CN117604127A - 用于检测肠道出血性大肠埃希氏菌的引物组及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测肠道出血性大肠埃希氏菌的引物组及方法。本发明的用于检测肠道出血性大肠埃希氏菌的引物组包含引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示；本发明利用LAMP技术结合本发明提供的用于检测肠道出血性大肠埃希氏菌的引物组检测肠道出血性大肠埃希氏菌，灵敏度高，特异性好，且可以在1小时内实现肠道出血性大肠埃希氏菌的简便初筛，无需增菌，以满足对肠道出血性大肠埃希氏菌的即时检测。

Description

用于检测肠道出血性大肠埃希氏菌的引物组及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测肠道出血性大肠埃希氏菌的引物组及方法。
背景技术
肠道出血性大肠埃希氏菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)，革兰氏阴性菌，在一定条件下可能引起食物中毒，临床表现为出血性肠炎、血栓性血小板减少性紫癜、溶血性尿毒综合征等，是全球关注的公共卫生问题。
目前，大部分肠道出血性大肠埃希氏菌的检测方法仍然包括传统培养法、生化和血清鉴定法、免疫学法、分子生物学法等。这些检测方法中，传统培养法和生化或血清鉴定法的整体检测时间较长，而且容易受到杂菌菌落形态、数量以及变种菌落的影响，出现假阴性结果；免疫学法，如酶联免疫检测法，检测周期长、步骤繁琐，各种非相关抗原易引起交叉反应，食物加热过程中产生的肠毒素蛋白凝集等也会造成检测结果的假阳性或假阴性；分子生物学法，如多重PCR技术、实时荧光定量PCR法等，检测结果同样容易受到样品成分等各因素的影响。这些常用的EHEC检测方法，或是需要长时间的处理、熟练的操作人员和昂贵的实验室设备，或具有不稳定、灵敏度低、准确性差等缺点。操作复杂、检测周期较长、准确性不高，这些不利因素导致在突发的公共卫生事件(如食物中毒)中，难以满足现场快速检测的需求；同时在家庭食品安全检测、食品加工生产抽样检查、冷链运输过程中食品安全监控等不适合进行实验室检测的应用场景中，急需一种新型的快速、精准、简便的检测方法对肠道出血性大肠埃希氏菌进行实时监测。
近年来，肠道出血性大肠埃希氏菌(EHEC)的检测产品的研发发展迅速，包括PCR检测试剂盒、免疫胶体金快速检测试纸等。免疫胶体金快速检测试纸，使用的抗体一般为单克隆抗体作为金标抗体和多克隆抗体为检测抗体，二者配合使用的过程中，可能存在检测精度低、交叉反应高、试纸有效期较短等问题，对EHEC的检测结果的精准度造成一定不良影响。分子生物检测方法，如实时荧光定量PCR法等，准确性和特异性高，但所需仪器设备复杂、操作要求高，无法快速便捷地进行快速检测；LAMP等温扩增法也得到了一定的研发及应用，相较于PCR技术具有扩增时间短、灵敏度高的优点，但LAMP产物假阳性难以区分，而且LAMP扩增产物的检测方法仍为荧光检测或浊度检测，所需仪器设备体积大、价格昂贵、操作要求高，使LAMP扩增技术无法得到大范围的推广应用。
目前用于肠道出血性大肠埃希氏菌的检测方法都需要进行增菌的步骤，分离培养法需要经过数天多次增菌，无法用于需要即时检测的场景，如学校企业机关食堂、家庭检测、冷链运输抽检等。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种用于检测肠道出血性大肠埃希氏菌的引物组及方法，以解决现有技术中肠道出血性大肠埃希氏菌检测复杂、灵敏度不高、检测时间长的技术问题。
本发明一方面提供了一种用于检测肠道出血性大肠埃希氏菌的引物组，其特征在于，所述引物组包含引物的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1：5’-CTCTGCAATAGGTACTCCAT-3’；
SEQ ID NO.2：5’-TGTTAACAAATCCTGTCACAT-3’；
SEQ ID NO.3：
5’-TTATCCCCTGTGCCACTATCATTTTTACAGACTATTTCATCAGGAGG-3’；
SEQ ID NO.4：
5’-TTGTTTGCAGTTGATGTCAGAGGTTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA-3’；
SEQ ID NO.5：5’-AGATCCAGAGGAAGGGCGGTTT-3’。
其中，正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；正向内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；反向内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向环引物LB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
具体的，本发明还提供上述引物组的应用，上述引物组可以应用于制备肠道出血性大肠埃希氏菌试剂盒中，或者，利用所述的引物组检测肠道出血性大肠埃希氏菌中的应用，利用上述引物组在检测肠道出血性大肠埃希氏菌的微流控芯片中的应用，尤其是利用环介导等温扩增-光谱传感器-人工智能技术平台检测肠道出血性大肠埃希氏菌。
又一方面，本发明还提供了一种肠道出血性大肠埃希氏菌的检测方法，包括：利用LAMP检测技术结合如上所述的引物组对待测样本进行环介导等温扩增；对扩增产物进行分析。
进一步的，所述环介导等温扩增的反应温度为65℃，反应时间为25～30分钟。
进一步的，本检测方法在进行环介导等温扩增前，对所述待测样本经过或者不经过增菌。
进一步的，所述环介导等温扩增的反应在微流控芯片中进行。
进一步的，所述对扩增产物进行分析的方法包括对LAMP反应结果进行光谱分析和/或显色分析。
本发明的有益效果是，本发明利用LAMP技术结合本发明提供的用于检测肠道出血性大肠埃希氏菌的引物组检测肠道出血性大肠埃希氏菌，灵敏度高，特异性好，且可以在1小时内实现肠道出血性大肠埃希氏菌的简便初筛，无需增菌，以满足对肠道出血性大肠埃希氏菌的即时检测。
本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点在说明书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是针对肠道出血性大肠埃希氏菌中的stx1基因序列设计的3组引物组的LAMP反应第30分钟的筛选结果；
图2是肠道出血性大肠埃希氏菌在不同浓度梯度下LAMP反应直接检测结果；
图3是本发明特异性实验的检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例中使用的肠道出血性大肠埃希氏菌(EHEC)标准菌液为BNCC345676(北京北纳创联生物技术研究院，简称“北纳生物”)，样本浓度为约104CFU/mL。沙门氏菌(Sal)标准菌液为ATCC14028(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，简称“海博生物”)、单增李斯特菌(LM)标准菌液为ATCC19114(海博生物)、金黄色葡萄球菌(SA)标准菌液ATCC6538(海博生物)、大肠埃希氏菌(E.coli)标准菌液ATCC25922(海博生物)，各标准菌液样本浓度均为约106CFU/mL。
本发明的实施例中涉及的2×LAMP预混液可以是购买得到的NEB(美国)2×LAMP预混液，也可以是自己配置的，其可以包含有MgSO4，MgSO4的浓度为6mM～12mM，缓冲液、dNTPs、KCl、(NH4)2SO4、Bst DNA polymerase、酚红、灭菌无酶水等。
本发明的实施例中涉及的引物序列可以从生工生物工程(上海)股份有限公司订购。
1、引物的设计与筛选
从NCBI中下载肠道出血性大肠埃希氏菌(EHEC)的中的stx1基因上的保守序列，作为引物设计模板；在引物设计网站(http://primerexplorer.jp/e/)中设计多组LAMP引物组。
通过上述方式，初步设计3组LAMP引物组的序列供选择，各组引物的核苷酸序列如下表1所示：
表1引物设计
使用肠道出血性大肠埃希氏菌标准菌液BNCC345676中提取的基因组DNA作为阳性样本，灭菌纯化水(ddH2O)作为阴性样本，对上述三组引物组分别采用阴性样本和阳性样本各三组进行LAMP扩增实验，观察LAMP反应体系的颜色变化，并在第30分钟进行拍照，如图1所示，其中，第1组阳性样本反应20分钟后开始变色，25分钟后变为橙黄色，阴性样本反应30分钟后仍未变色；第2组阳性样本反应15分钟后开始变色，25分钟后变为黄色，阴性样本反应30分钟后仍未变色；第3组阳性样本反应20分钟后开始变色，25分钟后变为橙黄色，阴性样本反应30分钟后仍未变色；由此可见，第2组引物组的特异性和灵敏度更优，因此，选择第2组引物组作为检测肠道出血性大肠埃希氏菌的引物组。
2、反应条件
经过几轮不同反应条件测试后，最终选定以下条件为最终的试剂配比与反应条件：
(1)引物浓度配比：
表2
工作浓度(μM) 10×引物混合液浓度(μM)
FIP 1.6 16
BIP 1.6 16
F3 0.2 2
B3 0.2 2
LB 0.4 4
(2)10×引物混合液配制：
表3
引物浓度(μM) 引物名称 配制40个反应(μL)
100 FIP 8
100 BIP 8
10 F3 10
10 B3 10
100 LB 2
灭菌纯化水 12
总体积(μL) 50
(3)LAMP反应体系中的引物、2×LAMP预混液和阳性/阴性样本配比：
表4
1个反应(μL)
2×LAMP预混液 6.25
10×引物混合液 1.25
阳性/阴性样本 5.0
所述阳性样本可以是购买的肠道出血性大肠埃希氏菌标准菌液、或者培养的肠道出血性大肠埃希氏菌菌液稀释液，或者肠道出血性大肠埃希氏菌培养的单菌落或者其稀释液，或者接种至不同食品样本中的肠道出血性大肠埃希氏菌。
所述阴性样本可以是灭菌纯化水(ddH2O)。
(4)反应条件
在65℃温度条件下，恒温扩增25～30分钟，有较好的检测结果。
加热可以采用恒温加热装置(水浴锅、金属浴、恒温烘箱、或PCR仪等)进行加热。
3、无需增菌条件下检测肠道出血性大肠埃希氏菌
即时检测方法，适用场景为学校企业机关食堂、家庭自测、冷链运输随时抽检等需要即时检测肠道出血性大肠埃希氏菌的场景，该检测方法简单易操作，从采样到出结果整个流程30～60分钟内完成，无需增菌，即可用于液体食品中肠道出血性大肠埃希氏菌的简便初筛。
第一步、肠道出血性大肠埃希氏菌阳性/阴性样本制备
将浓度为109CFU/ml的肠道出血性大肠埃希氏菌菌液依次用灭菌纯化水(ddH2O)按1/10倍梯度依次稀释，分别得到的浓度为104CFU/ml，103CFU/ml的肠道出血性大肠埃希氏菌阳性样本；将使用灭菌纯化水(ddH2O)作为阴性样本。
第二步、按照上述表3中的方法配制10×引物混合液。
第三步、取第一步中制备的阳性/阴性样本各5μL按照上述表4中的方法配制各反应的LAMP反应体系。
第四步、65℃加热，反应30分钟。
反应结果如图2所示，可见肠道出血性大肠埃希氏菌可被明确检出(颜色变为黄色)，阳性样本为104CFU/ml时，5个阳性样本均变为黄色；阳性样本为103CFU/ml时，5个阳性样本均变为橙红色；同时，阴性样本均未发生明确的颜色变化(10个样本均为紫红色)，综上，肠道出血性大肠埃希氏菌的检出限为104CFU/ml。
4、特异性实验
为了检测肠道出血性大肠埃希氏菌的检测引物组的特异性，分别使用沙门氏菌(Sal)、单增李斯特菌(LM)、金黄色葡萄球菌(SA)和大肠埃希氏菌(E.coli)等其它食源性致病菌进行交叉反应测试。
第一步、交叉测试用肠道出血性大肠埃希氏菌阳性/阴性样本制备
将浓度为104CFU/ml的肠道出血性大肠埃希氏菌菌液为阳性样本，并以各菌液浓度均为106CFU/ml的沙门氏菌标准菌液、单增李斯特菌标准菌液、金黄色葡萄球菌标准菌液和大肠埃希氏菌标准菌液的混合液作为阴性样本；
第二步、按照上述表3中的方法配制10×引物混合液。
第三步、分别取第一步中制备的阳性/阴性样本各5μL，按照上述表4中的方法配制各反应的LAMP反应体系。
第四步、65℃加热，反应25～30分钟。
反应结果如图3所示，可见肠道出血性大肠埃希氏菌可被明确检出(颜色变为黄色)，且反应不受沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌等其他食源性致病菌的影响，各含有沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的各种阴性样本均未发生明确的颜色变化，即未发生明确的LAMP反应。
根据图3的实验结果初步计算大肠埃希氏菌LAMP检测的灵敏度和特异性，根据图3的实验结果统计，20个阳性样本中的20个呈现明确的阳性结果，所以灵敏度计算为：以及20个其它菌种的阴性样本中的20个呈现明确的阴性结果，所以特异性计算为：/>
本检测方法还可以通过环介导等温扩增-光谱传感器-人工智能(LAMP-SpectralSensor-AI)技术平台检测肠道出血性大肠埃希氏菌，可直接使用稀释后的液体食品样本(如牛奶)，注入集成在微流控芯片反应腔中的LAMP反应试剂中进行扩增，扩增产物通过光谱传感器进行分析，并通过AI技术对收集到的光谱信号进行综合判断，从而快速判断样本中是否有肠道出血性大肠埃希氏菌污染，并且光谱检测方法配合AI算法，可以使检测精确度达到分子检测水平。通过将待测样品限制在设备的微流控环境中，降低了样品污染的风险，并将检测所需的样品体积和试剂降到最低，从而进一步降低了筛选和检测的总体成本。该检测技术可用于食品的即时检测，无需增菌，即检即测，30～60分钟内可以得到结果，具有快速、准确、简便、防污染等优点，LAMP扩增在微流控芯片中自动化进行，配合相应的便携式检测设备，组成了一套可以低成本全自动检测食品中肠道出血性大肠埃希氏菌的便携式检测产品，随时随地无缝测试，在家庭、运输、突发公共卫生事件中进行快速、精准、自动化操作的检测，对建立食品安全监控体系具有重要意义。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (9)

1.一种用于检测肠道出血性大肠埃希氏菌的引物组，其特征在于，所述引物组包含引物的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.1：5’-CTCTGCAATAGGTACTCCAT-3’；
SEQ ID NO.2：5’-TGTTAACAAATCCTGTCACAT-3’；
SEQ ID NO.3：
5’-TTATCCCCTGTGCCACTATCATTTTTACAGACTATTTCATCAGGAGG-3’；
SEQ ID NO.4：
5’-TTGTTTGCAGTTGATGTCAGAGGTTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA-3’；
SEQ ID NO.5：5’-AGATCCAGAGGAAGGGCGGTTT-3’。
2.根据权利要求1所述的引物组在制备肠道出血性大肠埃希氏菌试剂盒中的应用。
3.根据权利要求1所述的引物组在检测肠道出血性大肠埃希氏菌中的应用。
4.根据权利要求1所述的引物组在检测肠道出血性大肠埃希氏菌的微流控芯片中的应用。
5.一种肠道出血性大肠埃希氏菌的检测方法，其特征在于，包括：
利用LAMP检测技术结合如权利要求1所述的引物组对待测样本进行环介导等温扩增；
分析扩增产物的结果。
6.根据权利要求5所述的肠道出血性大肠埃希氏菌的检测方法，其特征在于，
所述环介导等温扩增的反应温度为65℃，反应时间为25～30分钟。
7.根据权利要求5所述的肠道出血性大肠埃希氏菌的检测方法，其特征在于，
在进行环介导等温扩增前，对所述待测样本经过或者不经过增菌。
8.根据权利要求7所述的肠道出血性大肠埃希氏菌的检测方法，其特征在于，
所述环介导等温扩增的反应在微流控芯片中进行。
9.根据权利要求5所述的肠道出血性大肠埃希氏菌的检测方法，其特征在于，
所述分析扩增产物的结果的方法包括对LAMP反应结果进行光谱分析和/或显色分析。
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