CN116249715A - 抗ctla4单克隆抗体和嵌合抗原受体 - Google Patents
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Abstract
提出了组合物和方法，其中选择的多肽化合物与CTLA‑4结合。最典型地，结合由选择的VH和/或VL结构域介导，并且将优选的化合物制备为scFv、IgG或CAR。
Description
本申请要求序列号为63/038,111的我们共同未决的美国临时专利申请的优先权，该美国临时专利申请于2020年6月11日提交并且通过引用以其全文并入。
序列表
文件名称为102719.0032PCT_REV005_ST25.txt、大小为110KB的序列表的ASCII文本文件的内容创建于2021年06月01日并且经由EFS-Web与本申请一起以电子方式提交，将其通过引用以其全文并入。
技术领域
本发明的领域是用于与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)结合的化合物的组合物和方法，并且尤其是如本文提出的抗体、抗体片段、scFv和包含VH和VL结构域的融合分子。
背景技术
背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认特别地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被特别地且单独地指明通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。
针对多种癌症，免疫疗法已逐渐成为有希望的治疗性策略。在其他选择中，典型地与免疫刺激性药物组合的癌症疫苗组合物在至少一些方法中已显示出显著的治疗性效果。遗憾的是，肿瘤微环境通常具有T细胞和NK细胞的免疫抑制作用，免疫疗法的效果通常受到减弱。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4，CD152)是由激活的效应T细胞(T效应)表达的膜糖蛋白，参与阻遏T细胞增殖、细胞周期进程和细胞因子(IL-2、IFN-γ)的产生。CTLA-4被认为通过多种机制发挥其抑制性功能，这些机制包括与CD28阳性共刺激竞争结合抗原呈递细胞(APC)上它们共享的B7配体(CD80/CD86)，以及通过与信号传导分子相关的胞质尾区的直接抑制性作用。
为了克服由于CTLA-4活性引起的免疫抑制，可以使用抗CTLA-4抗体作为治疗性效应物。目前已知的抗CTLA-4抗体包括伊匹木单抗和曲美木单抗，这些抗体已单独或与化疗、癌症疫苗或其他抗体(抗PD-1或抗OX40)组合用于治疗多种癌症，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝细胞癌和间皮瘤。伊匹木单抗以10mg/kg剂量在黑色素瘤的情况下提高长期生存率，并在B细胞淋巴瘤患者中具有抗肿瘤活性。然而，伊匹木单抗在转移性去势抵抗性前列腺癌患者中没有显示出有效性。尽管没有显示出与伊匹木单抗相似的益处，但曲美木单抗在黑色素瘤、难治性转移性结直肠癌、肝细胞癌和恶性间皮瘤患者中的临床试验显示出可接受的耐受性和临床上有意义的活性。
遗憾的是，伊匹木单抗和曲美木单抗具有显著的有害作用，且并不总是有效降低免疫抑制。因此，尽管在本领域中已知干扰CTRLA-4信号传导的各种系统和方法，但所有或几乎所有这些系统和方法都有几个缺点。因此，仍然需要用于与CTLA-4结合的改善的化合物的组合物和方法。
发明内容
本发明主题涉及以高特异性和亲和力与CTLA-4结合的多肽的多种组合物和方法。在优选的实施例中，多肽被配置为scFv、抗体或其部分、或嵌合分子，如CAR、N-803或TxM衍生物。在另外的优选实施例中，多肽包含VH和/或VL结构域并且具有如SEQ ID NO.1-59中所述的氨基酸序列、或包含如SEQ ID NO：60-71中所述的抗体的重链或轻链。如将容易理解的，这些多肽可用于多种诊断性和治疗性用途，并且尤其是用于降低免疫抑制和治疗癌症。
在本发明主题的一个方面，诸位发明人考虑了单链可变片段(scFv)肽，该单链可变片段肽包括含有第一氨基酸序列的VH区段和/或含有第二氨基酸序列的VL区段，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、46、48、49、51、54、56和58组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、47、50、53、55、57和59组成的组。最典型地，VH区段和VL区段用接头肽(例如，富含甘氨酸的肽)偶联。此外，考虑单链可变片段(scFv)肽可进一步包含至少两对VH区段和VL区段，其中该至少两对经连接形成多价scFv。有需要时，该肽可存在于药理学上可接受的载体中。
在本发明主题的另一方面，诸位发明人考虑了抗体，该抗体包含含有第一氨基酸序列的重链和/或含有第二氨基酸序列的轻链，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.60、61、62、64、65、66、68和70组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.63、67、69和71组成的组。例如，合适的抗体包括具有含有SEQ ID NO.68的第一氨基酸序列的重链和含有SEQID NO.69的第二氨基酸序列的轻链、或含有SEQ ID NO.70的第一氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO.71的第二氨基酸序列的轻链的那些抗体。
在本发明主题的另外的方面，诸位发明人考虑了用于治疗患有癌症的患者的药物组合物，该药物组合物包括如本文提出的单链可变片段(scFv)肽或抗体，其中该单链可变片段(scFv)肽或抗体存在于药理学上可接受的载体中。
在本发明主题的仍另一方面，诸位发明人考虑了诊断组合物，该诊断组合物包含如本文提出的单链可变片段(scFv)肽或抗体，其中该单链可变片段(scFv)肽或抗体进一步包含可检测标记。
此外，诸位发明人还考虑了重组核酸，该重组核酸包含：编码第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列的第一核酸区段，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、46、48、49、51、54、56和58组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、47、50、53、55、57和59组成的组。优选地但不是必须地，第一区段和第二区段存在于同一阅读框中。另外，诸位发明人考虑了重组核酸，该重组核酸包含编码第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列的第一核酸区段，该第一氨基酸序列选自由SEQID NO.60、61、62、64、65、66、68和70组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.63、67、69和71组成的组。优选地但不是必须地，第一区段和第二区段以双顺反子排列。
例如，考虑的重组核酸可以包含编码SEQ ID NO.68的第一氨基酸序列的第一核酸区段和编码SEQ ID NO.69的第二氨基酸序列的第二核酸区段、或编码SEQ ID NO.70的第一氨基酸序列的第一核酸区段和编码SEQ ID NO.71的第二氨基酸序列的第二核酸区段。
如将容易理解的，重组核酸可以进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的至少一部分的编码多肽的第三区段，其中当在细胞中表达时，该CAR具有包含第一核酸区段和/或第二核酸区段的抗原结合胞外域。可替代地，重组核酸还可以包含编码N-803或TxM的至少一部分的编码多肽的第三区段，其中当在细胞中表达时，该N-803或TxM具有包含第一核酸区段和/或第二核酸区段的抗原结合结构域。
因此，诸位发明人还考虑了重组细胞，该重组细胞包括(例如，经由转染或基因工程)如上所述的重组核酸。在其他合适的细胞类型中，重组细胞可以是重组T细胞、重组NK细胞、重组NKT细胞、重组单核细胞、重组巨噬细胞、或重组树突状细胞。可替代地，重组细胞也可以是经工程化以产生重组蛋白的生产细胞，如CHO细胞或EC7细胞。
在另外的考虑的方面，提出了减少细胞或组织中CTLA-4介导的效应的方法，该方法包括以下步骤：使该细胞或组织与如本文提出的单链可变片段(scFv)肽或抗体以减少该细胞或组织中CTALA-4介导的效应的量接触。
因此，诸位发明人还考虑了治疗患有肿瘤的患者的方法，该方法包括以下步骤：向该患者施用包含如本文提出的单链可变片段(scFv)肽或抗体的药物组合物、或如本文提出的重组细胞。最优选地，将药物组合物以有效治疗肿瘤的剂量和方案向该患者施用。
因此，从不同的角度看，诸位发明人还考虑了在患有肿瘤的患者中降低免疫抑制的方法，该方法包括以下步骤：向该患者施用包含如本文提出的单链可变片段(scFv)肽或抗体的药物组合物、或如本文提出的重组细胞。最优选地，将药物组合物以有效降低肿瘤微环境中的免疫抑制的剂量和方案向该患者施用。
因此，考虑如本文提出的单链可变片段(scFv)或抗体或重组细胞用于医学并且尤其用于在患有肿瘤的患者中治疗癌症和/或降低免疫抑制。
根据优选实施例的以下详细描述以及附图(其中相同的附图标记代表相同的组件)，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1描绘了如本文提出的多种scFv构建体的示例性SPR结果。
图2A-2D描绘了接受如本文提出的抗CTLA-4抗体和对照的经治疗肿瘤的示例性结果。
图2E是图2A-2D的治疗组的卡普兰梅尔(Kaplan Meier)图。
图3A-3D描绘了接受如本文提出的抗CTLA-4抗体和对照的未治疗肿瘤的示例性结果。
图3E是图3A-3D的治疗组的卡普兰梅尔图。
具体实施方式
诸位发明人已经发现了与CTLA-4显著结合的多种多肽、以及特别地抗体的VH和VL结构域或含有VH和/或VL结构域(以及其中含有的CDR)的片段或融合蛋白。最有利地，其中包含的VH和/或VL结构域或CDR可用于产生对CTLA-4具有高亲和力和特异性的多种治疗剂或诊断剂。
关于本文考虑的VH和VL结构域，应当理解，这些结构域通常遵循熟知的命名法。因此，VH结构域表示抗体中典型地与几个恒定结构域结合的重链的可变片段(例如，IgG中与CH1、CH2和CH3结构域结合的VH结构域)。同样地，VL结构域表示抗体中典型地与几个恒定结构域结合的轻链的可变片段(例如，IgG中与CL结合的VL结构域)。因此，如将容易理解的，VH结构域和VL结构域中的每一个将具有相应的框架区(FR)和互补决定区(CDR)，这些FR和CDR典型地依序排列为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3CDR3-FR4。因此，基于VH结构域和VL结构域中的已知框架区，本领域技术人员将容易识别VH结构域或VL结构域中的相应CDR。术语“结构域”和“区段”连同它们的VH或VL在本文中可互换使用。
如将进一步容易认识到的，本领域技术人员将能够使用VH区段和/或VL区段的氨基酸序列来产生重组的、分离的抗体或其片段。如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，“抗体及其片段”包括完整的免疫球蛋白分子(例如，全尺寸的完整IgG1、IgA等)、以及完整免疫球蛋白分子的抗原结合片段。因此，考虑的片段包括scFv、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fv、以及包含任一VH区段和/或VL区段的任何片段。在抗体是免疫球蛋白的情况下，考虑免疫球蛋白可以包括任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)和任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)的重链或恒定结构域以构成不同类型的免疫球蛋白。此外，“抗体”将尤其包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。因此，应当理解，可以使用本领域熟知的方法将SEQ ID NO.1-59的VH和/或VL结构域移植到任何现有的(典型地是人或人源化的)抗体或抗体片段中。
诸位发明人进一步考虑到，SEQ ID NO.1-59中所示的VH区段和/或VL区段的氨基序列可以与载体蛋白偶联使用以产生在其表面上具有VH区段和/或VL区段的杂交蛋白，使得该杂交蛋白可以结合或阻断CTLA-4。考虑了可以稳定地携带VH区段和/或VL区段并且优选提供进入肿瘤微环境的入口的载体蛋白的任何合适形式。一种尤其优选的载体蛋白包括与一个或多个VH区段和/或VL区段偶联的白蛋白、重折叠的白蛋白和对抗体部分具有亲和力的其他蛋白(例如，蛋白A、蛋白G、蛋白Z)。
典型地，VH区段和/或VL区段与锚定分子偶联，VH区段和/或VL区段可以通过该锚定分子与载体蛋白偶联。例如，在载体蛋白是白蛋白的情况下，锚定分子可以是任何合适大小的疏水肽或糖脂，以适合白蛋白的Sudlow位点I和II位中的一个或白蛋白的任何其他疏水区。例如，如上所述的针对CTLA-4的重组免疫球蛋白可以经由其Fc结构域与载体蛋白偶联。在其他实施例中，锚定分子可以包括疏水肽(长度为至少10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、30个氨基酸等)。在这些实施例中，可以考虑VH区段和/或VL区段(例如，作为scFv形式)和疏水肽的多种构型。例如，单价scFv结构域可以直接与疏水肽连接，或者多价scFv可以直接与疏水肽连接。可替代地，一个scFv结构域可以直接与多个疏水肽连接，或者多个scFv结构域可以直接与多个疏水肽连接。
可替代地或另外，一个或多个VH区段和/或VL区段可与具有锚定部分的中间分子偶联以与载体蛋白结合。在优选的实施例中，诸位发明人考虑中间分子为VH区段和/或VL区段提供多个结合位点，使得可以经由载体蛋白上的单个结合位点携带多个靶标识别结构域。合适的中间分子可以包括不会对原初组织产生任何显著毒性的任何蛋白、糖脂、有机分子或无机分子。例如，合适的中间分子可以包括纳米颗粒(例如，量子点、金纳米颗粒、磁性纳米颗粒、纳米管、聚合物纳米颗粒、树枝状聚合物等)或珠粒(例如，聚苯乙烯珠粒、乳胶珠粒、dynabead等)。优选地，纳米颗粒和/或珠粒的尺寸低于1μm，优选低于100nm。纳米颗粒可以与疏水尾交联或被疏水尾部分包被，该疏水尾为载体蛋白(例如白蛋白)提供锚。一个或多个VH区段和/或VL区段也可以与纳米颗粒交联或部分包被在纳米颗粒上(例如，经由连接至靶标识别结构域的额外尾部结构域进行交联等)。
在另一实例中，合适的中间分子可包括与针对载体蛋白的抗体偶联的珠粒(例如，聚苯乙烯珠粒、乳胶珠粒、dynabead等)。因此，在载体蛋白是白蛋白的情况下，珠粒可以与α-白蛋白抗体偶联(例如，交联、包被等)，使得珠粒可以高亲和力和特异性与载体蛋白结合。一个或多个VH区段和/或VL区段也可以与珠粒交联或部分包被在珠粒上(例如，经由连接至靶标识别结构域的额外尾部结构域进行交联、硫醇介导的交联等)。
在一些实施例中，scFv肽可以形成包含或模拟ALT-803(IL-15超激动剂复合物，参见例如Blood[血液]2015126：1957)或TxM(基于靶向ALT-803的支架平台，参见例如URLaltorbioscience.com/our-science/il-15-protein-superagonist-and-scaffold-technology/)结构的重组免疫球蛋白复合物。优选地，诸位发明人考虑到，在免疫球蛋白复合物模拟TxM结构的情况下，scFv肽可以直接地(或经由接头间接地)偶联至一个或多个白细胞介素-15(IL-15)结合基序和/或IL-15结合基序的一个或多个配体(例如，IL-15、IL-15N72D等)。因此，在重组免疫球蛋白复合物模拟TxM IgG1结构的情况下，重组免疫球蛋白复合物可包括1-4个针对CTLA-4的scFv肽。
另外，模拟具有一个或多个与IL-15结合基序或其配体偶联的scFv肽的TxM结构的重组免疫球蛋白复合物还可包括针对肿瘤特异性抗原或患者和肿瘤特异性新表位的结合结构域(例如，针对新表位的scFv肽等)。例如，重组免疫球蛋白复合物可包括与两个IL-15结合基序偶联的两个针对CTLA-4的scFv肽、以及与两个IL-15结合基序配体偶联的两个针对新表位的ScFv肽。优选地，该新表位是患者特异性的且肿瘤特异性的，其通过如例如US2012/0059670A1和US 2012/0066001A1中披露的序列数据的组学分析而鉴定。
在一些实施例中，可以使用SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、46、48、49、51、54、56和58中编码VH区段的一个序列来产生scFv、重组抗体或其片段。在其他实施例中，可以使用SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、47、50、53、55、57和59中编码VL区段的一个序列来产生scFv、重组抗体或其片段。在又其他实施例中，可以使用SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、46、48、49、51、54、56和58中编码VH区段的一个序列以及SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、47、50、53、55、57和59中编码VL区段的一个序列来产生scFv、重组抗体或其片段。在这些实施例中，优选的是将在序列列表中具有共同的指示符与区别性VH和VL识别符(例如，分别如SEQ ID NO.1和2中所示的73-2VH和73-2VL)的编码VH区段的序列和编码VL区段的序列配对。然而，如下文更详细显示，还考虑可以通过选择来自SEQ IDNO.xx的一个VH片段和来自SEQ ID NO.yy的一个VL片段产生任何一对VH区段和VL区段以形成CTLA-4结合分子，其中xx是1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、46、48、49、51、54、56和58中的任一个，并且yy为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、47、50、53、55、57和59中的任一个。
诸位发明人还考虑到scFv、重组抗体或其片段可以用编码VH区段和/或VL区段的氨基酸序列产生，这些氨基酸序列与SEQ ID NO.xx或yy中的任一个具有至少85％的同一性、优选至少90％的同一性、更优选至少95％的同一性。最典型地，在同一性不是100％的情况下，差异的一个或多个氨基酸将位于序列的一个或多个框架区中，并且不影响给定序列的CDR区。在另外的实施例中，优选的是scFv肽、重组抗体或其片段的结合亲和力不高于100nM、或不高于50nM、或不高于20nM、或不高于10nM、或不高于5nM、或不高于2nM、或不高于1nM。例如，可以选择如本文提出的具有特定VH和/或VL结构域的任何scFv，然后经由VH和VL的CDR区中的随机诱变使该scFv经受亲和力成熟。在这样的实例中，典型地考虑将在给定序列的所有CDR区中改变不超过4个、或不超过3个、或不超过2个氨基酸。如将认识到的，因此可以从亲和力成熟过程中分离出具有改善的结合特征的多种结合物。
最典型地，scFv肽或类似构建体中的VH区段和VL区段经由接头或间隔子偶联，该接头或间隔子典型地为5-40个氨基酸、优选地10-30个氨基酸、更优选地20-30个氨基酸。在一些实施例中，接头可以偶联VH区段的N端和VL区段的C端。在其他实施例中，接头可以偶联VL区段的N端和VH区段的C端。诸位发明人进一步考虑到，优选接头的富含甘氨酸的序列(例如(G4S)n，其中n在1-5之间；等等)以在VH区段和VL区段之间提供结构柔性。还考虑到接头包括一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基以增加scFv肽、重组抗体或其片段的溶解性。有许多本领域已知的接头和制备scFv的方法，并且所有这样的已知方法均被认为适合在本文中使用。
另外，scFv肽可包括多个VH区段和VL区段以形成二价或多价scFv。在一些实施例中，多个VH区段和/或VL区段可以具有相同的氨基酸序列(例如，具有三个VH区段和三个VL区段的多价scFv，并且所有VH区段具有相同的VH结构域且所有VL区段都具有相同的VL结构域)。在其他实施例中，VH区段和/或VL区段中的至少两个可以具有不同的氨基酸序列(例如，具有三个VH区段和三个VL区段的多价scFv，并且VH区段中的两个是相同的VH结构域且VH区段中的一个是不同的，并且VL区段中的两个是相同的VL结构域且VH区段中的一个是不同的)。
优选地，在25℃至37℃之间的温度下测量并在5.5-7.5之间的pH范围内测量的scFv、重组抗体或其片段对CTLA-4(72-mer和77-mer IL-8中的至少一种)的结合亲和力(Kd)为至少小于1x10-7M、优选小于1x10-8M、并且更优选小于1x10-9M。诸位发明人考虑到，即使使用相同氨基酸序列的VH区段和/或VL区段产生scFv、重组抗体或其片段，由于结构差异，scFv、重组抗体或其片段对CTLA-4的结合亲和力也可能不同。例如，表1-4提供了不同scFv克隆的不同亲和力(以KD值测量)，而表5显示了不同重组抗体(IgG1)克隆的不同亲和性(以KD值测量)。
进一步考虑到scFv肽(或抗体或其片段的VH区段和VL区段)可以由单个重组核酸编码。在这样的实施例中，重组核酸包括至少两个核酸区段：编码本发明主题的VH区段的第一核酸区段和编码本发明主题的VL区段的第二核酸区段。然而，还考虑到第一核酸区段和第二核酸区段分别编码与SEQ ID NO.1-59中的任一个具有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性的VH区段和VL区段。最优选地，该两个核酸区段在同一阅读框中，使得两个核酸区段可以翻译成具有两个肽区段的单个蛋白。
另外，重组核酸可在第一核酸区段和第二核酸区段之间包括编码接头肽(优选富G肽或其他柔性接头肽)的第三核酸区段，该接头肽典型地为5-40个氨基酸、优选10-30个氨基酸、更优选20-30个氨基酸。在该实施例中，尤其优选该三个核酸区段在同一阅读框中，使得三个核酸区段可以翻译成具有三个肽区段的单个蛋白。
另一方面，在CTLA-4结合分子是抗体(例如IgG)的情况下，可以将如本文提出的VH区段和VL区段编码在单个重组双顺反子构建体上，或者可以将这些区段编码两个单独的构建体上。最典型地，编码VH结构域的核酸还将在框中编码一个或多个CH结构域(例如，在IgG的情况下为CH1-CH2-CH3)。最典型地，编码VL结构域的核酸还将在框中编码一个CH结构域(例如，在IgG的情况下为CL)。最典型地，重链和轻链的恒定结构域将是人源化的，但其他哺乳动物序列也被认为是适当的。此外，应当认识到，重组核酸将优选(但不一定)具有针对表达抗体的细胞优化的密码子使用。
诸位发明人进一步考虑到，scFv肽、抗体或其片段可被配制成药物组合物，以便可以将其施用给患有肿瘤的患者以降低或抑制CTLA-4引起的信号传导及伴随的免疫抑制。因此，考虑到对于治疗性配制品，可以以每剂量单位至少1ml、优选至少5ml、更优选且至少20ml的量，将scFv肽、抗体或其片段配制在任何药学上可接受的载体中(例如，配制成无菌可注射组合物)。然而，可替代配制品也被认为适用于本文，并且本文考虑所有已知的施用途径和方式。如本文所用，术语“施用”是指本文所考虑到的化合物和组合物的直接和间接施用，其中直接施用典型地由医疗保健专业人员(例如，医师、护士等)进行，而间接施用典型地包括提供或制备医疗保健专业人员可用的化合物和组合物以便直接施用的步骤。在一些实施例中，经由全身注射施用药物配制品，该全身注射包括皮下、真皮下注射或静脉内注射。在其他实施例中并且如下文更详细显示，考虑经由肿瘤内注射施用配制品。
包括scFv肽、抗体或其片段(包括上述VH和VL区段)的药物组合物的一种示例性方法和用途是减少靶组织或靶细胞中CTLA-4介导的效应。如本文所用，CTLA-4介导的效应是指由CTLA-4在组织或组织的微环境中的活性直接或间接诱导的任何生物学结果。最典型的是，该效应可作为可在肿瘤微环境中增强或观察到的T细胞活性(并且尤其是T细胞和NK细胞的细胞毒性细胞杀伤)的降低而观察到。从不同的角度看，体内IL-8介导的效应的降低也可以通过生理现象进行观察。例如，经由减少或消除肿瘤生长，通过肿瘤收缩、肿瘤细胞凋亡或坏死，可以观察到CTLA-4信号传导减少。类似地，患者中尤其是肿瘤微环境中CTLA-4信号传导的减少将减少肿瘤产生局部或远处转移的倾向。
关于向患者施用药物组合物的剂量和方案，考虑剂量和/或方案可以根据肽的类型(例如，scFv、抗体、抗体片段、那些中的任何两种的组合、全部的组合等)、疾病的类型和预后(例如，肿瘤类型、大小、位置)、患者的健康状况(例如，包括年龄、性别等)改变。虽然可以改变，但是可以选择和调整剂量和方案，使得配制品不会对宿主正常细胞产生任何显著的毒性作用，但足以在少于3小时、6小时、12小时、24小时、72小时或一周内使肿瘤微环境中的CTLA-4效应减少至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、最优选至少50％。例如，在CTLA-4结合物是抗体的情况下，该抗体的合适剂量可以是0.1mg-1.0mg、或1.0mg-5.0mg、或5.0mg-10.0mg、或10mg-50mg、或50mg-100mg/施用。
另外，诸位发明人考虑到scFv、抗体或其片段针对CTLA-4的效应可以通过一种或多种癌症药品的共同施用而加强。癌症药品包括但不限于氟维司群(Fulvestrant)、阿多柔比星(Aldoxorubicin)、多西紫杉醇(Docetaxel)、肿瘤坏死治疗剂(例如131I-chTNT-3等)、阿维单抗(Avelumab)(阻断PD-L1与其受体之间的相互作用的人单克隆IgG1抗体)、Brachyury靶向疫苗(例如ETBX-051(Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury))、Her2靶向疫苗(例如ETBX-021等)、MUC-1靶向疫苗(例如，ETBX-061(Ad5[E1-、E2b-]-MUC1)和酵母疫苗(例如GI-4000(GI-4014、GI-4015、GI-4016、GI-4020)、GI-6207、GI-6301)、以及针对肿瘤特异性新表位的基于腺病毒或酵母的疫苗。这些癌症药品的示例性详情在PCT/US17/40297中描述，将该文献作为参考以其全文并入本文。
在希望的情况下，也可以将CTLA-4结合剂与基于细胞的治疗共同施用(同时或相隔一天或多天)，并且尤其优选的基于细胞的治疗包括使用NK细胞和/或T细胞的输注。当然，应当理解，这样的细胞可以经基因修饰以表达一种或多种重组分子，从而增加靶标特异性肿瘤细胞杀伤。
在尤其优选的方面，这样的修饰的NK细胞或T细胞可以经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，NK细胞或T细胞的CAR可靶向一种或多种癌症或肿瘤特异性抗原，同时在尤其考虑的实施例中由NK细胞或T细胞表达的CAR将靶向CTLA-4。总体来说，注意到合适的CAR包含与至少一个细胞内信号传导结构域连接的单链可变片段(scFv)。scFv识别并结合靶细胞上的抗原(例如抗原或CTLA-4)，并触发效应细胞激活。在大多数情况下，信号传导结构域含有免疫受体酪氨酸激活结构域(ITAM)，其对通过受体的细胞内信号传导非常重要。合适的CAR包括可以在多种细胞、并且尤其是T细胞和NK细胞中表达的第一代、第二代和第三代CAR。
第一代CAR将典型地含有一个胞质信号传导结构域。例如，T细胞中第一代CAR的一个版本可以包括来自Fcε受体γ(FcεRIγ)的信号传导结构域，其含有一个ITAM，而另一版本可以含有来自CD3ζ的信号传导结构域，其含有三个ITAM。第二代CAR典型地使用CD28作为与CD3ζ一起的最常见的细胞内共刺激结构域。可替代地，第二代CAR也可以掺入与CD3ζ一起的4-1BB细胞内信号传导结构域。第三代CAR将典型地包括CD3ζ、CD28和4-1BB细胞内信号传导结构域。对于另外的第三代CAR，还参见WO 2016/201304和WO 2018/076391。
实例
经由表面等离子体共振(SPR)进行选择的scFv分子对人CTLA-4的亲和力。更特别地，使用Pioneer FE仪器在25℃下测量scFv与重组CTLA-4蛋白之间的结合亲和力。简言之，将生物素化的抗FLAG M2抗体固定在用中性抗生物素蛋白(neutravidin)包被的PCH生物传感器(分子装置公司(Molecular Devices)/颇尔富迪生物公司(ForteBio))上。用传感器上的抗FLAG M2捕获加3xFLAG标签的scFv，并使用一步法注射用重组人CTLA-4蛋白测量结合亲和力。选择的scFv的示例性结果显示在下面的表1和2中。在下面的表1-4的克隆命名中，应注意，scFv的克隆包括具有如所指示的SEQ ID NO的VH结构域和VL结构域两者。
表1
表2
类似地，经由表面等离子体共振(SPR)进行选择的scFv分子对鼠CTLA-4的亲和力。更特别地，使用Pioneer FE仪器在25℃下测量scFv与重组CTLA-4蛋白之间的结合亲和力。简言之，将生物素化的抗FLAG M2抗体固定在用中性抗生物素蛋白包被的PCH生物传感器(分子装置公司/颇尔富迪生物公司)上。用传感器上的抗FLAG M2捕获加3xFLAG标签的scFv，并使用一步法注射用重组小鼠CTLA-4蛋白测量结合亲和力。选择的scFv的示例性结果显示在下面的表3和4中。
表3
表4
在另外的实验中，将选择的VH和VL结构域移植到人IgG支架中，并在25℃或37℃下通过SPR(Pioneer FE)或Octet(Red96e)进行KD确定。表5中显示的所有值均为x 10-9M。使用抗人Fc抗体(SPR)或AHC传感器(Octet)在芯片表面上捕获抗体。人或小鼠CTLA-4是如在表5中指示的分析物。
表5
诸位发明人使用人CTLA-4/人CD80或小鼠CTLA-4/小鼠CD80进一步研究了通过BLI阻断CD80/CTLA4复合的抗体(IgG1)。此处，使用Octet Red96e仪器测试αCTLA-4抗体阻断CD80与CTLA-4结合的能力。简言之，将生物素化的CTLA-4固定在SA生物传感器(分子装置公司/颇尔富迪生物公司)上。然后使用10μg/mL(67nM)的αCTLA-4加载CTLA-4包被的生物传感器。最后，使用250nM的CD80测试在αCTLA-4抗体存在下与CTLA-4的结合，并且示例性结果显示在图1中。
在上面的体外研究之后，诸位发明人接着开始进行各种体内实验以研究选择的IgG构建体的抗肿瘤活性。特别地，诸位发明人使用酵母裂解物(pTK170，表达肿瘤特异性新表位的酵母)、抗OX40抗体和如所显示的选择的抗CTLA-4抗体在B16F10小鼠肿瘤模型中测试了肿瘤内免疫。使用了四组动物：1.PBS；2.pTK170+aOX40+a-CTLA4-7(SEQ ID NO：68、SEQID NO：69)；3.pTK170+aOX40+a-CTLA4-8(SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71)；以及4.pTK170+aOX40+a-CTLA4-9H10。pTK170酵母的施用剂量为5YU/注射，并且将抗OX40和抗CTLA4以100ug/注射施用。
肿瘤体积的示例性结果显示在图2A-2D中，并且动物的卡普兰-梅尔图在图2E中提供。如可以容易地看到的，与PBS(图2A)相比，所有抗CTLA4组(图2B-2D)显著降低了经治疗和未治疗的肿瘤的肿瘤生长。在100ug剂量下，克隆7、8和9H10之间尚没有统计学上的显著差异。未注射的肿瘤体积显示在图3A-3D中，其中图3A是PBS对照，并且图3B-3D显示使用抗CTLA4化合物的治疗。图3E中提供了动物的对应卡普兰-梅尔图。
在一些实施例中，用于描述和要求保护本发明某些实施例的表达成分、特性(如浓度)、反应条件等的量的数字应被理解为在一些情况下由术语“约”来修饰。因此，在一些实施例中，书面说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据特定实施例寻求获得的希望的特性而变化。本文中对值的范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非在本文中另有说明，否则将每个单独的值并入说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。
如本文所用，术语“施用”药物组合物或药物是指直接和间接施用药物组合物或药物，其中直接施用药物组合物或药物典型地通过健康护理专业人员(例如，医师、护士等)进行，并且其中间接施用包括向健康护理专业人员提供药物组合物或药物或使健康护理专业人员可用药物组合物或药物以用于直接施用(例如，经由注射、输注、口服递送、局部递送等)的步骤。还应注意，术语“预后”或“预测”病症、疾病发展的易感性或对预期治疗的应答旨在涵盖进行预测或预测病症、易感性和/或应答(包括受试者中病症的进展速度、改善和/或持续时间)的行为(但不包括治疗行为或诊断行为)。
除非在本文中另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法能以任何合适顺序进行。关于本文某些实施例提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对原本要求保护的本发明范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应当被解释为指示任何未要求保护的要素是实践本发明所必需的。
如本文的说明书和随后的整个权利要求书中所用，“一个/一种(a、an)”以及“该/这些(the)”的含义包括复数参照物，除非上下文清楚地另外指明。此外，如本文的说明书中所用，“在......中(in)”的含义包括“在......中(in)”和“在......上(on)”，除非上下文清楚地另外指明。还如本文中所用，并且除非上下文另外指明，否则术语“偶联到”旨在包括直接偶联(其中两个彼此偶联的要素彼此接触)和间接偶联(其中至少一个另外的要素位于两个要素之间)两者。因此，术语“偶联到”和“与......偶联”同义使用。
对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，本发明主题仅受限于所附权利要求书的范围。此外，在解释本说明书和权利要求书时，所有术语都应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地，术语“包含/包括(comprises和comprising)”应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在本说明书的权利要求提及选自由A、B、C......和N组成的组的某物中的至少一种的情况下，该文本应当被解释为仅需要该组中的一种要素，而不是A加N或B加N等。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种单链可变片段(scFv)肽，该肽包含：
包含第一氨基酸序列的VH区段和/或包含第二氨基酸序列的VL区段，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、46、48、49、51、54、56和58组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、47、50、53、55、57和59组成的组。
2.如权利要求1所述的肽，其中该VH区段和VL区段用接头肽偶联。
3.如权利要求2所述的肽，其中该接头肽是富含甘氨酸的肽。
4.如前述权利要求中任一项所述的肽，其中该肽存在于药理学上可接受的载体中。
5.如权利要求1-3中任一项所述的肽，该肽进一步包含至少两对VH区段和VL区段，其中该至少两对经连接形成多价scFv。
6.一种抗体，该抗体包含：
包含第一氨基酸序列的重链和/或包含第二氨基酸序列的轻链，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.60、61、62、64、65、66、68和70组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ IDNO.63、67、69和71组成的组。
7.如权利要求6所述的抗体，该抗体包含：包含该第一氨基酸序列的重链和包含该第二氨基酸序列的轻链，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.60、61、62、64、65、66、68和70组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.63、67、69和71组成的组。
8.一种抗体，该抗体包含：包含SEQ ID NO.68的第一氨基酸序列的重链和包含SEQ IDNO.69的第二氨基酸序列的轻链、或包含SEQ ID NO.70的第一氨基酸序列的重链和包含SEQID NO.71的第二氨基酸序列的轻链。
9.一种用于治疗患有癌症的患者的药物组合物，该药物组合物包含：
如权利要求1-3中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽或如权利要求6-8中任一项所述的抗体；并且
其中该单链可变片段(scFv)肽或该抗体存在于药理学上可接受的载体中。
10.一种诊断组合物，该诊断组合物包含：
如权利要求1-3中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽或如权利要求6-8中任一项所述的抗体；并且
其中该单链可变片段(scFv)肽或该抗体进一步包含可检测标记。
11.一种重组核酸，该重组核酸包含：
编码第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列的第一核酸区段，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、46、48、49、51、54、56和58组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、47、50、53、55、57和59组成的组；并且
其中该第一区段和第二区段任选地存在于同一阅读框中。
12.一种重组核酸，该重组核酸包含：
编码第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列的第一核酸区段，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.60、61、62、64、65、66、68和70组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ IDNO.63、67、69和71组成的组；并且
其中该第一区段和第二区段任选地以双顺反子排列。
13.一种重组核酸，该重组核酸包含：
编码SEQ ID NO.68的第一氨基酸序列的第一核酸区段和编码SEQ ID NO.69的第二氨基酸序列的第二核酸区段、或
编码SEQ ID NO.70的第一氨基酸序列的第一核酸区段和编码SEQ ID NO.71的第二氨基酸序列的第二核酸区段。
14.如权利要求11所述的重组核酸，该重组核酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的至少一部分的编码多肽的第三区段，其中当在细胞中表达时，该CAR具有包含该第一核酸区段和/或第二核酸区段的抗原结合胞外域。
15.如权利要求11所述的重组核酸，该重组核酸进一步包含编码N-803或TxM的至少一部分的编码多肽的第三区段，其中当在细胞中表达时，该N-803或TxM具有包含该第一核酸区段和/或第二核酸区段的抗原结合结构域。
16.一种重组细胞，该重组细胞包含如权利要求11-15中任一项所述的重组核酸。
17.如权利要求16所述的重组细胞，其中该细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。
18.如权利要求16所述的重组细胞，其中该细胞是CHO细胞或EC7细胞。
19.一种减少细胞或组织中CTLA-4介导的效应的方法，该方法包括：
使该细胞或组织与如权利要求1-3中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽或如权利要求6-8中任一项所述的抗体以减少该细胞或组织中CTALA-4介导的效应的量接触。
20.一种治疗患有肿瘤的患者的方法，该方法包括：
向该患者施用药物组合物，该药物组合物包含
如权利要求1-3中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽、或
如权利要求6-8中任一项所述的抗体；并且
其中将该药物组合物以有效治疗该肿瘤的剂量和方案向该患者施用。
21.一种降低患有肿瘤的患者的免疫抑制的方法，该方法包括：
向该患者施用药物组合物，该药物组合物包含
如权利要求1-3中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽、或
如权利要求6-8中任一项所述的抗体；并且
其中将该药物组合物以有效降低肿瘤微环境中的免疫抑制的剂量和方案向该患者施用。
22.如权利要求1-3中任一项所述的单链可变片段(scFv)用于在患有肿瘤的患者中治疗癌症和/或降低免疫抑制的用途。
23.如权利要求6-8中任一项所述的抗体用于在患有肿瘤的患者中治疗癌症和/或降低免疫抑制的用途。
24.如权利要求16所述的重组细胞用于在患有肿瘤的患者中治疗癌症和/或降低免疫抑制的用途。
25.如权利要求1-3中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽、或如权利要求6-8中任一项所述的抗体在医学中的用途。
26.一种单链可变片段(scFv)肽，该肽包含：
包含第一氨基酸序列的VH区段和包含第二氨基酸序列的VL区段，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、38、40、42、44、46、48、51、54、56和58组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、47、50、53、55、57和59组成的组；从而产生选自由73-2、74-1、78-1、78-2、78-5、78-8、78-13、78-19、78-24、78-28、78-36、78-39、78-8D2、78-8D4、78-8D5、78-8D6、78-8D7、78-8D10、78-8D14、78-8D22、78-24D1、78-24D4、78-24D8、78-24D9、78-24D12、78-24D14、78-24D17和78-24D22组成的组的scFv。
27.如权利要求26所述的scFv肽，其中该VH区段和VL区段用接头肽偶联。
28.如权利要求26所述的scFv肽，其中该接头肽是富含甘氨酸的肽。
29.如权利要求26所述的scFv肽，其中该肽存在于药理学上可接受的载体中。
30.如权利要求26所述的scFv肽，该肽进一步包含至少两对VH区段和VL区段，其中该至少两对经连接形成多价scFv。
31.一种抗体，该抗体包含：
包含第一氨基酸序列的重链和包含第二氨基酸序列的轻链，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.60、61、62、64、65和66组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.63和67组成的组，从而产生选自由αCTLA4-1、αCTLA4-2、αCTLA4-3、αCTLA4-7、αCTLA4-8和αCTLA4-9组成的组的抗体。
32.一种用于治疗患有癌症的患者的药物组合物，该药物组合物包含：
如权利要求26-30中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽或如权利要求31所述的抗体；并且
其中该单链可变片段(scFv)肽或该抗体存在于药理学上可接受的载体中。
33.一种诊断组合物，该诊断组合物包含：
如权利要求26-30中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽或如权利要求31所述的抗体；并且
其中该单链可变片段(scFv)肽或该抗体进一步包含可检测标记。
34.一种重组核酸，该重组核酸包含：
编码第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的第一核酸区段，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、38、40、42、44、46、48、51、54、56和58组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、47、50、53、55、57和59组成的组；其中该重组核酸选自由序列73-2、74-1、78-1、78-2、78-5、78-8、78-13、78-19、78-24、78-28、78-36、78-39、78-8D2、78-8D4、78-8D5、78-8D6、78-8D7、78-8D10、78-8D14、78-8D22、78-24D1、78-24D4、78-24D8、78-24D9、78-24D12、78-24D14、78-24D17和78-24D22组成的组；并且
其中该第一区段和第二区段任选地存在于同一阅读框中。
35.一种重组核酸，该重组核酸包含：
编码第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的第一核酸区段，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.60、61、62、64、65和66组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.63和67组成的组；其中该重组核酸编码包含抗体的肽，该抗体选自由αCTLA4-1、αCTLA4-2、αCTLA4-3、αCTLA4-7、αCTLA4-8和αCTLA4-9组成的组；并且其中该第一区段和第二区段任选地以双顺反子排列。
36.如权利要求34所述的重组核酸，该重组核酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的至少一部分的编码多肽的第三区段，其中当在细胞中表达时，该CAR具有包含该第一核酸区段和/或第二核酸区段的抗原结合胞外域。
37.如权利要求34所述的重组核酸，该重组核酸进一步包含编码N-803或TxM的至少一部分的编码多肽的第三区段，其中当在细胞中表达时，该N-803或TxM具有包含该第一核酸区段和/或第二核酸区段的抗原结合结构域。
38.一种重组细胞，该重组细胞包含如权利要求34-37中任一项所述的重组核酸。
39.如权利要求38所述的重组细胞，其中该细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。
40.如权利要求38所述的重组细胞，其中该细胞是CHO细胞或EC7细胞。
41.一种减少细胞或组织中CTLA-4介导的效应的方法，该方法包括：
使该细胞或组织与如权利要求26-30中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽或如权利要求31所述的抗体以减少该细胞或组织中CTLA-4介导的效应的量接触。
42.一种治疗患有肿瘤的患者的方法，该方法包括：向该患者施用药物组合物，该药物组合物包含
如权利要求26-30中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽或如权利要求31所述的抗体；并且
其中将该药物组合物以有效治疗该肿瘤的剂量和方案向该患者施用。
43.一种降低患有肿瘤的患者的免疫抑制的方法，该方法包括：向该患者施用药物组合物，该药物组合物包含
如权利要求26-30中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽或如权利要求31所述的抗体；并且
其中将该药物组合物以有效降低肿瘤微环境中的免疫抑制的剂量和方案向该患者施用。
44.如权利要求26-30中任一项所述的单链可变片段(scFv)用于在患有肿瘤的患者中治疗癌症和/或降低免疫抑制的用途。
45.如权利要求31所述的抗体用于在患有肿瘤的患者中治疗癌症和/或降低免疫抑制的用途。
46.如权利要求38所述的重组细胞用于在患有肿瘤的患者中治疗癌症和/或降低免疫抑制的用途。
47.如权利要求26-30中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽或如权利要求31所述的抗体在医学中的用途。
Claims (25)
1.一种单链可变片段(scFv)肽，该肽包含：
包含第一氨基酸序列的VH区段和/或包含第二氨基酸序列的VL区段，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、46、48、49、51、54、56和58组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、47、50、53、55、57和59组成的组。
2.如权利要求1所述的肽，其中该VH区段和VL区段用接头肽偶联。
3.如权利要求2所述的肽，其中该接头肽是富含甘氨酸的肽。
4.如前述权利要求中任一项所述的肽，其中该肽存在于药理学上可接受的载体中。
5.如前述权利要求中任一项所述的肽，该肽进一步包含至少两对VH区段和VL区段，其中该至少两对经连接形成多价scFv。
6.一种抗体，该抗体包含：
包含第一氨基酸序列的重链和/或包含第二氨基酸序列的轻链，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.60、61、62、64、65、66、68和70组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ IDNO.63、67、69和71组成的组。
7.如权利要求6所述的抗体，该抗体包含：包含该第一氨基酸序列的重链和包含该第二氨基酸序列的轻链，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.60、61、62、64、65、66、68和70组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.63、67、69和71组成的组。
8.一种抗体，该抗体包含：包含SEQ ID NO.68的第一氨基酸序列的重链和包含SEQ IDNO.69的第二氨基酸序列的轻链、或包含SEQ ID NO.70的第一氨基酸序列的重链和包含SEQID NO.71的第二氨基酸序列的轻链。
9.一种用于治疗患有癌症的患者的药物组合物，该药物组合物包含：
如权利要求1-5中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽或如权利要求6-8中任一项所述的抗体；并且
其中该单链可变片段(scFv)肽或该抗体存在于药理学上可接受的载体中。
10.一种诊断组合物，该诊断组合物包含：
如权利要求1-5中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽或如权利要求6-8中任一项所述的抗体；并且
其中该单链可变片段(scFv)肽或该抗体进一步包含可检测标记。
11.一种重组核酸，该重组核酸包含：
编码第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列的第一核酸区段，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、46、48、49、51、54、56和58组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、47、50、53、55、57和59组成的组；并且
其中该第一区段和第二区段任选地存在于同一阅读框中。
12.一种重组核酸，该重组核酸包含：
编码第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列的第一核酸区段，该第一氨基酸序列选自由SEQ ID NO.60、61、62、64、65、66、68和70组成的组，该第二氨基酸序列选自由SEQ IDNO.63、67、69和71组成的组；并且
其中该第一区段和第二区段任选地以双顺反子排列。
13.一种重组核酸，该重组核酸包含：
编码SEQ ID NO.68的第一氨基酸序列的第一核酸区段和编码SEQ ID NO.69的第二氨基酸序列的第二核酸区段、或
编码SEQ ID NO.70的第一氨基酸序列的第一核酸区段和编码SEQ ID NO.71的第二氨基酸序列的第二核酸区段。
14.如权利要求11所述的重组核酸，该重组核酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的至少一部分的编码多肽的第三区段，其中当在细胞中表达时，该CAR具有包含该第一核酸区段和/或第二核酸区段的抗原结合胞外域。
15.如权利要求11所述的重组核酸，该重组核酸进一步包含编码N-803或TxM的至少一部分的编码多肽的第三区段，其中当在细胞中表达时，该N-803或TxM具有包含该第一核酸区段和/或第二核酸区段的抗原结合结构域。
16.一种重组细胞，该重组细胞包含如权利要求11-15中任一项所述的重组核酸。
17.如权利要求16所述的重组细胞，其中该细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。
18.如权利要求16所述的重组细胞，其中该细胞是CHO细胞或EC7细胞。
19.一种减少细胞或组织中CTLA-4介导的效应的方法，该方法包括：
使该细胞或组织与如权利要求1-5中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽或如权利要求6-8中任一项所述的抗体以减少该细胞或组织中CTALA-4介导的效应的量接触。
20.一种治疗患有肿瘤的患者的方法，该方法包括：
向该患者施用药物组合物，该药物组合物包含
如权利要求1-6中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽、或
如权利要求6-8中任一项所述的抗体、或
如权利要求16-17中任一项所述的重组细胞；并且
其中将该药物组合物以有效治疗该肿瘤的剂量和方案向该患者施用。
21.一种降低患有肿瘤的患者的免疫抑制的方法，该方法包括：
向该患者施用药物组合物，该药物组合物包含
如权利要求1-6中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽、或
如权利要求6-8中任一项所述的抗体、或
如权利要求16-17中任一项所述的重组细胞；并且
其中将该药物组合物以有效降低肿瘤微环境中的免疫抑制的剂量和方案向该患者施用。
22.如权利要求1-5中任一项所述的单链可变片段(scFv)用于在患有肿瘤的患者中治疗癌症和/或降低免疫抑制的用途。
23.如权利要求6-8中任一项所述的抗体用于在患有肿瘤的患者中治疗癌症和/或降低免疫抑制的用途。
24.如权利要求16-17中任一项所述的重组细胞用于在患有肿瘤的患者中治疗癌症和/或降低免疫抑制的用途。
25.如权利要求1-6中任一项所述的单链可变片段(scFv)肽、或如权利要求6-8中任一项所述的抗体、或如权利要求16-17中任一项所述的重组细胞在医学中的用途。
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