CN117604128A - 一种用于五种常见肠道致病菌的多重pcr检测引物及其应用 - Google Patents

一种用于五种常见肠道致病菌的多重pcr检测引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物及其应用，属于分子检测技术领域。用于用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物，包括用于检测大肠杆菌的引物、用于检测沙门氏菌的引物、用于检测志贺氏菌的引物、用于检测副溶血性弧菌的引物及用于检测霍乱弧菌的引物。应用方法如下：提取待测样品的DNA作为模板，利用多重PC R检测引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，若存在无条DNA条带，则证明待检测样品中含有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌。本发明的应用方法相较于单一特异性引物检测，可同时检测一种、两种、三种、四种或五种病菌，具有准确、快速、简单易操作等优点。

Description

一种用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物及其应用
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体地说，涉及一种用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物及其应用。
背景技术
肠道感染是全球范围内一种常见的疾病，其主要原因是肠道致病菌的感染。肠道致病菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌等。准确、快速地检测这些致病菌对于疾病防控和治疗至关重要。本发明公开了一种用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物及其应用，该方法具有同时检测多种病菌、准确性高、快速和简单易操作等优点，有助于在疾病侵染初期鉴定出病原物。
肠道感染与肠道致病菌：
肠道感染是由各种肠道致病菌引起的疾病，主要通过食物、饮水或接触传播。这些致病菌可以引起胃肠道炎症、腹泻、呕吐、发热等症状，严重时甚至危及生命。在肠道致病菌中，大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌是最常见和具有重要病原性的菌株。
传统方法的局限性：
传统的肠道致病菌检测方法通常采用培养和生化鉴定技术，这些方法需要耗费较长时间来培养细菌，并且对特定培养条件要求较高，存在一定的假阴性和假阳性结果的风险。此外，传统方法通常只能针对一种或有限种类的菌株进行检测，无法同时检测多种致病菌。
多重PCR技术的优势：
多重聚合酶链式反应(PCR)技术是一种快速、敏感、特异性强的分子检测方法。通过使用多个特异性引物，可以同时扩增多个目标基因序列，从而实现对多种致病菌的检测。相比传统方法，多重PCR技术具有以下优势：
同时检测多种致病菌：本发明公开了用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物，可同时检测大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌，极大提高了检测效率。
准确性：多重PCR检测引物特异性高，能够与目标致病菌的基因序列发生特异性扩增反应，减少了假阳性和假阴性结果的风险。
快速和简单易操作：多重PCR技术的操作相对简单，并且具有较短的反应时间，可以在较短的时间内得到检测结果，有助于迅速采取相应的防控措施。
但目前来说，尚未有同时检测上述五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物，多重PCR实验面临的最新挑战包括以下几点：
1.优化过程耗时且繁琐：多重PCR技术的一个重要挑战是耗时且繁琐的优化过程。
2.传统分离技术的不适用性：例如琼脂糖凝胶，对于分离只相差几个碱基对的多重PC R产物来说并不适用。
3.引物设计问题：多重PCR的引物设计仍然是一个具有挑战性的问题，需要考虑的因素包括非特异性结合到非目标DNA模板的引物错误配对、引物二聚体化，以及无法分离和纯化具有相似电泳迁移率的DNA扩增产物。
4.资源竞争：反应中的不同目标可以互相竞争资源，这样高丰度的模板会被检测到，而低丰度的则会淡出背景。
5.优化反应条件：传统的多重PCR需要对退火条件、酶和缓冲液浓度进行大量优化，以实现每个目标的最大扩增效率。
6.热启动程序和缓冲系统：成功的结果绝对需要严格的热启动程序和专门优化的缓冲系统。
7.引物结合动力学：与使用2个引物的标准PCR系统相比，多重PCR的额外挑战在于不同引物对之间存在不同的结合动力学。高效结合的引物会消耗更多的PCR反应组分，从而降低其他PCR产物的产量。这通常会导致DNA序列未被扩增，并在琼脂糖凝胶上出现缺失条带。
这些挑战需要通过精心设计和优化实验条件来克服，以确保实验结果的准确性和可靠性。
发明内容
1、要解决的问题
针对上述检测技术存在的问题，本发明提供一种用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物，根据五种肠道致病菌的外膜蛋白基因保守序列设计引物，并对多对引物进行筛选，选择退火温度基本一致的引物，并进一步优化PCR的反应体系及产物扩增条件。最终建立了单个反应体系同时检测五种不同肠道致病菌的方法。该技术为粪便中肠道致病菌的鉴定与预警打下基础，进一步可以控制肠道致病菌危害程度，从而达到预防及后续针对性治疗的目的。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物，
所述的多重PCR检测引物包括用于检测大肠杆菌的引物、用于检测沙门氏菌的引物、用于检测志贺氏菌的引物、用于检测副溶血性弧菌的引物及用于检测霍乱弧菌的引物；
所述的用于检测大肠杆菌的引物如下：
其上游引物DC-R序列如SEQ ID NO.1所示，
其下游引物DC-F序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的用于检测沙门氏菌的引物如下：
其上游引物SM-R序列如SEQ ID NO.3所示，
其下游引物SM-F序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的用于检测志贺氏菌的引物如下：
其上游引物ZH-R序列如SEQ ID NO.5所示，
其下游引物ZH-F序列如SEQ ID NO.6所示；
用于检测副溶血弧菌的引物如下：
其上游引物FR-R序列如SEQ ID NO.7所示，
其下游引物FR-F序列如SEQ ID NO.8所示；
用于检测霍乱弧菌的引物如下：
其上游引物HL-R序列如SEQ ID NO.9所示，
其下游引物HL-F序列如SEQ ID NO.10所示。
上述所述的用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物，
其中用于检测大肠杆菌的引物基于大肠杆菌特异性蛋白OmpT设计的；
其中用于检测沙门氏菌的引物基于沙门氏菌特异性蛋白UgtL设计的；
其中用于检测志贺氏菌的引物基于志贺氏菌特异性蛋白Spa15设计的；
其中用于检测副溶血弧菌的引物基于副溶血弧菌特异性蛋白PirB设计的；
其中用于检测霍乱弧菌的引物基于霍乱弧菌特异性蛋白TsrA设计的；
所述的用于检测大肠杆菌的引物、所述的用于检测沙门氏菌的引物、所述的用于检测志贺氏菌的引物、所述的用于检测副溶血性弧菌的引物及所述的用于检测霍乱弧菌的引物通过如下的损失函数算法进行优化：
式中，L(S)表示损失函数并用于近似地计算引物集S形成引物发夹结构的严重程度，Badness()表示坏度函数并用于每对引物之间潜在发夹结构相互作用的总和，pa表示前一对引物，pb表示后一对引物，N表示引物集S引物对的总和，len表示每对引物子序列长度，munGC表示每对引物中G/C核苷酸数量，d1表示每对引物子序列到pa的5’端距离，d2表示每对引物子序列到pb的5’端距离。
一种如上述所述的多重PCR检测引物在大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌检测中的应用。
上述所述的多重PCR检测引物在大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌检测中的应用，
提取待测样品的DNA作为模板，利用多重PCR检测引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，若存在五条DNA条带，分子量分别为263bp、187bp、398bp、321bp和467bp，则证明所述的待检测样品中含有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌。
上述所述的多重PCR检测引物在大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌检测中的应用，
所述的PCR反应的扩增体系如下：
10×PCR buffer 3.0μL，
25mM MgCl2 1.5μL，
25mM dNTP 2μL，
20μM NO.1上游引物0.5μL，
20μM NO.2下游引物0.5μL，
20μM NO.3上游引物0.5μL，
20μM NO.4下游引物0.5μL，
20μM NO.5上游引物0.5μL，
20μM NO.6下游引物0.5μL，
20μM NO.7下游引物0.5μL，
20μM NO.8下游引物0.5μL，
20μM NO.9下游引物0.5μL，
20μM NO.10下游引物0.5μL，
5U/μL Taq DNA聚合酶1.5μL，
模板DNA 1.5μL，
ddH2O 11.5μL。
上述所述的多重PCR检测引物在大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌检测中的应用，
所述的PCR反应的反应程序如下：
94℃变性3min；进入循环，94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸10min。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
根据五种肠道致病菌的外膜蛋白基因保守序列设计引物，并对多对引物进行筛选，选择退火温度基本一致的引物，并进一步优化PCR的反应体系及产物扩增条件。最终建立了单个反应体系同时检测五种不同肠道致病菌的方法。该技术为粪便中肠道致病菌的鉴定与预警打下基础，进一步可以控制肠道致病菌危害程度，从而达到预防及后续针对性治疗的目的。
具体来说，本申请设计的用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物具有较高的特异性，对于常见肠道相关的其他菌(金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、克罗诺杆菌(ATCC29544)、阴沟肠杆菌(ATCC13047)、霍氏肠杆菌(ATCC700323)、神户肠杆菌(ATCC BAA-260)、小肠结肠炎耶尔森菌(ATCC23715)、空肠弯曲菌(ATCC33291)、变形杆菌(ATCC12453))具有较好的区分作用，只有目标致病菌才可以特异性扩增出条带。此外，本申请设计的多重PCR检测引物具有较高的抗干扰效果，在人类粪便样品中DNA的浓度低至30pg/25μL时依旧可以检出。
附图说明
图1为用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物的特异性实验结果图；
图2为用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物的灵敏度实验结果图；
图3为用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物的真实样品实验结果图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物，所述的多重PCR检测引物包括用于检测大肠杆菌的引物、用于检测沙门氏菌的引物、用于检测志贺氏菌的引物、用于检测副溶血性弧菌的引物及用于检测霍乱弧菌的引物；
所述的用于检测大肠杆菌的引物如下：
其上游引物DC-R序列如SEQ ID NO.1所示，
其下游引物DC-F序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的用于检测沙门氏菌的引物如下：
其上游引物SM-R序列如SEQ ID NO.3所示，
其下游引物SM-F序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的用于检测志贺氏菌的引物如下：
其上游引物ZH-R序列如SEQ ID NO.5所示，
其下游引物ZH-F序列如SEQ ID NO.6所示；
用于检测副溶血弧菌的引物如下：
其上游引物FR-R序列如SEQ ID NO.7所示，
其下游引物FR-F序列如SEQ ID NO.8所示；
用于检测霍乱弧菌的引物如下：
其上游引物HL-R序列如SEQ ID NO.9所示，
其下游引物HL-F序列如SEQ ID NO.10所示。
需要说明的是，
其中用于检测大肠杆菌的引物基于大肠杆菌(O157：H7，ATCC35150)特异性蛋白OmpT设计的，大肠杆菌外膜蛋白T(OmpT)属于外膜蛋白酶家族的一种，与阴性细菌的致病性有关，omptins家族蛋白可形成β-桶状孔，用于跨膜运输亲水性溶质和离子(https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/outer-membrane-protein)。
其中用于检测沙门氏菌的引物基于沙门氏菌(ATCC 13311)特异性蛋白UgtL设计的，对于沙门氏菌，我们最近证明，PhoP激活的ugtL基因是介导对抗菌肽magainin 2和多粘菌素B产生抗性的脂质A修饰所必需的(21)。ugtL基因是沙门氏菌特异性基因簇的一部分，该基因簇包括PhoP激活的pcgL基因(22)和sifB基因，后者在低Mg2+条件下表达，而低Mg2+条件通常会激活PhoP/PhoQ系统(23)。在此，现有研究报告了ugtL基因的转录以及对抗菌肽magainin 2和多粘菌素B的抗性都需要phoP和slyA调节基因。我们确定PhoP蛋白与slyA启动子结合，并且PhoP和SlyA蛋白都与ugtL启动子结合，这表明这两种蛋白利用前馈环来控制ugtL的表达。这是第一个同时需要PhoP和SlyA进行转录的基因实例。
其中用于检测志贺氏菌的引物基于志贺氏菌(ATCC12022)特异性蛋白Spa15设计的，许多革兰氏阴性病原体利用III型分泌(TTS)途径将毒力因子注入真核细胞。除了功能性TTS装置外，效应蛋白的分泌还依赖于特定的伴侣蛋白。通过在酵母中进行双杂交筛选和在柔性志贺氏菌中进行共纯化试验，目前研究证明了由TTS装置元件操作子编码的Spa15在胞质中与TTS途径分泌的三种蛋白质IpaA、IpgB1和OspC3相关。研究发现，Spa15对于IpgB1的稳定性是必要的，但对于IpaA的稳定性却不是必要的；Spa15也是分泌储存在细胞质中的IpaA分子的必要条件，但对于分泌装置处于活动状态时合成的IpaA分子却不是必要条件。Spa15与几种非同源分泌蛋白结合的能力、Spa15同源物在其他TTS系统中的存在以及相应基因在TTS装置组分操作子中的位置表明，Spa15属于一类新的TTS伴合子。
其中用于检测副溶血弧菌的引物基于副溶血弧菌(ATCC17802)特异性蛋白PirB设计的；
引起急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌菌株(在此称为VP急性肝胰腺坏死病)含有一个70kbp的质粒(称为pVA1)，其中含有编码PirA和PirB基因的序列，而非引起急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌菌株则不含这些基因。从副溶血性弧菌中移除pVA1质粒会导致该细菌丧失引起急性肝胰腺坏死病的能力。同样，选择性敲除Pir基因或去除VP急性肝胰腺坏死病中的Pir毒素也会导致该细菌无法引起对虾急性肝胰腺坏死病。尽管PirA和PirB构成了二元毒素，但PirB似乎是导致急性肝胰腺坏死病的主要毒素蛋白。
其中用于检测霍乱弧菌的引物基于霍乱弧菌(ATCC14035)特异性蛋白TsrA设计的；TsrA是弧菌属特有的蛋白质，通过基于BLAST的蛋白质同源性搜索确定，它在弧菌属生物基因组中最为常见。研究表明，TsrA与人体感应途径协调调节VI型分泌系统(T6SS)基因(即Hcp)，并进一步影响toxT的表达和霍乱弧菌在小肠中的定植能力。
所述的用于检测大肠杆菌的引物、所述的用于检测沙门氏菌的引物、所述的用于检测志贺氏菌的引物、所述的用于检测副溶血性弧菌的引物及所述的用于检测霍乱弧菌的引物通过如下的损失函数算法进行优化：
式中，L(S)表示损失函数并用于近似地计算引物集S形成引物发夹结构的严重程度，Badness()表示坏度函数并用于每对引物之间潜在发夹结构相互作用的总和，pa表示前一对引物，pb表示后一对引物，N表示引物集S引物对的总和，len表示每对引物子序列长度，munGC表示每对引物中G/C核苷酸数量，d1表示每对引物子序列到pa的5’端距离，d2表示每对引物子序列到pb的5’端距离。
关于上述损失函数算法，引物池的设计非常关键，纳入引物池的引物具备以下特点：
ΔG°介于-11.0～-13.5kcal/mol，并且GC含量介于-0.35～0.80的引物对。
同时，相对来说，两条引物之间的互补配对的序列数越多，离5’端越近，GC含量越低，这样的引物对的损失值越高。损失值越高，形成引物发夹结构的可能性越大，损失值越低，形成引物发夹结构的可能性越小。
此外，对引物池的引物对计算损失函数，并与上一次选取的引物的损失函数进行比较，如果当前引物的损失函数更小，那么这条/对引物就会迭代上一条/对选取的引物，直到获取最佳引物对。
实施例2
特异性测试
额外选择金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、克罗诺杆菌(ATCC29544)、阴沟肠杆菌(ATCC13047)、霍氏肠杆菌(ATCC700323)、神户肠杆菌(ATCC BAA-260)、小肠结肠炎耶尔森菌(ATCC23715)、空肠弯曲菌(ATCC33291)、变形杆菌(ATCC12453)进行补充测试。
参考如下实验方案进行PCR扩增及琼脂糖凝胶实验，
所述的PCR反应的扩增体系如下：
10×PCR buffer 3.0μL，
25mM MgCl2 1.5μL，
25mM dNTP 2μL，
20μM NO.1上游引物0.5μL，
20μM NO.2下游引物0.5μL，
20μM NO.3上游引物0.5μL，
20μM NO.4下游引物0.5μL，
20μM NO.5上游引物0.5μL，
20μM NO.6下游引物0.5μL，
20μM NO.7下游引物0.5μL，
20μM NO.8下游引物0.5μL，
20μM NO.9下游引物0.5μL，
20μM NO.10下游引物0.5μL，
5U/μL Taq DNA聚合酶1.5μL，
模板DNA 1.5μL，
ddH2O 11.5μL。
提取待测样品的DNA作为模板(本实施例使用纯菌LB培养液与细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)-来自天根生化科技有限公司)，利用多重PCR检测引物进行PCR反应(涉及的试剂或缓冲液均采购自Takara Bio，涉及的PCR扩增仪为美国biorad生产的T100PCR仪)，取PCR反应扩增产物进行检测，使用Invitrogen的预制E-GelTMGo琼脂糖凝胶(2％)及上海天能公司生产的Tanon 2500全自动数码凝胶成像分析系统进行处理，若存在五条DNA条带，分子量分别为263bp、187bp、398bp、321bp和467bp，则证明所述的待检测样品中含有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌。
所述的PCR反应的反应程序如下：
94℃变性3min；进入循环，94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸10min。
如图1所示，泳道“0”为空白对照(不添加模板DNA)，泳道“1”为五种常见肠道致病菌(各自浓度比1：1：1：1：1，大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌)的条带图，泳道“2”为大肠杆菌的条带图，泳道“3”为沙门氏菌的条带图，泳道“4”为志贺氏菌的条带图，泳道“5”为副溶血性弧菌的条带图，泳道“6”为霍乱弧菌的条带图，泳道“7”为金黄色葡萄球菌的条带图，泳道“7”为铜绿假单胞菌的条带图，泳道“8”为克罗诺杆菌的条带图，泳道“9”为阴沟肠杆菌的条带图，泳道“10”为霍氏肠杆菌的条带图，泳道“11”为神户肠杆菌的条带图，泳道“12”为小肠结肠炎耶尔森菌的条带图，泳道“13”为空肠弯曲菌条带图，泳道“14”为变形杆菌的条带图，由此可见，本申请设计的用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物具有较高的特异性，对于常见肠道相关的其他菌(金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、克罗诺杆菌(ATCC29544)、阴沟肠杆菌(ATCC13047)、霍氏肠杆菌(ATCC700323)、神户肠杆菌(ATCC BAA-260)、小肠结肠炎耶尔森菌(ATCC23715)、空肠弯曲菌(ATCC33291)、变形杆菌(ATCC12453))具有较好的区分作用，只有目标致病菌才可以特异性扩增出条带。
实施例3
灵敏度测试
选择大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌进行灵敏度测试，其中模板DNA的浓度10pg/25μL。
参考如下实验方案进行PCR扩增及琼脂糖凝胶实验，
所述的PCR反应的扩增体系如下：
10×PCR buffer 3.0μL，
25mM MgCl2 1.5μL，
25mM dNTP 2μL，
20μM NO.1上游引物0.5μL，
20μM NO.2下游引物0.5μL，
20μM NO.3上游引物0.5μL，
20μM NO.4下游引物0.5μL，
20μM NO.5上游引物0.5μL，
20μM NO.6下游引物0.5μL，
20μM NO.7下游引物0.5μL，
20μM NO.8下游引物0.5μL，
20μM NO.9下游引物0.5μL，
20μM NO.10下游引物0.5μL，
5U/μL Taq DNA聚合酶1.5μL，
模板DNA 1.5μL，
ddH2O 11.5μL。
提取待测样品的DNA作为模板(本实施例使用纯菌LB培养液与细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)-来自天根生化科技有限公司)，利用多重PCR检测引物进行PCR反应(涉及的试剂或缓冲液均采购自Takara Bio，涉及的PCR扩增仪为美国biorad生产的T100 PCR仪)，取PCR反应扩增产物进行检测，使用Invitrogen的预制E-GelTMGo琼脂糖凝胶(2％)及上海天能公司生产的Tanon 2500全自动数码凝胶成像分析系统进行处理，若存在五条DNA条带，分子量分别为263bp、187bp、398bp、321bp和467bp，则证明所述的待检测样品中含有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌。
所述的PCR反应的反应程序如下：
94℃变性3min；进入循环，94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸10min。
如图2所示，泳道“0”为空白对照(不添加模板DNA)，泳道“1”为五种常见肠道致病菌(各自浓度比1：1：1：1：1，大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌)的条带图，泳道“2”为大肠杆菌的条带图，泳道“3”为沙门氏菌的条带图，泳道“4”为志贺氏菌的条带图，泳道“5”为副溶血性弧菌的条带图，泳道“6”为霍乱弧菌的条带图。由此可见，本申请设计的用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物具有较高的灵敏度，DNA的浓度低至10pg/25μL时依旧可以检出。
实施例4
真实样品测试
选择大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌进行真实样品测试，其中模板DNA的浓度30pg/25μL；真实样品的处理方法如下：为人类粪便，取1g与1mL的对应的菌液进行混合，然后离心取上清液，稀释到上述模板DNA浓度即可。
参考如下实验方案进行PCR扩增及琼脂糖凝胶实验，
所述的PCR反应的扩增体系如下：
10×PCR buffer 3.0μL，
25mM MgCl2 1.5μL，
25mM dNTP 2μL，
20μM NO.1上游引物0.5μL，
20μM NO.2下游引物0.5μL，
20μM NO.3上游引物0.5μL，
20μM NO.4下游引物0.5μL，
20μM NO.5上游引物0.5μL，
20μM NO.6下游引物0.5μL，
20μM NO.7下游引物0.5μL，
20μM NO.8下游引物0.5μL，
20μM NO.9下游引物0.5μL，
20μM NO.10下游引物0.5μL，
5U/μL Taq DNA聚合酶1.5μL，
模板DNA 1.5μL，
ddH2O 11.5μL。
提取待测样品的DNA作为模板(细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)-来自天根生化科技有限公司)，利用多重PCR检测引物进行PCR反应(涉及的试剂或缓冲液均采购自TakaraBio，涉及的PCR扩增仪为美国biorad生产的T100 PCR仪)，取PCR反应扩增产物进行检测，使用Invitrogen的预制E-GelTMGo琼脂糖凝胶(2％)及上海天能公司生产的Tanon 2500全自动数码凝胶成像分析系统进行处理，若存在五条DNA条带，分子量分别为263bp、187bp、398bp、321bp和467bp，则证明所述的待检测样品中含有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌。
所述的PCR反应的反应程序如下：
94℃变性3min；进入循环，94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸10min。
如图3所示，泳道“0”为空白对照(不添加模板DNA)，泳道“1”为五种常见肠道致病菌(各自浓度比1：1：1：1：1，大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌)的条带图，泳道“2”为大肠杆菌的条带图，泳道“3”为沙门氏菌的条带图，泳道“4”为志贺氏菌的条带图，泳道“5”为副溶血性弧菌的条带图，泳道“6”为霍乱弧菌的条带图。由此可见，本申请设计的多重PCR检测引物具有较高的抗干扰效果，在人类粪便样品中DNA的浓度低至30pg/25μL时依旧可以检出。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物，其特征在于：
所述的多重PCR检测引物包括用于检测大肠杆菌的引物、用于检测沙门氏菌的引物、用于检测志贺氏菌的引物、用于检测副溶血性弧菌的引物及用于检测霍乱弧菌的引物；
所述的用于检测大肠杆菌的引物如下：
其上游引物DC-R序列如SEQ ID NO.1所示，
其下游引物DC-F序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的用于检测沙门氏菌的引物如下：
其上游引物SM-R序列如SEQ ID NO.3所示，
其下游引物SM-F序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的用于检测志贺氏菌的引物如下：
其上游引物ZH-R序列如SEQ ID NO.5所示，
其下游引物ZH-F序列如SEQ ID NO.6所示；
用于检测副溶血弧菌的引物如下：
其上游引物FR-R序列如SEQ ID NO.7所示，
其下游引物FR-F序列如SEQ ID NO.8所示；
用于检测霍乱弧菌的引物如下：
其上游引物HL-R序列如SEQ ID NO.9所示，
其下游引物HL-F序列如SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的用于五种常见肠道致病菌的多重PCR检测引物，其特征在于：
其中用于检测大肠杆菌的引物基于大肠杆菌特异性蛋白OmpT设计的；
其中用于检测沙门氏菌的引物基于沙门氏菌特异性蛋白UgtL设计的；
其中用于检测志贺氏菌的引物基于志贺氏菌特异性蛋白Spa15设计的；
其中用于检测副溶血弧菌的引物基于副溶血弧菌特异性蛋白PirB设计的；
其中用于检测霍乱弧菌的引物基于霍乱弧菌特异性蛋白TsrA设计的；
所述的用于检测大肠杆菌的引物、所述的用于检测沙门氏菌的引物、所述的用于检测志贺氏菌的引物、所述的用于检测副溶血性弧菌的引物及所述的用于检测霍乱弧菌的引物通过如下的损失函数算法进行优化：
式中，L(S)表示损失函数并用于近似地计算引物集S形成引物发夹结构的严重程度，Badness()表示坏度函数并用于每对引物之间潜在发夹结构相互作用的总和，pa表示前一对引物，pb表示后一对引物，N表示引物集S引物对的总和，len表示每对引物子序列长度，munGC表示每对引物中G/C核苷酸数量，d1表示每对引物子序列到pa的5’端距离，d2表示每对引物子序列到pb的5’端距离。
3.一种如权利要求1所述的多重PCR检测引物在大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌检测中的应用。
4.根据权利要求3所述的多重PCR检测引物在大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌检测中的应用，其特征在于：
提取待测样品的DNA作为模板，利用多重PCR检测引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，若存在五条DNA条带，分子量分别为263bp、187bp、398bp、321bp和467bp，则证明所述的待检测样品中含有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌。
5.根据权利要求4所述的多重PCR检测引物在大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌检测中的应用，其特征在于：
所述的PCR反应的扩增体系如下：
10×PCR buffer 3.0μL，
25mM MgCl2 1.5μL，
25mM dNTP 2μL，
20μM NO.1上游引物0.5μL，
20μM NO.2下游引物0.5μL，
20μM NO.3上游引物0.5μL，
20μM NO.4下游引物0.5μL，
20μM NO.5上游引物0.5μL，
20μM NO.6下游引物0.5μL，
20μM NO.7下游引物0.5μL，
20μM NO.8下游引物0.5μL，
20μM NO.9下游引物0.5μL，
20μM NO.10下游引物0.5μL，
5U/μL Taq DNA聚合酶1.5μL，
模板DNA1.5μL，
ddH2O 11.5μL。
6.根据权利要求4所述的多重PCR检测引物在大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌检测中的应用，其特征在于：
所述的PCR反应的反应程序如下：
94℃变性3min；进入循环，94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸10min。
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