CN117625590A - 一种菌剂微胶囊的制备方法以及该方法的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种菌剂微胶囊的制备方法，以及该方法的实际用途。所述方法包括：将目标菌剂与海藻酸钠溶液混合为悬液，向悬液中加入沉降剂和油相液搅拌至其形成乳浊液，调节乳浊液pH值至酸性后搅拌析出微胶囊得到混合液，加入萃取液萃取后分离油相即得到菌剂微胶囊分散液。本发明构建微胶囊能够形成更有利于菌株保存的微环境，使得菌株能够更加有效地保持生物活性和扩繁活性，并且显著提高菌株在常温（25℃）保存条件下的保存效果。

Description

一种菌剂微胶囊的制备方法以及该方法的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种菌剂微胶囊的制备方法，以及该方法的实际用途。

背景技术

微生物菌剂是目前非常常见且常用的制剂，其被广泛地用在各个领域中。尤其在农业领域，目前愈来愈多的研究证明，通过菌养协同效应能够更加有效地提高植株的肥料利用率、避免土壤出现酸化等问题，同时菌养协同效应还能够起到仅靠养分肥料无法实现的调节植物生长机制的效果。

但是，现有的微生物菌剂普遍存在着一个较为突出的问题，即保质期短，或说实际使用有效期较短。这主要是因为微生物在保存过程中容易失活，导致微生物的活性下降，且活性下降后虽然还含有一定的微生物，但剩余的微生物也基本失去了扩繁活性，不再具备实际的使用效果。

发明内容

为解决现有的菌剂保存期限短，容易失活且失去扩繁活性等问题，本发明提供了一种菌剂微胶囊的制备方法，以及该方法的实际应用。

本发明的目的在于：

一、能够有效延长菌剂的保存期限；

二、能够提高菌剂的低温保存能力；

三、能够保持菌剂的长期扩繁活性。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种菌剂微胶囊的制备方法，

所述方法包括：

将目标菌剂与海藻酸钠溶液混合为悬液，向悬液中加入沉降剂和油相液搅拌至其形成乳浊液，调节乳浊液pH值至酸性后搅拌析出微胶囊得到混合液，加入萃取液萃取后分离油相即得到菌剂微胶囊分散液。

作为优选，

所述菌剂和海藻酸钠溶液以体积比1：（1.8～2.2）的比例混合；

所述海藻酸钠溶液的浓度为1.2～1.8 wt%。

作为优选，

所述沉降剂为300～700 mmol/L的碳酸钙溶液；

所述油相液为含1.2～1.8 wt% Tween80的棉籽油。

作为优选，

所述调节乳浊液pH值采用冰醋酸或醋酸溶液进行。

作为优选，

所述萃取液为0.03～0.07 mmol/L的氯化钙溶液。

作为优选，

所述萃取液用量为混合液的1.0～1.5 倍体积。

一种菌剂微胶囊的制备方法的应用，

所述菌剂微胶囊的制备方法用于菌剂的保存和/或含菌剂产品延长有效期。

本发明的核心在于构建适于微生物菌株存活的微环境。对此，本发明采用海藻酸钠和碳酸钙进行配合，首先构建了能够用于固定微生物菌株的微载体，微生物菌株能够附着在微载体上，且该微载体也作为微胶囊的核心。

同时在该过程中引入含有吐温80（Tween80）的棉籽油，实现微载体的分散，同时部分棉籽油能够包裹在微载体表面，形成一定的微环境保温层，在低温条件和常温条件下能够有效提高菌株的存活率。另一方面，本发明还配合pH值调控后实现微胶囊的成型，在酸性条件下碳酸钙溶解出钙离子并与海藻酸钠产生阳离子交换形成不溶性的海藻酸钙包膜，实际可视作本身多孔的微载体在吸附负载微生物菌株后部分溶出后重新成膜后包覆在菌株外部，对其进行保护。

本发明的有益效果是：

本发明构建微胶囊能够形成更有利于菌株保存的微环境，使得菌株能够更加有效地保持生物活性和扩繁活性，并且显著提高菌株在常温保藏保存条件下的保存效果。

附图说明

图1为本发明实施例1所制得菌剂微胶囊的显微镜表征图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和说明书附图对本发明作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例所用原料均为市售或本领域技术人员可获得的原料；如无特殊说明，本发明实施例所用方法均为本领域技术人员所掌握的方法。

如无特殊说明，本发明实施例所用的试验菌剂分别为：食二氮植物杆菌和固氮螺菌。

以上菌株的来源如下：

食二氮植物杆菌（Phytobacter diazotrophicus）,菌种保藏编号CGMCC 1.5339;固氮螺菌（Azospirillum brasilense 1224T ）菌种保藏编号 NBRC 102289

实施例1

一种菌剂微胶囊的构建方法，所述方法为：

分别取10 mL Pyhto菌剂（即食二氮植物杆菌，Phytobacter diazotrophicus，浓度约为1.0×10⁹ CFU/mL，下同）、10 mL 1224T菌剂（即固氮螺菌，Azospirillumbrasilense 1224T，浓度约为1.0×10⁹ CFU/mL，下同）和40 mL浓度为1.5 wt%的海藻酸钠溶液混合搅拌为悬液，随后加入4 mL浓度为500 mmol/L的碳酸钙溶液和200 mL含1.5 wt%吐温80的棉籽油，搅拌15 min至其形成乳浊液，向乳浊液中加入40 mL含160 μL冰醋酸的棉籽油调节乳浊液pH值至酸性后搅拌析出微胶囊得到混合液，加入300 mL浓度为0.05 mmol/L的氯化钙水溶液进行萃取后分离油相即得到菌剂微胶囊分散液。

对菌剂微胶囊分散液进行显微镜表征，结果如图1所示。可见其形成完成的囊泡状微胶囊结构。

以上述菌剂微胶囊分散液进行保藏试验，分别以常规方法进行低温（4 ℃）冰箱保藏和常温保藏（25℃），低温冰箱保藏和常温保藏各制10 个样本实验组，低温冰箱保藏于2m（month）、4 m和6 m后表征菌株活性(CFU/mL)以及扩繁活性，并计算菌株活性保持率和扩繁活性保持率。

菌株活性保持率计算方法如下：

扩繁活性表征以培育的方式进行，各样本实验组分别进行五次接种培育，若能够形成菌落则表明其保持有扩繁活性，扩繁活性保持率的计算式为：

常温保藏分别于1 m、2 m和3 m后以相同的方法表征菌株活性以及扩繁活性。

表征结果如下表所示：

从上述表征结果可以看出，本发明方法能够形成微胶囊以实现菌株非常有效的保藏。

对比例1

以市售Strain Store Medium培养基，对实施例1所用的Pyhto菌剂和1224T菌剂进行常温保藏（25℃），常温保藏于1 m（month）、2 m和3 m后表征菌株活性(CFU/mL)以及扩繁活性，并计算菌株活性保持率和扩繁活性保持率。

菌株活性保持率计算方法如下：

扩繁活性表征以培育的方式进行，各样本实验组分别进行五次接种培育，若能够形成菌落则表明其保持有扩繁活性，扩繁活性保持率的计算式为：

表征结果如下表所示：

与实施例1对比可以明显发现，以上的保藏方式并不能有效实现菌株的保藏，其在低温保藏情况下即非常容易失活，且当保藏时间达到2 个月时，则会显著地降低菌株的扩繁活性。

实施例2

一种菌剂微胶囊的构建方法，所述方法为：

分别取10 mL Pyhto菌剂（即食二氮植物杆菌，Phytobacter diazotrophicus，浓度约为1.0×10⁹ CFU/mL，下同）、10 mL 1224T菌剂（即固氮螺菌，Azospirillumbrasilense 1224T，浓度约为1.0×10⁹ CFU/mL，下同）和36 mL浓度为1.8 wt%的海藻酸钠溶液混合搅拌为悬液，随后加入4 mL浓度为300 mmol/L的碳酸钙溶液和200 mL含1.2 wt%吐温80的棉籽油，搅拌15 min至其形成乳浊液，向乳浊液中加入40 mL含160 μL冰醋酸的棉籽油调节乳浊液pH值至酸性后搅拌析出微胶囊得到混合液，加入300 mL浓度为0.05 mmol/L的氯化钙水溶液进行萃取后分离油相即得到菌剂微胶囊分散液。

以上述菌剂微胶囊分散液进行保藏试验，分别以常规方法进行低温（4 ℃）冰箱保藏和常温保藏（25℃），低温冰箱保藏和常温保藏各制10 个样本实验组，低温冰箱保藏于2m（month）、4 m和6 m后表征菌株活性(CFU/mL)以及扩繁活性，并计算菌株活性保持率和扩繁活性保持率。

菌株活性保持率计算方法如下：

扩繁活性表征以培育的方式进行，各样本实验组分别进行五次接种培育，若能够形成菌落则表明其保持有扩繁活性，扩繁活性保持率的计算式为：

常温保藏分别于1 m、2 m和3 m后以相同的方法表征菌株活性以及扩繁活性。

表征结果如下表所示：

从上述结果可以看出，本发明方法能够有效实现菌株的保存。

实施例3

一种菌剂微胶囊的构建方法，所述方法为：

分别取10 mL Pyhto菌剂（即食二氮植物杆菌，Phytobacter diazotrophicus，浓度约为1.0×10⁹ CFU/mL，下同）、10 mL 1224T菌剂（即固氮螺菌，Azospirillumbrasilense 1224T，浓度约为1.0×10⁹ CFU/mL，下同）和44 mL浓度为1.1 wt%的海藻酸钠溶液混合搅拌为悬液，随后加入4 mL浓度为700 mmol/L的碳酸钙溶液和200 mL含1.8 wt%吐温80的棉籽油，搅拌15 min至其形成乳浊液，向乳浊液中加入40 mL含160 μL冰醋酸的棉籽油调节乳浊液pH值至酸性后搅拌析出微胶囊得到混合液，加入300 mL浓度为0.05 mmol/L的氯化钙水溶液进行萃取后分离油相即得到菌剂微胶囊分散液。

以上述菌剂微胶囊分散液进行保藏试验，分别以常规方法进行低温（4 ℃）冰箱保藏和常温保藏（25℃），低温冰箱保藏和常温保藏各制10 个样本实验组，低温冰箱保藏于2m（month）、4 m和6 m后表征菌株活性(CFU/mL)以及扩繁活性，并计算菌株活性保持率和扩繁活性保持率。

菌株活性保持率计算方法如下：

扩繁活性表征以培育的方式进行，各样本实验组分别进行五次接种培育，若能够形成菌落则表明其保持有扩繁活性，扩繁活性保持率的计算式为：

常温保藏分别于1 m、2 m和3 m后以相同的方法表征菌株活性以及扩繁活性。

表征结果如下表所示：

从上述结果可以看出，本发明方法能够有效实现菌株的保存。

对比例2

一种菌剂微胶囊的构建方法，所述方法为：

分别取10 mL Pyhto菌剂（即食二氮植物杆菌，Phytobacter diazotrophicus，浓度约为1.0×10⁹ CFU/mL，下同）、10 mL 1224T菌剂（即固氮螺菌，Azospirillumbrasilense 1224T，浓度约为1.0×10⁹ CFU/mL，下同）和40 mL浓度为1.5 wt%的海藻酸钠溶液混合搅拌为悬液，随后加入4 mL浓度为500 mmol/L的碳酸钙溶液和200 mL含1.5 wt%吐温80的水溶液，搅拌15 min，再加入40 mL含160 μL冰醋酸水溶液调节乳浊液pH值至酸性后搅拌析出微胶囊得到混合液，即得到菌剂微胶囊分散液。

以上述菌剂微胶囊分散液进行保藏试验，分别以常规方法进行低温（4 ℃）冰箱保藏和常温保藏（25℃），低温冰箱保藏和常温保藏各制10 个样本实验组，低温冰箱保藏于2m（month）、4 m和6 m后表征菌株活性(CFU/mL)以及扩繁活性，并计算菌株活性保持率和扩繁活性保持率。

菌株活性保持率计算方法如下：

扩繁活性表征以培育的方式进行，各样本实验组分别进行五次接种培育，若能够形成菌落则表明其保持有扩繁活性，扩繁活性保持率的计算式为：

常温保藏分别于1 m、2 m和3 m后以相同的方法表征菌株活性以及扩繁活性。

表征结果如下表所示：

从上述表征结果可以看出，在不加入棉籽油的情况下，菌株的保存效果产生了较为明显的下降，尤其是在常温保藏（25℃）的情况下，菌株活性和扩繁活性保持率均产生了非常显著的下降。可见棉籽油作为油相成分，其在促进微载体分散的同时，还能够在微胶囊内构建形成相对良好的保温微结构，能够避免过大的温度变化导致菌株失活或丧失扩繁活性的情况发生。

而除了棉籽油外，其余菜籽油等无害的油相物质理论上也具备相应的使用效果。

Claims (7)

1.一种菌剂微胶囊的制备方法，其特征在于，

所述方法包括：

将目标菌剂与海藻酸钠溶液混合为悬液，向悬液中加入沉降剂和油相液搅拌至其形成乳浊液，调节乳浊液pH值至酸性后搅拌析出微胶囊得到混合液，加入萃取液萃取后分离油相即得到菌剂微胶囊分散液。

2.根据权利要求1所述的一种菌剂微胶囊的制备方法，其特征在于，

所述菌剂和海藻酸钠溶液以体积比1：（1.8～2.2）的比例混合；

所述海藻酸钠溶液的浓度为1.2～1.8 wt%。

3.根据权利要求1所述的一种菌剂微胶囊的制备方法，其特征在于，

所述沉降剂为300～700 mmol/L的碳酸钙溶液；

所述油相液为含1.2～1.8 wt% Tween80的棉籽油。

4.根据权利要求1或3所述的一种菌剂微胶囊的制备方法，其特征在于，

所述调节乳浊液pH值采用冰醋酸或醋酸溶液进行。

5.根据权利要求1所述的一种菌剂微胶囊的制备方法，其特征在于，

所述萃取液为0.03～0.07 mmol/L的氯化钙溶液。

6.根据权利要求1或5所述的一种菌剂微胶囊的制备方法，其特征在于，

所述萃取液用量为混合液的1.0～1.5 倍体积。

7.一种如权利要求1至6任一所述方法的应用，其特征在于，

所述菌剂微胶囊的制备方法用于菌剂的保存和/或含菌剂产品延长有效期。