Rett综合征的至少一种症状的患者；和ii)药学上可接受的组合物，其包含从mRNA分子内提前终止密码子的第一个核苷酸下游+4至+8核苷酸位置之间开始与信使核糖核酸(mRNA)序列互补的脱氧核糖核酸(DNA)或修饰的核酸反义寡聚体；和b)向患者施用药学上可接受的组合物，使得所述Rett综合征的至少一种症状减轻。在一个实施方案中，药学上可接受的组合物还包含氨基糖苷。在一个实施方案中，施用不会导致氨基糖苷副作用。在一个实施方案中，氨基糖苷是G418。在一个实施方案中，氨基糖苷包括但不限于庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、链霉素或新霉素。在一个实施方案中，mRNA序列编码甲基胞嘧啶结合蛋白2。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAA。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAT。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTGAAGCTGACCCTCAGGCC(Mecp2+8(57)255X)。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CGGGGAGTGTGGTGGCAG(Mecp2+8(57)270X)。在一个实施方案中，DNA寡聚体是TGCAGGAGACCGTACTCCCC(Mecp2+8(57)294X)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，包括：a)提供；i)表现出囊性纤维化的至少一种症状的患者；和ii)包含氨基糖苷的药学上可接受的组合物和包含脱氧核糖核酸(DNA)或修饰的核酸反义寡聚体的药学上可接受的组合物，所述脱氧核糖核酸(DNA)或修饰的核酸反义寡聚体从mRNA分子内提前终止密码子的第一个核苷酸下游+4至+8核苷酸位置之间开始与信使核糖核酸(mRNA)序列互补；和b)向患者施用药学上可接受的组合物，使得囊性纤维化的所述至少一种症状减轻。在一个实施方案中，与单独的所述氨基糖苷相比，所述施用具有所述至少一种症状的协同减轻。在一个实施方案中，施用不会导致氨基糖苷副作用。在一个实施方案中，氨基糖苷是G418。在一个实施方案中，氨基糖苷包括但不限于庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、链霉素或新霉素。在一个实施方案中，mRNA序列编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAC。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAG。在一个实施方案中，DNA寡聚体的解链温度(Tm)包括但不限于32℃、34℃、40℃、47℃、53℃或66℃。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTC(CFTR+4(60))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(49))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是GACCTCCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(60))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(32))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是ACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(34))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(47))。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(66))。在一个实施方案中，反义寡聚体包含至少一个具有修饰的核苷酸。在一个实施方案中，这些修饰包括但不限于2’-氟化物(F)修饰、2’-O-甲基(Ome)修饰和硫代磷酸酯(PS)键联修饰。在一个实施方案中，反义寡聚体是CFTR+8(47)寡核苷酸，包括氟化物修饰的CFTR+8(47)寡核苷酸。在一个实施方案中，氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCACF。在一个实施方案中，氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是UFCCACFTCAGFTGTGFATTCFCACF。
在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，包括：a)提供；i)表现出Rett综合征的至少一种症状的患者；和ii)包含氨基糖苷和脱氧核糖核酸(DNA)反义寡聚体的药学上可接受的组合物，所述脱氧核糖核酸(DNA)反义寡聚体从mRNA分子内提前终止密码子的第一个核苷酸下游+4至+8核苷酸位置之间开始与信使核糖核酸(mRNA)序列互补；和b)向患者施用药学上可接受的组合物，使得所述Rett综合征的至少一种症状减轻。在一个实施方案中，与单独的所述氨基糖苷相比，所述施用具有所述至少一种症状的协同减轻。在一个实施方案中，施用不会导致氨基糖苷副作用。在一个实施方案中，氨基糖苷是G418。在一个实施方案中，氨基糖苷包括但不限于庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、链霉素或新霉素。在一个实施方案中，mRNA序列编码甲基胞嘧啶结合蛋白2。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAC。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAG。在一个实施方案中，DNA寡聚体的解链温度(Tm)包括但不限于57℃。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAA。在一个实施方案中，提前终止密码子是UGAT。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CTGAAGCTGACCCTCAGGCC(Mecp2+8(57)255X)。在一个实施方案中，DNA寡聚体是CGGGGAGTGTGGTGGCAG(Mecp2+8(57)270X)。在一个实施方案中，DNA寡聚体是TGCAGGAGACCGTACTCCCC(Mecp2+8(57)294X)。
定义
为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本文定义的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一个”、“一种”和“该”的术语不仅指单数实体，还指复数实体，并且还包括可以使用具体示例来说明的一般类别。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是除了权利要求中概述的之外，它们的使用并不限制本发明。
如本文所用，术语“大约”或“约”在任何测定测量的上下文中是指给定测量的+/-5％。
如本文所用，通用术语“+#(##)”是指反义核苷酸结合命名法格式。例如，反义寡核苷酸名称“+8(70)”表示“+8”指的是登记的结合核苷酸，其位于无义/提前终止密码子的第一个核苷酸下游八(8)个核苷酸，和“(70)”是具有反义寡核苷酸的相同序列的类似DNA-DNA双链体的解链温度。本文提出的其他反义寡核苷酸名称遵循相同的格式和解释。
如本文所用，术语“氨基糖苷”是指含有氨基糖亚结构的任何有机分子。临床上，氨基糖苷是传统革兰氏阴性抗菌药物的医学和细菌学类别，其抑制蛋白质合成并含有作为分子一部分的氨基修饰的糖苷。例如，氨基糖苷包括但不限于G418、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、链霉素和新霉素。众所周知，常规浓度(即剂量)的氨基糖苷的施用导致大部分患者产生副作用。这些副作用包括但不限于与听觉、肾脏和前庭相关的系统。
如本文所用，术语“有效量”是指包含实现临床有益结果(即，例如，症状减轻)的治疗剂的药物组合物的特定量。此类组合物的毒性和治疗功效可以通过标准制药程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如用于测定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体来说治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，其可以用LD50/ED50的比率来表示。优选表现出大治疗指数的化合物。从这些细胞培养测定和其他动物研究中获得的数据可用于配制一系列供人类使用的剂量。此类化合物的剂量优选在包括ED50在内的毒性很小或没有毒性的循环浓度范围内。剂量在此范围内变化，取决于所采用的剂型、患者的敏感性和施用途径。
如本文所用，术语“症状”是指患者观察到的疾病或身体不适的任何主观或客观证据。例如，主观证据通常基于患者的自我报告，并且可以包括但不限于疼痛、头痛、视觉障碍、恶心和/或呕吐。或者，客观证据通常是医学测试的结果，包括但不限于体温、全血细胞计数、脂质组、甲状腺组、血压、心率、心电图、组织和/或身体成像扫描。
如本文所用，术语“相关”是指基因突变与医学病况或疾病之间的本领域公认的因果关系。例如，本领域公认具有包含产生提前终止密码子的突变的CTFR基因的患者患有囊性纤维化或具有囊性纤维化的风险。
如本文所用，术语“疾病”或“医学病况”是指活体动物或植物体或其部分之一的正常状态的任何损害，其中断或改变生命功能的表现。通常通过区分体征和症状来表现，其通常是对以下因素的反应：i)环境因素(例如营养不良、工业危害或气候)；ii)特定传染性病原体(例如蠕虫、细菌或病毒)；iii)生物体的固有缺陷(例如遗传异常)；和/或iv)这些因素的组合。
当涉及相对于治疗的受试者，未治疗的受试者中的任何症状的表达时，术语“减少”、“抑制”、“减弱”、“阻止”、“降低”、“预防”和语法等同词(包括“较低”、“较小”等)是指治疗的受试者中的症状的数量和/或程度以被任何受过医学训练的人员认为是临床相关的任何量低于未治疗的受试者中的数量和/或程度。在一个实施方案中，所治疗的受试者中的症状的数量和/或程度比未治疗受试者中的症状数量和/或严重程度低至少10％、低至少25％、低至少50％、低至少75％和/或低至少90％。
如本文所用，术语“施用的”或“施用”是指向患者提供组合物使得该组合物对患者具有其预期效果的任何方法。示例性的施用方法是通过直接机制，例如局部组织施用(即，例如血管外放置)、口服摄入、透皮贴剂、局部、吸入、栓剂等。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”是人或动物并且不需要住院。例如，门诊病人、疗养院的人都是“患者”。患者可以包括任何年龄的人类或非人类动物，因此包括成人和青少年(即儿童)。术语“患者”并不意味着需要医学治疗，因此，无论是临床还是支持基础科学研究，患者可以自愿或非自愿地参与实验。
如本文所用，术语“蛋白质”是指许多天然存在的极其复杂的物质(例如酶或抗体)中的任何一种，其由通过肽键连接的氨基酸残基组成，含有碳、氢、氮、氧元素，通常还有硫元素。一般来说，蛋白质包含数量级在数百以内的氨基酸。
如本文所用，术语“肽”是指通过一种酸的氨基与另一种酸的羧基结合而从两个或多个氨基酸衍生而来的各种酰胺类中的任何一种，并且其通常通过蛋白质的部分水解获得。通常，肽包含数量级在数十个的氨基酸。
术语“多肽”是指通过一种酸的氨基与另一种酸的羧基结合而从两个或多个氨基酸衍生而来的各种酰胺类中的任何一种，其通常通过蛋白质的部分水解获得。通常，多肽包含数量级在数十个或更多的氨基酸。
如本文所用，术语“药学上的”或“药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生副作用、过敏反应或其他不良反应的分子实体和组合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的承载体”包括任何和所有溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油、包衣、等渗剂和吸收延迟剂、脂质体、市售清洁剂等。补充的生物活性成分也可以掺入此类承载体中。
如本文所用的“核酸序列”和“核苷酸序列”是指寡核苷酸或多核苷酸，及其片段或部分，并且是指基因组或合成来源的DNA或RNA或它们的修饰类似物，其可以是单链或双链，并代表有义链或反义链。
如本文所用，术语“修饰的核酸”是指具有修饰的主链、糖、核碱基或新碱基或碱基对的任何核酸分子。
如本文所用，术语“分离的核酸”是指已从其天然状态移除的任何核酸分子(例如，从细胞中移除并且在优选的实施方案中不含其他基因组核酸)。
如本文所用，术语“氨基酸序列”和“多肽序列”可互换并且是指氨基酸序列。
当用于指代核苷酸序列时，术语“部分”是指该核苷酸序列的片段。该片段的大小可以在5个核苷酸残基至整个核苷酸序列减去1个核酸残基的范围。当用于提及氨基酸序列时，是指该氨基酸序列的片段。该片段的大小可以在2个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去1个氨基酸残基的范围内。
如本文所用，术语“核酸序列”和“核苷酸序列”是指寡核苷酸或多核苷酸、及其片段或部分，以及基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链，并且代表有义链或反义链。
如本文所用，术语“分离的核酸”是指已从其天然状态移除的任何核酸分子(例如，从细胞中移除并且在优选的实施方案中不含其他基因组核酸)。
如本文所用，术语“氨基酸序列”和“多肽序列”可互换并且指氨基酸序列。
当用于指代氨基酸序列时，术语“部分”是指该氨基酸序列的片段。该片段的大小可以在2个氨基酸残基至整个氨基酸减去1个氨基酸残基的范围内。
如本文所用，术语“反义”用于指与特定RNA序列(例如，mRNA)互补的核酸序列。反义RNA可以通过任何方法产生，包括通过以与病毒启动子相反的方向剪接感兴趣的基因来合成，其允许合成编码链。一旦引入细胞，该转录链就会与细胞产生的天然mRNA结合以形成双链体。然后，这些双链体会阻断mRNA的进一步转录或其翻译。以这种方式，可以产生突变表型。术语“反义链”用于指与“有义”链互补的核酸链。名称(-)(即“负”)有时用于指反义链，而名称(+)有时用于指有义(即“正”)链。
如本文所用，术语“功能等同的密码子”是指编码相同氨基酸的不同密码子。这种现象通常被称为遗传密码的“简并性”。例如，六种不同的密码子编码氨基酸精氨酸。
蛋白质的“变体”定义为与多肽序列或多肽序列的任何同源物有一个或多个氨基酸不同的氨基酸序列。变体可以具有“保守”改变，其中置换的氨基酸具有相似的结构或化学性质，例如用异亮氨酸取代亮氨酸。更罕见的是，变体可能具有“非保守”变化，例如用色氨酸替换甘氨酸。类似的微小变化还可以包括氨基酸缺失或插入(即添加)或两者。可以使用包括但不限于软件的计算机程序找到确定哪些氨基酸残基和多少个氨基酸残基可以被置换、插入或缺失而不消除生物或免疫活性的指导。
核苷酸的“变体”定义为因具有缺失、插入和置换而不同于参考寡核苷酸的新核苷酸序列。这些可以使用多种方法(例如测序、杂交测定等)来检测。
“缺失”定义为核苷酸或氨基酸序列的改变，其中分别不存在一个或多个核苷酸或氨基酸残基。
“插入”或“添加”是核苷酸或氨基酸序列中的改变，其导致一个或多个核苷酸或氨基酸残基的添加。
“置换”由一个或多个核苷酸或氨基酸分别被不同的核苷酸或氨基酸取代而产生。
如本文所用，术语“互补”或“互补性”用于指通过碱基配对规则相关的“多核苷酸”和“寡核苷酸”(其是指代核苷酸序列的可互换术语)。例如，序列“C-A-G-T”与序列“G-T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”或“全部的”。“部分”互补是指其中一个或多个核酸碱基根据碱基配对规则不匹配。核酸之间的“全部”或“完全”互补性是指其中每个核酸碱基在碱基配对规则下与另一个碱基匹配。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间结合的检测方法中特别重要。
如本文所用，关于核苷酸序列的术语“同源性”和“同源的”是指与其他核苷酸序列的互补程度。可能存在部分同源性或完全同源性(即同一性)。与核酸序列部分互补即“基本上同源”的核苷酸序列是至少部分抑制完全互补序列与靶核酸序列杂交的核苷酸序列。可以在低严格条件下使用杂交测定(Southern或Northern印迹、溶液杂交等)来检查完全互补的序列与靶序列的杂交的抑制。在低严格条件下，基本上同源的序列或探针将竞争并抑制完全同源的序列与靶序列的结合(即杂交)。这并不是说低严格性条件允许非特异性结合；低严格条件要求两个序列彼此的结合是一种特异性(即选择性)相互作用。可以通过使用甚至缺乏部分程度的互补性(例如，小于约30％同一性)的第二靶序列来测试不存在非特异性结合；在不存在非特异性结合的情况下，探针将不会与第二个非互补靶标杂交。
如本文所用，关于氨基酸序列的术语“同源性”和“同源的”是指两个氨基酸序列之间一级结构的同一性程度。这种同一性程度可以针对每个氨基酸序列的一部分，或者针对氨基酸序列的整个长度。“基本上同源”的两个或更多个氨基酸序列可以具有至少50％同一性，优选至少75％同一性，更优选至少85％同一性，最优选至少95％或100％同一性。
作为“同源物”的寡核苷酸序列在本文中定义为当比较长度为100bp或更大的序列时，与序列表现出大于或等于50％同一性的寡核苷酸序列。
如本文所用，术语“杂交性”、“杂交的”或“杂交”用于指使用核酸链通过碱基配对与互补链连接以形成杂交复合物的任何过程来进行互补核酸的配对。杂交和杂交的强度(即核酸之间的缔合强度)受到诸如以下因素的影响：核酸之间的互补程度、所涉及条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。
如本文所用，术语“杂交复合物”是指两个核酸序列之间通过互补的G和C碱基之间以及互补的A和T碱基之间形成氢键而形成的复合物；这些氢键可以通过碱基堆积相互作用进一步稳定。两个互补的核酸序列以反平行构型氢键合。杂交复合物可以在溶液中形成(例如，C0 t或R0 t分析)，或者在溶液中存在的一个核酸序列与固定至固相支持物(例如，如在Southern和Northern印迹、点印迹中使用的尼龙膜或硝化纤维素滤膜或原位杂交包括FISH(荧光原位杂交)中使用的载玻片)上的另一种核酸序列之间形成。
如本文所用，术语“Tm”用于指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群体一半解离成单链时的温度。如标准参考文献所示，当核酸处于1M NaCl的水溶液中时，Tm值的简单估计可以通过以下公式计算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)。Anderson等人，“QuantitativeFilter Hybridization”于:NucleicAcidHybridization(1985)。更复杂的计算在计算Tm时考虑了结构和序列特征。
术语“DNA寡聚体”被认为具有“5'端”和“3'端”，因为单核苷酸以使得一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸通过磷酸二酯键连接到其在一个方向上的相邻单核苷酸戊糖环的3'氧上的方式反应产生寡核苷酸。因此，如果寡核苷酸的5'磷酸未与单核苷酸戊糖环的3'氧连接，则寡核苷酸的末端被称为“5'末端”。如果寡核苷酸的3'氧未与另一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸连接，则寡核苷酸的末端被称为“3'末端”。如本文所使用的，核酸序列即使在较大寡核苷酸内部，也可以说具有5'和3'末端。在线性或环状DNA分子中，离散元件被称为在“下游”或3'元件的“上游”或5'。该术语反映了转录沿着DNA链以5'到3'的方式进行的事实。指导连接的基因的转录的启动子和增强子元件通常位于编码区的5'或上游。然而，即使位于启动子元件和编码区的3'时，增强子元件也可以发挥其作用。转录终止和聚腺苷酸化信号位于编码区的3'或下游。
如本文所用，术语“具有编码基因的核苷酸序列的寡核苷酸”意指包含基因的编码区的核酸序列，即编码基因产物的核酸序列。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸可以是单链(即有义链)或双链的。如果需要，合适的控制元件例如增强子/启动子、剪接点、聚腺苷酸化信号等可以放置在紧邻基因的编码区的位置以允许转录的正确起始和/或初级RNA转录物的正确加工。或者，本发明表达载体中使用的编码区可含有内源增强子/启动子、剪接点、间插序列、聚腺苷酸化信号等或内源性和外源性控制元件的组合。
如本文所用，术语“编码...的核酸分子”、“编码...的RNA序列”、“编码...的DNA序列”和“编码...的DNA”是指(脱氧)核糖核苷酸沿着(脱氧)核糖核酸链的顺序或序列。这些(脱氧)核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此，DNA和RNA序列编码氨基酸序列。
如本文所用，术语“编码区”或“开放阅读框(ORF)”当用于指结构基因时是指编码由于mRNA分子的翻译而在新生多肽中发现的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中，编码区在5'侧以编码起始子甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”为界，并且在3'侧以指定终止密码子的三个三联体之一(即TAA、TAG、TGA)为界。
如本文所用，术语“结构基因”是指编码RNA或蛋白质的DNA序列。相反，“调节基因”是编码控制其他基因(例如转录因子)表达的产物的结构基因。
如本文所用，术语“基因”是指包含结构基因的编码区并且包括位于5'和3'末端上与编码区相邻(在任一端上约1kb的距离以使得该基因对应于全长mRNA的长度)的序列的脱氧核糖核苷酸序列。位于编码区5'并且存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。位于编码区3'或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3'非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有被非编码序列(称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”)中断的编码区。内含子是转录成异源核RNA(hnRNA)的基因片段；内含子可能含有调节元件，例如增强子。内含子从核转录物或初级转录物中被移除或“剪接”出来；因此，信使RNA(mRNA)转录物中不存在内含子。mRNA在翻译过程中发挥作用，以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。
除了含有内含子外，基因的基因组形式还可以包括位于序列的5'和3'端的存在于RNA转录物上的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于mRNA转录物上存在的非翻译序列的5'或3')。5'侧翼区可以含有调节序列，例如控制或影响基因转录的启动子和增强子。3'侧翼区可以包含指导转录终止、转录后切割和聚腺苷酸化的序列。
如本文所用，术语“结合”包括任何物理附着或紧密关联，其可以是永久性的或临时的。一般来说，氢键、疏水力、范德华力、共价键和离子键等的相互作用促进感兴趣的分子和被测量的分析物之间的物理附着。“结合”相互作用可以是短暂的，如在结合引起化学反应发生的情况下。当结合组分是酶并且分析物是该酶的底物时，这是典型的。出于本发明的目的，由结合剂和分析物之间的接触引起的反应也在结合的定义之内。
如本文所用，术语“结合位点”是指具有特定三级和/或四级结构的任何分子排列，其经历与结合组分的物理附着或紧密缔合。例如，分子排列可以包括氨基酸序列。或者，分子排列可以包括核酸序列。此外，分子排列可以包括脂质双层或其他生物材料。
附图简述
本专利的文件包含至少一张彩色附图。在申请并支付必要的费用之后，专利商标局将提供带有彩色附图的本专利的副本。
图1呈现了用于描述本发明的术语和Kar等人，“Induction of TranslationalReadthrough across the Thalassemia-Causing Premature Stop Codon inβ-Globin-Encoding mRNA”Biochemistry59(1):80-84(2020；2019年10月2号在线)中公开的不同核苷酸登记命名法的说明。
图2呈现了从具有提前(无义)终止密码子或天然(野生型)终止密码子的mRNA分子(黑色)翻译假设蛋白质的示例性说明。
图2A：在提前终止密码子(红色，左)处产生截短的蛋白质(蓝色，左)。在天然终止密码子(蓝色，左)处产生全长蛋白质(蓝色，右)。
图2B：终止因子(绿色)的图示，它识别并结合提前终止密码子(红色，左)或天然终止密码子(红色，右)。终止因子在空间上将终止密码子“拉”入核糖体(灰色)，从而释放翻译的蛋白质(蓝色)。
图2C：位于提前终止密码子(红色，左)下游的位点特异性反义DNA或修饰的寡核苷酸(浅绿色)的图示，其干扰空间“拉力”或在核糖体(灰色)上与终止因子(绿色)的其他相互作用，从而允许完整的mRNA的通读和全长蛋白质的翻译。
图3说明了兔网织红细胞萤光素酶mRNA翻译测定。
图3A：显示带有终止密码子(红色)的萤光素酶mRNA分子(黑色)翻译成发光(箭头)的全长萤光素酶蛋白(蓝色)的分步图示。
图：3B：萤光素酶mRNA翻译过程中光强度的示例性数据(例如相对发光单位(RLU))。左图：作为时间(例如秒)函数的光强度模式。中图：通过随时间的光强度波动显示的萤光素酶翻译速率。右图：描绘了随时间的光强度波动所显示的萤光素酶翻译的最大可实现速率。
图4说明了CAN1精氨酸通透酶基因/萤光素酶表达构建体(Can1-luc)的一个实施方案。上图：构建体示意图，其显示提前终止密码子和Can1开放阅读框以及具有天然终止密码子的萤光素酶基因的相对位置。下图：具有TGA提前终止密码子的Can1-luc构建体的脱氧核糖核酸序列和在提前终止密码子下游+8个核苷酸位置处与Can1-luc构建体杂交的脱氧核糖核酸寡核苷酸。
图5呈现了显示使用在提前终止密码子下游+8个核苷酸位置处杂交的DNA寡核苷酸的CAN1-luc表达构建体提前终止密码子的通读的示例性数据。
图6呈现了囊性纤维化基因/纳米萤光素酶表达构建体(511-565CFTR)的一个实施方案。上图：构建体示意图，显示囊性纤维化开放阅读框(CFTR)内提前终止密码子(UGAG或UGAC)和具有天然末端终止密码子的萤光素酶基因的相对位置。下图：具有TGA提前终止密码子的CFTR构建体的脱氧核糖核酸序列和在提前终止密码子下游+8个核苷酸位置处与CFTR构建体杂交的脱氧核糖核酸寡核苷酸。
图7呈现了示例性数据，其显示了在靶向提前终止密码子下游各个核苷酸位置并且具有不同解链温度的DNA寡核苷酸存在下，CFTR提前终止密码子(UGAC)构建体表达的通读分析。
图8呈现了显示氨基糖苷G418对511-565CFTR构建体表达的影响的示例性数据。增加G418的浓度降低了无提前终止密码子(GGAG)的野生型构建体的表达，同时增加了提前终止密码子构建体(UGAG、UGAC)的表达。
图9呈现了显示+8(66)DNA寡核苷酸和氨基糖苷G418对提前终止密码子的CFTRDNA构建体表达通读的协同作用的示例性数据。还显示了与G418组合的+8寡核苷酸，其降低了氨基糖苷的有效浓度。
图10呈现了显示+8(47)DNA寡核苷酸和氨基糖苷G418对提前终止密码子的CFTRDNA构建体表达通读的协同作用的示例性数据。
图11呈现了将纳米萤光素酶活性与表达的蛋白质水平相关联的示例性数据，以验证本文所涉及的寡核苷酸构建体的通读促进。
图12提供了基于萤光素酶的测定(TermiLuc，Susorov，2020)的示意图，以鉴定翻译终止步骤的丢失以促进通读。
图12A：Termi-Luc测定的示意图。
图12B：真核终止复合物的一个示例。
图13呈现了显示在Termi-Luc测定中促进通读的寡核苷酸+7和+8以序列特异性方式抑制终止的示例性数据。
图14呈现了具有2'-氟化物置换的修饰的寡核苷酸的说明性结构。
图15呈现了显示使用兔网织红细胞裂解物(RRL)测定的使用氟化物修饰的寡核苷酸的通读促进的示例性数据。
图16呈现了显示G418和修饰的反义寡核苷酸的组合以剂量依赖性方式促进CFTR无义密码子通读的示例性数据。O＝修饰的寡核苷酸；G＝G418，在表达具有提前终止密码子G542X的CFTR的细胞的培养物中，与HRP融合以测量全长蛋白表达产生的化学发光。
图17呈现了全长Mecp2基因/纳米萤光素酶表达构建体的一个实施方案。
图17A：构建体的示意图，其显示全长Mecp2开放阅读框内提前终止密码子和具有天然末端终止密码子的萤光素酶基因的相对位置。
图17B：显示+8DNA寡核苷酸对导致Rett综合征的四(4)个提前终止密码子的通读效率的影响的示例性数据。
图18A-D呈现了显示使用TOPO克隆(例如，等位基因排除)方法的PCR扩增子的下一代批量测序结果的示例性数据。
图19A-F呈现了显示使用定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹对基因表达进行分析的示例性数据。
图20A-C呈现了在过滤播种后一(1)周进行的TECC/24电导测定的示例性数据。
图21A-B呈现了CFF-16HBEge细胞系的跨上皮电阻的示例性数据。
发明详述
本发明涉及基因工程领域。具体地，其涉及用于治疗基于遗传的疾病和病症的组合物和方法，所述疾病和病症是由从具有无义终止密码子的mRNA翻译非功能性蛋白质引起的。例如，预期了促进提前mRNA终止(无义)密码子的翻译通读的DNA和修饰的核酸(NA)寡聚体。无义密码子通读产生全长蛋白质并恢复蛋白质功能。例如，在提前mRNA终止密码子的第一个核苷酸(+1位置，参见图1)下游的+4至+8核苷酸位置(即+4、+5、+6、+7、+8位置)处开始结合的DNA寡聚体成功促进通读。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗由提前无义或终止密码子引起的遗传性病症的方法。在一个实施方案中，遗传性病症包括但不限于囊性纤维化(CF)或Rett综合征。在一个实施方案中，无义或终止密码子是X-终止密码子。在一个实施方案中，X-终止密码子是G542X。在一个实施方案中，X-终止子是R255X(Rett)。在一个实施方案中，X-终止子是R270X(Rett)。在一个实施方案中，X-终止子是R294X(Rett)。
II.常规终止密码子通读方法
已经做出了许多努力来确定能够通读提前终止密码子并恢复全长蛋白质翻译的治疗方法。小分子，例如氨基糖苷抗生素，导致mRNA的系统性错误编码，并且治疗价值有限。尽管它们也导致突变mRNA的终止密码子通读，但细胞mRNA的广泛错误编码使此类分子有毒，并且通常是较差的治疗剂。Dabrowski等人,“Advances in therapeutic use of adrug-stimulated translational readthrough of premature termination codons”MolMed 24(2018)；和Keeling等人,“Therapeutics Based on Stop Codon Readthrough”.Annu Rev Genomics Hum Genet.(2014)。
氨基糖苷的主要报道的不良反应是耳毒性、肾毒性和神经肌肉阻滞。Avent等人,“Current use of aminoglycosides:indications,pharmacokinetics and monitoringfor toxicity”Intern Med J.41(6):441-449(2011)。氨基糖苷的常规剂量通常是大约3-5mg/kg/天，分为每8小时一次，经静脉内/肌肉内(IV/IM)给药。延长的给药间隔为大约每24小时或更长时间一次，以4-7mg/kg/一次IV剂量/天。
氨基糖苷抗生素被用作囊性纤维化(CF)的肺部恶化的常规治疗方法，并且减缓肺功能下降，最终导致大多数患者死亡。CF的预后有所改善，因此治疗的副作用变得越来越重要。Prayle等人,“Side effects of aminoglycosides on the kidney,ear and balancein cystic fibrosis”Thorax 65(7):654-658(2010)。
观察性研究表明，氨基糖苷副作用的发病率非常普遍，而且积极的治疗可能会导致更多副作用。氨基糖苷的一种常见副作用是肾毒性。研究对毒性的定义各不相同，但大约5-10％的接受氨基糖苷的(非CF)成年患者具有血清肌酐的显著升高。Meyer RD.,“Riskfactors and comparisons of clinical nephrotoxicity of aminoglycosides”Am JMed80:119-125(1986)。
虽然毒性是氨基糖苷类别效应，但实验数据表明庆大霉素比妥布霉素和阿米卡星毒性更大。De Broe等人,“Choice of drug and dosage regimen.Two important riskfactors for aminoglycoside nephrotoxicity”Am J Med 80:115-118(1986)。随机对照试验(RCT)的定量概述得出了大致相同的结论。Buring等人,“Randomized trials ofaminoglycoside antibiotics:quantitative overview”Rev Infect Dis10:951-7(1988)。
氨基糖苷给药方案的操作提供了一种减少肾损伤的经济有效且简单的方法。鉴于氨基糖苷的可饱和吸收，据报道，预计每日单剂量的肾毒性将低于三次分剂量的相同每日剂量。例如，一项针对CF患者的妥布霉素大型随机试验表明，每日单次给药方案与每日多次给药方案具有相同的功效，这一发现在随后的meta分析中得到证实。在接受每日单剂量的儿科组中，血清肌酐水平在治疗过程中下降，相比之下接受三次分剂量的组中的血清肌酐水平则有所上升。为了进一步支持肾脏安全性，在成人和儿童中，每日一次治疗臂中NAG的升高比接受每日3次方案的组中低33％。Smyth等人,“Once versus three-times dailyregimens of tobramycin treatment for pulmonary exacerbations of cysticfibrosis-the TOPIC study:a randomised controlled trial”Lancet 365:573-578(2008)；和Smyth等人,“Once-daily versus multiple-daily dosing with intravenousaminoglycosides for cystic fibrosis”Cochrane Database Syst Rev2006；(3):CD002009。氨基糖苷的药代动力学因清除的昼夜节律而变得复杂。在每日一次组中，大多数在晚上接受抗生素治疗，妥布霉素的清除率低于每日三次组。Touw等人,“Populationpharmacokinetics of tobramycin administered thrice daily and once daily inchildren and adults with cystic fibrosis”J Cyst Fibros 6:327-333(2007)。药物的肾脏清除率可能存在昼夜变化，其中夜间清除率降低。与早上相比，如果在晚上施用药物会导致在疾病过程中肾脏对氨基糖苷的暴露增加。
众多研究中的一部分报告了在CF患者中通过Pure Tone Audigrams(PTA)测量的听觉毒性。例如，一项从CF诊所招募的七十(70)名患者的研究，使用>20dB的≥2个阈值或>25dB的一个的定义，他们发现服用氨基糖苷后，听力损伤的总体患病率为17％。Mulheran等人,“Occurrence and risk of cochleotoxicity in cystic fibrosis patientsreceiving repeated high-dose aminoglycoside therapy”Antimicrob AgentsChemother 45:2502-2509(2001)。
据报道，在人工引入的提前终止密码子“UAG”下游+1或+9个核苷酸处与β-珠蛋白mRNA互补的DNA寡核苷酸可以诱导细胞中的翻译通读。Kar等人,“Induction ofTranslational Readthrough across the Thalassemia-Causing Premature Stop Codoninβ-Globin-Encoding mRNA”Biochemistry 59(1):80-84(2020；2019年10月2号在线)。然而，这些DNA寡核苷酸尚未被证明可以有效治疗任何已知的遗传性病症。
应该指出的是，Kar等人的DNA寡核苷酸起始位置命名系统与本发明中使用的不同，Kar等人使用的DNA寡核苷酸位置不适用于CFTR和Mecp2。特别地，Kar的+1和+9位置(分别)对应于本文所示的+4和+12位置(参见图1)。因此，从提前终止密码子的第一个核苷酸下游+5至+8核苷酸位置开始与mRNA序列互补的DNA寡核苷酸先前尚未报道过。特别地，对于CFTR和Mecp2基因的在提前终止密码子的第一个核苷酸下游的+4至+8核苷酸位置处互补的寡核苷酸先前尚未报道过。例如，位于无义密码子第一个核苷酸下游的核苷酸(例如位置+9、+12)不会促进CFTR的通读。
II.无义密码子相关的蛋白释放因子
在一个实施方案中，本发明涉及诱导提前终止(无义)密码子的有效mRNA特异性通读的组合物和方法，从而导致最小的脱靶副作用。尽管不必理解发明的机制，但据信这种方法依赖于终止密码子和有义密码子的细胞识别之间的结构差异。
例如，细胞对终止密码子的识别被认为是由蛋白质释放因子(即真核生物中的eRF1)介导的。识别发生在A位密码子中，其中eRF1蛋白与mRNA核苷酸序列在终止密码子和后续核苷酸(例如UGAC或UAAA)处相互作用。相比之下，三联体有义密码子被tRNA识别，其中A位密码子下游的mRNA序列随后穿过核糖体mRNA通道并进入溶液中。因此，eRF1识别蛋白需要将mRNA“拉”入A位密码子，而tRNA则不需要。
测试了与核糖体通道旁边的mRNA碱基配对的DNA寡核苷酸，以确定它们是否能够：i)限制mRNA的流动性；ii)使eRF1的终止密码子识别效率低下；和iii)使tRNA的误读终止密码子有效，从而导致通读，iv)或通过不同的机制促进通读。
III.+4至+8反义寡脱氧核糖核苷酸
在一个实施方案中，本发明涉及在无义终止密码子的第一个核苷酸下游的+4至+8个核苷酸处或之间的与mRNA结合的反义寡核苷酸(oligos)。
本文提供的数据证明，与提前终止密码子下游的mRNA序列退火的DNA反义寡核苷酸促进翻译通读。令人惊讶的是，DNA寡核苷酸最有效的退火位点始于提前终止密码子下游的+8位置，其中+1位置是提前终止密码子的第一个核苷酸。据观察，并非所有位于提前终止密码子下游的DNA寡核苷酸在促进通读方面都是相同的。在位置+4和+7开始退火的DNA寡核苷酸的通读低于从+8位置开始的那些，但比背景通读更有效，使得+4至+8之间的反义寡核苷酸结合范围对终止密码子的翻译通读的促进敏感。
围绕提前终止密码子的截短蛋白质的翻译通读可能与全长蛋白质的通读不同。例如，已知终止密码子在翻译终止和随后释放截短蛋白质的效率上有所不同。例如，导致UGAC提前终止密码子的无义突变在翻译终止方面比野生型UAAA终止密码子(例如，作为强终止密码子)效率低得多(例如，弱终止密码子)，因为+4位置上的嘌呤(A、G)核苷酸使翻译终止比+4位置上的嘧啶(C、U)更有效。因此，UGAC-“弱”终止密码子-比“强”UAAA终止密码子更容易通读。事实上，大多数测试小分子的研究都报告了UGAC终止密码子的最有效的通读，而UAAA或UGAG可以完全抵抗通读。
在一个实施方案中，本发明涉及反义寡核苷酸，其单独地或与氨基糖苷组合地从具有“弱”提前终止密码子的mRNA和/或具有“强”终止密码子的mRNA有效通读和翻译功能蛋白。数据表明，与提前终止密码子的第一个核苷酸下游+4至+8位置处的mRNA核苷酸序列互补的反义寡核苷酸是由无义突变引起的遗传性疾病的有效治疗候选者。这些发现表明，异常mRNA的DNA互补性是特异性的，但也是通用的，因为反义寡核苷酸或其他核酸序列(即RNA、LNA和其他修饰)可以与导致各种疾病的具有提前终止密码子的mRNA结合。
一些遗传性疾病是由具有提前终止密码子的mRNA分子引起的，因为截短的蛋白质被翻译和释放。相反，如果mRNA分子在其正确位置具有天然(野生型)终止密码子，则全长蛋白质就会被翻译并释放。参见图2A。翻译终止蛋白因子的作用是结合终止密码子并将其“拉”到核糖体中，导致蛋白质从核糖体中释放，这阻止进一步的mRNA翻译。参见图2B。位于提前终止密码子下游的位点特异性反义寡核苷酸防止终止密码子被“拉”入核糖体，从而抑制早期蛋白质翻译终止，导致提前终止密码子的通读和全长蛋白质的翻译。参见图2C。
本文提供的数据是使用商业细胞提取物(即兔网织红细胞裂解物)的翻译测定进行收集的。参见图3A和3B。初步数据发现，将反义寡核苷酸放置在RNA提前终止密码子的+8个核苷酸位置(+1位置对应于终止密码子的U)导致具有提前终止密码子的两个不同mRNA序列的出色通读，而其他下游位置安排导致较低的阅读效率。此外，数据显示，反义寡核苷酸与低浓度氨基糖苷(例如G418)的组合显著提高了通读效率，从而提供30-40％的功能性蛋白质翻译的恢复。
使用包含提前终止密码子和萤光素酶基因的DNA表达构建体来验证本文涉及的DNA反义寡核苷酸。基本方法是使用编码精氨酸通透酶氨基酸转运蛋白的CAN1基因表达构建体。CAN1表达构建体将TAG提前终止密码子定位在CAN1开放阅读框的末端，随后是萤光素酶开放阅读框。参见图4。然后将具有5'-GCGCCGGGCCTTTCTTTATGTTTTTGGCGT-3'核酸序列的DNA反义寡核苷酸+8(70)定位在提前终止密码子的第一个核苷酸下游的+8核酸位置处。数据表明位于提前终止下游的+8反义寡核苷酸增加了CAN1-luc DNA表达构建体中提前终止密码子的通读。参见图5。
IV.用反义寡核苷酸治疗囊性纤维化
在一个实施方案中，本发明涉及可用于治疗囊性纤维化的多种特异性+4至+8(例如，+4、+5、+6、+7、+8)反义寡聚体。
囊性纤维化是一种遗传性的危及生命的病症，其损害肺部和消化系统。特别地，囊性纤维化影响产生粘液、汗液和消化液的细胞，并导致这些液体变得粘稠。囊性纤维化的致病因素被认为是基因突变G542X，其群体频率为～2.4％。
在一个实施方案中，本发明涉及一种修饰的囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)脱氧核糖核酸(DNA)构建体。在一个实施方案中，修饰的CFTR DNA构建体包含含有提前TGA终止密码子的CFTR开放阅读框。在一个实施方案中，TGA提前终止密码子是G542X突变。在一个实施方案中，修饰的CFTR DNA构建体还包含纳米萤光素酶基因和天然终止密码子。在一个实施方案中，修饰的CFTR mRNA构建体分子在TGA提前终止密码子下游+8核苷酸位置处与单链DNA反义寡核苷酸杂交。在一个实施方案中，DNA反义寡核苷酸是5'-CTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCAC-3'。参见图6。
511-565CFTR DNA表达载体构建体被设计为具有几种不同的密码子配置：i)单个野生型有义密码子(“GGAG”)和随后的野生型终止密码子；ii)包含G542X突变的提前终止密码子“TGAG”(例如，强终止密码子)；和iii)呈现人工通读倾向背景的包含G542X突变(弱终止密码子)的提前终止密码子“TGAC”。数据显示，具有“TGAC”提前终止密码子的CFTR DNA表达载体构建体提供了在“TGAC”提前终止密码子下游+8核苷酸位置处杂交的DNA反义寡核苷酸，并且与+4、+7、+9、+11和+14核酸下游位置相比显示出显著的翻译通读。令人惊讶的是，与其他下游位置相比，+8(32)、+8(34)、+8(47)和+8(66)DNA反义寡核苷酸显示4-5倍更高的通读。尽管如此，与位置+4和+7杂交的反义寡核苷酸显示出比背景通读逐渐更高的通读，而在位置+9、+11和+14处杂交的寡核苷酸显示出减少的通读。参见图7。
还使用氨基糖苷G418进行CFTR提前终止密码子DNA构建体表达通读分析，其结构如下：
数据显示，G418以浓度依赖性方式抑制野生型有义密码子(GGAG)通读。此外，G418以浓度依赖性方式促进提前终止密码子(UGAG和UGAC)通读。参见图8。
由于氨基糖苷用于一些提前终止密码子相关疾病的临床治疗，因此评估了DNA反义寡核苷酸和G418的协同作用。数据显示，与单独的G418或+8(66)DNA寡核苷酸相比，+8(66)反义寡核苷酸和G418的组合确实提供了在使用CFTR DNA表达构建体促进提前终止密码子的通读方面的高达5倍的协同作用。参见图9。强UGAG(患者突变背景)提前终止密码子比UGAC提前终止密码子更难通读。令人惊讶的是，弱(UGAC)和强UGAG提前密码子(患者突变背景)下，0.5μM和0.1μM G418浓度具有显著高于1μM G418浓度的通读率。当组合使用G418和+8(47)DNA反义寡核苷酸而不是单独使用CFTR UGAG mRNA时，观察到类似的协同数据。参见图10。
通过将纳米萤光素酶活性与表达的蛋白质水平相关联来验证由本文公开的反义寡核苷酸诱导的mRNA通读。参见图11。这些数据表明，由增加的萤光素酶信号所揭示的翻译通读与全长蛋白质的成比例增加的量相关。
使用改良的萤光素酶测定(例如，Termiluc)评估终止密码子的诱导的寡核苷酸翻译通读过程中的终止步骤。简而言之，该测定在eRF1真核终止蛋白存在的情况下，在光出现时识别翻译终止。参见图12A和12B。数据显示通读启动子寡核苷酸确实以序列特异性方式抑制体外终止翻译。参见图13。
翻译的终止伴随着抑制的蛋白质释放，如使用Termiluc测定的反义寡核苷酸+7和+8所示。参见图13。这些数据与兔网织红细胞裂解物(RRL)测定中获得的通读数据一致。此外，+9反义寡核苷酸效率最低，这也与RRL数据一致。
这些数据表明本文所涉及的反义寡核苷酸特异性地干扰翻译终止步骤，从而降低截短的蛋白质的释放并允许核糖体继续翻译。尽管不必理解发明的机制，但据信本文公开的终止密码子通读技术是可编程的以提供特定mRNA的特定终止密码子的特异性。
V.修饰的反义寡核苷酸
在一个实施方案中，本发明涉及包含至少一种核糖修饰的+4至+8反义寡聚体通读启动子。在一个实施方案中，这些修饰包括但不限于2'-氟化物(F)修饰、2'-O-甲基(Ome)修饰和硫代磷酸酯(PS)键联修饰。参见图14。例如，+8(47)寡核苷酸用氟化物修饰至少一个核酸(NAF)：i)一个修饰：TCCACTCAGTGTGATTCCACF；ii)六个修饰：UFCCACFTCAGFTGTGFATTCFCACF。本文提供的数据表明，这些修饰的反义寡核苷酸以改进的稳定性和/或效率在RRL测定中以及在哺乳动物细胞培养物中促进通读。参见图15和图16。
表达CFTR(G542X)和辣根过氧化物酶(HRP)融合蛋白的Fischer大鼠甲状腺(FRT)细胞在含10％胎牛血清(FBS；Thermo Fisher Scientific，#26140-079)、1％青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific，#15140-122)和100μg/mL潮霉素B(Thermo FisherScientific，#10687010)的Ham's F-12,Coon's Modification(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,#F6636)缓冲液中在37℃和5％CO2下培养。然后，将这些FRT细胞以2×104个细胞/孔的密度接种在Costar 96孔板中。
接种后二十四(24)小时，将表达CFTR(G542X)的FRT细胞在有或没有不同浓度的G418和/或以下修饰的8(47)反义寡核苷酸的情况下再孵育二十四(24)小时：
UFCCACFTCAGFTGTGFATTCFCACF
用1×DPBS洗涤细胞3次，然后与SuperSignal West Femto HRP底物(15μL/孔，Thermo Fisher Scientific，#34096)在室温下孵育5分钟后进行HRP发光测定。在以下条件下用Tecan酶标仪读取HRP催化的发光：室温；无摇动/无延迟；积分时间，0.1s；读取高度，8.00mm。数据显示G418和寡核苷酸的组合导致无义密码子通读的剂量-反应相关的协同作用。参见图16。
这些数据表明，化学修饰的寡核苷酸与G418一起改善表达CFTR的致病变体(具有G542X突变)的细胞中提前终止密码子的通读。
VI.用反义寡核苷酸治疗Rett综合征
在一个实施方案中，本发明涉及可用于治疗Rett综合征的多种特异性+4至+8(例如，+4、+5、+6、+7、+8)反义寡聚体。
Rett综合征是一种主要见于女性的影响大脑发育的罕见基因突变。简而言之，婴儿在出生后的前六个月看起来很健康，但随着时间的推移，他们会迅速失去协调性、言语和双手的使用能力。然后症状可能会稳定数年。其无法治愈，但药物、物理和言语治疗以及营养支持有助于控制症状、预防并发症并提高生活质量。最近，发现了似乎涉及提前终止密码子的遗传基础。
据信，功能失调的脑蛋白甲基胞嘧啶结合蛋白2(Mecp2)可能是Rett综合征的许多症状的原因。MECP2基因提供了制造被称为MeCP2的蛋白质的指令。这种蛋白质通过修饰染色质(DNA和将DNA包装到染色体中的蛋白质的复合物)来帮助调节基因活性(表达)。MeCP2蛋白存在于全身细胞中，但其在脑细胞中特别丰富。
在大脑中，MeCP2蛋白对于包括神经细胞(神经元)在内的多种细胞的功能非常重要。该蛋白质可能在维持神经元之间的连接(突触)(在这里发生细胞间通信)方面发挥作用。许多已知受MeCP2蛋白调节的基因在正常大脑功能(特别是突触的维持)中发挥作用。
本领域技术人员相信MeCP2蛋白还可能参与加工被称为信使RNA(mRNA)的分子，其充当制造蛋白质的遗传蓝图。通过以不同方式切割和重新排列mRNA分子，MeCP2蛋白控制不同形式的某些蛋白质的产生。这个过程被称为选择性剪接。在大脑中，蛋白质的选择性剪接在神经元之间的正常通信中发挥着作用，并且对于其他类型脑细胞的功能也可能是必需的。
Rett综合征的大多数病例是由甲基胞嘧啶结合蛋白2(MECP2)基因中的突变引起的。MECP2基因位于X染色体上。90％至95％患有Rett综合征的女孩具有MECP2基因中的突变。Amir等人,“Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2”NatureGenetics 23(2):185-188(1999)；Schollen等人,“Gross rearrangements in the MECP2gene in three patients with Rett syndrome:Implications for routine diagnosisof Rett syndrome”Human Mutations 22:116-120(2003)；和Zoghbi,H.Y.“MeCP2dysfunction in humans and mice”Journal of Child Neurology 20:736-740(2005)。普遍认为，MECP2基因中的大约八(8)个突变是Rett综合征最常见的原因。Rett综合征症状的发展和严重程度取决于MECP2基因上突变的位置和类型。Percy等人,“Rett syndrome:North American database”Journal of Child Neurology 22(12):1338-1341(2007)。
本文提供的数据使用Mecp2 DNA表达载体构建体，其表达具有包含无义突变(例如，R168X、R255X、R270X或R294X)的四(4)个提前终止密码子之一的Mecp2 mRNA。参见图17A。数据显示，+8DNA反义寡核苷酸仅略微增强了四分之三提前终止密码子处mRNA的通读。参见图17B。
实验
实施例1
细胞培养
A.示例性细胞系
CFF-16HBEge CFTR G542X
CFF-16HBEge CFTR R1162X
CFF-16HBEge CFTR W1282X
CFFT-16HBEge CFTR Y122X
B.示例性细胞培养条件
培养基(完全培养基储存于4℃)
冷冻溶液(新鲜配制)
C.其他试剂
DPBS(Hyclone SH30028.02)
TrypLE Express(Gibco 12604-021)
D.包被溶液(新鲜配制)
用包被溶液包被烧瓶：T-25烧瓶使用1ml溶液，T-75烧瓶使用2ml。将溶液均匀地分布在表面上，确保整个表面都被溶液润湿，并在37℃下放置2-3小时。孵育后，彻底除去液体。不要重复使用该溶液。不要冲洗容器。包被的烧瓶可以在4℃下保存几个月。
E.示例性传代培养方案
·在80-100％汇合度下传代培养
·除去培养基并用DPBS冲洗并除去
·添加TrypLE Express(铺满细胞表面)并在37℃下孵育烧瓶
·3-5分钟后，在显微镜下检查烧瓶以观察细胞脱离的程度。如果细胞正在从表面脱落，用手掌敲击烧瓶的侧面以促进进一步的脱离。如果细胞仍然附着，将烧瓶放回培养箱中再放置几分钟，并再次检查烧瓶。目标是从表面去除>95％的细胞。
·反复吸取细胞以打碎任何团块，并将细胞悬浮液转移至离心管中。
·以1200rpm旋转3.5分钟以沉淀细胞o注意：如果您无法旋转细胞(例如高通量96孔板形式)，则可以跳过此步骤
·弃去液体并将细胞沉淀重新悬浮于完全培养基中。
·以1:10至1:20分开细胞以用于一周传代oCFF培养基更换计划-每周3次
F.示例性液氮储存方案
·按照传代培养方法处理细胞，除了将细胞沉淀重新悬浮于冷冻溶液中。
·将细胞转移至冷冻瓶中，1-1.5mL/瓶。根据细胞密度，对于T-75烧瓶，将细胞等分到4-6个小瓶中，对于T-75等分到2-4个小瓶中。oCFF冷冻500万个细胞/瓶用于在T-75烧瓶中解冻。
·将小瓶放入受控冷却室中，并将板置于-80℃下冷冻过夜(冷却室以约1℃/分钟的速度调节冷却)
·尽快将小瓶从冷却室移至液氮储存室中
G.示例性培养冷冻储存细胞
·从液氮中取出一小瓶细胞，并在37℃水浴中解冻细胞
·用5mL完全培养基重新悬浮
·以1200rpm的速度旋转3.5分钟以沉淀细胞
·去除液体(以去除DMSO)
·用9mL培养基(用于T-75烧瓶)重新悬浮细胞沉淀，并将细胞接种到包被的烧瓶上
·在37℃、5％CO2的培养箱中培养细胞。
·过夜孵育后，细胞应附着在烧瓶上。圆形的、未附着的细胞是死细胞。
实施例II
基因编辑
A.Cas9蛋白复合物
·RNP复合物包括：
·Cas9：化脓链球菌(S.pyogenes)Cas9
·引导RNA靶序列：5’-GAGAAAGACAATATAGTTCT-3’
B.原型间隔子辅助基序序列：TGG
C.同源定向修复供体模板序列(ssODN：5’-3’)：
GCAAATGCTTGCTAGACCAATAATTAGTTATTCACCTTGCTAAAGAAATTCTTGCTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTCTCAAAGAACTATATTGTCTTTCTCTGCAAACTTGGAGAT
D.扩增/测序引物
正向引物：5’-ATGGAAGCCCAGTGAAGATAC-3’
反向引物：5’-CTAGCCATAAAACCCCAGGA-3’
实施例III
测序
使用根据实施例II的引物进行PCR扩增子的批量测序。TOPO克隆(例如，等位基因排除)方法对质粒载体进行测序。参见图18A-D。
数据显示，使用CFTR基因座的下一代测序未发现大的缺失或重排。然而，在16HBE14o-亲代细胞和源自它们的16HBEge细胞中的一个CFTR等位基因的内含子6中的位置(hg38)Chr7:117536118处观察到未知大小的插入。该插入包含SV40基因组序列，其在永生化过程中用于创建16HBE14o-细胞，并非基因编辑的结果。多项证据支持携带插入的等位基因产生降解的CFTR转录物或无功能的CFTR；因此，16HBE14o-细胞在功能上是单等位基因的。16HBEge细胞系对于工程化CFTR变体是纯合的，并且表达与16HBE14o-细胞相同数量的等位基因的CFTR。
实施例IV
基因表达
此实施例呈现了通过定量聚合酶链式反应和(qPCR)进行mRNA分析以及通过蛋白质印迹进行蛋白质分析的结果。
数据显示反义SMG1i是NMD介体SMG1的药理学抑制剂，并且恢复PTC等位基因的mRNA水平。与往常一样，使用SMG1i也观察到CFTR WT mRNA的较小增加。参见图19A-F。
实施例V
电生理学
过滤后接种一(1)周，使用TECC/24电导测定进行了功能测定，其显示电阻但没有可测量的CFTR功能。参见图20A-C。
CFF-16HBEge细胞系的跨上皮电阻随着时间的推移保持稳定(在CFF-16HBEgeCFTR W1282X细胞系中测试的高达50次传代)。参见图21A-B。

Claims (109)

1.一种脱氧核糖核酸(DNA)反义寡聚体，其从信使RNA(mRNA)分子内提前终止密码子中的第一个核苷酸下游的+4至+8核苷酸位置之间开始与核糖核酸(RNA)序列互补。
2.权利要求1的寡聚体，其中所述提前终止密码子是UGAC(RNA)。
3.权利要求1的寡聚体，其中所述提前终止密码子是UGAG。
4.权利要求1的寡聚体，其中所述提前终止密码子是UGAA。
5.权利要求1的寡聚体，其中所述提前终止密码子是UGAU。
6.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体具有选自32℃、34℃、40℃、47℃、53℃、57℃和66℃的解链温度(Tm)。
7.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体是CCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTC(CFTR+4(60))。
8.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体是CCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(49))。
9.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体是GACCTCCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(60))。
10.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体是CTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(32))。
11.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体是ACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(34))。
12.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(47))。
13.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体是CTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(66))。
14.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体是CTGAAGCTGACCCTCAGGCC(Mecp2+8(57)255X)。
15.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体是CGGGGAGTGTGGTGGCAG(Mecp2+8(57)270X)。
16.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体是TGCAGGAGACCGTACTCCCC(Mecp2+8(57)294X)。
17.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体包含至少一个具有修饰的核苷酸。
18.权利要求17的寡聚体，其中所述修饰选自2'-氟化物(F)修饰、2'-O-甲基(Ome)修饰和硫代磷酸酯(PS)键联修饰。
19.权利要求1的寡聚体，其中所述寡聚体是CFTR+8(47)寡核苷酸，其包括氟化物修饰的CFTR+8(47)寡核苷酸。
20.权利要求19的寡聚体，其中所述氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCAC(F)。
21.权利要求1的寡聚体，其中所述氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是UFCCACFTCAGFTGTGFATTCFCACF。
22.一种组合物，其包含：i)脱氧核糖核酸(DNA)或修饰的核酸反义寡聚体；和ii)编码RNA序列和提前终止密码子的信使核糖核酸(mRNA)分子，其中所述反义寡聚体从所述提前终止密码子的第一个核苷酸下游的+4至+8核苷酸位置之间开始与所述RNA序列互补。
23.权利要求22的组合物，其中所述反义寡聚体与所述RNA序列杂交。
24.权利要求22的组合物，其中所述mRNA分子编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
25.权利要求22的组合物，其中所述mRNA分子编码甲基胞嘧啶结合蛋白2(Mecp2)。
26.权利要求22的组合物，其中所述组合物还包含氨基糖苷。
27.权利要求26的组合物，其中所述组合物还包含比促进翻译通读的常规氨基糖苷浓度低5倍的氨基糖苷浓度。
28.权利要求26的组合物，其中所述氨基糖苷是G418。
29.权利要求22的组合物，其中所述氨基糖苷选自庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、链霉素和新霉素。
30.权利要求22的组合物，其中所述提前终止密码子是UGAC。
31.权利要求22的组合物，其中所述提前终止密码子是UGAG。
32.权利要求22的组合物，其中所述提前终止密码子是UGAA。
33.权利要求22的组合物，其中所述提前终止密码子是UGAT。
34.权利要求22的组合物，其中所述寡聚体具有选自32℃、34℃、40℃、47℃、53℃和66℃的解链温度(Tm)。
35.权利要求22的组合物，其中所述寡聚体是CCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTC(CFTR+4(60))。
36.权利要求22的组合物，其中所述寡聚体是CCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(49))。
37.权利要求22的组合物，其中所述寡聚体是GACCTCCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(60))。
38.权利要求22的组合物，其中所述寡聚体是CTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(32))。
39.权利要求22的组合物，其中所述寡聚体是ACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(34))。
40.权利要求22的组合物，其中所述寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(47))。
41.权利要求22的组合物，其中所述寡聚体是CTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(66))。
42.权利要求22的组合物，其中所述寡聚体是CTGAAGCTGACCCTCAGGCC(Mecp2+8(57)255X)。
43.权利要求22的组合物，其中所述寡聚体是CGGGGAGTGTGGTGGCAG(Mecp2+8(57)270X)。
44.权利要求22的组合物，其中所述寡聚体是TGCAGGAGACCGTACTCCCC(Mecp2+8(57)294X)。
45.权利要求22的组合物，其中所述寡聚体包含至少一个具有修饰的核苷酸。
46.权利要求45的组合物，其中所述修饰选自2’-氟化物(F)修饰、2’-O-甲基(Ome)修饰和硫代磷酸酯(PS)键联修饰。
47.权利要求45的组合物，其中所述修饰的寡聚体包括氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体。
48.权利要求47的组合物，其中所述氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCACF。
49.权利要求47的组合物，其中所述氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是UFCCACFTCAGFTGTGFATTCFCACF。
50.一种方法，包括：
a)提供；
i)包含具有提前终止密码子的信使核糖核酸(mRNA)分子并且表现出医学病症的至少一种症状的患者；和
ii)药学上可接受的组合物，其包含从所述提前终止密码子的第一个核苷酸下游+4至+8核苷酸位置之间开始与mRNA序列互补的脱氧核糖核酸(DNA)或修饰的核酸反义寡聚体；和
b)向所述患者施用所述药学上可接受的组合物，使得所述医学病症的所述至少一种症状减轻。
51.权利要求50的方法，其中所述医学病症是由所述提前终止密码子引起的。
52.权利要求50的方法，其中所述医学病症是囊性纤维化或Rett综合征。
53.权利要求50的方法，其中所述药学上可接受的组合物还包含氨基糖苷。
54.权利要求53的方法，其中所述施用不导致氨基糖苷副作用。
55.权利要求53的方法，其中所述氨基糖苷是G418。
56.权利要求53的方法，其中所述氨基糖苷选自庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、链霉素和新霉素。
57.权利要求50的方法，其中所述mRNA分子编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白。
58.权利要求50的方法，其中所述mRNA分子编码甲基胞嘧啶结合蛋白2。
59.权利要求50的方法，其中所述提前终止密码子是UGAC。
60.权利要求50的方法，其中所述提前终止密码子是UGAG。
61.权利要求50的方法，其中所述提前终止密码子是UGAA。
62.权利要求50的方法，其中所述提前终止密码子是UGAT。
63.权利要求50的方法，其中所述寡聚体具有选自32℃、34℃、40℃、47℃、53℃或66℃的解链温度(Tm)。
64.权利要求50的方法，其中所述寡聚体是CCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTC(CFTR+4(60))。
65.权利要求50的方法，其中所述寡聚体是CCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(49))。
66.权利要求50的方法，其中所述寡聚体是GACCTCCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(60))。
67.权利要求50的方法，其中所述寡聚体是CTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(32))。
68.权利要求50的方法，其中所述寡聚体是ACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(34))。
69.权利要求50的方法，其中所述寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(47))。
70.权利要求50的方法，其中所述寡聚体是CTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(66))。
71.权利要求50的方法，其中所述寡聚体是CTGAAGCTGACCCTCAGGCC(Mecp2+8(57)255X)。
72.权利要求50的方法，其中所述寡聚体是CGGGGAGTGTGGTGGCAG(Mecp2+8(57)270X)。
73.权利要求50的方法，其中所述寡聚体是TGCAGGAGACCGTACTCCCC(Mecp2+8(57)294X)。
74.权利要求50的方法，其中所述寡聚体包含至少一个具有修饰的核苷酸。
75.权利要求74的方法，其中所述修饰选自2’-氟化物(F)修饰、2’-O-甲基(Ome)修饰和硫代磷酸酯(PS)键联修饰。
76.权利要求74的方法，其中所述修饰的寡聚体包括氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体。
77.权利要求76的方法，其中所述氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCACF。
78.权利要求50的方法，其中所述氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是UFCCACFTCAGFTGTGFATTCFCACF。
79.一种方法，包括：
a)提供；
i)包含具有提前终止密码子的信使核糖核酸(mRNA)分子并且表现出医学病症的至少一种症状的患者；和
ii)药学上可接受的组合物，其包含氨基糖苷和从所述提前终止密码子的第一个核苷酸下游+4至+8核苷酸位置之间开始与mRNA序列互补的脱氧核糖核酸(DNA)或修饰的核酸反义寡聚体；和
b)向所述患者施用所述药学上可接受的组合物，使得所述医学病症的所述至少一种症状减轻。
80.权利要求79的方法，其中与单独的所述氨基糖苷相比，所述施用具有所述至少一种症状的协同减轻。
81.权利要求79的方法，其中所述医学病症是由所述提前终止密码子引起的。
82.权利要求79的方法，其中所述医学病症是囊性纤维化或Rett综合征。
83.权利要求79的方法，其中所述药学上可接受的组合物还包含氨基糖苷。
84.权利要求83的方法，其中所述施用不导致氨基糖苷副作用。
85.权利要求83的方法，其中所述氨基糖苷是G418。
86.权利要求83的方法，其中所述氨基糖苷选自庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、链霉素或新霉素。
87.权利要求79的方法，其中所述mRNA分子编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白。
88.权利要求79的方法，其中所述mRNA分子编码甲基胞嘧啶结合蛋白2。
89.权利要求79的方法，其中所述提前终止密码子是UGAC。
90.权利要求79的方法，其中所述提前终止密码子是UGAG。
91.权利要求79的方法，其中所述提前终止密码子是UGAA。
92.权利要求79的方法，其中所述提前终止密码子是UGAT。
93.权利要求79的方法，其中所述寡聚体具有选自32℃、34℃、40℃、47℃、53℃、66℃和70℃的解链温度(Tm)。
94.权利要求79的方法，其中所述寡聚体具有选自32℃、34℃、40℃、47℃、53℃或66℃的解链温度(Tm)。
95.权利要求79的方法，其中所述寡聚体是CCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTC(CFTR+4(60))。
96.权利要求79的方法，其中所述寡聚体是CCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(49))。
97.权利要求79的方法，其中所述寡聚体是GACCTCCACTCAGTGTGATTCCACC(CFTR+7(60))。
98.权利要求79的方法，其中所述寡聚体是CTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(32))。
99.权利要求79的方法，其中所述寡聚体是ACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(34))。
100.权利要求79的方法，其中所述DNA寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(47))。
101.权利要求79的方法，其中所述寡聚体是CTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCAC(CFTR+8(66))。
102.权利要求79的方法，其中所述寡聚体是CTGAAGCTGACCCTCAGGCC(Mecp2+8(57)255X)。
103.权利要求79的方法，其中所述寡聚体是CGGGGAGTGTGGTGGCAG(Mecp2+8(57)270X)。
104.权利要求79的方法，其中所述寡聚体是TGCAGGAGACCGTACTCCCC(Mecp2+8(57)294X)。
105.权利要求79的方法，其中所述寡聚体包含至少一个具有修饰的核苷酸。
106.权利要求105的方法，其中所述修饰选自2'-氟化物(F)修饰、2'-O-甲基(Ome)修饰和硫代磷酸酯(PS)键联修饰。
107.权利要求105的方法，其中所述修饰的寡聚体包括氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体。
108.权利要求107的方法，其中所述氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是TCCACTCAGTGTGATTCCACF。
109.权利要求79的方法，其中所述氟化物修饰的CFTR+8(47)寡聚体是UFCCACFTCAGFTGTGFATTCFCACF。
CN202280040327.4A 2021-04-07 2022-04-06 无义密码子的特定寡核苷酸编程的通读 Pending CN117642506A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163171893P 2021-04-07 2021-04-07
US63/171,893 2021-04-07
PCT/US2022/023640 WO2022216804A2 (en) 2021-04-07 2022-04-06 Specific oligonucleotide-programmed readthrough of nonsense codons

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117642506A true CN117642506A (zh) 2024-03-01

Family

ID=83546520

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280040327.4A Pending CN117642506A (zh) 2021-04-07 2022-04-06 无义密码子的特定寡核苷酸编程的通读

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20240209376A1 (zh)
EP (1) EP4320239A2 (zh)
JP (1) JP2024515244A (zh)
CN (1) CN117642506A (zh)
AU (1) AU2022256039A1 (zh)
CA (1) CA3214561A1 (zh)
WO (1) WO2022216804A2 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024025824A2 (en) * 2022-07-25 2024-02-01 University Of Massachusetts Nucleic acid antisense oligomer readthrough of nonsense codons

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7601493B2 (en) * 2002-07-26 2009-10-13 Nanogen, Inc. Methods and apparatus for screening and detecting multiple genetic mutations
EP1581643A2 (en) * 2002-12-23 2005-10-05 Melinka Butenko Plant gene
FI20075124A0 (fi) * 2007-02-21 2007-02-21 Valtion Teknillinen Menetelmä ja testikitti nukleotidivariaatioiden toteamiseksi
US10647983B2 (en) * 2013-09-04 2020-05-12 Cold Spring Harbor Laboratory Reducing nonsense-mediated mRNA decay

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022216804A2 (en) 2022-10-13
US20240209376A1 (en) 2024-06-27
CA3214561A1 (en) 2022-10-13
AU2022256039A1 (en) 2023-11-02
EP4320239A2 (en) 2024-02-14
JP2024515244A (ja) 2024-04-08
WO2022216804A3 (en) 2023-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101914309B1 (ko) 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(scna)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(scna) 관련된 질환의 치료
WO2016069591A2 (en) Compositions, methods and use of synthetic lethal screening
US20220372483A1 (en) Modified Guide RNAs for Gene Editing
TW201143782A (en) Treatment of LIM homeobox 2 (LHX2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to LHX2
EP3896451A1 (en) Carm1 inhibitors for facioscapulohumeral muscular dystrophy
US20210403906A1 (en) Gene-editing systems for editing a cystic fibrosis transmembrane regulator (cftr) gene
US20210228531A1 (en) Targeted treatment of autism spectrum disorder and other neurological or psychiatric disorders
US20230212615A1 (en) Grna targeting ctgf gene and use thereof
CN117413063A (zh) 冠状病毒治疗性干扰颗粒
CN112996913B (zh) 寡聚核酸分子及其应用
JP2023504661A (ja) 疾患の処置のための標的化トランスファーｒｎａ
IL297113A (en) CRISPR inhibition for facial-laparo-brachial muscular dystrophy
CN117642506A (zh) 无义密码子的特定寡核苷酸编程的通读
WO2019213504A1 (en) Microhomology mediated repair of microduplication gene mutations
JP2023524671A (ja) Ｓｈａｎｋ３の発現を増加させるアンチセンスオリゴヌクレオチド
AU2022349620A1 (en) Mrna regulon therapy for the treatment of haploinsufficiency disorders
US20230142669A1 (en) Compositions and methods for treating cystic fibrosis
TW202235622A (zh) 包裹rna之指環病毒(anellovirus)蛋白殼之活體外組裝
CN117925623B (zh) 用于hao1基因编辑和治疗ph1的组合物
Bartsakoulia Investigating the reversibility and tissue specificity of mitochondrial disorders
WO2024025824A2 (en) Nucleic acid antisense oligomer readthrough of nonsense codons

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination