CN117624355A

CN117624355A - 一种抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN117624355A
Application number: CN202311626890.2A
Authority: CN
Inventors: 扈晓敏; 柳孟姣; 钮倩; 吴娜; 王剑; 任琪; W·付; 张杨
Original assignee: WUXI ORIGENE BIO-TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: WUXI ORIGENE BIO-TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2023-11-30
Filing date: 2023-11-30
Publication date: 2024-03-01
Anticipated expiration: 2043-11-30

Abstract

本申请属于免疫检测技术领域，公开了一种抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体及其应用。本申请提供的抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体，包含轻链可变区和重链可变区，轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3依次分别包含如SEQ ID NO:3‑5所示的氨基酸序列，重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3依次分别包含如SEQ ID NO:6‑8所示的氨基酸序列。本申请的兔单克隆抗体可与人乙酰化tau274蛋白高特异性结合，采用本申请的抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体通过双抗体夹心ELISA检测人乙酰化tau274标准抗原，检测灵敏度小于78pg/ml。

Description

一种抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体及其应用

技术领域

本申请涉及免疫检测技术领域，具体涉及抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体及其应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，属于中枢神经系统变性病，临床标间为记忆功能的进行性衰退、认知功能障碍、语言及社交功能减退，乃至人格改变及生活能力丧失等，最终会导致死亡。典型的组织病理学改变为β-淀粉样蛋白(Aβ)的沉积导致老年斑，Tau蛋白异常磷酸化引起的神经纤维缠结，神经元和突触的丢失。

Tau蛋白在正常的神经元中主要富集于神经元轴突周围，具有促进微管组装和维持微管稳定的功能。在AD发病过程中，微管结构发生变化，微管结构的完整性遭到破坏，促使微管蛋白的解离，稳定性受到破坏。而与微管结合的tau蛋白也发生变化，以过度磷酸化tau蛋白为主要组成成分的神经纤维缠结是AD的一个重要病理特征，同时，tau蛋白其他性形式的翻译后修饰，如乙酰化也会直接或间接调节该蛋白的构象和功能，与tau蛋白相关的神经退行性疾病的发生和发展有一定的关联。乙酰化是发生在蛋白质赖氨酸侧链氨基上的一种翻译后修饰，而蛋白质的乙酰化/去乙酰化主要受组蛋白乙酰基转移酶/赖氨酸乙酰基转移酶及组蛋白去乙酰化酶/赖氨酸去乙酰化酶的调控。相关研究表明，tau蛋白的乙酰化能加剧该蛋白本身磷酸化程度，tau蛋白的乙酰化和磷酸化之间存在一定的关联。

近期有研究表明，tau蛋白可以在多个位点被乙酰化修饰，在AD的早期阶段，tau蛋白在K274和K281位点的乙酰化明显增加，在严重痴呆的晚期AD患者的大脑中更为显著，tau蛋白在K274/K281位点的乙酰化(TauKQ)具有比野生型tau和非乙酰化tau更严重的神经毒性。Tau蛋白通过减少线粒体的生物发生，扰乱线粒体的动态平衡，导致线粒体功能失调，从而加重认知功能障碍。在小鼠中也证明，tau蛋白在K274/K281位点的乙酰化会导致小鼠学习记忆障碍加重，神经元丢失，树突棘减少，神经元的树突复杂度降低。可见，乙酰化tau274蛋白明显参与到阿尔茨海默病的发病过程，那么对tau蛋白乙酰化位点274的检测就显得尤为重要，实现人乙酰化tau274的检测，能够更好地在整个临床进程中对阿尔茨海默病的筛查和诊断。

因此，亟需能够对人乙酰化tau274实现灵敏度高、特异性强、亲和力高的抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体及检测方法。

发明内容

为了克服上述技术问题，本申请提供了一种灵敏度高、特异性强、亲和力高的抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体，以及该抗体在双抗体夹心ELISA免疫检测试剂盒中的应用，为与人乙酰化tau274相关的阿尔兹海默症、老年痴呆提供辅助诊断，为疾病早期诊断、及时干预和治疗争取有效时间。

第一方面，本申请提供了一种抗人乙酰化tau274的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区；

所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括LCDR1-3，所述LCDR1、LCDR2、LCDR3依次分别包含如SEQ ID NO:3-5所示的氨基酸序列，所述重链可变区包括HCDR1-3，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3依次分别包含如SEQ ID NO:6-8所示的氨基酸序列。

可选地，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，VL全长为108个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和10，LCDR的3个结构域氨基酸数分别为7、3和9，LCDR1、LCDR2和LCDR3的区域相应地分别为27aa-33aa，51aa-53aa和90aa-98aa，其氨基酸序列分别:QSVYSNW(SEQ ID NO:3)、DAS(SEQ ID NO:4)、QGEFTCSVA(SEQ ID NO:5)。

所述重链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，VH全长为109个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为24、17、36和11，HCDR的3个结构域氨基酸数分别为8、7和6，HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为25aa-32aa，50aa-56aa和93aa-98aa，其氨基酸序列分别为GFSLSNYA(SEQ ID NO.6)、ISSGGST(SEQ ID NO.7)、AGELGL(SEQ ID NO.8)。

第二方面，本申请还提供了编码第一方面中抗人乙酰化tau274的兔单克隆抗体的分离的多核苷酸。

第三方面，本申请还提供了一种重组表达载体，其含有本申请第二方面所述的多核苷酸。

第四方面，本申请还提供了含有第三方面所述的重组表达载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

第五方面，本申请还提供了第一方面所述的兔单克隆抗体在制备检测人乙酰化tau274蛋白的免疫检测产品中的应用。

可选地，所述免疫检测产品为检测试剂盒、芯片或检测试纸。

可选地，所述检测试剂盒为双抗体夹心ELISA检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。

第六方面，本申请还提供了一种检测人乙酰化tau274的免疫检测产品，所述免疫检测产品包括本申请第一方面所述的兔单克隆抗体。

相对于现有技术而言，本申请的抗人乙酰化tau274的兔单克隆抗体可以特异性识别tau蛋白中274位赖氨酸(K)乙酰化位点表位，同时与人乙酰化tau274蛋白具有高亲和力，其亲和常数Ka可达7.2×10⁸L/mol。本申请的抗人乙酰化tau274的兔单克隆抗体还可以制备成检测磷酸化tau274的各种免疫检测试剂盒，应用于双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中，通过双抗体夹心ELISA检测人乙酰化tau274标准抗原，检测灵敏度小于78pg/ml。

附图说明

图1为兔单克隆抗体OTIR5F4重链和轻链全长扩增产物的电泳图，M为DNA分子量Marker。

图2为间接夹心ELISA法检测人乙酰化tau274多肽、非磷酸化tau274多肽、人乙酰化tau274全长蛋白以及非磷酸化全长tau蛋白样本，纵坐标为检测的OD值。

图3为双抗体夹心ELISA法检测人乙酰化tau274标准抗原，横坐标为人乙酰化tau274标准抗原浓度(ng/ml)，纵坐标为检测的OD值。标准曲线的R²＝0.99，线性检测范围0-10000pg/mL，推出样品浓度计算公式：y＝0.0003x+0.1528。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体的制备

1)人乙酰化tau274免疫原的制备

根据tau蛋白(NP_005901.2)(2N4R变体)1-441aa序列设计免疫原多肽，多肽序列在260-290aa，多肽纯度在90％以上，达到了制备单抗的纯度要求。多肽由第三方中肽生化有限公司合成。

2)动物免疫

上述合成的人乙酰化tau274多肽以1:1的体积比用完全弗氏佐剂乳化，采用皮下注射方法免疫2kg左右的新西兰大白兔，免疫剂量为800μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂以1:1的体积比乳化，免疫剂量为400μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；依据ELISA效价128000时的OD450大于1.0为标准，根据结果判定是否收集PBMCs或是继续免疫，选取抗体效价最高的兔子进行PBMCs收集。

3)PBMCs分离、特异性B细胞分选、克隆重组

将兔仰卧固定在手术台上，将心脏部位被毛减掉，用酒精消毒皮肤，选择心搏最明显处用50ml注射器穿刺，针头刺入心脏后即有血液涌入注射器，取得所需血量后迅速将针头拔出，将注射器中的全血转入无菌50ml管中，与等量的PBS混匀后逐滴缓慢的加入到淋巴细胞分离液上方，室温400×g离心30分钟，离心后，液面由上至下分为四层：黄色血浆层、白色薄膜层即单个核细胞层、分离液层及红细胞层，小心吸取单个核细胞层并用PBS洗涤去除血小板和淋巴细胞分离液后即可获得兔PBMCs。

从兔PBMCs中继续分选抗原特异性的B细胞进行培养，培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA板筛选阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA并反转录成cDNA，天然配对的兔单克隆抗体轻链、重链全长序列从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，通过克隆重组方法构建兔单克隆抗体表达载体，并经测序确定序列，扩增的全长PCR产物结果如图1。

4)单克隆抗体的制备和纯化

为了获得多株识别人乙酰化tau274蛋白的兔单克隆抗体，将兔单克隆抗体重链、轻链基因装载在表达载体上，将质粒转染KEK293细胞，转染120-144小时获得培养上清中含有重组的识别人乙酰化tau274蛋白的兔单克隆抗体。收取细胞悬液，离心取上清，亲和层析法进行抗体纯化。以BCA法测定纯化后的单抗浓度，再分装、冻干，将纯化后的抗体命名为兔单克隆抗体OTIR5F4。

实施例2抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体OTIR5F4的鉴定

1)兔单克隆抗体的特异性鉴定

采用间接ELSA法检测。以人乙酰化tau274多肽、非磷酸化tau274多肽、人乙酰化tau274全长蛋白以及非磷酸化全长tau蛋白包被酶标板，浓度为1μg/ml，4℃过夜，以含1％BSA的PBST封闭酶标板，加10⁴倍稀释的纯化后兔单克隆抗体OTIR5F4，37℃反应50min，PBST洗板3次，加HRP-羊抗兔Ig二抗，37℃反应50min，PBST洗板5次，加TMB显色10min，加终止液，酶标仪测A450。

图2结果显示，非磷酸化tau274多肽及非磷酸化全长tau蛋白与兔单克隆抗体OTIR5F4反应均为阴性，OD450均小于0.1；人乙酰化tau274多肽、人乙酰化tau274全长蛋白与OTIR5F4抗体反应呈阳性，OD450均大于1，说明本申请的抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体OTIR5F4特异性识别tau蛋白中274位赖氨酸(K)乙酰化位点表位。

2)兔单克隆抗体的亲和常数测定

采用非竞争ELISA法测定亲和常数(Ka)。

包被：用碳酸盐缓冲液稀释抗原至浓度为1、0.5、0.1、0.05μg/mL，按照100μL/孔加到96孔酶标板分别包被，4℃孵育24h；

封闭：用PBST洗板4次，按照200μL/孔加入BSA溶液，37℃孵育2h；

加单抗：用PBST洗板4次，用碳酸盐缓冲液将单抗OTIR5F4以100μg/mL开始倍比稀释，每孔加入100μL，37℃孵育2h；

加酶标二抗：用PBST洗板4次，每孔加入100μL的l:10000倍稀释的HRP酶标记的羊抗兔Ig二抗，37℃放置30min；

显色及终止：用PBST洗板4次，每孔加底物显色液100μL，37℃避光反应15min；每孔加入50μL 1.0mol/L的H₂SO₄终止液，终止反应；

检测：测定波长为450nm处的吸光度值(A450nm)。

以抗体浓度的对数为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制S型曲线，经计算，抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体OTIR5F4的亲和常数Ka＝7.2×10⁸L/mol。

3)抗体配对

为了挑选包被抗体和检测抗体的最佳组合，将三株纯化后的兔单克隆抗体OTIR1B11、OTIR1A10及OTIR5F4分别包被酶标板，4℃过夜。第二天取出酶标板，PBST洗涤一次，1％BSA溶液37℃封闭2小时，PBST洗涤3次；每孔加入人乙酰化tau274全长蛋白100μl，浓度为20ng/ml，37℃孵育1小时；孵育完成后取出酶标板，PBST洗涤3次，分别加入HRP标记的鼠单抗OTI9A5作为检测抗体，37℃孵育1小时。PBST洗涤5次，加入TMB底物，37℃显色10min。取出后加终止液，在酶标仪上测定OD450读数。根据样品的OD值与阴性对照的背景值，选出最为理想的兔单克隆抗体对，配对筛选结果见表1。

表1抗体配对实验筛选结果

可见，本申请涉及的抗体OTIR5F4作为包被抗体，鼠单抗OTI9A5作为检测抗体最佳。

实施例3兔单克隆抗体OTIR5F4可变区基因与氨基酸序列分析以OTIR5F4抗体的重组质粒为DNA模板，根据模板上轻链及重链5'端载体序列设计轻链可变区及重链可变区测序引物，采用测序仪ABI 3730进行测序。经测序获得兔单克隆抗体OTIR5F4轻链及重链可变区核苷酸序列。

利用互联网，在http://www.imgt.org上使用IMGT/V-QUEST分析软件，分别将轻链可变区与重链可变区的核苷酸序列进行测序结果数据分析，兔单克隆抗体OTIR5F4的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。VL全长为108个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和10，LCDR的3个结构域氨基酸数分别为7、3和9，LCDR1、LCDR2和LCDR3的区域相应地分别为27aa-33aa，51aa-53aa和90aa-98aa，其氨基酸序列分别:QSVYSNW(SEQ ID NO:3)、DAS(SEQ ID NO:4)、QGEFTCSVA(SEQ ID NO:5)。VH全长为109个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为24、17、36和11，HCDR的3个结构域氨基酸数分别为8、7和6，HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为25aa-32aa，50aa-56aa和93aa-98aa，其氨基酸序列分别为GFSLSNYA(SEQ ID NO.6)、ISSGGST(SEQ ID NO.7)、AGELGL(SEQ ID NO.8)。

实施例4抗人乙酰化tau274兔单克隆抗体OTIR5F4用于制备双抗体夹心ELISA检测试剂盒基于ELISA双抗体夹心法原理的检测技术，制作人乙酰化tau274检测试剂盒，用于临床上与人乙酰化tau274相关疾病辅助诊断。

一、试剂盒组成

1.包被OTIR5F4抗体的板条：用PBS缓冲液稀释抗体至1μg/ml，包被到微孔板上，每孔100μl，4℃孵育过夜，以PBST洗涤3次，甩干；加含有1％BSA、5％蔗糖、0.05％Proclin300的PBS进行封闭，37℃反应2h，弃去孔内封闭液，甩干；将包被板置于37℃烘箱2h，即完成包被，以铝箔袋密封，存放于4℃保存备用。

2.试剂配制

2.1酶结合物配制采用简易过碘酸钠法标记抗人非磷酸化tau蛋白鼠单克隆抗体OTI9A5，滴定工作浓度，配制成1:20的浓缩液，稀释液为含1％BSA、5％甘油、0.05％Proclin 300的PBS，过滤除菌。

2.2洗涤缓冲液为常规的pH7.4的PBST，含0.05％ Proclin300，配制成20倍浓缩液。

2.3酶的底物液(显色液)单组分TMB(从市场采购)。

2.4样本稀释液含1％BSA、0.05％ Proclin 300的PBS，过滤除菌。

2.5终止液用10ml HCl(36-38％)加入110ml蒸馏水中，混合过程需缓慢进行，配置成1N的HCl。

2.6标准品全长人乙酰化tau274蛋白，以含1％BSA、5％蔗糖、10％甘油、0.05％Proclin300的PBS为稀释液，将样品稀释为20μg/ml，过滤除菌，无菌分装。

二、检测操作要点

1.为保证检测结果的准确性，建议标准品及样本均设双孔测定。每次检测均需做标准曲线。

2.如标本中待测物质含量过高，请先用样本稀释液进行稀释，以使样本符合试剂盒的检测范围，最后计算时再乘以相应的稀释倍数。

3.加样：加样时，请使用一次性的洁净吸头，避免交叉污染。加样时应尽量轻缓，避免起泡，将样本加于酶标板孔底部，切勿沿孔壁加样。

4.温育：为防止样本蒸发或污染，温育过程中酶标板必须覆上板贴，实验过程中酶标板应避免处于干燥的状态。温育过程中应随时观察温箱温度是否恒定于37℃，及时调整。温育过程中，温箱不易开启太多次，以免影响温度平衡。

5.洗涤：洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

6.显色：为保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。可在加入底物溶液后每隔一段时间观察一下显色情况以控制反应时间(比如每隔10分钟)。当肉眼可见标准品前3-4孔有明显梯度蓝色，后3-4孔显色不明显时，即可加入终止液终止反应，此时蓝色立刻变为黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

7.底物溶液应为浅蓝色或无色，如果颜色严重变深则必须弃用。底物溶液易受污染，请避光妥善保存。

三、标准人乙酰化tau274蛋白不同稀释度标准曲线的确定

上述制备的检测人乙酰化tau274蛋白双抗体夹心ELISA检测试剂盒从4℃冰箱取出，平衡到室温。将标准品用PBS从20μg/ml稀释到10000pg/ml，制备成0、78、156、313、625、1250、2500、5000、10000pg/ml共9个系列浓度标准品，按照上述的检测方法在每孔中加入标准品100μl，进行温育，然后弃去液体，加入HRP标记的检测抗体工作液进行温育，弃去孔内液体，甩干后每孔加入底物溶液，避光显色后每孔加入终止溶液，在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度OD值做标准曲线，结果见表2。

表2双抗体夹心ELISA法检测人乙酰化tau274标准品

依据表2制作人乙酰化tau274检测标准曲线，见图3。标准曲线的R²＝0.99，线性检测范围0-10000pg/mL，推出样品浓度计算公式：y＝0.0003x+0.1528，检测灵敏度小于78pg/ml。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.一种抗人乙酰化tau274的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括LCDR1-3，所述LCDR1、LCDR2、LCDR3依次分别包含如SEQ ID NO:3-5所示的氨基酸序列，所述重链可变区包括HCDR1-3，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3依次分别包含如SEQ ID NO:6-8所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的兔单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区包含如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1-2中任一所述的兔单克隆抗体。

4.一种重组表达载体，其特征在于，其含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求4所述的重组表达载体，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

6.权利要求1或2所述的兔单克隆抗体在制备检测人乙酰化tau274蛋白的免疫检测产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫检测产品为检测试剂盒、芯片或检测试纸。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒为双抗体夹心ELISA检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。

9.一种人乙酰化tau274的免疫检测产品，其特征在于，所述免疫检测产品包括权利要求1或2所述的兔单克隆抗体。

10.根据权利要求9所述的免疫检测产品，其特征在于，所述免疫检测产品为检测试剂盒、芯片或检测试纸。