CN117625592A - 一种高分辨率检测肿瘤内微生物组的文库构建及测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高分辨率检测肿瘤内微生物组成的方法，可依次包括如下步骤：(1)收集患者的肿瘤组织；(2)手术肿瘤组织和石蜡切片肿瘤组织微生物DNA的提取；(3)16S rRNA基因多区域文库引物设计及文库构建；(4)高通量测序及生物信息学分析。本发明公开了肿瘤内微生物组16S rRNA基因多区域文库构建和测序数据分析方法。本发明对微生物16S rRNA基因9个可变区中的5个可变区进行特异性扩增，显著提高了肿瘤组织中检出的OTU数目、种群多样性及分辨率，成本与经典方法相比基本不变，更加适用于低微生物载量、高宿主DNA含量的肿瘤组织样本，更能反映样本真实微生物组成情况，为肿瘤内微生物组研究提供了技术支持。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种在肿瘤患者手术新鲜肿瘤组织及石蜡切片肿瘤组织中提取微生物DNA、构建16S rRNA基因多区域文库及测序的方法。
背景技术
人体是由宿主细胞和微生物共同构成的共生体，人体内微生物的基因大约是人类宿主基因的100倍。随着二代测序(Next-generation sequencing，NGS)技术的发展，以往被认为是无菌的肿瘤组织也被证实存在着微生物，且不同肿瘤组织中有着不同的微生物组成，如结直肠癌中梭杆菌属、拟杆菌属、微单胞菌属、普雷沃菌属显著富集；乳腺癌患者肿瘤内假单胞菌属、变形杆菌属、氮单胞菌属有所富集；胃癌患者肿瘤内叶杆菌属、无色杆菌属、柠檬酸杆菌属等显著富集；胰腺癌长生存期患者肿瘤内假黄单胞菌属、链霉菌属、糖多孢菌属及克劳氏芽孢杆菌丰度显著增加。除此之外，肿瘤内微生物与肿瘤的发生发展及转移同样有着紧密联系。
目前，肿瘤内微生物组测序手段大致有两种，经典的16S rRNA(16S ribosomalRNA)基因测序技术及宏基因组鸟枪法测序技术。其中，经典的16S rRNA基因测序技术在肿瘤微生物组研究中的应用最为广泛，通过针对微生物16S rRNA基因的高保守区设计引物，对可变区进行测序，将下机数据比对到参考基因组，进而获得样本的物种分类、种群结构等信息。然而，由于二代测序读长的限制，目前的方法只能对16S rRNA基因9个可变区中的1～2个进行测序，仅占其全长的16％～33％，物种检测的分辨率仅能达到属水平，极少部分微生物可以检测到种水平。宏基因组鸟枪法测序技术虽然能够将分辨率提升到种水平，但由于其原理是对样本中DNA进行无差别测序，并不适用于低微生物载量、高宿主DNA含量的肿瘤样本，且成本极为昂贵。
因此，现有的16S rRNA基因文库构建及测序方法仍有待改进。目前需要一种低成本、易操作的16S rRNA基因测序方法，使测序区域覆盖率更高，以提高物种分辨率至种水平，为肿瘤微生物组研究提供技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种肿瘤内微生物DNA提取、16S rRNA基因多区域文库构建及测序的方法，具有低成本、易操作等特点，能够使测序区域覆盖率更高，提高物种分辨率水平。
本发明首先保护一种在手术肿瘤组织中提取微生物DNA的方法，可依次包括如下步骤：
(1)在胃癌手术标本取材过程中，在一旁放置开盖的无菌冻存管，作为手术室环境对照；
(2)将(1)中的肿瘤组织和手术室环境对照用溶菌酶裂解，同时添加每一批次的提取对照，处理同肿瘤组织；
(3)将(2)中的组织和对照样本通过蛋白酶消化、细胞裂解、洗脱得到含微生物DNA的肿瘤组织DNA。
本发明还保护一种在石蜡切片肿瘤组织中提取微生物DNA的方法，可依次包括如下步骤：
(1)每一批次提取添加一个提取对照，处理同石蜡切片胃癌组织；
(2)将(1)中的肿瘤组织和提取对照用无毒脱蜡液脱腊；
(3)将(2)中的肿瘤组织和提取对照用多聚酶裂解；
(3)将(3)中的组织和对照样本通过蛋白酶消化、细胞裂解、洗脱得到含微生物DNA的肿瘤组织DNA。
本发明还保护一种肿瘤内微生物16S rRNA基因多区域文库构建及测序的方法，可依次包括如下步骤：
(1)设计用于构建16S rRNA基因多区域测序文库的引物，所述引物包括序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10；
(2)使用(1)中所述引物对基因组DNA进行扩增并纯化扩增产物；
(3)将(2)中的纯化产物用含有不同标签的index引物进行扩增，所述引物包括序列11、序列12，纯化扩增产物；
(4)对(3)中文库进行质检，质检合格的文库根据每个样本的数据量要求，进行相应比例混合后，采用Illumina NovaSeq高通量测序平台完成16S rRNA基因多区域测序，测序模式为PE 150。序列11、序列12的8个N表示8bp的随机碱基，可作为随机标签。
本发明还保护以上所述方法构建得到的DNA文库。
本发明还保护一种用于构建16S rRNA基因多区域文库的试剂盒，包括上述任一所述的引物混合物。所述用于构建测序文库的试剂盒具体可由上述任一所述的引物混合物组成。
上述试剂盒还可包括用于DNA提取的试剂、用于DNA建库的试剂、用于文库纯化的试剂、用于文库扩增的试剂、用于文库质检的试剂等用于文库构建的材料。
本发明还保护上述试剂盒在检测肿瘤内微生物组成中的应用。
上述应用中，所述肿瘤可为胃部恶性肿瘤，即胃癌。
本发明还保护一种针对16S rRNA基因多区域测序数据的生物信息学分析方法，可依次包括如下步骤：
(1)根据分子标签从原始下机数据中拆分出每个样本的原始数据，去除下机数据中的引物序列、低质量序列以及嵌合体序列后获得的高质量序列；
(2)将16S rRNA基因序列进行拼接、比对，划分出OTU，将每个OTU中的代表性序列在SILVA数据库中进行注释，并生成OTU表格，过滤掉相对丰度小于10-4的物种；
(3)对(2)中结果进行组内组间统计比较分析等，多角度度量样本的微生物群落特征。
本发明提供了一种可以高分辨率检测肿瘤内微生物组成的方法，该方法基于经典的16S rRNA基因测序技术，对微生物16S rRNA基因9个可变区中的5个可变区进行特异性扩增，显著提高了肿瘤组织中检出的OTU数目、种群多样性及分辨率，成本与经典方法相比基本不变，更加适用于低微生物载量、高宿主DNA含量的肿瘤组织样本，更能反映样本真实微生物组成情况。同时，文库的构建方法不仅适用于肿瘤内微生物DNA样本，也适用于其他痕量微生物样本类型的基因组DNA样本.本发明为肿瘤内微生物组研究提供了理论支撑及技术支持。
附图说明
图1是16S rRNA基因多区域测序文库结构图。
图2是实施例3的文库电泳结果图。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均自常规生化试剂商店购买得到。
实施例1、手术肿瘤组织的收集与处理
一、胃癌患者手术肿瘤组织的收集
胃癌患者标本离体后，使用无菌手术刀及镊子进行取材，将肿瘤组织转移至无菌的冻存管中，在冰上转运至实验室后立即处理或冻存于-80℃冰箱。标本取材过程中，在一旁放置开盖的无菌冻存管，作为手术室环境对照。该环境对照的处理与肿瘤组织样本全程保持一致。
二、手术肿瘤组织微生物DNA的提取
1.提取实验进行前，紫外线照射超净台30分钟，全程使用无菌耗材，严格无菌操作，每一批次提取取一无菌1.5ml离心管作为提取对照，全程处理步骤同其他样本：
2.为完全裂解革兰阳性菌，首先将样本置于灭菌的1.5ml离心管中，加入150μl20mg/ml的溶菌酶(Solarbio，货号：L1080-3ml)，涡旋混匀后瞬时离心，用封口膜封口，放置于金属加热震荡仪，37℃1000rpm(待金属加热震荡仪温度达到37℃后再放置离心管)，振荡裂解30min，30min后取下离心管，瞬时离心。后续步骤使用QIAamp DNA mini kit(QIAGEN，货号：51304)提取，以下试剂均为QIAamp DNA mini kit(QIAGEN，货号：51304)试剂盒中的产品；
3.向溶菌酶消化后的1.5ml离心管中加入180μl Buffer ATL和20μl ProteinaseK，涡旋混匀后瞬时离心，用封口膜封口，放置于金属加热震荡仪，56℃ 1000rpm(待金属加热震荡仪温度达到56℃后再放置离心管)，直至样本消化完全、液体清澈透明(约1-3小时)；
4.将3中的离心管瞬离，待其平衡至室温后，加入200μl Buffer AL，涡旋混匀15s，瞬离；
5.将4中的离心管放置于金属加热震荡仪，70℃ 10min(待金属加热震荡仪温度达到70℃后再放置离心管)；
6.将5中的离心管瞬离，待其平衡至室温后，加入200μl无水乙醇，涡旋混匀15s，瞬离；
7.将6中的离心管中液体全部转移至QIAamp Mini spin column，室温6000×g(8000rpm)离心1min，弃掉收集管中的废液；
8.加入500μl Buffer AW1(已提前加入无水乙醇)，室温6000×g(8000rpm)离心1min，弃掉收集管中的废液；
9.加入500μl Buffer AW2(已提前加入无水乙醇)，室温全速(20,000×g，14,000rpm)离心3min，弃掉收集管中的废液；
10.将QIAampMini spin column放入新的2ml收集管中，再次室温全速(20,000×g，14,000rpm)离心1min，完全去除Buffer AW2；
11.将QIAamp Mini spin column放入标记好的1.5ml离心管中，加入100μlBuffer AE，室温孵育10min，6000×g(8000rpm)离心1min；
12.用Exkubit Plus dsDNA HS分析试剂盒检测11中的DNA浓度，全程需避光处理。取199μl Exkubit dsDNA HS稀释缓冲液，加入1μl的荧光试剂，涡旋混匀，瞬离；
13.弃去1μl的12中的混合液，加入1μl的DNA样本，涡旋混匀，瞬离，避光孵育2min；
14.使用Qubit 4.0荧光计(Thermo Fisher Scientific，货号：Q33238)检测DNA浓度并记录。
实施例2、石蜡切片组织的微生物DNA提取
1.提取实验进行前，紫外线照射超净台30分钟，全程使用无菌耗材，严格无菌操作，每一批次提取取一无菌1.5ml离心管作为提取对照，全程处理步骤同其他样本；
2.以下步骤使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN，货号：56404)进行提取；
3.用无菌刀手术片刮取石蜡切片的肿瘤组织于灭菌的1.5ml离心管中，同时刮取该样本肿瘤组织周围的石蜡于另一1.5ml离心管中作为石蜡对照，每个样本之间更换无菌刀片：
4.向3中离心管中加入160μl无毒脱腊液，涡旋混匀瞬离后，放置于金属加热震荡仪，56℃1000rpm(待金属加热震荡仪温度达到56℃后再放置离心管)，振荡3min，取下离心管后瞬时离心，待液体冷却后，观察液体是否凝固，若凝固需重新加入无毒脱蜡液再次脱腊，若不凝固则继续进行以下步骤；
5.向4中离心管中加入150μl多聚酶Metapolyzyme(Sigma，货号：MAC4L-5MG)，涡旋混匀后瞬时离心，用封口膜封口，放置于金属加热震荡仪，35℃1000rpm(待金属加热震荡仪温度达到35℃后再放置离心管)，振荡裂解4h，4h后取下离心管，瞬时离心；
6.向5中消化后的1.5ml离心管中加入180μl Buffer ATL和20μl Proteinase K，涡旋混匀后瞬时离心，用封口膜封口，放置于金属加热震荡仪，56℃1000rpm(待金属加热震荡仪温度达到56℃后再放置离心管)，过夜消化，期间可补加Proteinase K直至离心管内液体清澈透明；
7.将6中的离心管取下后，瞬离，放置于金属加热震荡仪，90℃1h(待金属加热震荡仪温度达到90℃后再放置离心管)；
8.将7中的离心管取下后，瞬离，待其平衡至室温后，加入200μl Buffer AL，涡旋混匀15s，瞬离；
9.向8中的离心管中加入200μl无水乙醇，涡旋混匀15s，瞬离；
10.将9中的离心管中液体全部转移至QIAamp MinElute column，室温6000×g(8000rpm)离心1min，弃掉收集管中的废液；
11.加入500μl Buffer AW1(已提前加入无水乙醇)，室温6000×g(8000rpm)离心1min，更换新的2ml收集管；
12.加入500μl Buffer AW2(已提前加入无水乙醇)，室温6000×g(8000rpm)离心1min，更换新的2ml收集管；
13.再次室温全速(20,000×g，14,000rpm)离心3min，完全去除Buffer AW2；
14.将QIAamp MinElute column放入标记好的1.5ml离心管中，加入35μl BufferATE，室温孵育10min，全速(20,000×g，14,000rpm)离心1min；
15.用Exkubit Plus dsDNA}S分析试剂盒检测14中的DNA浓度，全程需避光处理。取199μl Exkubit dsDNA HS稀释缓冲液，加入1μl的荧光试剂，涡旋混匀，瞬离；
16.弃去1μl 15中的混合液，加入1μl的DNA样本，涡旋混匀，瞬离，避光孵育2min；
17.使用Qubit 4.0荧光计(Thermo Fisher Scientific，货号：Q33238)检测DNA浓度并记录。
实施例3、微生物16S rRNA基因多区域文库构建及测序
一、引物设计
本实施例用到的引物序列信息如下：
表1. 16S rRNA基因多区域文库扩增引物信息
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| 16S-F1 | TACACGACGCTCTTCCGATCTTGGCGAACGGGTGAGTAA(序列1) |
| 16S-F2 | TACACGACGCTCTTCCGATCTACTCCTACGGGAGGCAGC(序列2) |
| 16S-F3 | TACACGACGCTCTTCCGATCTGTGTAGCGGTGRAATGCG(序列3) |
| 16S-F4 | TACACGACGCTCTTCCGATCTGGAGCATGTGGWTTAATTCGA(序列4) |
| 16S-F5 | TACACGACGCTCTTCCGATCTGGAGGAAGGTGGGGATGAC(序列5) |
| 16S-R1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGTGTCTCAGTCCCARTG(序列6) |
| 16S-R2 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTATTACCGCGGCTGCTG(序列7) |
| 16S-R3 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCGTCAATTCMTTTGAGTT(序列8) |
| 16S-R4 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGTTGCGGGACTTAACCC(序列9) |
| 16S-R5 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGGCCCGGGAACGTATT(序列10) |
二、16S rRNA多区域文库构建
1.实验进行前，紫外线照射超净台30分钟，全程使用无菌耗材，严格无菌操作，每一批次文库构建需要一PCR扩增无模板对照(No template control，NTC)，全程处理步骤同其他样本；
2.提取的微生物基因组在建库之间做0.8％-1％琼脂糖凝胶电泳，检测DNA是否降解；
3.将提取后的DNA取出100ng，按照下表配置PCR扩增反应混合液：
表2.反应体系
上游引物为16S-F1、16S-F2、16S-F3、16S-F4、16S-F5等比例混合物组成，下游引物为16S-R1、16S-R2、16S-R3、16S-R4、16S-R5等比例混合物组成。
充分涡旋混匀后，瞬时离心，放置于PCR仪中，按下表设置PCR程序：
表3.反应程序
4.反应结束后，向3中反应产物加入1.2倍体积的AMPure XP磁珠(Beckman，货号：A63880)纯化，即30μl磁珠，涡旋混匀后瞬离，室温放置10min，磁力架吸附10min，弃上清。用80％(体积百分含量)乙醇清洗磁珠两次，每次200ul，30s，弃上清；待乙醇晾干后，加入25μl无酶水，涡旋混匀后瞬离，室温放置10min，磁力架吸附5min，吸取20μl上清液至新的PCR管内，作为下一步反应的PCR模板；
5.按照下表反应体系配置混合液：
表4.反应体系
表5.CT-D index序列信息
充分涡旋混匀后，瞬时离心，放置于PCR仪中，按下表设置PCR程序：
表6.反应程序
6.反应结束后，向5中反应产物加入0.75倍体积的AMPure XP磁珠(Beckman，货号：A63880)，即37.5μl，涡旋混匀后瞬离，室温放置10min，磁力架吸附10min，将上清转移至新管中，再加入(0.85-0.75)倍原反应产物体积的AMPure XP磁珠(Beckman，货号：A63880)，即5μl磁珠，涡旋混匀后瞬离，室温放置10min，磁力架吸附10min，弃上清。用80％(体积百分含量)乙醇清洗磁珠两次，每次200ul，30s，弃上清；待乙醇晾干后，加入50|l Buffer EB(QIAGEN，货号：19086)，涡旋混匀后瞬离，室温放置10min，磁力架吸附5min，将上清收集至无菌1.5ml离心管中；
7.用Exkubit Plus dsDNA}S分析试剂盒检测6中的DNA浓度，全程需避光处理。取199μl Exkubit dsDNA HS稀释缓冲液，加入1μl的荧光试剂，涡旋混匀，瞬离；
8.弃去1μl 7中的混合液，加入1μl DNA样本，涡旋混匀，瞬离，避光孵育2min；
9.使用Qubit 4.0荧光计(Thermo Fisher Scientific，货号：Q33238)检测DNA浓度并记录。文库电泳图如图2所示。
三、高通量测序
质检合格的文库根据每个样本的数据量要求，进行相应比例混合后，采用Illumina NovaSeq高通量测序平台完成16S rRNA基因多区域测序，测序模式为PE 150，文库测序数据量为1G。每个样本碱基数据质量值Q30不低于85％，未符合要求的样本未纳入后续分析。
四、生物信息分析
首先，根据分子标签从原始下机数据中拆分出每个样本的原始数据(Raw Data)，去除下机数据中的引物序列、低质量序列以及嵌合体序列后获得的高质量序列(CleanData)，将16S rRNA基因序列进行拼接、比对，划分出同一操作分类单元(OperatingTaxonomic Units，OTU)，将每个OTU中的代表性序列在SILVA数据库中进行注释，并生成OTU表格，再过滤掉相对丰度小于10-4的物种，用于后续分析。对以上结果进行组内组间统计比较分析等步骤，多角度度量样本的微生物群落特征。
上述实施例的微生物组分析结果见下表，对比经典的单区域16S rRNA基因测序技术：
表7.3例新鲜肿瘤组织微生物OTU数均值
| 生物学分类 | 单区域 | 多区域 |
| 界 | 3.33±3.21 | 115.00±30.51 |
| 门 | 3.33±3.21 | 115.00±30.51 |
| 纲 | 3.33±3.21 | 115.00±30.51 |
| 目 | 3.33±3.21 | 115.00±30.51 |
| 科 | 3.33±3.21 | 112.67±29.94 |
| 属 | 3.33±3.21 | 93.67±29.94 |
| 种 | 2.33±1.53 | 51.00±16.09 |
表8.3例石蜡切片肿瘤组织微生物OTU数均值
| 生物学分类 | 单区域 | 多区域 |
| 界 | 13.33±3.21 | 199.67±22.50 |
| 门 | 12.67±2.89 | 199.67±22.50 |
| 纲 | 12.67±2.89 | 199.67±22.50 |
| 目 | 12.67±2.89 | 197.00±23.07 |
| 科 | 11.33±3.21 | 188.000±19.70 |
| 属 | 9.33±2.52 | 151.00±13.23 |
| 种 | 2.67±0.58 | 74.00±7.81 |
表9.3例新鲜肿瘤组织微生物α多样性的均值
| α多样性 | 单区域 | 多区域 |
| Shannon指数 | 0.68±0.68 | 2.88±0.40 |
| Simpson指数 | 0.37±0.32 | 0.88±0.04 |
| Chao1指数 | 3.33±3.21 | 115.83±31.95 |
表10.3例石蜡切片肿瘤组织微生物α多样性的均值
| α多样性 | 单区域 | 多区域 |
| Shannon指数 | 1.18±0.12 | 3.08±0.09 |
| Simpson指数 | 0.63±0.04 | 0.89±0.01 |
| Chao1指数 | 14.67±3.21 | 199.67±22.50 |
总而言之，本发明提供的方法得到的肿瘤内微生物OTU数更多，α多样性指数更高，同时成本保持不变。此外，通过与目前研究中通过高通量测序仅能检测16S rRNA基因某一可变区相比，本发明包含的信息更多、分辨率更高，更有利于区分微生物种群分类及丰度信息，充分体现了该方法的优越性。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，以上仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种在手术肿瘤组织中提取微生物DNA的方法，可依次包括如下步骤：
(1)在胃癌手术标本取材过程中，在一旁放置开盖的无菌冻存管，作为手术室环境对照；
(2)将(1)中的肿瘤组织和手术室环境对照用溶菌酶裂解，同时添加每一批次的提取对照，处理同肿瘤组织；
(3)将(2)中的组织和对照样本通过蛋白酶消化、细胞裂解、洗脱得到含微生物DNA的肿瘤组织DNA。
2.一种在石蜡切片肿瘤组织中提取微生物DNA的方法，可依次包括如下步骤：
(1)每一批次提取添加一个提取对照，处理同石蜡切片胃癌组织；
(2)将(1)中的肿瘤组织和提取对照用无毒脱蜡液脱腊；
(3)将(2)中的肿瘤组织和提取对照用多聚酶裂解；
(3)将(3)中的组织和对照样本通过蛋白酶消化、细胞裂解、洗脱得到含微生物DNA的肿瘤组织DNA。
3.一种肿瘤内微生物16S rRNA基因多区域文库构建及测序的方法，可依次包括如下步骤：
(1)设计用于构建16S rRNA基因多区域测序文库的引物，所述引物包括16S-F1、16S-F2、16S-F3、16S-F4、16S-F5、16S-R1、16S-R2、16S-R3、16S-R4、16S-R5；
(2)使用(1)中所述引物对基因组DNA进行扩增并纯化扩增产物；
(3)将(2)中的纯化产物用含有不同标签的index引物进行扩增，纯化扩增产物；
(4)对(3)中文库进行质检，质检合格的文库根据每个样本的数据量要求，进行相应比例混合后，采用Illumina NovaSeq高通量测序平台完成16S rRNA基因多区域测序，测序模式为PE 150。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的index中的标签是由8个随机碱基N构成的序列，每个随机碱基N选自A、T、G、C中的任意一个碱基。
5.根据权利要求3所述的方法构建得到的DNA文库。
6.一种用于构建16S rRNA基因多区域测序文库的试剂盒，包括权利要求3中所述的引物混合物。
7.权利要求3中所述的引物组合用于检测手术肿瘤组织、石蜡切片肿瘤组织DNA样本中微生物组成的应用。
8.一种针对16S rRNA基因多区域测序数据的生物信息学分析方法，可依次包括如下步骤：
(1)根据分子标签从原始下机数据中拆分出每个样本的原始数据，去除下机数据中的引物序列、低质量序列以及嵌合体序列后获得的高质量序列；
(2)将16S rRNA基因序列进行拼接、比对，划分出OTU，将每个OTU中的代表性序列在SILVA数据库中进行注释，并生成OTU表格，过滤掉相对丰度小于10-4的物种；
(3)对(2)中结果进行组内组间统计比较分析等，多角度度量样本的微生物群落特征。
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