CN117624344A - 一种重组人源化金属硫蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组人源化金属硫蛋白的制备方法及其应用，属于重组蛋白技术领域。本发明通过在发酵培养基中添加γ‑胺基丁酸和谷胱甘肽，并在IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+后，设定发酵温度为30～35℃、溶氧量为18～22ppm、pH值为6.5～7，发酵完成后收集发酵上清进行纯化，得到重组人源化金属硫蛋白。本发明的制备方法提高了菌体中重组人源化金属硫蛋白的表达量和得率。
Description
技术领域
本发明涉及重组蛋白技术领域，尤其涉及一种重组人源化金属硫蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
金属硫蛋白(metallothionein，MT)是富含半胱氨酸(Cys)的低分子量蛋白质(6000～7000Da)，通过其半胱氨酸硫醇基团对重金属具有结合能力，能够结合多达20个单价或7个二价重金属离子。MT在生物体内发挥重要的生理作用，主要表现为参与生物体内微量金属元素的储存、运输及代谢和对非必需重金属元素的螯合解毒，此外在调节内环境的稳态、清除自由基、防止组织氧化损伤、拮抗生理和生化反应等方面也有很重要的意义，并为其他金属蛋白和金属酶类提供活性中心，因此MT在环境监测、保健食品与医药领域具有十分广泛的应用。
目前，国内市场上常见的MT多数是从兔肝脏中提纯，提取工艺繁复，产量极低，致使MT的价格极其昂贵，纯度在95％以上价格为45000～50000元/g。MT原料来源已成为制约该领域发展的瓶颈之一，从而使其应用和研究受到限制。目前，利用基因重组技术大规模化生产制备MT虽然解决了MT来源限制瓶颈，但由于哺乳动物的金属硫蛋白在工程菌内的不稳定性，金属硫蛋白对细胞的毒性以及菌株对金属离子的耐受性差等原因，一直难以获得比较高的产率。
发明内容
有鉴于此，为了解决工程菌生产金属硫蛋白产率低的问题，本发明提供了一种重组人源化金属硫蛋白的制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种重组人源化金属硫蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)将含有金属硫蛋白外源基因的工程菌接种于添加γ-胺基丁酸和谷胱甘肽的发酵培养基中于24～28℃进行发酵，发酵8～12h后，得发酵液1；
(2)在发酵液1中补加发酵培养基进行扩大培养，所述发酵液1与补加的发酵培养基的体积比为1:10～16；
(3)继续发酵3～4h，当发酵液吸光度OD600升高至0.6～1时，加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+，于30～35℃发酵3～6h，收集发酵上清液；
(4)纯化发酵上清液，得到金属硫蛋白。
优选的，所述γ-胺基丁酸的浓度为15～25mM/L，所述谷胱甘肽的浓度为20～40mM/L。
优选的，所述工程菌的接种量为5～10％。
优选的，所述Zn2+、Cu2+和Cd2+的终浓度独立地为2.5～3.5mM/L，IPTG的终浓度为1.5～3mM/L。
优选的，所述发酵培养基为2YT培养基或YPD培养基。
优选的，发酵过程伴随搅拌，步骤(1)、步骤(2)搅拌的转速为320～360rpm，溶氧量为10～15ppm；步骤(3)搅拌的转速为500～580rpm，溶氧量为18～22ppm。
优选的，步骤(3)发酵过程中需补充IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+，IPTG的浓度维持在1.5～3mM/L，Zn2+、Cu2+和Cd2+各自的浓度维持在2.5～3.5mM/L。
优选的，所述发酵的pH值为6.5～7.0，并在发酵过程中补充pH调节剂，使pH值维持在6.5～7.0。
优选的，所述工程菌为包含重组质粒pET28-cA-GFP的大肠杆菌。
本发明还提供了所述制备方法制备得到的重组人源化金属硫蛋白在护肤品中的应用。
通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明通过在培养基中添加γ-胺基丁酸和谷胱甘肽，并在IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+诱导培养后，设定发酵温度为30～35℃、溶氧量为18～22ppm、pH值为6.5～7，发酵完成后收集发酵上清进行纯化，得到重组人源化金属硫蛋白。本发明的制备方法提高了菌体中金属硫蛋白的表达量和得率。
具体实施方式
本发明提供了一种重组人源化金属硫蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)将含有金属硫蛋白外源基因的工程菌接种于添加γ-胺基丁酸和谷胱甘肽的发酵培养基中于24～28℃进行发酵，发酵8～12h后，得发酵液1；
(2)在发酵液1中补加发酵培养基进行扩大培养，所述发酵液1与补加的发酵培养基的体积比为1:10～16；
(3)继续发酵3～4h，当发酵液吸光度OD600升高至0.6～1时，加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+于30～35℃发酵3～6h，收集发酵上清液；
(4)纯化发酵上清液，得到金属硫蛋白。
在本发明中，将工程菌株接种到LB固体斜面培养基上培养得到复壮菌体，所述培养的温度为24～28℃，进一步优选为25～27℃，更优选为26℃；所述培养的时间优选为18～24h，进一步优选为20～22h，更优选为21h。
将上述的复壮菌体接种到LB液体种子培养基中进行培养，得到发酵种子液；所述培养的温度为24～28℃，进一步优选为25～27℃，更优选为26℃；所述培养的转速为180～220rpm，进一步优选为190～210rpm，更优选为200rpm；所述培养的时间为16～20h，进一步优选为17～19h，更优选为18h。
将上述获得的发酵种子液接种到发酵培养基中，进行发酵。所述接种量为5～10％，进一步优选为7～9％，更优选为8％；所述发酵培养基优选为添加了γ-胺基丁酸和谷胱甘肽的2YT培养基或添加了γ-胺基丁酸和谷胱甘肽的YPD培养基；所述γ-胺基丁酸在培养基中的浓度为15～25mM/L，优选为18～23mM/L，更优选为20mM/L；所述谷胱甘肽的浓度为20～40mM/L，进一步优选为25～35mM/L，更优选为30mM/L；添加γ-胺基丁酸和谷胱甘肽的目的是提高工程菌对金属离子的耐受性。本发明所述发酵培养基含有氨苄青霉素，所述氨苄青霉素的浓度为80～120mg/L，进一步优选为90～110mg/L，更优选为100mg/L。
本发明所述发酵的温度为24～28℃，进一步优选为25～27℃，更优选为26℃；所述发酵伴随搅拌，所述搅拌的转速为320～360rpm，进一步优选为330～350rpm，更优选为340rpm；发酵液中的溶氧量为10～15ppm，进一步优选为11～14ppm，更优选为12ppm，所述发酵优选在发酵罐中进行。发酵8～12h后，进一步优选为9～11h后，更优选为10h后，得发酵液1，所述发酵优选在发酵罐中进行。
本发明在发酵液1中补加培养基进行扩大培养，所述发酵液1与补加的发酵培养基的体积比为1:10～16，进一步优选为1:12～14，更优选为1:13。
扩大培养后，继续发酵3～4h，进一步优选为3.5h，当发酵液吸光度OD600升高至0.6～1时，进一步优选为0.7～0.9，更优选为OD600升高至0.8时，加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+进行诱导培养，发酵后收集菌体。所述Zn2+、Cu2+和Cd2+的浓度独立地为2.5～3.5mM/L，进一步优选为2.7～3.2mM/L，更优选为3mM/L；所述IPTG的终浓度为1.5～3mM/L，进一步优选为2～2.5mM/L，更优选为2.3mM/L，所述诱导后发酵的温度为30～35℃，进一步优选为31～34℃，更优选为32℃，诱导后所述搅拌速率为500～580rpm，进一步优选为520～560rpm，更优选为540rpm，此时增加发酵罐的通气量，使发酵液中的溶氧量维持在18～22ppm，进一步优选为19～21ppm，更优选为20ppm。此阶段，每隔2～3h对IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+的浓度进行测定，然后补充IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+，使IPTG的浓度维持在1.5～3mM/L，Zn2+、Cu2+和Cd2+各自的浓度维持在2.5～3.5mM/L。所述诱导培养的pH值为6.5～7.0，进一步优选为6.7～6.9，更优选为6.8；在诱导培养过程中补充pH调节剂，pH调节剂加培养液由发酵罐控制，将pH维持在6.5～7.0。在此过程中，设定温度、转速、溶氧量、pH值的目的是为了调节发酵条件，促进菌株合成金属硫蛋白。诱导后所述发酵的时间为3～6h，进一步优选为4～5h，更优选为4.5h。本发明所述工程菌优选为包含重组质粒的pET28-cA-GFP的大肠杆菌，所述包含重组质粒pET28-cA-GFP的大肠杆菌按照文献“人源金属硫蛋白hMT-I的重组表达及其在乳酸乳球菌的表面展示.苏艳芳.2015”中的方法构建。
本发明在发酵完成后对菌液离心，收集上清液，所述离心的离心力为5000～7000g，进一步优选为5500～6500g，更优选为6000g；所述离心的时间为8～12min，进一步优选为9～11min，更优选为10min。上清液上样至柱床体积为30ml的Ni-NTA亲和层析柱中，流速0.6～0.8ml/min，进一步优选为0.65～0.75ml/min，更优选为0.7ml/min；NTA-10buffer洗回基线，流速为0.8～1.2ml/min，进一步优选为0.9～1.1ml/min，更优选为1ml/min；NTA-40buffer洗杂蛋白，NTA-250buffer洗脱，纯化后的目的蛋白经Sephadex G-25分子筛脱咪唑后进行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白，得到金属硫蛋白。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
2YT培养基成分：蛋白胨16g/L，酵母膏10g/L，NaCl 5g/L，pH＝6.5～7.0；
YPD培养基成分：蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，pH＝6.5～7.0；
LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH＝＝6.5～7.0；
LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，pH＝6.5～7.0。
本发明实施例中包含重组质粒pET28-cA-GFP的大肠杆菌按照文献“人源金属硫蛋白hMT-I的重组表达及其在乳酸乳球菌的表面展示.苏艳芳.2015”中的方法构建。
实施例1
将包含重组质粒pET28-cA-GFP的大肠杆菌接种至LB固体斜面培养基上，于24℃培养18h得到复壮菌体，将复壮菌体接种到LB液体种子培养基中于24℃、180rpm培养16h，得到发酵种子液。将获得的发酵种子液按照5％的接种比例接种到含有15mM/Lγ-胺基丁酸、20mM/L谷胱甘肽和80mg/L氨苄青霉素的2YT发酵培养基中，于24℃、320rpm，溶氧量为10ppm的条件下发酵8h后得发酵液1，在发酵液1中添加发酵培养基，发酵液1与添加的发酵培养基的体积比为1:10。
继续发酵3h，当发酵液吸光度OD600升高至0.6时，加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+进行发酵，IPTG的终浓度为1.5mM/L，Zn2+、Cu2+和Cd2+的终浓度为2.5mM/L，用NaOH溶液调节pH值至6.5，调节发酵罐温度至30℃，调节转速至500rpm，容氧量为18ppm，发酵3h，在发酵2h时，测定IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+浓度，并添加IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+，补料后，IPTG的浓度为1.5M/L，Zn2+、Cu2+和Cd2+的含量为2.5M/L。
发酵完成后，菌液5000g离心8min，收集上清液，上清液上样至柱床体积为30ml的Ni-NTA亲和层析柱中，流速0.6ml/min；NTA-10buffer洗回基线，流速为0.8ml/min，NTA-40buffer洗杂蛋白，NTA-250buffer洗脱，纯化后的目的蛋白经Sephadex G-25分子筛脱咪唑后进行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白，得到金属硫蛋白。
实施例2
将包含重组质粒pET28-cA-GFP的大肠杆菌接种至LB固体斜面培养基上，于26℃培养20h得到复壮菌体，将复壮菌体接种到LB液体种子培养基中于26℃、200rpm培养18h，得到发酵种子液。将获得的发酵种子液按照8％的接种比例接种到含有20mM/Lγ-胺基丁酸、30mM/L谷胱甘肽和100mg/L氨苄青霉素的2YT发酵培养基中，于26℃、340rpm，溶氧量为13ppm的条件下发酵10h后得发酵液1，在发酵液1中添加发酵培养基，发酵液1与添加的发酵培养基的体积比为1:13。
继续发酵3.5h，当发酵液吸光度OD600升高至0.8时，加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+进行发酵，IPTG的终浓度为2mM/L，Zn2+、Cu2+和Cd2+的终浓度为3mM/L，用NaOH溶液调节pH值至6.7，调节发酵罐温度至32℃，调节转速至550rpm，容氧量为20ppm，发酵5h，在发酵2.5h时，测定IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+浓度，并添加IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+，补料后，IPTG的浓度为2M/L，Zn2+、Cu2+和Cd2+的含量为3M/L。
发酵完成后，菌液6000g离心10min，收集上清液，上清液上样至柱床体积为30ml的Ni-NTA亲和层析柱中，流速0.7ml/min；NTA-10buffer洗回基线，流速为1.0ml/min，NTA-40buffer洗杂蛋白，NTA-250buffer洗脱，纯化后的目的蛋白经Sephadex G-25分子筛脱咪唑后进行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白，得到金属硫蛋白。
实施例3
将包含重组质粒pET28-cA-GFP的大肠杆菌接种至LB固体斜面培养基上，于28℃培养24h得到复壮菌体，将复壮菌体接种到LB液体种子培养基中于28℃、220rpm培养20h，得到发酵种子液。将获得的发酵种子液按照10％的接种比例接种到含有25mM/Lγ-胺基丁酸、35mM/L谷胱甘肽和120mg/L氨苄青霉素的YPD发酵培养基中，于28℃、360rpm，溶氧量为15ppm的条件下发酵12h后得发酵液1，在发酵液1中添加发酵培养基，发酵液1与添加的发酵培养基的体积比为1:16。
继续发酵4h，当发酵液吸光度OD600升高至1时，加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+进行发酵，IPTG的终浓度为3mM/L，Zn2+、Cu2+和Cd2+的终浓度为3.5mM/L，用NaOH溶液调节pH值至7.0，调节发酵罐温度至35℃，调节转速至580rpm，容氧量为20ppm，发酵6h，在发酵3h时，测定IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+浓度，并添加IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+，补料后，IPTG的浓度为3M/L，Zn2 +、Cu2+和Cd2+的含量为3.5M/L。
发酵完成后，菌液7000g离心12min，收集上清液，上清液上样至柱床体积为30ml的Ni-NTA亲和层析柱中，流速0.8ml/min；NTA-10buffer洗回基线，流速为1.2ml/min，NTA-40buffer洗杂蛋白，NTA-250buffer洗脱，纯化后的目的蛋白经Sephadex G-25分子筛脱咪唑后进行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白，得到金属硫蛋白。
对比例1
与实施例2不同的是，发酵培养基中未添加γ-胺基丁酸。
对比例2
与实施例2不同的是，发酵培养基中未添加谷胱甘肽。
对比例3
与实施例2不同的是，诱导培养后的发酵温度为28℃。
对比例4
与实施例2不同的是，加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+后的发酵温度为37℃。
对比例5
与实施例2不同的是，加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+后发酵液中的溶氧量为15ppm。
对比例6
与实施例2不同的是，加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+后发酵液中的溶氧量为25ppm。
对比例7
与实施例2不同的是，加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+后发酵液的pH值为6.2。
对比例8
与实施例2不同的是，加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+后发酵液的pH值为7.3。
实验例1不同组别的菌体金属硫蛋白的纯度、得率和表达量分析
1.金属硫蛋白的纯度、得率测定
首先用考马斯亮蓝法对实施例和度比例制备的金属硫蛋白进行纯度分析。
具体方法为：(1)试剂的制备：将0.1000g考马斯亮蓝G-250溶于50ml体积百分比浓度为95％乙醇溶液中，加入100ml质量百分比浓度为85％的浓磷酸，然后用蒸馏水补充至200ml，得到Bradford储备液，此储备液放置在4℃冰箱中，备用。按体积比为1:5的比例用蒸馏水稀释Bradford储备液，即200ml储备液加800ml蒸馏水，得到Bradford使用液；配制0.15mol/L的NaCl溶液；
(2)标准曲线的测定：称取0.1000g牛血清蛋白溶于玻璃烧杯中，移至1000mL的容量瓶中，蒸馏水定容，配制100μg/mL的牛血清蛋白标准液；在试管中分别加入0.00、0.10.0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL牛血清蛋白溶液，不足1ml者，添加0.15mol/L的NaCl溶液使成1ml；然后加入5.0ml Bradford使用液，用漩涡振荡器摇匀，显色5-8min后,用分光光度计在入＝595nm测定吸光度值，用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，获得校正吸光度值，并以此绘制标准曲线。
(3)蛋白质的测定：分别取0.5g待测金属硫蛋白试管中，加入0.15mol/L的NaCl溶液使成1ml；再加入5.0ml Bradford使用液，用漩涡振荡器摇匀，另取1mlNaCl溶液同法操作，加入Bradford试剂做空白对照，显色5～8min后，用分光光度计在入＝595nm测定吸光度值，用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，得到最终的吸光度值，然后从标准曲线上查得相对应的值，计算出待测蛋白质的含量。经测定，实施例和对比例制备的重组人源化金属硫蛋白的纯度都在95％以上。
测定蛋白纯度后，计算实施例和对比例的目的蛋白得率。
目的蛋白得率＝(纯化后的蛋白重量/发酵上清液总重量)×100％，结果如表1所示。
表1不同组别金属硫蛋白蛋白得率
| 金属硫蛋白得率(mg/ml) | |
| 实施例1 | 0.769 |
| 实施例2 | 0.776 |
| 实施例3 | 0.813 |
| 对比例1 | 0.441 |
| 对比例2 | 0.489 |
| 对比例3 | 0.502 |
| 对比例4 | 0.633 |
| 对比例5 | 0.468 |
| 对比例6 | 0.530 |
| 对比例7 | 0.662 |
| 对比例8 | 0.637 |
由表1可知，对比例1的培养基中未添加γ-胺基丁酸，对比例2的培养基中未添加谷胱甘肽，对比例1和对比例2金属硫蛋白蛋白得率为0.441mg/ml、0.489mg/ml小于实施例金属硫蛋白蛋白得率，说明培养基中的γ-胺基丁酸和谷胱甘肽协同作用，能够提高菌体中金属硫蛋白蛋白得率。对比例3～8对加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+后的温度、含氧量以及pH调整后，金属硫蛋白蛋白得率均小于实施例，说明只有加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+后的温度、含氧量以及pH在本发明的范围内，金属硫蛋白才能有较高的得率。
2.金属硫蛋白的表达量分析
各取10μL实施例、对比例的最终发酵上清液上样，15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色、脱色，观察细菌总蛋白质条带、可溶性金属硫蛋白条带的比例，表达数据采集采用Tanon 1600R凝胶成像分析系统进行条带密度扫描分析，测定可溶性金属硫蛋白占菌体蛋白的百分比，测定结果如表2所示。
表2不同组别金属硫蛋白百分比
| 金属硫蛋白百分比(％) | |
| 实施例1 | 10.23 |
| 实施例2 | 11.57 |
| 实施例3 | 11.26 |
| 对比例1 | 7.82 |
| 对比例2 | 8.05 |
| 对比例3 | 7.22 |
| 对比例4 | 8.74 |
| 对比例5 | 8.82 |
| 对比例6 | 9.19 |
| 对比例7 | 8.64 |
| 对比例8 | 8.51 |
由表2可知，实施例中的金属硫蛋白占菌体蛋白的百分比高于对比例1、2，说明培养基中同时添加γ-胺基丁酸和谷胱甘肽能够提高金属硫蛋白的表达量，由实施例3～8可知，若加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+后的温度、溶氧量、pH值不在本发明的范围内，金属硫蛋白的表达量降低。
由以上实施例可知，本发明提供了一种重组人源化金属硫蛋白的制备方法，本发明通过在培养基中添加添加γ-胺基丁酸和谷胱甘肽，并设置加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+后的发酵温度、溶氧量、pH，提高了重组人源化金属硫蛋白的得率和表达量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种重组人源化金属硫蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将含有金属硫蛋白外源基因的工程菌接种于添加γ-胺基丁酸和谷胱甘肽的发酵培养基中于24～28℃进行发酵，发酵8～12h后，得发酵液1；
(2)在发酵液1中补加发酵培养基进行扩大培养，所述发酵液1与补加的发酵培养基的体积比为1:10～16；
(3)继续发酵3～4h，当发酵液吸光度OD600升高至0.6～1时，加入IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2 +，于30～35℃发酵3～6h，收集发酵上清液；
(4)纯化发酵上清液，得到金属硫蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述γ-胺基丁酸的浓度为15～25mM/L，所述谷胱甘肽的浓度为20～40mM/L。
3.据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工程菌的接种量为5～10％。
4.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Zn2+、Cu2+和Cd2+的终浓度独立地为2.5～3.5mM/L，IPTG的终浓度为1.5～3mM/L。
5.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为2YT培养基或YPD培养基。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵过程伴随搅拌，步骤(1)、步骤(2)搅拌的转速为320～360rpm，溶氧量为10～15ppm；步骤(3)搅拌的转速为500～580rpm，溶氧量为18～22ppm。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)发酵过程中需补充IPTG、Zn2+、Cu2+和Cd2+，IPTG的浓度维持在1.5～3mM/L，Zn2+、Cu2+和Cd2+各自的浓度维持在2.5～3.5mM/L。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的pH值为6.5～7.0，并在诱导培养过程中补充pH调节剂，使pH值维持在6.5～7.0。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述工程菌为包含重组质粒pET28-cA-GFP的大肠杆菌。
10.权利要求1～9任意一种制备方法制备得到的重组人源化金属硫蛋白在护肤品中的应用。
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