CN117624371A - 一种新型的抗体药物偶联物制备方法 - Google Patents
一种新型的抗体药物偶联物制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117624371A CN117624371A CN202211036848.0A CN202211036848A CN117624371A CN 117624371 A CN117624371 A CN 117624371A CN 202211036848 A CN202211036848 A CN 202211036848A CN 117624371 A CN117624371 A CN 117624371A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fab
- tri
- igg
- antibody
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 title claims abstract description 76
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 title claims abstract description 73
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 116
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 70
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 51
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 29
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 31
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 25
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 25
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 claims description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 5
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000012221 photothermal agent Substances 0.000 claims description 3
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 claims description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 2
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N [4-[[(2S)-5-(carbamoylamino)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)hexanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]pentanoyl]amino]phenyl]methyl N-[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1S,2R)-1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl]amino]-1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-methylamino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]-N-methylcarbamate Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]([C@@H](CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)c1ccccc1)OC)N(C)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)OCc1ccc(NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCCN2C(=O)CCC2=O)C(C)C)cc1)C(C)C IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N 0.000 description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 59
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 49
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 49
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 49
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 30
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 25
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 24
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 22
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 22
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 21
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 18
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 12
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 11
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 11
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 10
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 10
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 10
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M indocyanine green Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](CCCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960004657 indocyanine green Drugs 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001808 coupling effect Effects 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000001699 photocatalysis Effects 0.000 description 1
- 238000007626 photothermal therapy Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一种新型的抗体药物偶联物制备方法，涉及生物药物技术领域。本发明首先提供了一种IgG结合结构域，它包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。然后提供了利用该IgG结合结构域制备的抗体药物偶联物。本发明提供的IgG结合结构域对IgG的亲和力高，可以通过Fab结合多种IgG，且结合后的复合物稳定性好。此外，该IgG结合结构域可以与多种药物偶联，然后与IgG抗体通过简单混合的方法制备得到抗体药物偶联物。本发明IgG结合结构域可快速制备出针对不同靶标的ADC，适应于多种疾病的治疗，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物药物技术领域，具体涉及一种新型的抗体药物偶联物制备方法。
背景技术
目前肿瘤治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗及免疫治疗等。而对于中晚期肿瘤患者，化疗仍然是主要治疗手段。但是，传统的化疗药物通常不具备肿瘤靶向性，毒副作用大(Zhong L，Yang SY et al.Sig Transduct Target Ther.2021.6：201)。如果将细胞毒性化疗药物与抗体通过进行偶联，制备成抗体药物偶联物(antibody-drugconjugate，ADC)，则可兼具小分子化疗药物的强效杀伤和抗体药物的精准靶向优势，相较于传统化疗药物，具有更好的疗效和更小的毒副作用(Chau CH，Figg WD.Lancet.2019394：793-804)。
偶联技术对于ADC药物的制备极为关键。早期ADC药物多采用非定点偶联技术，导致药物抗体比(Drug-to-antibody ratio，DAR)不可控，药物一致性差。定点偶联制备的ADC药物形式均一，DAR可控，是理想的ADC药物制备方式。目前普遍采用的定点偶联技术主要包括了酶催化定点偶联，非天然氨基酸定点偶联，化学修饰定点偶联以及糖基修饰定点偶联等，使ADC药物的活性、稳定性以及毒副反应取得了明显改善，但是这些定点偶联技术多需要对抗体进行化学修饰或者基因工程化改造，不仅可能会影响抗体的功能，还存在技术难度较大、通用性差等缺点(Fu ZW，Zhang Yet al.Sig Transduct Target Ther.2022.7：93；Wu KL，Xiao H et al.Bioconjug Chem.202132：1947-1959)，迫切需要发展能快速、简便实现化学药物与抗体定点偶联的新技术。
制备ADC药物的抗体类型主要为IgG类抗体。为制备IgG类ADC药物，除将化学药物直接与IgG抗体偶联外，还可能利用IgG结合结构域(IgG-binding domain，IgBD)作为载体，先将化学药物偶联到IgBD上，再将携带化学药物的IgBD与IgG混合，在IgBD的介导下，使化学药物通过共价或非共价方式偶联到IgG上。已有研究选择的IgBD对IgG抗体的亲和力有限，将携带化学药物的IgBD与IgG混和后，IgBD不能介导化学药物与抗体形成稳定的ADC，需要在IgBD中引入非天然氨基酸、酶促基团、光促基团等特殊基团或使用交联剂，仍然存在较大的技术难度和较高的成本(Matsuda Y.et al.Molecular pharmaceutics.2021.18：4058-4066；Wu KL，Xiao H et al.Bioconjug Chem.202132：1947-1959；Lee T，ChungSJ.Org Lett.2020.22：8419-8423.)。如果能筛选出高亲和力的IgBD，将化学药物与其偶联后，只需将其与IgG抗体简单混合即可获得稳定的ADC药物。相比于共价偶联，该制备过程更简单快速。而且，若筛选到的IgBD能结合不同种类的IgG，将携带化学药物的IgBD与不同的IgG抗体混合，即可快速制备出针对不同靶标的ADC，适应于多种疾病的治疗，极具应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的抗体药物偶联物制备方法。
本发明提供了一种IgG结合结构域，它包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列和SEQID NO.4所示的氨基酸序列。
进一步地，前述的IgG结合结构域还包括SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
进一步地，前述的IgG结合结构域是SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列连接SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列而得。
进一步地，前述的IgG结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了前述的IgG结合结构域在制备抗体药物偶联物中的用途。
进一步地，所述抗体药物偶联物的抗体为IgG抗体。
本发明还提供了一种抗体药物偶联物，它是由前述的IgG结合结构域连接药物和抗体而得。
进一步地，所述抗体为IgG抗体；
和/或，所述药物为抗肿瘤药物、细胞毒素药物、光敏剂、光热剂、声敏剂、放射性核素。
本发明还提供了前述的抗体药物偶联物的制备方法，它包括如下步骤：
通过固相偶联法将药物偶联到前述的IgG结合结构域上，将得到的偶联物与抗体孵育，即得；
优选地，所述孵育为室温孵育0.5～1h；
和/或，所述偶联物与抗体的摩尔比为1∶1。
本发明还提供了前述的抗体药物偶联物在制备抗肿瘤药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种IgG结合结构域，该IgG结合结构域对IgG的亲和力高，可以通过Fab结合多种IgG，且结合后的复合物稳定性好。此外，该IgG结合结构域可以与多种药物偶联，然后与IgG抗体通过简单混合的方法制备得到抗体药物偶联物。本发明IgG结合结构域可快速制备出针对不同靶标的ADC，适应于多种疾病的治疗，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为三聚体IgBD的制备；其中，A为三聚体IgBD制备的示意图；B为各IgBD的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；C为各IgBD的分子筛检测结果。
图2为IgBD对IgG的结合部位分析；其中，A为CFab-tri对IgG(hIgG)及其Fab(hFab)和Fc(hFc)片段的结合结果；B为ZFc-tri对IgG(hIgG)及其Fab(hFab)和Fc(hFc)片段的结合结果。
图3为IgBD与IgG结合后的稳定性；其中，A为CFab-tri与不同抗体结合后的相对浊度；B为ZFc-tri与不同抗体结合后的相对浊度。
图4为CFab-tri对不同种属IgG的结合。
图5为CFab-tri与MMAE偶联的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图6为利用CFab-tri-MMAE制备EGFR靶向的ADC药物；其中，A为乳腺癌细胞MDA-MB-231上EGFR受体的表达以及αEGFR增加CFab-tri对MDA-MB-231细胞的结合；B为CFab-tri-MMAE与αEGFR结合的分子筛检测结果；C为CFab-tri-MMAE结合αEGFR后对MDA-MB-231细胞的杀伤；D为CFab-tri-MMAE结合αEGFR后对结肠癌细胞LS 174T的杀伤；E为CFab-tri-MMAE结合αEGFR后对结肠癌细胞COLO 205的杀伤；F为CFab-tri-MMAE结合αEGFR后对胰腺癌细胞MIA PaCa-2的杀伤。
图7为利用CFab-tri-MMAE制备HER2靶向的ADC药物；其中，A为乳腺癌细胞SKBR3上HER2受体的表达以及αHER2增加CFab-tri对SKBR3细胞的结合；B为CFab-tri-MMAE与αHER2结合的分子筛检测结果；C为CFab-tri-MMAE结合αHER2后对SKBR3细胞的杀伤；D为CFab-tri-MMAE结合αHER2后对卵巢癌细胞SK-OV-3的杀伤；E为CFab-tri-MMAE结合αHER2后对乳腺癌细胞ZR-75-1的杀伤。
图8为利用CFab-tri-MMAE制备CD20靶向的ADC药物；其中，A为B淋巴瘤细胞Ramos上的CD20表达以及αCD20增加CFab-tri对Ramos细胞的结合；B为CFab-tri-MMAE与αCD20结合的分子筛检测结果；C为CFab-tri-MMAE结合αCD20后对Ramos细胞的杀伤；D为CFab-tri-MMAE结合αCD20后对B细胞淋巴瘤细胞Raji的杀伤；E为CFab-tri-MMAE结合αCD20后对套细胞淋巴瘤细胞JeKo的杀伤。
图9为利用CFab-tri-MMAE制备PD-L1靶向ADC药物的体内抑瘤效果；其中，A为CFab-tri-MMAE与αPD-L1结合的分子筛检测结果；B为CFab-tri-MMAE与αPD-L1结合后对小鼠结肠癌细胞MC38的体外杀伤作用；C为CFab-tri-MMAE与αPD-L1结合后在MC38移植瘤模型中的体内抗肿瘤作用。
图10为CFab-tri与SN38偶联的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图11为利用CFab-tri-SN38制备靶向EGFR的ADC药物；其中，A为CFab-tri-SN38与αEGFR结合的分子筛检测结果；B为CFab-tri-SN38结合αEGFR后对结肠癌细胞COLO 205的杀伤；C为CFab-tri-SN38结合αEGFR后对乳腺癌细胞MDA-MB-231的杀伤。
图12为利用CFab-tri-SN38制备靶向HER2的ADC药物；其中，A为CFab-tri-SN38与αHER2结合的分子筛检测结果；B为CFab-tri-SN38结合αHER2后对卵巢癌细胞SK-OV-3的杀伤；C为CFab-tri-SN38结合αHER2后对乳腺癌细胞SKBR3的杀伤。
图13为利用CFab-tri-SN38制备靶向CD20的ADC药物；其中，A为CFab-tri-SN38与αCD20结合的分子筛检测结果；B为CFab-tri-SN38结合αCD20后对B淋巴瘤细胞Ramos的杀伤；C为CFab-tri-SN38结合αCD20后对B淋巴瘤细胞Raji的杀伤。
图14为CFab-tri与ICG偶联的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图15为利用CFab-tri-ICG制备靶向EGFR的抗肿瘤药物；其中，A为CFab-tri-ICG与αEGFR结合的分子筛检测结果；B为CFab-tri-ICG与αEGFR结合后在HT-29人结肠癌移植瘤模型中的体内抗肿瘤作用。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明涉及到的序列信息如下：
1)CFab核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
2)CFab氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：
3)Tri核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：
4)Tri氨基酸序列(SEQ ID NO.4)：
5)(G4S)3核苷酸序列(SEQ ID NO.5)：
6)(G4S)3氨基酸序列(SEQ ID NO.6)：
NH2-GGGGSGGGGSGGGGS-COOH
7)CFab-tri核苷酸序列(SEQ ID NO.7)：
8)CFab-tri氨基酸序列(SEQ ID NO.8)
9)ZFc核苷酸序列(SEQ ID NO.9)
10)ZFc氨基酸序列(SEQ ID NO.10)
11)ZFc-tri核苷酸序列(SEQ ID NO.11)
12)ZFc-tri氨基酸序列(SEQ ID NO.12)
实施例1、IgG结合结构域的制备
1、IgBD的分子设计
已有的IgG结合结构域(IgG-binding domain，IgBD)可能通过单独或同时识别Fab和Fc而与IgG结合。为了利用IgBD介导化学药物与IgG抗体的定点偶联，最好选择只识别Fab或Fc的IgG结合结构域。为了筛选合适的IgBD，本发明同时提供了特异性结合Fab和Fc的IgBD进行比较。考虑到单体IgBD往往亲和力不够，本发明通过将IgBD与三聚结构域融合，使IgBD形成三聚体，以期提高其亲和力。
如图1A所示，本发明将已有研究的Fab结合肽(Unverdorben等，PloSOne，2015，10：e0139838描述的一种Fab结合肽SpGC3FabRR，简称CFab，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)与三聚结构域tri(Wirz等，Matrix Biol.2011，30：9-15描述的氨基酸序列，如SEQ ID NO.4所示)融合，两个片段之间插入连接子(G4S)3，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，得到三价Fab结合肽(CFab-tri，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)。将Fc特异性结合Z肽(Nilsson等，Protein Eng.，1987，1：107-113，简称为ZFc，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示)与三聚结构域tri(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)融合，两个片段之间插入连接子(G4S)3，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，得到三价Fc结合肽(ZFc-tri，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)。
2、IgBD的重组表达和分离纯化
根据CFab，CFab-tri，ZFc和ZFc-tri的氨基酸序列，本发明设计并委托公司合成了编码基因。为方便将这些基因克隆如表达载体，合成时在基因两端分别添加限制性酶切位点BamHI和SalI。按常规分子克隆方法，将合成获得的基因克隆到商业化表达质粒pQE30上，转入M15大肠杆菌感受态中，构建相应的表达菌株。
为了诱导蛋白表达，将表达菌株接入LB液体培养基中。待菌株进入对数生长期，向培养基中添加0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，于25℃振荡诱导过夜。离心(7000g，10min)收集菌体，用裂解液(50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0；300mM氯化钠；20mM咪唑)重悬，再加入1mM苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF)，高压匀浆破菌，离心收集破菌上清。利用Ni-NTA树脂凝胶对上清中的目的蛋白进行纯化。如图1B所示，分离纯化的CFab，CFab-tri，ZFc和ZFc-tri在聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上均显示为单一蛋白条带，说明本发明获得了纯品。CFab和CFab-tri在电泳凝胶上显示的分子量分别为7KD和14KD(图1B)，与预期分子量相符。但是，分子筛结果显示，CFab和CFab-tri的分子量分别为7KD和42KD(图1C)，说明CFab在溶液状态下为单体，CFab-tri为三聚体。类似地，凝胶电泳和分子筛检测分析发现，ZFc为单体，ZFc-tri为三聚体。
实施例2、IgBD对IgG的结合部位分析
为证明本发明制备的IgBD具有Fab或Fc特异性结合能力，以及三聚化是否提高了IgBD的亲和力，本发明通过ELISA检测了IgBD，包括CFab，CFab-tri，ZFc和ZFc-tri对人源IgG(hIgG)及其Fab(hFab)和Fc(hFc)片段的结合。
首先将100nM的hIgG，hFab及hFc分别包被在高亲和力的ELISA专用孔板上，然后加入生物素标记的IgBD(0-25nM，100μl/孔)。37℃孵育1小时后，板孔用PBS洗涤3次，加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的Streptavidin，37℃孵育0.5小时，用磷酸盐缓冲液(PBS，10mM Na2HPO4，137mM NaCl，2.68mM KCl，and 2mM KH2PO4，pH 7.4)洗涤5次后加入TMB显色，酶标仪上测定A450nm。结果如图2A所示，CFab对hIgG，hFab和hFc不结合或弱结合。CFab-tri对hIgG及hFab显示强结合，对hFc结合的结合弱，说明三聚化增强了CFab对hIgG的结合能力，CFab是通过Fab结合IgG的。相同的分析发现，三聚化能增强ZFc对hIgG的结合能力，ZFc是通过Fc段结合IgG的(图2B)。上述实验可知：单聚体的CFab和ZFc对IgG以及Fab和Fc片段几乎没有结合能力，不能用于制备抗体药物偶联物；三聚体CFab-tri和ZFc-tri对IgG的结合能力显著提高，其中CFab-tri通过Fab结合IgG，ZFc-tri通过Fc结合IgG，具有制备抗体药物偶联物的潜力。
实施例3、IgBD与抗体结合后的稳定性分析
IgBD与抗体结合后可能会引起抗体过度聚集而沉淀而不能用于制备ADC。因此，在制备ADC前，需要对IgBD是否引起抗体聚集进行评估。由于CFab-tri和ZFc-tri显示更强的IgG结合能力，本发明进一步对这两种IgBD进行比较。
首先将肿瘤靶向性抗体(人源αEGFR/αHER2/αCD20)浓度调整为25μM，然后加入不同量的CFab-tri或ZFc-tri。室温孵育0.5小时后测定A340nm。同时，等量的抗体用三氟乙酸沉淀后测定A340nm，并以此为100％计算与IgBD蛋白混合后抗体的相对浊度。如果随着抗体溶液中加入IgBD蛋白的增加浊度增加，提示IgBD引起了抗体的聚集。
结果如图3A所示，CFab-tri与三种抗体(αEGFR/αHER2/αCD20)孵育后溶液中未出现明显沉淀，溶液浊度不随CFab-tri的增加而升高(图3A)。相反，向抗体中加入ZFc-Tri后，三种抗体溶液中均能观察到明显沉淀，溶液浊度随着ZFc-tri的增加而增加(图3B)。这些结果说明CFab-tri与这些抗体结合后不会引起抗体聚集，能形成稳定复合物。但ZFc-tri与这些抗体结合后会引起不同程度的抗体聚集，不能形成稳定复合物。因此，只有CFab-tri能作为化学药物载体用于ADC制备。
实施例4、CFab-tri对不同物种来源IgG的结合
CFab-tri对不同物种来源的IgG的结合，关系到能否利用不同来源的IgG制备ADC。为分析CFab-tri对不同物种IgG的结合，本发明将人(hIgG)、小鼠(mIgG)、大鼠(rat IgG)、兔子(rabbit IgG)、猴(monkey IgG)以及仓鼠IgG(hamster IgG)分别包被在ELISA专用孔板上，再加入生物素标记的CFab-tri，37℃孵育1小时后，用PBS洗涤3次，再加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的Streptavidin，37℃孵育0.5小时，PBS洗涤5次后加入TMB显色，酶标仪上测定A450nm。结果如图4显示，CFab-tri与不同种属IgG均显示出较好的结合，表明用CFab-tri可与不同种属的IgG制备ADC，具有广泛的应用前景。
实施例5、CFab-tri与MMAE的偶联
在确认了CFab-tri出色的抗体结合能力后，将其与细胞毒素药物进行偶联，探究其能否用于制备ADC药物。已知小分子毒素MMAE是一种微管蛋白抑制剂，可通过抑制微管蛋白的聚合而阻断细胞有丝分裂，诱导细胞凋亡，具有较强的抗癌活性。然而其单独使用时往往具有很强的毒副作用，与肿瘤靶向抗体偶联可明显提高其安全性，因此，MMAE多与抗体偶联制备ADC药物。本发明中，采用固相偶联的方法将vcMMAE偶联到CFab-tri上。首先将1mg/ml的CFab-tri与Ni-NTA树脂结合过夜，与vcMMAE按摩尔比1∶3在4℃结合3-5h，PBS洗涤200ml后，通过含300mM咪唑的PBS洗脱，然后在PBS中透析过夜，并进行凝胶电泳验证偶联效果。结果如图5所示，MMAE标记后的CFab-tri与未标记的相比，条带发生明显上移，表明MMAE成功地偶联到CFab-tri蛋白上。
实施例6、利用CFab-tri-MMAE制备靶向EGFR的ADC药物
为进一步分析利用CFab-tri-MMAE与EGFR单克隆抗体(αEGFR)是否可以通过简单混合即能制备ADC药物杀伤肿瘤细胞，本发明首先检查了CFab-tri是否能通过αEGFR介导而结合到肿瘤细胞上。流式细胞术检测发现，乳腺癌细胞MDA-MB-231高表达EGFR受体(图6A)。将FAM荧光染料标记的CFab-tri与αEGFR按摩尔比1∶1于室温混合0.5小时后加入乳腺癌细胞MDA-MB-231，然后用流式细胞术检测细胞上的CFab-tri。结果(图6A)显示，与对照抗体nIgG(同为IgG类抗体，但不识别EGFR)相比，αEGFR明显增加了CFab-tri对MDA-MB-231细胞的结合，说明CFab-tri先与αEGFR结合后能进一步结合到肿瘤细胞上。
随后，本发明利用分子筛检测偶联MMAE是否会影响CFab-tri与aEGFR的结合。将CFab-tri-MMAE的偶联物与αEGFR按摩尔比1∶1于室温混合0.5小时后，得到αEGFR-CFab-tri-MMAE抗体药物偶联物。保留体积越小，表示分子量越大，单峰表示物质形式均一性好。结果显示，单独的CFab-tri-MMAE和αEGFR都能够形成均一性较好的单峰。CFab-tri-MMAE的保留体积为14.6ml，αEGFR的保留体积为11.5ml，CFab-tri-MMAE与αEGFR的结合复合物(αEGFR-CFab-tri-MMAE)形成明显的单峰，保留体积为11ml，均小于二者单独的保留体积，表明CFab-tri-MMAE仍然能够很好地结合αEGFR(图6B)。
进一步，本发明将CFab-tri-MMAE与αEGFR室温混合0.5小时后再加入肿瘤细胞中，作用72小时后测定细胞存活率。结果(图6C)显示，单纯的αEGFR对MDA-MB-231没有明显杀伤。CFab-tri-MMAE与αEGFR结合后，对MDA-MB-231的杀伤随药物浓度增加而增强。这说明CFab-tri-MMAE与αEGFR通过简单混合形成了ADC。
进一步用结肠癌细胞LS 174T(图6D)、COLO 205(图6E)以及胰腺癌细胞MIA PaCa-2(图6F)测试也发现，单纯αEGFR对这些细胞均无明显杀伤，但CFab-tri-MMAE与αEGFR结合后对这些细胞都展示了剂量依赖的的杀伤作用。这些结果表明，CFab-tri-MMAE与αEGFR简单混合后即可形成ADC药物，对EGFR阳性的肿瘤细胞具有良好的杀伤能力。
实施例7、利用CFab-tri-MMAE制备靶向HER2的ADC药物
除了αEGFR抗体，目前临床上常用的抗体还有靶向HER2的曲妥珠单抗(αHER2)等。如果将CFab-tri-MMAE结合到αHER2抗体上，将会进一步提高αHER2的抗肿瘤效果。依据实施例6中相同的方法，本发明利用流式细胞术检测了乳腺癌细胞SKBR3上的HER2表达以及αHER2能否增加CFab-tri对HER2阳性细胞的结合。结果(图7A)显示，SKBR3细胞高表达HER2。，αHER2明显增加了CFab-tri对SKBR3细胞的结合。分子筛检测结果显示，单独的CFab-tri-MMAE和αHER2都能够形成均一性较好的单峰。CFab-tri-MMAE的保留体积为14.6ml，αHER2的保留体积为11.7ml，CFab-tri-MMAE与αHER2的结合复合物形成明显的单峰，保留体积为11.1ml，均小于二者单独的保留体积，表明偶联了MMAE的CFab-tri依然能够有效结合αHER2(图7B)。体外杀伤实验结果(图7C)显示，与单独αHER2相比，CFab-tri-MMAE与αHER2结合后，对SKBR3细胞显示出强大的杀伤活性。此外，其对人卵巢癌细胞SK-OV-3(图7D)、人乳腺癌细胞ZR-75-1(图7E)也具有较强的杀伤能力。这些结果表明，CFab-tri-MMAE与αHER2结合形成的ADC药物，对HER2阳性的肿瘤细胞具有良好的结合和杀伤能力。
实施例8、利用CFab-tri-MMAE制备靶向CD20的ADC药物
上述两种抗体主要针对实体瘤，而对于血液瘤，作为全球首款抗体药物的αCD20则发挥了重要的作用。本发明将CFab-tri-MMAE与αCD20偶联，评估其制备靶向CD20的ADC药物可能性。依据实施例6中相同的方法，利用流式细胞术检测了B淋巴瘤细胞Ramos上的CD20表达以及αCD20能否增加CFab-tri对CD20阳性细胞的结合。结果(图8A)显示，Ramos细胞高表达CD20，，而αCD20能够明显增加CFab-tri与Ramos细胞的结合。分子筛检测结果(图8B)显示，单独的CFab-tri-MMAE和αCD20都能够形成均一性较好的单峰。CFab-tri-MMAE的保留体积为14.5ml，αCD20的保留体积为11.5ml，CFab-tri-MMAE与αCD20的结合复合物形成明显的单峰，保留体积为10.95ml，均小于二者单独的保留体积，表明偶联MMAE并不会影响CFab-tri与αCD20的结合。体外杀伤实验结果(图8C)显示，与单独αCD20相比，CFab-tri-MMAE与αCD20结合后对Ramos细胞的杀伤活性明显增强，并且在人B细胞淋巴瘤细胞Raji(图8D)和人套细胞淋巴瘤细胞JeKo(图8E)中也显示出强效杀伤。这些结果表明，CFab-tri-MMAE与αCD20结合形成的ADC药物，对CD20阳性的淋巴瘤细胞具有良好的结合和杀伤能力。
实施例9、利用CFab-tri-MMAE制备靶向PD-L1的ADC药物
αPD-L1抗体可以与肿瘤细胞上广泛表达的PD-L1结合，具有良好的肿瘤靶向能力，在免疫治疗中发挥了重要作用。采用实施例6相同的方法，本发明中将CFab-tri-MMAE与αPD-L1结合，制成靶向PD-L1的ADC药物，将可能发挥比二者单独使用更强的抗肿瘤作用。首先，分子筛检测结果(图9A)显示，单独的CFab-tri-MMAE和αPD-L1都能够形成均一性较好的单峰。CFab-tri-MMAE的保留体积为14.55ml，αPD-L1的保留体积为11.49ml，CFab-tri-MMAE与αPD-L1的结合复合物形成明显的单峰，保留体积为10.91ml，均小于二者单独的保留体积，表明CFab-tri-MMAE能够较好地与αPD-L1抗体结合。进一步，体外杀伤实验(图9B)显示，单纯的αPD-L1对小鼠结肠癌细胞MC38没有明显杀伤。CFab-tri-MMAE与αPD-L1结合后，则对MC38细胞表现出较强的浓度依赖性杀伤能力。
为了评估CFab-tri-MMAE与αPD-L1抗体结合后的体内抗肿瘤增效作用，本发明将CFab-tri-MMAE(含MMAE 0.3mg/kg)与αPD-L1抗体(11.4mg/kg)室温孵育0.5h后，尾静脉注入MC38小鼠结肠癌移植瘤模型中，PBS和单独的αPD-L1以及CFab-tri-MMAE作为对照。每周给药2次，共给药4次。结果(图9C)显示，第18天处死小鼠时，PBS对照组的瘤体平均大小为1560.4±257mm3，αPD-L1组的瘤体平均大小为871±189.9mm3，CFab-tri-MMAE组的瘤体平均大小为997.3±148mm3，而αPD-L1-CFab-tri-MMAE的瘤体平均大小为511±171.8mm3，明显小于二者单独使用组(p＜0.05)。表明通过与αPD-L1结合，能够明显增强CFab-tri-MMAE的抗肿瘤作用。
实施例10、CFab-tri与SN38的偶联
为了阐明CFab-tri不仅能够快速简便的与多种抗体结合，还能够实现与不同的细胞毒性分子的快速偶联。本发明选择将CFab-tri与另一种小分子毒素药物SN38进行偶联。与MMAE偶联类似，本发明采用与实施例5中相同的固相偶联方法，将SN38与CFab-tri进行偶联。结果(图10)显示，SN38偶联后的CFab-tri与偶联前相比，条带发生明显上移，表明SN38成功地偶联到CFab-tri蛋白上。
实施例11、利用CFab-tri-SN38制备靶向EGFR的ADC药物
为了评估CFab-tri-SN38是否能够与靶向性抗体结合而制备ADC药物，采用实施例6相同的方法，本发明利用分子筛检测了CFab-tri-SN38能否与αEGFR结合，制备靶向EGFR的ADC药物。分子筛结果(图11A)显示，单独的CFab-tri-SN38和αEGFR都能够形成均一性较好的单峰。CFab-tri-SN38的保留体积为14.6ml，αEGFR的保留体积为11.5ml，而CFab-tri-SN38与αEGFR的结合复合物形成保留体积更小(10.97ml)的单峰。保留体积越小，表示分子量越大，因此结果表明，CFab-tri-SN38能够较好地与αEGFR抗体结合。进一步肿瘤细胞杀伤实验结果显示，相比于单独的αEGFR抗体，制备而成的ADC药物αEGFR-CFab-tri-SN38在结肠癌细胞COLO 205(图11B)和乳腺癌细胞MDA-MB-231(图11C)上都显示出较强的细胞杀伤，说明利用CFab-tri-SN38可以制备靶向EGFR的ADC药物。
实施例12、利用CFab-tri-SN38制备靶向HER2的ADC药物
为了验证CFab-tri-SN38能够与更多的靶向抗体结合来制备ADC药物，本发明采用与实施例11相同的方法，将CFab-tri-SN38与αHER2室温孵育0.5h，利用分子筛检测二者是否能够结合。保留体积越小，表示分子量越大，单峰表示物质形式均一性好。结果(图12A)显示，单独CFab-tri-SN38及αHER2都能够形成均一的单峰，二者的保留体积分别为14.5ml和11.7ml。而CFab-tri-SN38与αHER2的结合复合物形成保留体积更小(11.1ml)的单峰，表明CFab-tri-SN38能够较好地与αHER2抗体结合。进一步的肿瘤细胞杀伤实验结果显示，与单独αHER2抗体相比，偶联后的αHER2-CFab-tri-SN38分别在人卵巢癌细胞SK-OV-3(图12B)和乳腺癌细胞SKBR3(图12C)上显示了出色的肿瘤细胞杀伤能力，表明利用CFab-tri-SN38同样适用于制备靶向HER2的ADC药物。
实施例13、利用CFab-tri-SN38制备靶向CD20的ADC药物
除了靶向实体瘤的抗体，针对血液瘤细胞，选择将CFab-tri-SN38与αCD20抗体进行结合，方法同实施例11。分子筛结果显示，单独CFab-tri-SN38及αCD20的保留体积分别为14.5ml和11.5ml。而CFab-tri-SN38与αCD20的结合复合物的保留体积为10.9ml，小于二者单独的保留体积，且为均一单峰。保留体积越小，表示分子量越大，单峰表示物质形式均一性好。这些结果表明CFab-tri-SN38与αCD20抗体能够很好地形成结合复合物(图13A)。进一步，在对人B淋巴瘤细胞Ramos(图13B)和Raji(图13C)的杀伤实验中，αCD20-CFab-tri-SN38显示出显著优于单独αCD20抗体的抗肿瘤效果。结果表明，利用CFab-tri-SN38能够用于制备靶向CD20的ADC药物。
显然，实施例10-13的这些结果表明，通过CFab-tri能够将毒性分子SN38快速偶联到多种肿瘤靶向抗体上，制备相应的ADC药物，并显示出显著优于单独抗体的肿瘤细胞杀伤能力。
实施例14、CFab-tri与ICG的偶联
吲哚菁绿(Indocyanine green，ICG)是一种生物相容性和稳定性好的光敏剂及光热剂，可作为药物用于光热治疗，在临床上已经被证实安全。但其单独使用并不具备肿瘤靶向性，如能增强其在肿瘤部位富集，将可能会显著提高其抗肿瘤效果。本发明中，参考实施例5中的固相偶联方法，将ICG与CFab-tri进行偶联。凝胶电泳结果(图14)显示，ICG偶联后的CFab-tri与偶联前相比，条带发生一定程度上移，凝胶在760-820nm激光照射下，在目标条带位置可呈现明显的荧光条带，表明ICG可成功地偶联到CFab-tri蛋白上。
实施例15、利用CFab-tri-ICG制备靶向EGFR的抗肿瘤药物
为了验证偶联的ICG是否会影响CFab-tri与IgG的结合，本发明利用分子筛对二者的结合情况进行检测分析。采用实施例6相同的方法将CFab-tri-ICG与αEGFR结合，分子筛结果(图15A)显示，CFab-tri-ICG的保留体积为13.4ml，αEGFR的保留体积为11.6ml，CFab-tri-ICG与αEGFR的结合复合物形成明显的单峰，保留体积为11.1ml，表明CFab-tri-ICG能够与αEGFR抗体结合。
为了进一步评估CFab-tri-ICG结合αEGFR抗体后的体内抗肿瘤效果。本发明构建了人结肠癌细胞HT-29移植瘤模型。小鼠随机分为PBS空白对照组，αEGFR+CFab-tri-ICG实验组和nIgG+CFab-tri-ICG以及αEGFR+CFab-tri-ICG+TN对照组，其中nIgG指的是与αEGFR同源的小鼠对照抗体；TN指的是αEGFR与CFab-tri-ICG的结合复合物用胰酶进行消化后再给药。当肿瘤生长约400mm3时，尾静脉给药，结合复合物中含αEGFR 10.7mg/kg和CFab-tri-ICG 3mg/kg(其中ICG为0.2mg/kg)，其他对照组给予相应的等同剂量。24小时后用激光器在800nm波长下，1W/cm2，光照14分钟，各组共给药及光照1次。结果(图15B)显示，治疗后第9天完成实验观察时，PBS对照组的瘤体平均大小为865.1±81.6mm3，Isotype IgG+CFab-tri-ICG组的瘤体平均大小为684.8±198.1mm3，αEGFR+CFab-tri-ICG+TN组的瘤体平均大小为688.8±148.1mm3，三个对照组之间无明显差异(p＞0.05)。而αEGFR+CFab-tri-ICG的瘤体平均大小为70.9±63.5mm3，与前三组对照相比，均存在显著差异(p＜0.0001)，表明通过与αEGFR结合，能够显著增强CFab-tri-ICG的抗肿瘤作用。
综上，本发明提供了一种IgG结合结构域CFab-tri，该IgG结合结构域对IgG的亲和力高，可以通过Fab结合多种IgG，且结合后的复合物稳定性好。此外，该IgG结合结构域可以与多种药物偶联，然后与IgG抗体通过简单混合的方法制备得到抗体药物偶联物。本发明IgG结合结构域可快速制备出针对不同靶标的ADC，适应于多种疾病的治疗，具有良好的应用前景。
Claims (10)
1.一种IgG结合结构域，其特征在于：它包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列和SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的IgG结合结构域，其特征在于：它还包括SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的IgG结合结构域，其特征在于：它是SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列连接SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列而得。
4.根据权利要求3所述的IgG结合结构域，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.权利要求1～4任一项所述的IgG结合结构域在制备抗体药物偶联物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述抗体药物偶联物的抗体为IgG抗体。
7.一种抗体药物偶联物，其特征在于：它是由权利要求1～4任一项所述的IgG结合结构域连接药物和抗体而得。
8.根据权利要求7所述的抗体药物偶联物，其特征在于：所述抗体为IgG抗体；
和/或，所述药物为抗肿瘤药物、细胞毒素药物、光敏剂、光热剂、声敏剂、放射性核素。
9.权利要求7或8所述的抗体药物偶联物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
通过固相偶联法将药物偶联到权利要求1～4任一项所述的IgG结合结构域上，将得到的偶联物与抗体孵育，即得；
优选地，所述孵育为室温孵育0.5～1h；
和/或，所述偶联物与抗体的摩尔比为1∶1。
10.权利要求7或8所述的抗体药物偶联物在制备抗肿瘤药物中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211036848.0A CN117624371A (zh) | 2022-08-26 | 2022-08-26 | 一种新型的抗体药物偶联物制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211036848.0A CN117624371A (zh) | 2022-08-26 | 2022-08-26 | 一种新型的抗体药物偶联物制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117624371A true CN117624371A (zh) | 2024-03-01 |
Family
ID=90036498
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211036848.0A Pending CN117624371A (zh) | 2022-08-26 | 2022-08-26 | 一种新型的抗体药物偶联物制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117624371A (zh) |
-
2022
- 2022-08-26 CN CN202211036848.0A patent/CN117624371A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114456186B (zh) | 一种喜树碱类衍生物及其配体-药物偶联物 | |
| CA3062962C (en) | Multispecific protein drug and library thereof, preparing method therefor and application thereof | |
| CN113195530B (zh) | 抗体融合蛋白、制备方法及其应用 | |
| CN113444182B (zh) | 一种靶向递送IgG类抗体的融合蛋白载体及其用途 | |
| WO2022262099A1 (zh) | 抗cd70内化的抗体、抗体偶联物及其应用 | |
| Zhu et al. | Preparation and characterization of humanized nanobodies targeting the dimer interface of epidermal growth factor receptor (EGFR) | |
| CN117940461A (zh) | 一种双特异性抗体及其用途 | |
| CN101143902B (zh) | 抗HER2单链抗体-力达霉素强化融合蛋白HER2(Fv-LDM) | |
| Wang et al. | Pentamerisation of a scFv directed against TRAIL receptor 2 increases its antitumour efficacy | |
| CN117624371A (zh) | 一种新型的抗体药物偶联物制备方法 | |
| CN112156184B (zh) | 靶向于egfr的抗体偶联药物、制备方法及应用 | |
| CN110467676B (zh) | 特异性结合egfr的单克隆抗体及其抗癌用途 | |
| CN116249715A (zh) | 抗ctla4单克隆抗体和嵌合抗原受体 | |
| CN113817071B (zh) | 一种egfr靶向的trail融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| US11952402B2 (en) | Fusion protein containing trail and IgG binding domain and the uses thereof | |
| TW201809013A (zh) | 用於藥物遞送之抗體融合蛋白 | |
| WO2022206881A1 (zh) | 核酸自组装介导的adc药物的构建方法及应用 | |
| WO2024145858A1 (zh) | Dna-trail复合物及其治疗肿瘤的用途 | |
| CN110563846B (zh) | 一种特异性结合egfr的单克隆抗体及其抗癌用途 | |
| WO2024061364A1 (zh) | 一种抗4-1bb纳米抗体及其制备和应用 | |
| WO2021219046A1 (zh) | 靶向her2的抗原结合构建体及用途 | |
| US20210138075A1 (en) | Cell internalizing compounds | |
| US20210015891A1 (en) | Interleukin-18 mimics and methods of use | |
| CN115583995A (zh) | 双特异性抗体及其制备方法和应用 | |
| CN114957476A (zh) | 一种半胱氨酸工程化的结合人5t4的全人源纳米抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |