CN117597360A - 脑信号蛋白-4d结合分子在rett综合征治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于缓解患有Rett综合征的对象症状的方法，包括向对象给予有效量的特异性结合脑信号蛋白‑4D(SEMA4D)的分离的结合分子。

Description

脑信号蛋白-4D结合分子在RETT综合征治疗中的应用

毛艺霖(Matthew Yilin Mao)

W·戈尔德(Wendy Gold)

E·E·埃文斯(Elizabeth E.Evans)

M·造德尔(Maurice Zauderer)

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用纳入本文。在2020年6月24日创建的所述ASCII副本被命名为8555_039Z_SL.txt，大小为29,049字节。

背景技术

Rett综合征(RTT)是一种神经发育障碍，主要由X连锁基因甲基CpG-结合蛋白2(MECP2)突变引起。Rett综合征主要影响女孩，是继唐氏综合征之后第二常见的严重智力残疾原因，发生率为10000例活产中1例。患者患有认知和身体残疾，其中大多数患者被轮椅束缚，需要全职护理。迄今为止还没有治愈方法，然而，6-18个月的晚期发病为治疗干预提供了宝贵的机会窗口。实验模型Mecp2缺陷小鼠可用于临床前研究。RTT研究的一个重要贡献是概念证明，MeCP2在MeCP2缺陷小鼠中的再表达，特别是在星形胶质细胞中，与完全空白的小鼠相比显著改善了运动和焦虑水平，将呼吸异常恢复到正常模式，大大延长了寿命。这些研究表明，胶质细胞和神经元一样，是RTT神经病理学的组成部分。(Lioy等人，Nature，475(7357):497-500(2012))。这一里程碑式的成就，即Mecp2在突变小鼠中的表达得以恢复，导致其“Rett样表型”显著恢复，增加了寻找治愈方法的动力。然而，仍然需要治疗Rett综合征，以缓解与该疾病相关的症状。

发明内容

本文公开了使用脑信号蛋白4D(SEMA4D)结合分子来减轻Rett综合征患者症状的方法。根据本文所示的公开内容的方面，提供了一种改善患有Rett综合征的对象的症状的方法，包括向对象给予有效量的特异性结合SEMA4D并抑制、阻抑、预防、逆转或减缓SEMA4D对疾病进展的影响的分离的结合分子。

根据本文所示的方面，提供了一种治疗患有Rett综合征的对象的方法，包括向对象给予有效量的特异性结合SEMA4D的分离的结合分子，其中与SEMA4D结合用于改善与疾病相关的症状。

本发明提供了减轻患有Rett综合征的对象症状的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合SEMA4D的分离的结合分子。在方法的某些实施方式中，结合分子抑制SEMA4D与其受体或其受体部分的相互作用。在方法的某些实施方式中，所述受体选自丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和CD72。在方法的某些实施方式中，结合分子抑制SEMA4D介导的丛蛋白-B1信号转导。在方法的某些实施方式中，分离的结合分子特异性结合与选自VX15/2503、MabD2517、D2585和Mab 67的参考单克隆抗体相同的SEMA4D表位。在方法的某些实施方式中，分离的结合分子竞争性抑制选自VX15/2503、Mab D2517、D285和Mab 67的参考单克隆抗体特异性结合SEMA4D。在方法的某些实施方式中，分离的结合分子包含抗体或其抗原结合片段。在方法的某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体VX15/2503或MAb67。在方法的某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述可变重链包含VHCDR1-3，所述VHCDR1-3分别包含SEQ ID NO3、4和5，所述可变轻链包括VLCDR1-3，分别包括SEQ ID NO 8、9和10。在方法的某些实施方式中，VH和VL分别包含SEQID NO:6和SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:25。在方法的某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含VHCDR1-3，所述VHCDR1-3分别包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24，所述可变轻链包含VLCDR1-3，其分别包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO：28。

在上述任一方法的某些实施方式中，所治疗的症状选自神经精神症状、认知症状、运动功能障碍及其任何组合。在任何上述方法的某些实施方式中，对象具有I期Rett综合征。在某些实施方式中，神经精神症状的缓解包括减少焦虑样行为、减少睡眠障碍、减少焦虑、减少不安，以及它们的任何组合。在某些实施方式中，减轻的症状选自神经精神症状、认知症状、身体发育迟缓、沟通发育迟缓、沟通技能丧失、运动障碍、睡眠障碍、心跳不规则、重复抽动动作、身体震颤及其任何组合。在某些实施方式中，缓解症状包括预防或减少焦虑样行为、增加认知、增加协调、增加运动、促进身体发育、减少身体震颤、减少重复运动、增加运动技能、增加沟通技能、减少睡眠障碍、减少焦虑、减少不安、以及它们的任何组合。

在某些实施方式中，对象处于Rett综合征的II期、III期或IV期。在某些实施方式中，II期、III期或IV期对象表现出选自以下的症状：神经精神症状、认知症状、身体发育迟缓、运动功能障碍、心跳和呼吸不规则、沟通能力下降、脊柱侧弯、睡眠障碍、癫痫发作、胃肠道问题、重复性抽动动作、身体震颤、以及它们的任何组合。在某些实施方式中，缓解症状包括减少焦虑样行为、增加认知、增加协调、增加运动、促进身体发育、减少身体震颤、减少重复运动、增加运动技能、增加沟通技能、减少睡眠障碍、减少焦虑、减少不安、或它们的任何组合。

附图简述

图1显示了用于行为测试的加速旋转棒装置。

图2显示了用于行为测试的高架加迷宫装置。

图3显示了用于测试呼吸模式的全身体积描记仪。

图4A显示了Mecp2小鼠后肢扣爪的程度，从0(无扣爪)到2(最严重)。图4B显示了用对照抗体(-●-WT)治疗的4周龄野生型小鼠，4周龄(症状前)用对照抗体治疗的Mecp2小鼠(-■-P)和用抗SEMA4D抗体治疗的4周龄(症状前)Mecp2小鼠(-▲-T)的后肢扣爪程度。*WT对P，～WT对T，^P对T(WT＝用对照抗体治疗的野生型小鼠；P＝用对照抗体治疗的Rett小鼠；T＝用抗SEMA4D抗体治疗的Rett小鼠)。*,～,和^p≤0.05；**～～,和^^p≤0.01；***,～～～,和^^^p≤0.001。

图5以图形方式显示了用对照抗体处理的年龄匹配的野生型小鼠(-●-WT)、用对照抗体治疗的症状前Mecp2小鼠(-■–P)和用抗SEMA4D抗体(-▲-T)治疗的症状前Mecp2小鼠表现出的全身震颤。*WT对P，～WT对T，^P对T(WT＝用对照抗体治疗的野生型小鼠；P＝用对照抗体治疗的Rett小鼠；T＝用抗SEMA4D抗体治疗的Rett小鼠)。*,～,和^p≤0.05；**～～,和^^p≤0.01；***,～～～,和^^^p≤0.001。*,～,和^p≤0.05；**～～,和^^p≤0.01；***,～～～,和^^^p≤0.001。

图6以图形方式显示了在十周间，在加速旋转棒装置上对年龄匹配的症状前和野生型小鼠的运动和协调能力测试结果：用对照抗体(-●-WT)治疗4周龄野生型小鼠，用对照抗体治疗4周龄(症状前)Mecp2小鼠(-■–P)，和用抗SEMA4D抗体治疗4周龄(症状前)Mecp2小鼠(-▲-T)。*WT对P，～WT对T，^P对T(WT＝用对照抗体治疗的野生型小鼠；P＝用对照抗体治疗的Rett小鼠；T＝用抗SEMA4D抗体治疗的Rett小鼠)。*,～,和^p≤0.05；**～～,和^^p≤0.01；***,～～～,和^^^p≤0.001。

图7以图形方式显示了在十周间使用高架加迷宫(EPM)装置对年龄匹配的症状前Mecp2和野生型小鼠进行认知测试的结果。图7A显示了在设备的开放臂区域中花费的时间百分比；图7B显示了进入设备开放臂区域的百分比：用对照抗体(-●-WT)治疗4周龄野生型小鼠，用对照抗体治疗4周龄(症状前)Mecp2小鼠(-■–P)，和用抗SEMA4D抗体治疗4周龄(症状前)Mecp2小鼠(-▲-T)。*WT对P，～WT对T，^P对T(WT＝用对照抗体治疗的野生型小鼠；P＝用对照抗体治疗的Rett小鼠；T＝用抗SEMA4D抗体治疗的Rett小鼠)。*,～,和^p≤0.05；**～～,和^^p≤0.01；***,～～～,和^^^p≤0.001。

图8以图形方式显示了九周内年龄匹配的野生型和Mecp2小鼠的全身体积描记图测试结果。图8A显示了吸气期；图8B显示了呼气期：用对照抗体(-●-WT)治疗4周龄野生型小鼠，用对照抗体治疗4周龄(症状前)Mecp2小鼠(-■–P)，和用抗SEMA4D抗体治疗4周龄(症状前)Mecp2小鼠(-▲-T)。*WT对P，～WT对T，^P对T(WT＝用对照抗体治疗的野生型小鼠；P＝用对照抗体治疗的Rett小鼠；T＝用抗SEMA4D抗体治疗的Rett小鼠)。*,～,和^p≤0.05；**～～,和^^p≤0.01；***,～～～,和^^^p≤0.001。

图9用图示显示了用对照抗体(-●-WT)治疗的8周龄野生型小鼠，8周龄(症状前)用对照抗体治疗的Mecp2小鼠(-■-P)和用抗SEMA4D抗体治疗的8周龄(症状前)Mecp2小鼠(-▲-T)的后肢扣爪程度。*WT对P，～WT对T，^P对T(WT＝用对照抗体治疗的野生型小鼠；P＝用对照抗体治疗的Rett小鼠；T＝用抗SEMA4D抗体治疗的Rett小鼠)。*,～,和^p≤0.05；**～～,和^^p≤0.01；***,～～～,和^^^p≤0.001。

图10以图形方式显示了用对照抗体治疗的年龄匹配的野生型小鼠(-●-WT)、用对照抗体治疗的8周龄有症状Mecp2小鼠(-■–P)和用抗SEMA4D抗体(-▲-T)治疗的有症状Mecp2小鼠表现出的全身震颤。*WT对P，～WT对T，^P对T(WT＝用对照抗体治疗的野生型小鼠；P＝用对照抗体治疗的Rett小鼠；T＝用抗SEMA4D抗体治疗的Rett小鼠)。*,～,和^p≤0.05；**～～,和^^p≤0.01；***,～～～,和^^^p≤0.001。

图11以图形方式显示了在十周间，在加速旋转棒装置上对年龄匹配的有症状和野生型小鼠的运动和协调能力测试结果：用对照抗体(-●-WT)治疗8周龄野生型小鼠，用对照抗体治疗8周龄(有症状)Mecp2小鼠(-■–P)，和用抗SEMA4D抗体治疗8周龄(有症状)Mecp2小鼠(-▲-T)。*WT对P，～WT对T，^P对T(WT＝用对照抗体治疗的野生型小鼠；P＝用对照抗体治疗的Rett小鼠；T＝用抗SEMA4D抗体治疗的Rett小鼠)。*,～,和^p≤0.05；**～～,和^^p≤0.01；***,～～～,和^^^p≤0.001。

图12以图形方式显示了在十周间使用高架加迷宫(EPM)装置对年龄匹配的有症状Mecp2和野生型小鼠进行认知测试的结果。图12A显示了在设备的开放臂区域中花费的时间百分比；图12B显示了进入设备开放臂区域的百分比：用对照抗体(-●-WT)治疗8周龄野生型小鼠，用对照抗体治疗8周龄(有症状)Mecp2小鼠(-■–P)，和用抗SEMA4D抗体治疗8周龄(症状前)Mecp2小鼠(-▲-T)。*WT对P，～WT对T，^P对T(WT＝用对照抗体治疗的野生型小鼠；P＝用对照抗体治疗的Rett小鼠；T＝用抗SEMA4D抗体治疗的Rett小鼠)。*,～,和^p≤0.05；**～～,和^^p≤0.01；***,～～～,和^^^p≤0.001。

图13以图形方式显示了九周内年龄匹配的野生型和Mecp2小鼠的全身体积描记图测试结果。图13A显示了吸气期；图13B显示了呼气期：用对照抗体(-●-WT)治疗8周龄野生型小鼠，用对照抗体治疗8周龄(症状前)Mecp2小鼠(-■–P)，和用抗SEMA4D抗体治疗8周龄(症状前)Mecp2小鼠(-▲-T)。*WT对P，～WT对T，^P对T(WT＝用对照抗体治疗的野生型小鼠；P＝用对照抗体治疗的Rett小鼠；T＝用抗SEMA4D抗体治疗的Rett小鼠)。*,～,和^p≤0.05；**～～,和^^p≤0.01；***,～～～,和^^^p≤0.001。

图14显示了约8个月大的雌性小鼠(Mecp2^T158A和野生型同窝对照C57/BL6)的脑福尔马林固定石蜡包埋切片，其中针对SEMA4D(CD100多克隆抗体-Invitrogen-PA5-47711)和神经元标志物HuC/HuD(HuC/Hu D单克隆抗体(16A11)-Invitrigen:A-1271)染色。显示了海马区的代表性图像。图14A：C57/BL6小鼠，对SEMA4D染色；图14B：C57/BL6小鼠，对HuC/HuD染色；图14C：Mecp2^T158A小鼠，对SEMA4D染色；图14D：Mecp2^T158A小鼠，对HuC/HuD染色。

具体实施方式

I.定义

应注意，术语“一个”或“一种”实体指一种或多种该实体；例如，“一种抗SEMA4D抗体”应理解为代表一种或多种抗SEMA4D抗体。如此，本文所述术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。

此外，本文所用“和/或”应被视作具体公开了两种特征或组分的每一种，伴随或不伴随另一种。因此，本文短语“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、和“B”(单独)。类似地，在例如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方式中的每一种：A、B、和C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

除非另有定义，本文使用的科技术语与本公开所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。例如，《生物医药和分子生物学简明词典》(Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology)，Juo,Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社(CRCPress)；《细胞和分子生物学词典》(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第3版，1999，学术出版社(Academic Press)；和《牛津生物化学和分子生物学辞典》(OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修订，2000，牛津大学出版社(Oxford University Press)，向技术人员提供了本公开使用的很多术语的常用词典。

单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数值。除非另外说明，氨基酸以氨基到羧基的取向从左到右书写。本文提供的标题不是本公开各种方面或某方面的限制，可以参考说明书整体理解本公开的各种方面或实施方式。因此，下面紧接着定义的术语完全参考说明书全文定义。

本文所用术语“非天然产生的”物质、组合物、实体，和/或物质、组合物、实体的任意组合，或其任意语法变化形式是条件术语，其明确排除，但仅排除本领域普通技术人员熟知的“天然产生的”，或者可以是在任何时间，由法官或行政机关或司法机关确定或理解为“天然产生的”物质、组合物、实体，和/或物质、组合物、实体的任意组合的那些形式。

如本文所用，术语“神经发育障碍”是指大脑或中枢神经系统的生长和发育障碍。该术语指的是大脑功能紊乱，其影响情绪、学习能力、自控力、运动控制和记忆，并随着个体的成长而发展，即紊乱的过程随时间而变化。Rett综合征是一种罕见的遗传性神经和发育障碍(一种X连锁神经发育障碍)，它影响大脑的发育方式，导致运动功能和言语的逐渐丧失。

如本文所使用的，术语“Rett综合征”(RTT)指的是一种进展性疾病，最初表现在人类约6至18个月大时，随后是一段停滞期，然后是运动和语言功能的快速退化。Rett综合征几乎轻易影响孩子生活的方方面面：说话、走路、吃饭，甚至呼吸。症状包括语言、协调和重复动作方面的问题。通常会出现生长缓慢、失去正常的运动和协调能力、失去沟通能力、不寻常的眼球运动，例如，强烈的凝视、眨眼、对眼或一次闭一只眼睛、呼吸问题、易怒、认知障碍、心跳不规则，以及小于正常的头部大小。并发症可能包括癫痫发作、脊柱侧弯、睡眠问题以及呼吸问题。Rett综合征的特征是几乎持续的重复性手部运动。然而，患者可能受到不同程度的影响。总的来说，该疾病以四个“阶段”的顺序展开，随着疾病的发展，这些阶段包含了对象的特定变化。患有经典RTT的对象(主要是女孩)有一个明显正常的正常发育期，在大约6-18个月龄时，出现了该疾病的早期症状。在疾病的第1阶段，出现发育停滞和/或延迟，对象停止达到预期的发育里程碑。接下来是第二阶段，即快速消退期，对象在1岁至4岁之间失去了沟通和社交等后天技能，同时也失去了一些精细和粗略的运动技能。此外，可能发生头部发育延迟。正是在这一时期，RTT的一个标志——刻板的手部动作变得明显。(Temudo,等人(2007)Abnormal movements in Rett syndrome are present before theregression period:a case study.Mov.Disord.22,2284-2287；Einspieler等人(2005)Isthe early development of girls with Rett disorder really normal？Pediatr.Res.57,696-700.)第三阶段是消退后阶段，表型稳定。在这段时间里，许多对象会产生强烈的眼神凝视，并提高社会意识。他们也可能部分恢复在第二阶段失去的一些技能。最后一个阶段，即第四阶段，是后期运动退化阶段，可能持续数年至数十年。这一阶段的特点是活动能力下降、肌肉无力、僵硬和痉挛，随着对象年龄的增长，出现肌张力障碍和手足畸形。可能不再行走，但眼睛凝视通常会改善，重复的手部动作可能会减少，认知、沟通或手部技能通常不会下降。

术语“治疗有效量”是指对“治疗”对象或哺乳动物中的疾病或病症而言有效的抗体、多肽、多核苷酸、小有机分子或其他药物的量。在神经发育障碍的情况下，治疗有效量的药物可以缓解该障碍的症状；减少、减轻、延缓或停止症状的发生；减少、减轻、延缓症状的严重程度；抑制，例如阻抑、延缓、预防、停止或逆转症状的表现；在某种程度上缓解与该病症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；提高生活质量；或这些效果的组合。

本文所指的术语“症状”是指，例如，1)神经精神症状，2)认知症状，和3)运动功能障碍。例如，神经精神症状的例子包括焦虑样行为、睡眠障碍和易怒。例如，认知症状的例子包括学习和记忆缺陷。运动功能障碍的例子包括例如，运动或协调困难或重复性运动，例如，手部运动，如绞手。

术语例如“处理”或“治疗”或“以治疗”或“缓解”或“以缓解"或“改善”或“以改善”指的是1)治愈、减缓、减少已经诊断的病理病症或紊乱的症状，逆转和/或截停已经诊断的病理病症或紊乱的进展的治疗性措施和2)预防和/或减缓目标病理病症或紊乱的发展的预防或预防性措施。因此，需要治疗的那些(对象)包括已经患有疾病的那些(对象)；易于患有疾病的那些(对象)；和需要预防疾病的那些(对象)。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病的稳定(即，不恶化)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓解，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以指与不接受治疗的期望存活相比延长生存期。需要治疗的人包括那些已经表现出疾病或病症的症状的人以及无症状的对象。

脑信号蛋白4D(SEMA4D)，也称作CD100，是一种属于脑信号蛋白基因家族的跨膜蛋白(例如SEQ ID NO:1(人)；SEQ ID NO:2(鼠))。SEMA4D在细胞表面上表达为同二聚体，但在细胞激活之后，SEMA4D可通过蛋白水解切割从细胞表面上释放以生成该蛋白质的溶解形式sSEMA4D，其也是有生物活性的。参见Suzuki等，Nature Rev.Immunol.3:159-167(2003)；Kikutani等，Nature Immunol.9:17-23(2008)。SEMA4D在包括脾脏、胸腺和淋巴结的淋巴器官中以及如脑、心脏和肾脏的非淋巴器官中以高水平表达。SEMA4D在神经系统发育中作为轴突指导蛋白发挥重要作用，并与神经退行性疾病、自身免疫性疾病、脱髓鞘疾病和某些癌症的发展有关。然而，阻断SEMA4D信号转导对中枢神经系统(CNS)(包括大脑和脊髓)的组织和功能以及由CNS控制的行为的影响仍有待阐明。这很重要，因为中枢神经系统的变化对对象的行为和生活质量有着深远的影响。特别是，这种变化会影响对象的神经精神行为、认知行为和运动技能。

述及“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”，其指需要诊断、预防或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象，例如人。

如本文所使用的，诸如“将受益于给予抗SEMA4D抗体的对象”和“需要治疗的动物”的短语包括对象，例如哺乳动物对象，其将受益于给予抗SEMA4D抗体或例如用于检测SEMA4D多肽(例如，用于诊断程序)的其它SEMA4D结合分子以及受益于减轻或预防Rett综合征的症状发展的治疗。

本文提供的“结合分子”或“抗原结合分子”在其最广泛的意义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。在一个实施方式中，结合分子特异性结合SEMA4D，例如，约150kDa的跨膜SEMA4D多肽或约120kDa的可溶性SEMA4D(通常称为SEMA4D)。在另一个实施方式中，本公开的结合分子是抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，本公开的结合分子包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方式中，本公开的结合分子包含来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方式中，本公开的结合分子包含来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方式中，本公开的结合分子包含来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方式中，本公开的结合分子包含来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方式中，本公开的结合分子包含来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。

本发明涉及一种减轻患有称为Rett综合征的神经发育障碍的对象症状的方法，包括向对象给予抗SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或其衍生物。除非特别提到完整大小的抗体如天然产生的抗体，术语“抗-SEMA4D抗体”包括完整大小的抗体以及这种抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然产生的抗体或免疫球蛋白分子，或以类似于抗体分子的方式结合抗原的经工程改造的抗体分子或片段。

本文中所用的"人"或“完全人”抗体包括，具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，且包括从人免疫球蛋白文库分离或来自一种或多种人免疫球蛋白的动物转基因的抗体，并且其不表达内源性免疫球蛋白，如下文所述，例如，描述于Kucherlapati等的美国专利号5,939,598。“人”或“完全人”抗体还包括至少包含重链可变结构域或至少包含重链和轻链的可变结构域的抗体，其中可变结构域具有人免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列。

如上所述，“人”或“全人”抗体还包括“人”抗体或“全人”抗体，其包含、基本上由或由本文所述抗体分子(例如VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)组成，所述抗体或其片段与SEMA4D多肽或其片段或变体免疫特异性结合。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码人抗-SEMA4D抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。在一些实施方式中，所述变体(包括衍生物)编码相对于参考VH区、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL区、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代，少于30个氨基酸取代，少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代，少于15个氨基酸取代，少于10个氨基酸取代，少于5个氨基酸取代，少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。

在某些实施方式中，氨基酸取代是保守的氨基酸取代，下面将进一步讨论。或者，可以沿着编码序列的全部或部分随机引入突变，例如通过饱和诱变，且可筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体(例如，结合SEMA4D多肽的能力，例如，人、鼠或人和鼠SEMA4D)。这种“人”或“全人”抗体的变体(或其衍生物)也可以被称为“优化”或“针对抗原结合优化”的人或全人抗体，并且包括对抗原具有改进亲和力的抗体。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中互换使用。抗体或免疫球蛋白至少包含重链可变结构域，并且通常至少包含轻链和重链的可变结构域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对较好地了解的。参见例如，Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibodies:ALaboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)。

如本文所使用的，术语“免疫球蛋白”包括可以在生物化学上区分的各种各样的多肽。本领域技术人员将认识到，重链被分类为gamma、mu、alpha、delta、或epsilon，(γ、μ、α、б、ε)，其中有一些亚类(例如，γ1-γ4、γ4.Υ4)。该链的特性决定抗体“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等已被充分表征，且已知提供功能性特化。根据本文公开内容，本领域技术人员不难区分这些类别和同种型的修饰形式，因此，它们涵盖在本公开范围内。所有免疫球蛋白家族都清楚地在本公开的范围内，下面的讨论通常将针对免疫球蛋白分子的IgG家族。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包含两个分子量约23000道尔顿的相同轻链多肽和两个分子重量53000-70000的相同重链多肽。这四条链通常由二硫键以“Y”构型连接，其中轻链在重链相对外侧(bracket)，重链从“Y”口开始，并通过可变区继续。

轻链被分类为kappa或lambda(，λ)。每个重链类都可以与kappa轻链或lambda轻链结合。通常，轻链和重链互相共价结合，并且当由杂交瘤、B细胞或遗传工程改造的宿主细胞生成免疫球蛋白时，两条重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价连接结合在一起。在重链中，氨基酸从Y构型的分叉末端处的N-端到各条链的底部处的C-端。

轻链和重链都被划分成具有结构和功能同源性的区域。从功能角度使用术语“恒定”和“可变”。在这方面，应理解轻(VL或VK)链或重(VH)链部分的可变区决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(通常为CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予重要生物学特性，例如分泌、跨胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照习惯，恒定区结构域的编号随着远离抗原结合位点或抗体的N末端而增加。N末端部分是可变区，并且C末端部分是恒定区；CH3和CL结构域通常分别包括重链和轻链的羧基端。

如上所述，可变区允许抗体选择性地识别抗原上的表位并特异性地结合该表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域、或这些可变结构域中的互补决定区(CDR)亚组组合形成确定三维抗原结合位点的可变区。该四元抗体结构形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由VH和VL链每一条上的三个CDR定义。在某些情况下，例如，源自骆驼物种或基于骆驼免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子，一个完整的免疫球蛋白可只由重链组成，没有轻链。见例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448(1993)。

在天然存在的抗体中，各抗原结合结构域中存在的六个“互补决定区”或“CDR”是氨基酸的非连续短序列，其特异性地定位，以随着抗体在水性环境中采用其三维构型而形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸称为“构架”区，显示较小的分子间差异。构架区主要采用β-片层构象，并且CDR形成连接β-片层结构的环，而在某些情况中形成β-片层结构的部分。因此，构架区用于通过链间非共价相互作用形成为CDR提供正确方向位置的支架。定位的CDR形成的抗原结合结构域确定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进了抗体与其互补表位的非共价结合。分别包含CDR和构架区域的氨基酸，可由本领域普通技术人员通过任何给定的重或轻链可变区而容易地鉴定，因为它们已以多种不同的方式被定义(见下文)。

除非明确表述为相反的含义，否则在本领域内所使用和/或接受的某一术语有两种或多种定义的情况下，本文所用的术语定义应包括所有这些含义。具体示例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非毗连抗原结合位点。Kabat等人(1983年)美国卫生与公共服务部"Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest"和Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987年)对该特定区域进行了描述，其通过引用并入本文，其中定义当相互比较时包括氨基酸残基的重叠或子集。不过，述及抗体或其变体的CDR定义意在落在本文定义或所用术语范围之内。合适的氨基酸残基包括上文引用的各参考文献中定义的CDR，如下表1所示以作对比。包含特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员能够常规地确定哪些残基包含具体CDR。

表1

CDR定义

¹表1中所有CDR定义的编号均按照Kabat等所述的编号规则(见下文)。

Kabat等还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员能明确地将所述“Kabat编号”系统应用于任何可变区序列，而不依赖序列本身外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指Kabat等人(1983)美国卫生与公共服务部，“Sequence of Proteins of Immunological Interest.”提出的编号系统。除非另有规定，否则本公开的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统。

本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括但不限于，多克隆、单克隆、多特异性和双特异性(其中至少一条臂对于SEMA4D特异性)，人、人源化的、灵长类化的或嵌合抗体、单链抗体、表位-结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')₂、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、通过Fab表达文库产生的片段，和抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如本文公开的抗-SEMA4D抗体的抗-Id抗体)。ScFv分子是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号5,892,019。本公开的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或小类的免疫球蛋白分子。

本文所用的术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。在某些实施方式中，包含重链部分的多肽包含以下至少一种：VH结构域、CH1结构域、铰链(例如，上铰链区、中铰链区和/或下铰链区)结构域、CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。例如，用于本公开的结合多肽可以包括包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链，或包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本公开的多肽包括含CH3结构域的多肽链。此外，用于本公开的结合多肽可以缺少至少一部分CH2结构域(例如，全部或部分CH2结构域)。如上所述，本领域普通技术人员应理解，可修饰这些结构域(例如重链部分)，从而其氨基酸序列不同于天然存在的免疫球蛋白分子。

在本文公开的某些抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与多聚体第二条多肽链上的重链部分相同。或者，本发明含有重链部分的单体是不同的。例如，各单体可以包含不同的靶结合位点，形成例如双特异性抗体。

本文公开的方法中使用的结合分子的重链部分可以衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含从IgG1分子衍生的C_H1结构域和从IgG3分子衍生的铰链区。在另一个示例中，重链部分可包含部分衍生自IgG1分子、部分衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个示例中，重链部分可以包括部分衍生自IgG1分子、部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。

如本文所用，术语“轻链部分”包含衍生自免疫球蛋白轻链(例如，κ或λ轻链)的氨基酸序列。在一些方面，轻链部分包含VL或CL结构域中的至少一种。

本文公开的抗SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可就其识别或特异性结合的抗原的表位或部分方面被描述或说明，例如，本文公开的靶多肽(例如，SEMA4D)。靶多肽与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶多肽可包含单个表位，但通常包含至少两个表位，并可包括任意数量的表位，这取决于抗原的大小、构象和类型。此外，应注意，靶多肽上的表位摂可以是或可以包含非多肽元件，例如，表位可包含碳水化合物侧链。

抗体的肽或多肽表位的最小大小被认为是大约四到五个氨基酸。肽或多肽表位可包含例如至少七个、至少九个或至少约15至约30个氨基酸。由于CDR可以识别三级形式下的抗原肽或多肽，因此包含表位的氨基酸不需要是连续的，且在某些情况下可位于分开的肽链上。本文中被抗SEMA4D抗体识别的肽或多肽表位可包含SEMA4D的至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20个、至少25个或约15至约30个连续或非连续氨基酸。

“特异性结合”通常是指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且结合需要抗原结合结构域和表位之间的一些互补性。按照这一定义，当抗体通过其抗原结合结构域与表位结合比其与随机、无关的表位结合更容易时，称该结合分子“特异性结合”该表位。本文中使用术语“特异性”定性分析某一抗体与某一表位结合的相对亲和性。例如，可认为抗体“A”比抗体“B”对给定表位具有更高特异性，或者可以说抗体“A”以比其对相关表位“D”的特异性更高的特异性结合表位“C”。

“优先结合”指的是抗体对某表位的特异性结合比其对相关、类似、同源或相似表位的可能的结合更加容易。因此，相比相关的表位，"优先结合"至给定表位的抗体将更可能结合至该表位，即便所述抗体可能与该相关表位交叉反应也是如此。

作为非限制性实例，如果抗体以小于抗体对第二表位的解离常数(KD)的KD结合第一表位，则可以认为抗体优先结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比抗体对第二表位的KD小至少一个数量级的亲和力结合第一表位，则可以认为抗体优先结合第一抗原。在另一非限制性实例中，如果抗体以比抗体对第二表位的KD小至少两个数量级的亲和力结合第一表位，则可以认为抗体优先结合第一表位。

在另一个非限制性实例中，如果抗体以小于抗体对第二表位的解离率(k(off))的k(off)结合第一表位，则可以认为抗体优先结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比抗体对第二表位的K(off)小至少一个数量级的亲和力结合第一表位，则可以认为抗体优先结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比抗体对第二表位的K(off)小至少两个数量级的亲和力结合第一表位，则可以认为抗体优先结合第一表位。本文公开的抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可以被称为结合本文公开的靶多肽(例如SEMA4D，例如人、鼠或人和鼠SEMA4D)或其片段或变体，其解离率(k(off))小于或等于5X 10^-2秒^-1、10^-2秒^-1、5X 10^-3秒^-1或10^-3秒^-1。在某些方面，本公开的抗体可以被称为结合本文公开的靶多肽(例如，SEMA4D，例如，人、鼠或人和鼠SEMA4D)或其片段或变体，其解离率(k(off))小于或等于5X 10^-4秒^-1、10^-4秒^-1、5X 10^-5秒^-1或10^-5秒^-1、5x10^-6秒^-1，10^-6秒^-1，5x10^-7秒^-1或10^-7秒^-1。

本文公开的抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可以被称为结合本文公开的靶多肽(例如SEMA4D，例如人、鼠或人和鼠SEMA4D)或其片段或变体，其结合率(k(on))大于或等于10³秒^-1、5x 10³秒^-1、10⁴秒^-1、或5x 10⁴秒^-1。在一些实施方式中，本公开的抗体可被称为结合本文公开的靶多肽(例如，SEMA4D，例如，人、鼠或人和鼠SEMA4D)或其片段或变体，其结合速率(k(on))大于或等于10⁵M^-1秒^-1、5X 10⁵M^-1秒^-1、10⁶M^-1秒^-1或5X 10⁶M^-1秒^-1或10⁷M^-1秒^-1。

如果抗体优先与给定表位结合，其一定程度上阻断参考抗体与表位的结合，则称抗体竞争性地抑制参考抗体与该表位的结合。可通过本领域已知的任意方法确定竞争性抑制，例如，竞争ELISA试验。可以说抗体竞争性地抑制参考抗体与给定表位的结合至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。

如本文所用，术语“亲和力”是指单个表位与免疫球蛋白分子CDR结合强度的量度。参见例如，Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)，第27-28页。本文中所用的术语“亲合力(avidity)”指的是免疫球蛋白群体和抗原之间的复合物的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度。参见，例如，Harlow，第29-34页。亲合力既与群体中单独免疫球蛋白与特定表位的亲和力相关，也与免疫球蛋白分子和抗原的价态相关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复表位结构的抗原例如多聚体之间的相互作用是具有高亲合力的一个例子。

本发明的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以根据其交叉反应性来描述或指定。本文所用的术语“交叉反应性”指抗体对某一种抗原具有特异性、与第二种抗原发生反应的能力；它是两种不同抗原性物质之间关联性的量度。因此，如果抗体与诱导其形成的表位以外的其他表位结合，则具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，在某些情况下甚至比原始表位更匹配。

例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关但不相同的表位，例如与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％相同性的表位(如使用本领域已知和本文描述的方法计算的)。如果抗体不结合与参考表位具有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％和小于50％相同性(如使用本领域已知和本文所述的方法计算)的表位，则可以说抗体具有很少或没有交叉反应性。如果一种抗体不与某一表位的任何其他类似物、正交物或同源物结合，则该抗体可被视为对该表位具有“高度特异性”。

本公开的抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，也可以根据其与本公开的多肽，例如SEMA4D，例如人、鼠或人和鼠SEMA4D的结合亲和力来描述或指定。在某些方面，结合亲和力包括解离常数或Kd小于5X10^-2M、10^-2M、5X10^-3M、10^-3M、5X10^{- 4}M、10^-4M、5×10^-5M、10^-5M，5X10M、10^-6M、5X10^-7M、10^-7M，5X10^-8M、10^-8M，5X10^-9M、10^-9M，5X10M、10^-10M、5X10^-11M、10^-11M，5X10^-12M、10^-12M、5X10^-13M、10^-13M、5x10^-14M、10^-14M，5X10^-15M或10^-15M的那些。在某些实施方式中，本发明的抗SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，以约5X10^-9至约6X 10^-9的Kd结合人SEMA4D。在另一个实施方式中，本发明的抗SEMA4D结合分子，例如其抗体或抗原结合片段，以约1X10^-9至约2X10^-9的Kd结合鼠SEMA4D。

本文所用的术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其中免疫反应性区域或位点获自或衍生自第一物种，而恒定区(其可能是完整、一部分或修饰的)获自第二物种。在某些实施方式中，靶标结合区或位点将是来自非人来源(例如，小鼠或灵长类)并且恒定区是人的。

本文中所用的术语“工程改造的抗体”指这样的抗体，其中重链和轻链之一或两者中的可变区通过在来自具有已知特异性的抗体的一个或多个CDR的至少部分替代而被改变，如需要，通过部分框架区置换和序列改变。虽然CDR可衍生自与产生框架区的抗体属于同一类或甚至亚类的抗体，但CDR仍可衍生自不同类别的抗体，例如，不同物种的抗体。将来自具有已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR移植到人重链或轻链构架区内形成的工程改造的抗体在本文中称为“人源化抗体”。并非总是需要用供体可变结构域的完整CDR替换所有CDR以将一个可变结构域的抗原结合能力转移到另一个可变结构域。相反，人们可以只转移那些维持所需目标结合位点活性所需的残基。

进一步认识到，人源化抗体重链或轻链或两者中可变结构域内的框架区可以仅包含人类起源的残基，在这种情况下，人源化抗体的这些框架区被称为“全人框架区”(例如，MAb VX15/2503或67，作为MAb2503公开于美国专利申请公开号US 2010/0285036 A1，其全部内容通过引用并入本文)。或者，如果需要保持与SEMA4D抗原的适当结合或增强与SEMA3D抗原的结合，则供体可变结构域框架区的一个或多个残基可以在人源化抗体的重链或轻链或两者中可变结构域人框架区的相应位置内进行工程改造。以这种方式工程改造的人框架区因此将包含人和供体框架残基的混合物，在本文中称为“部分人框架区”。

例如，抗SEMA4D抗体的人源化基本上可以按照Winter及其同事的方法进行(Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物或突变啮齿动物CDR或CDR序列替换人抗SEMA4D抗体的相应序列。另见美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205；本文通过引用并入。所得的人源化抗SEMA4D抗体将在人源化抗体的重链和/或轻链的可变结构域的全人框架区域内包含至少一种啮齿动物或突变啮齿动物CDR。在某些情况下，人源化抗SEMA4D抗体的一个或多个可变结构域的框架区内的残基被相应的非人(例如啮齿动物)残基取代(例如，参见美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370)，在这种情况下，得到的人源化抗SEMA4D抗体将在重链和/或轻链的可变结构域内部分包含人框架区。

而且，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能(例如，获得期望的亲和力)。通常，人源化抗体将包含几乎所有的至少一个、通常两个可变区，其中全部或基本上全部的CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且全部或基本上全部的框架区是人免疫球蛋白序列的框架区。人源化抗体还任选包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多详情请参见Jones等人，Nature 331:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)；本文通过引用并入。因此，这种“人源化”抗体可以包括这样的抗体，其中基本上少于完整人可变结构域被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些框架残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。见例如，美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。另见美国专利号6,180,370和国际公开号WO01/27160，其中公开了人源化抗体和用于生产对预定抗原具有改进亲和力的人源化抗体的技术。

本文所用术语“医疗服务提供者”是指直接接触或向活的对象(例如人类患者)给予治疗的个人或机构。医疗提供者的非限制性示例包括医生、护士、技师、治疗师、药师、顾问、替代医学从业者、医学设备、医生办公室、医院、急救室、诊所、急救中心、替代医学诊所/设备、和提供关于患者健康状态的全部或任意部分的一般和/或特殊治疗、评价、维持、疗法、医药和/或建议的任意其它实体，包括但不限于一般医学、特殊医学、手术、和/或任何其它类型治疗、评价、维持、疗法、医药和/或建议。

本文所用术语“医疗服务提供者”包括整体或部分提供、赠予、供应、支付，或者与给予患者一种或多种医疗福利、福利计划、健康保险和/或医疗费用账户计划的渠道的个体部门、组织或集团。

如本文所用，术语“临床实验室”指用于检查或处理从活的对象(例如，人)中获得的材料或图像的设施。处理的非限制性实例包括生物学，生物化学，血清学，化学，免疫血液学，血液学，生物物理学，细胞学，病理学，遗传学，基于图像等对衍生自人体或任何或全部人体衍生的材料的检查，目的是提供数据或信息，例如用于诊断、预防或治疗任何疾病或损伤，或评估活体对象(例如，人)的健康状况。这些检查还可包括收集或获得图像，样品，准备、确定、测量或以其它方式描述活的对象(例如，人)身体中或获自活的对象(例如，人)的身体的样品中各种物质的存在或不存在。

II.靶多肽描述

本文所用术语“脑信号蛋白-4D”、“SEMA4D”和“SEMA4D多肽”可互换使用，如“SEMA4D”和“Sema4D”。SEMA4D是一种跨膜信号转导蛋白，参与多种可能增加神经炎症的过程，包括胶质细胞活化、抑制少突胶质细胞和星形胶质细胞迁移、抑制神经发育和诱导凋亡。在某些实施方式中，SEMA4D表达在细胞表面上或由细胞分泌。在另一个实施方式中，SEMA4D是膜结合的。在另一个实施方式中，SEMA4D是可溶的，例如sSEMA4D。在其他实施方式中，SEMA4D可包括完整大小的SEMA4D或其片段，或SEMA4D变体多肽，其中SEMA4D或SEMA4D变体多肽的片段保留完整大小的SEMA4D的一些或全部功能性质。

完整大小的人SEMA4D蛋白质是由2条150kDa的多肽链组成的同二聚体跨膜蛋白。SEMA4D属于脑信号蛋白家族细胞表面受体并且也称为CD100。人和小鼠SEMA4D/Sema4D从其跨膜形式经蛋白水解切割以形成120-kDa可溶性形式，指示两种Sema4D同种型的存在(Kumanogoh等,J.Cell Science 116(7):3464(2003))。脑信号蛋白由原始定义为发育过程中轴突引导因子的可溶性和膜结合蛋白组成，所述轴突引导因子在建立神经元与其合适靶标的精确连接中起到重要作用。从结构上考虑，IV类脑信号蛋白，SEMA4D由氨基末端信号序列接着特征性“Sema”结构域组成，其含有17个保守的半胱氨酸残基、Ig-样结构域、富赖氨酸伸长段、疏水性跨膜结构域和胞质尾。

SEMA4D多肽链可包含约13个氨基酸的信号序列，还包括约512个氨基酸的脑信号蛋白结构域，约65个氨基酸的免疫球蛋白样(Ig-样)结构域，104个氨基酸的富赖氨酸伸长段，约19个氨基酸的疏水性跨膜区，和110个氨基酸的胞质尾。胞质尾中酪氨酸磷酸化的共有位点支持SEMA4D与酪氨酸激酶的预测结合(Schlossman等编，(1995)《白细胞定型V》(Leucocyte Typing V)(牛津，牛经大学出版社(Oxford University Press,Oxford)))。

SEMA4D已知具有至少3个功能性受体，丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和CD72。丛蛋白-B1在非淋巴组织中表达并且已经显示为SEMA4D的高亲和性(1nM)受体(Tamagnone等，Cell 99:71-80(1999))。丛蛋白-B1信号转导的SEMA4D刺激已经显示出诱导神经元的生长锥塌陷，并且诱导少突细胞的过程延伸塌陷(process extension collapse)和凋亡(Giraudon等，J.Immunol.172:1246-1255(2004)；Giraudon等，NeuroMolecular Med.7:207-216(2005))。在与SEMA4D结合之后，丛蛋白B1信号转导介导R-Ras的失活，导致整联蛋白介导的胞外基质粘附减少，以及RhoA的激活，导致细胞骨架重新阻止和细胞迁移。参见Kruger等，NatureRev.Mol.Cell Biol.6:789-800(2005)；Pasterkamp,TRENDS in Cell Biology 15:61-64(2005)。另一方面，丛蛋白-B2与SEMA4D具有中等亲和力，最近的报告表明丛蛋白-B2调节成年脑室下区皮质神经元的迁移和神经母细胞的增殖和迁移(Azzarelli等人,Nat Commun2014Feb.27,5:3405,DOI:10.1038/ncomms4405；和Saha等人,J.Neuroscience,2012Nov.21,32(47):16892-16905)。

在淋巴组织中，CD72用作低亲和性(300nM)SEMA4D受体(Kumanogoh等，Immunity13:621-631(2000))。B细胞和APC表达CD72，并且抗-CD72抗体具有许多与sSEMA4D相同的作用，如增强CD40-诱导的B细胞应答和CD23的B细胞脱落。CD72被认为通过招募酪蛋白磷酸酶SHP-1发挥B细胞应答的负调节物的作用，其可与许多抑制性受体联合。SEMA4D与CD72的相互作用导致SHP-1的解离，以及这种负激活信号的失去。已报道SEMA4D促进T细胞刺激和B细胞聚集与存活(体外)。SEMA4D-表达细胞或sSEMA4D的添加在体外增强CD40-诱导的B细胞增殖和免疫球蛋白产生，并且在体内加快抗体应答(Ishida等，Inter.Immunol.15:1027-1034(2003)；Kumanogoh和H.Kukutani，Trends in Immunol.22:670-676(2001))。sSEMA4D增强CD40诱导的树突细胞(DC)成熟，包括共刺激分子上调和增加的IL-12分泌。另外，sSEMA4D可抑制免疫细胞迁移，其可能通过添加阻断性抗-SEMA4D小鼠抗体来逆转(Elhabazi等，J.Immunol.166:4341-4347(2001)；Delaire等，J.Immunol.166:4348-4354(2001))。

Sema4D在包括脾脏、胸腺和淋巴结的淋巴器官中以及如脑、心脏和肾脏的非淋巴器官中以高水平表达。在淋巴器官中，Sema4D在静息T细胞上大量表达，但是仅在静息B细胞和抗原呈递细胞(APC)如DC上弱表达。细胞激活增加了SEMA4D的表面表达以及可溶性SEMA4D(sSEMA4D)的生成。

SEMA4D的表达特性表明其在免疫系统中起到重要的生理和病理作用。SEMA4D已经显示促进B细胞激活、聚集和存活；增强CD40-诱导的增殖和抗体产生；增强对T细胞以来抗原的抗体响应；增加T细胞增殖；增强树突细胞成熟和刺激T细胞的能力；和直接涉及脱髓鞘和轴突变性(Shi等，Immunity 13:633-642(2000)；Kumanogoh等，J Immunol 169:1175-1181(2002)；和Watanabe等，J Immunol 167:4321-4328(2001))。

SEMA4D敲除(SEMA4D-/-)小鼠提供了额外的证据，表明SEMA4D在体液和细胞免疫应答中都发挥着重要作用。SEMA4D-/-小鼠的非淋巴组织没有已知的主要异常。来自SEMA4D-/-小鼠的DC具有较差的同种刺激能力，并显示共刺激分子的表达缺陷，这可以通过添加sSEMA4D来挽救。SEMA4D缺陷(SEMA4D-/-)的小鼠无法发展由髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白肽诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎，因为在缺乏SEMA4D的情况下髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白特异性T细胞生成较差(Kumanogoh等人，J Immunol 169:1175-1181(2002))。在自身免疫倾向性MRL/lpr小鼠(系统性自身免疫疾病如SLE的模型)的血清中也检测到大量可溶性SEMA4D，但在正常小鼠中没有检测到。此外，sSEMA4D的水平与自身抗体的水平相关，并且随着年龄的增长而增加(Wang等人，Blood 97:3498-3504(2001))。可溶性SEMA4D也已显示聚集在脱髓鞘疾病患者的脑脊髓液和血清中，并且sSEMA4D诱导人多能神经前体(Dev细胞)的凋亡，并且在体外抑制过程延伸并诱导大鼠少突胶质细胞的凋亡(Giraudon等人，JImmunol 172(2):1246-1255(2004))。这种凋亡被抗-SEMA4D Mab阻断。

发明人先前已经表明，在进行性神经退行性疾病(包括亨廷顿舞蹈症和阿尔茨海默氏症)和这些疾病的动物模型的过程中，实验动物和经历应激或损伤的患者的大脑中的神经元上调SEMA4D。(US 9,598,495和US 10,385,136)位于神经元附近的星形胶质细胞表达SEMA4D的高亲和力丛蛋白-B1受体，并通过与SEMA4D配体结合而触发，以发生与炎症转化相关的形态学和基因表达变化。用SEMA4D抗体阻断这一炎症信号通路已被证明可以改善HD(Southwell，A.L.等，Anti-semaphorin 4D immunotherapy ameliorates neuropathologyand some cognitive impairment in the YAC128 mouse model of Huntingtondisease。Neurobiol.Dis 76，46-56(2015))、AD和多发性硬化(Smith，E.S.等，SEMA4Dcompromises blood-brain barrier,activates microglia,and inhibitsremyelination in neurodegenerative disease.Neurobiol.Dis.73,254-268(2014)动物模型中的病理学，以及最近，防止表达导致亨廷顿舞蹈症的基因突变的患者大脑代谢活动的丧失。SEMA4D在雌性Mecp小鼠大脑中也上调的观察结果和星形胶质细胞作用的证据(Lioy等人，Nature，475(7357):497-500(2012))表明，这一相同的致病途径可能是活跃的，并有助于Rett综合征的病理学。

III.抗-SEMA4D抗体

已经在本领域中描述了结合SEMA4D的抗体。参见例如，美国专利号8,496,938，美国公开号2008/0219971 A1、US 2010/0285036 A1和US 2006/0233793 A1、国际专利申请WO93/14125、WO 2008/100995和WO 2010/129917，以及Herold等，Int.Immunol.7(1):1-8(1995)，其各自通过引用全文纳入本文。

本公开一般涉及缓解患有Rett综合征的对象(例如人类患者)症状的方法，包括给予特异性结合SEMA4D的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。在某些实施方式中，抗体阻断SEMA4D与其一种或多种受体(例如丛蛋白-B1)的相互作用。具有这些性质的抗-SEMA4D抗体可用于本文提供的方法。可使用的抗体包括但不限于MAb VX15/2503、67和76及其抗原结合片段、变体或衍生物，其在US2010/0285036A1中完全描述。可用于本文提供的方法的其他抗体包括US2006/0233793A1中所述的BD16和BB18抗体及其抗原结合片段、变体或衍生物；或MAb 301、MAb 1893、MAb 657、MAb 1807、MAb 1656、MAb 1808、Mab 59、MAb 2191、MAb2274、MAb 2275、MAb 2276、MAb 2277、MAb 2278、MAb 2279、MAb 2280、MAb 2281、MAb 2282、MAb 2283、MAb 2284和MAb 2285中的任意种，及其任意片段、变体或衍生物，如US 2008/0219971 A1所述。在某些实施方式中，用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体结合人、鼠、或人和鼠SEMA4D。还可使用与任意前述抗体结合相同表位的抗体和/或竞争性抑制任意前述抗体的抗体。

在某些实施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物具有与参照抗-SEMA4D抗体分子的氨基酸序列具有至少约80％、约85％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％或约95％序列相同性的氨基酸序列，例如，上述的那些。在另一个实施方式中，所述结合分子与参照抗体共有至少约96％、约97％、约98％、约99％或100％的序列相同性。

在另一个实施方式中，可用于本文提供方法的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：免疫球蛋白重链可变结构域(VH结构域)，其中VH结构域的至少一个CDR与SEQ ID NO:6、7或21的CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或相同。

在另一个实施方式中，可用于本文提供方法的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：免疫球蛋白重链可变结构域(VH结构域)，其中VH结构域的至少一个CDR与SEQ ID NO:3、4或5的CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或相同。

在另一个实施方式中，可用于本文提供方法的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：免疫球蛋白重链可变结构域(VH结构域)，其中VH结构域的至少一个CDR与SEQ ID NO:22、23或24的CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或相同。

在另一个实施方式中，可用于本文提供的方法的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：免疫球蛋白重链可变结构域(VH结构域)，其中VH结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5相同的氨基酸序列，除了1、2、3、4、5个保守氨基酸取代。

在另一个实施方式中，可用于本文提供的方法的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：免疫球蛋白重链可变结构域(VH结构域)，其中VH结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24相同的氨基酸序列，除了1、2、3、4、5个保守氨基酸取代。

在另一个实施方式中，在本文提供的方法中有用的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：VH结构域，其具有与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:21至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的氨基酸序列，其中包含编码的VH结构域的抗SEMA4D抗体特异性或优先结合SEMA4D。

在另一个实施方式中，可用于本文提供方法的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：免疫球蛋白轻链可变结构域(VL结构域)，其中VL结构域的至少一个CDR与SEQ ID NO:11、12或SEQ ID NO:25的CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列至少约80％,约85％,约90％,约95％,约96％,约97％,约98％,约99％,或相同。

在另一个实施方式中，可用于本文提供方法的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：免疫球蛋白轻链可变结构域(VL结构域)，其中VL结构域的至少一个CDR与SEQ ID NO:8、9或10的CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或相同。

在另一个实施方式中，可用于本文提供方法的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：免疫球蛋白轻链可变结构域(VL结构域)，其中VL结构域的至少一个CDR与SEQ ID NO:26、27或28的CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或相同。

在另一个实施方式中，可用于本文提供的方法的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：免疫球蛋白轻链可变结构域(VL结构域)，其中VL结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10相同的氨基酸序列，除了1、2、3、4、5个保守氨基酸取代。

在另一个实施方式中，可用于本文提供的方法的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：免疫球蛋白轻链可变结构域(VL结构域)，其中VL结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28相同的氨基酸序列，除了1、2、3、4、5个保守氨基酸取代。

在另一个实施方式中，在本文提供的方法中有用的抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括、基本上由以下组成或由以下组成：VL结构域，其具有与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:25至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的氨基酸序列，其中包含编码的VL结构域的抗SEMA4D抗体特异性或优先结合SEMA4D。

本文提供的方法中使用的还包括编码本文所述的抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的多肽，编码这类多肽的多核苷酸，包含这类多核苷酸的载体，和包含这类载体或多核苷酸的宿主细胞，全部用于产生用于本文所述方法的抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物。

本发明抗-SEMA4D抗体的合适生物活性变体可用于本发明的方法。这种变体将保持母体抗-SEMA4D抗体的所需结合性质。本领域中制备抗体变体的方法通常是可得的。

诱变和改变核苷酸序列的方法本领域中熟知。参见例如，Walker和Gaastra编(1983)，Techniques in Molecular Biology(《分子生物学技术》)(纽约麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Company))；Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985)；Kunkel等，Methods Enzymol.154:367-382(1987)；Sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(纽约州冷泉港(Cold SpringHarbor,N.Y.))；美国专利号4,873,192；以及其中引用的参考文献；其通过引用纳入本文。有关不影响感兴趣多肽生物学活性的合适氨基酸取代的指南可参见下述文献中的模型：Dayhoff等(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白质序列和结构图册》)(华盛顿特区的国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.))，第345-352页，通过引用全文纳入本文。Dayhoff等的模型利用单点可接受突变(Point Accepted Mutation，PAM)氨基酸相似矩阵(PAM 250矩阵)来确定合适的保守性氨基酸取代。在某些实施方式中，可用保守取代，如用具有相似特性的另一氨基酸替换一种氨基酸。Dayhoff等模型的PAM 250矩阵中教导的保守性氨基酸取代的示例包括但不限于：和

构建所述抗-SEMA4D结合分子的变体如抗体或其抗原结合片段、感兴趣多肽时，生成修饰，从而变体持续拥有所需属性，如能特异性结合SEMA4D，如人、灵长动物、鼠、或者人和鼠的SEMA4D，例如在表面上表达或由细胞分泌，并具有SEMA4D阻断活性，如本文所述。显然，在编码变体多肽的DNA中产生的任何突变都不能将序列置于阅读框之外，并且在某些实施方式中不会产生可产生二级mRNA结构的互补区域。参见欧洲专利申请公开号75,444。

测量抗-SEMA4D结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的结合特异性的方法包括但不限于：标准竞争结合实验、T细胞或B细胞的免疫球蛋白分泌的监测试验、T细胞增殖实验、凋亡实验、ELISA实验等。参见例如，WO 93/14125；Shi等，Immunity 13:633-642(2000)；Kumanogoh等，J Immunol169:1175-1181(2002)；Watanabe等，J Immunol 167:4321-4328(2001)；Wang等，Blood 97:3498-3504(2001)；和Giraudon等，J Immunol 172:1246-1255(2004)公开的实验，其都通过引用纳入本文。

本文在讨论本文公开的任何具体多肽(包括恒定区、CDR、VH结构域或VL结构域)是否与另一多肽至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或者甚至约100％相同时，相同性％可采用本领域已知的方法和计算机程序/软件测定，例如但不限于BESTFIT程序(威斯康星序列分析软件包，用于Unix系统的第8版，遗传学计算机团队(Genetics Computer Group)，威斯康星州麦迪逊科学大道575大学研究园(University Research Park)，53711)。53711).BESTFIT利用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489的局部同源性算法，以找到两条序列之间的最佳同源性区段。使用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定某具体序列是否与本发明所述参照序列(例如)95％相同时，当然要设定参数从而在参照多肽序列的全长上计算相同性百分数，并且在参照序列的氨基酸总数中允许多至5％的同源性缺口。

出于本发明的目的，可采用史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法测定序列相同性百分数，该算法使用仿射缺口搜索，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489中公开了史密斯-沃特曼同源性检索算法。变体与参照抗CXCL13抗体(如MAb VX15/2503、67、76或2282)可以差异例如，少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个氨基酸残基，如6-10个，少至5个，少至4、3、2、或者甚至1个氨基酸残基。

“序列相同性”的百分比也可通过比较对比窗中两种最优比对序列来测定。为了最佳比对用于比较的序列，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包括称为缺口的添加或删除，同时参考序列保持恒定。最佳比对是即使有缺口，也能在参考序列和比较序列之间产生尽可能多的“相同”位置的比对。可以使用2004年9月1日从国家生物技术信息中心获得的程序“BLAST 2序列”的版本来确定两个序列之间的“序列相同性”百分数，该程序包含程序BLASTN(用于核苷酸序列比较)和BLASTP(用于多肽序列比较)，这些程序基于Karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(12):5873-58771993)。当使用“BLAST 2序列”时，截至2004年9月1日，作为默认参数的参数可用于单词大小(3)、开放缺口罚分(11)、延伸缺口罚分(1)、缺口衰减(50)、期望值(10)和任何其他所需参数，包括但不限于矩阵选项。

可以多种方式使抗-SEMA4D抗体的恒定区突变从而改变效应物功能。例如，参见美国专利号6,737,056B1和美国专利申请公开号2004/0132101A1，其公开了优化抗体与Fc受体结合的Fc突变。

在可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其片段、变体或衍生物中，可使用本领域已知的技术突变Fc部分以降低效应物功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可降低循环的修饰抗体与Fc受体的结合，从而提高肿瘤定位。在其他情况中，与本发明一致的恒定区修饰对互补结合进行调节并因此缩短血清半衰期。可利用恒定区的其它修饰来改变二硫键连接或寡糖部分，能因抗原特异性或抗体灵活性提高而加强定位。无需过多实验，即可容易地利用熟知的免疫学技术测定或定量分析修饰所产生的生理学概况、生物利用度和其它生化作用，如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期。用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体包括修饰的衍生物，例如通过将任何类型的分子共价连接到抗体上，从而该共价连接不会阻碍抗体特异性结合其关联表位。例如但不限于，抗体衍生物包括通过，例如糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团衍生、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。通过已知技术可进行任意多种化学修饰，包括但不限于：特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等。此外，衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。

“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基取代。本领域已定义具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，也可沿编码序列的全部或部分随机引入突变(例如通过饱和诱变)，然后可筛选所得突变体的生物学活性，以鉴定保持活性(例如，结合抗SEMA4D多肽，阻遏SEMA4D与其受体相互作用，或减轻患者中与神经退行疾病相关的症状的能力)的突变体。

例如，可能仅在抗体分子的构架区内或仅在CDR区内引入突变。导入的突变可以是沉默或天然错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有或有很少的影响。可使用这些突变类型来优化密码子使用，或提高杂交瘤的抗体生成。或者，非天然错义突变可改变抗体结合抗原的能力。本领域技术人员将能够设计并测试具有所需性质的突变体分子，如没有抗原结合活性或结合活性的变化(例如，改善抗原结合活性或改变抗体特异性)。诱变之后，编码的蛋白质可经常规表达并且能使用本文所述的技术或者通过本领域已知的常规修饰技术来确定编码的蛋白质的功能和/或生物活性(例如，免疫特异性结合SEMA4D多肽的至少一个表位的能力)。

在某些实施方式中，用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体包含至少一个优化的互补决定区(CDR)。述及“优化的CDR”意指该CDR已经修饰并且经优化以提高包含优化的CDR的抗-SEMA4D抗体的结合亲和性和/或抗-SEMA4D活性。“抗-SEMA4D活性”或“SEMA4D阻断活性”可包括调节下列一种或多种SEMA4D相关活性的活性：B细胞活化、聚集和存活；CD40-诱导的增殖和抗体产生；对T细胞依赖抗原的抗体应答；T细胞或其他免疫细胞增殖；树突细胞成熟；脱髓鞘和轴突变性；多潜能神经前体和/或少突细胞的凋亡；诱导内皮细胞迁移；抑制自发性单核细胞迁移；调节胶质细胞(星状细胞、小胶质细胞、少突细胞、前体)功能和炎症活性，与细胞表面丛蛋白B1或其他受体结合，或者与可溶性SEMA4D或SEMA4D+细胞表面上表达的SEMA4D相关的任意其他活性。抗-SEMA4D活性也可导致与SEMA4D表达相关的疾病的发病或严重性降低，包括但不限于某些类型的癌症包括淋巴瘤，自身免疫疾病，炎性疾病包括中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)炎性疾病，移植排斥和侵入性血管生成。基于鼠抗-SEMA4D MAb BD16和BB18的优化的抗体的示例描述于美国专利公开号2008/0219971A1、国际专利申请号WO 93/14125和Herold等，Int.Immunol.7(1):1-8(1995)，其各自通过引用全文纳入本文。修饰可包括取代CDR内的氨基酸残基，使得抗-SEMA4D抗体保留对SEMA4D抗原的特异性并且具有改善的结合亲和性和/或改善的抗-SEMA4D活性。

IV.MeCP2

MECP2(甲基CpG结合蛋白2)基因编码蛋白MeCP2(Lewis等人，1992年6月，Cell 69(6):905–14)。MeCP2蛋白存在于身体的所有细胞中，包括大脑，视具体情况，它在大脑中充当转录抑制因子和激活因子。在大脑中，它在神经元中浓度较高，在星形胶质细胞中浓度较低，与中枢神经系统(CNS)的成熟和突触接触的形成有关。(Luikenhuis等人(2004年4月)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(16):6033–8)。MeCP2似乎对神经细胞的正常功能至关重要，对成熟神经细胞尤其重要，因为在成熟细胞中，MeCP2以高水平存在。总体而言，已经发现MeCP2影响谷氨酸清除、细胞因子产生、电信号转导和神经元形态，所有这些都在神经发育中发挥作用。

许多突变与MECP2基因的表达缺失有关，并已在Rett综合征患者中鉴定。MECP2基因突变是大多数Rett综合征病例的原因。这些突变包括单个DNA碱基对(SNP)的变化、MECP2基因中DNA的插入或缺失以及影响RNA剪接的变化。MeCP2基因的突变改变了MeCP2蛋白质的结构或导致蛋白质的量减少。结果，该蛋白无法与DNA结合(MeCP2蛋白通过与甲基化CpG二核苷酸的全基因组结合表观遗传学地调节基因表达)或打开或关闭其他基因。通常被MeCP2抑制的基因在不需要其产物时保持活性。其他通常被MeCP2活化的基因保持无活性，导致缺乏基因产物。这种缺陷可能会破坏神经细胞的正常功能，导致Rett综合征的症状。

V.Rett综合征的特征性症状

科学家通常描述Rett综合征的四个阶段。第一阶段称为早发，通常在6至18个月大时开始。这一阶段通常被忽视，因为这种疾病的症状可能有些模糊，而且最初可能没有注意到发育的细微减缓。婴儿可能开始表现出较少的眼神接触，对玩具的兴趣降低。坐姿或爬行等一般运动技能可能会出现延迟。可能会出现绞手和头部生长减少的情况，但不足以引起注意。这个阶段通常持续几个月，但可以持续一年以上。

第二阶段，即快速破坏阶段，通常从1岁到4岁开始，可能持续数周或数月。随着儿童失去有目的的手部技能和说话能力，其发作可能是很快或逐渐的。在这一阶段，通常会开始一些典型的手部动作，如绞手、搓手、拍手或轻敲，以及反复将手移到嘴边。儿童可以将双手紧握在背后或两侧，随意触摸、抓握和释放。这些动作在儿童醒着时继续，但在睡眠时消失。呼吸不规则，如呼吸暂停和过度换气可能会发生，尽管睡眠期间呼吸通常会有所改善。一些女孩还表现出类似自闭症的症状，如失去社交和交流。行走可能不稳定，启动运动可能很困难。在这个阶段通常会注意到头部生长缓慢。

第三阶段，即平稳期或伪静止期，通常从2岁到10岁开始，持续数年。在这一阶段，失神、运动问题和癫痫发作是突出的。然而，行为可能有所改善，减少了易怒、哭泣和自闭症样特征。处于第三阶段的女孩可能会对周围环境表现出更多的兴趣，她的警觉性、注意力广度和沟通能力可能会提高。许多女孩一生中大部分时间都维持在这个阶段。

第四阶段，也就是晚期的运动退化阶段，可能持续数年或数十年。显著特征包括活动性降低、脊柱弯曲(脊柱侧弯)和肌肉无力、僵硬、痉挛，以及肌肉张力增加并伴有手臂、腿部或身体上部姿势异常。以前会走路的女孩可能会停止走路。在第四阶段，认知、沟通或手部技能通常不会下降。重复的手部动作可能会减少，眼睛注视通常会提高。

Mecp2缺陷小鼠与Rett综合征患者有几种相同的症状和特征。MeCP2缺陷小鼠是低活性的(Chahrour M和Zoghbi，HY，Neuron.(2007)56:422-437；Guy等人，Nat.Genet.(2001)3:3220326；Chen等人，Nat.Genet.(2001)3:327-331)，并显示了焦虑相关行为的改变量度，例如后肢扣爪。(McGill等人，Proc.Nat.Acad.Sci.(2006)103:18267-72)与Rett综合征的人类同类一样，MeCP2缺陷小鼠也表现出呼吸异常。(Chahrour M and Zoghbi,HY,Neuron.(2007)56:422-437；Weese-Mayer等人,Pediatr.Res.(2006)60:443-449)

VI.星形胶质细胞

星形胶质细胞是专门的胶质细胞，其在健康的中枢神经系统中发挥许多重要的复杂功能，包括血流调节、液体/离子/pH/神经递质稳态、突触形成/功能、能量和代谢，以及血脑屏障维持(Barres BA,Neuron 60:430–440(2008))。虽然神经元具有最高水平的MeCP2表达，但星形胶质细胞和其他细胞类型也表达可检测水平的MeCP2。最近的研究表明星形胶质细胞可能参与Rett综合征的进展。(见McGann等人,Curr Opin Neurobiol.2012Oct；22(5):850–858)。许多研究表明，MeCP2缺陷会损害星形胶质细胞的功能。(Maezawa等人,JNeurosci.2009Apr 22；29(16):5051–5061)。尽管星形胶质细胞中的MeCP2水平大约比神经元中低五倍(Skene等人Mol Cell(2010)37:457–468；Maezawa等人，Neurosci(2009)29:5051–5061)，最近的研究表明星形胶质细胞中MeCP2的缺失与Rett样症状有关，且MeCP2修复可以挽救其中一些缺陷(Lioy等人，Nature(2011)475:497–500)。鉴于它们在Rett综合征中的核心作用，有必要确定并严格测试新的分子靶点，以恢复正常星形胶质细胞功能，从而有效减缓甚至逆转疾病进展。星形胶质细胞可以通过几种潜在途径影响Rett综合征的病理。

星形胶质细胞和Rett综合征

MeCP2在MeCP2缺陷小鼠出生后的整体再表达可导致正常的寿命，拯救运动行为，并改善整体健康。Guy等人,Science.(2007)315:1143-1147。因为在早期发育中来自神经元tau基因座的MeCP2表达阻止了几种Rett样症状的出现(Luikenhuis等人，Proc.Nat.Acad.Sci.(2004)101:6033-6038)，神经元可能在拯救中发挥关键作用。然而，体外研究表明星形胶质细胞MeCP2支持正常的神经元形态(Maezawa等人，J.Neurosci.(2009)29:5505105056；Ballas等人，Nat.Neurosci.(2009)12:311-317)。因此，星形胶质细胞可能也在体内拯救Rett神经病理学中发挥作用。

在正常发育过程中，神经发生首先发生，向星形胶质细胞发生的转变受到严格的调控。当神经发生时，MeCP2附着于星形胶质细胞特异性基因启动子的甲基化部分，如胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)，这是星形胶质细胞中标志性的中间丝蛋白。随着神经发育的进行，这种甲基化减少，MeCP2不再附着在启动子上，从而允许基因转录。这种受控时间导致产生正确数量的神经元和星形胶质细胞。然而在Rett综合征中，由于Mecp2突变，不能将启动子的染色质重塑为非活性状态，因此向星形胶质细胞发生的转变非常迅速。因此，星形胶质细胞基因有可能非常早被转录。已经观察到，与对照相比，Rett综合征患者中的诱导型多能干细胞(iPSC)更容易分化为GFAP阳性细胞，这进一步通过Rett综合症患者大脑中GFAP染色的增加得到证实。(Axol Bioscience Ltd.(2020年2月18日)。Rett综合征中星形胶质细胞的研究。News-Medical.于2020年6月9日从https://www.news-medical.net/whitepaper/ 20191112/Studying-Astrocytes-in-Rett-Syndrome.aspx)获得。

在对照条件下，当与健康神经元共培养时，健康星形胶质细胞促进树突生长。然而，Mecp2-/+小鼠星形胶质细胞和健康海马神经元的共培养导致树突和神经元胞体变短。此外，已经观察到健康星形胶质细胞中靶向MeCP2的siRNA也导致树突生长减少，证实这种影响是由于星形胶质细胞的MeCP2缺陷所致。(Axol Bioscience Ltd,见上)

培养物中野生型iPSC衍生的中间神经元形态受到来自Rett综合征患者的人iPSC衍生星形胶质细胞的不利影响；然而，与Rett综合征星形胶质细胞一起培养相比，健康的iPSC衍生星形胶质细胞对Rett综合症iPSC衍生中间神经元具有积极作用。这进一步强调了星形胶质细胞对疾病神经元的影响。(Axtol Biosciences,见上)

Lioy等人报道，在出生后第21天，仅从星形胶质细胞中去除Mecp2，在空白小鼠中产生比整体去除更为微妙的表型，星形胶质细胞的再表达主要稳定症状。(Nature(2012)475(7357):497-500)其他人报道了从胚胎的神经元亚群中去除Mecp2后出现的表型亚群。(Chen等人，Nat.Genet.(2001)3:327-33；Gemelli等人，Biol.Psych.(2006)59:468-476)，这可以通过导致疾病引发和防止Mecp2在胚胎神经元中重表达后Rett样表型来解释(Luikenhuis等人，Proc.Nat.Acad.Sci.(2004)101:6033-6038)。这些研究表明，Mecp2表达及其控制的途径的随时间变化可以调节疾病表型。

特别是将Mecp2重新引入星形胶质细胞导致Mecp2缺失小鼠症状的改善(Lioy等人，Nature(2012)475(7357):497-500)。此外，星形胶质细胞条件培养基已被证明对Mecp2-/-鼠神经元具有有利作用，增强其树突长度。(Axol Bioscience Ltd，见上)这些研究表明，通过靶向星形胶质细胞，Rett综合征模型中的一些负面影响可以最小化。

VII.使用治疗性抗-SEMA4D抗体的治疗方法

本公开的方法涉及使用抗-SEMA4D结合分子，例如抗体，包括抗原结合片段、变体及其衍生物，来治疗患有Rett综合征的对象。在某些实施方式中，内皮细胞表达SEMA4D受体，在其他实施方式中神经元细胞表达SEMA4D受体，并且在其他实施方式中内皮细胞和神经元细胞都表达SEMA4D受体。在某些实施方式中，受体是丛蛋白-B1。虽然以下说明涉及给予抗SEMA4D抗体，本文所述的方法也适用于保留本公开的抗SEMA4D抗体的所需性质的抗-SEMA4D抗体的抗原结合片段、变体和衍生物或其它生物制剂或小分子，所述性质例如，能够特异性结合SEMA4D，例如，人、小鼠或人和小鼠SEMA4D，具有SEMA4D中和活性，和/或阻断SEMA4D与其受体(例如丛蛋白-B1)的相互作用。在另一个实施方式中，所述方法指的是给予抗SEMA4D抗体，本文所述的方法也可指给予抗-丛蛋白-B1或抗-丛蛋白-B2结合分子，其能够特异性结合丛蛋白-B1和/或丛蛋白-B2并阻断SEMA-4D与其一个或两个的丛蛋白受体，例如丛蛋白-B1和/或丛蛋白-B2的相互作用。

在一个实施方式中，治疗包括向患者给予或给予抗SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段或如本文所述的结合和中和SEMA4D的其他生物或小分子，其中患者患有Rett综合征，例如，患者有症状或有发展Rett综合症症状的风险。在另一个实施方式中，治疗还旨在包括向患者给予或施用包含抗-SEMA4D结合分子的药物组合物，例如其抗体或抗原结合片段，其中患者具有Rett综合征症状或具有发展Rett综合征症状的风险。

本文所述的抗SEMA4D结合分子，例如抗体或其结合片段可用于治疗Rett综合征的各种症状。在一些实施方式中，治疗旨在诱导与病症相关的症状的改善。在其它实施方式中，Rett综合征的治疗旨在减少、延缓或阻止症状表现的增加。在其它实施方式，Rett综合征的治疗旨在抑制，例如抑制、延缓、预防、停止或逆转症状的表现。在其它实施方式，Rett综合征的治疗旨在于一定程度上缓解与病症相关的一种或多种症状。在这些情况中，症状可以是神经精神症状、认知症状和/或运动功能障碍。在其他实施方式中，Rett综合征的治疗旨在减少呼吸症状。在其它实施方式，治疗旨在改善生活质量。

在一个实施方式中，本公开涉及抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物作为药物的用途，特别是用于治疗Rett综合征，以改善、减少或逆转与Rett综合征相关的症状。

根据本公开的方法，至少一种抗SEMA4D结合分子，例如抗体或抗原结合片段、变体或其衍生物，或本文他处定义的其他生物或小分子，可用于促进针对Rett综合征的积极治疗应答。关于Rett综合征的“积极治疗反应”旨在包括有症状对象中与疾病相关的症状的改善，也旨在包括无症状对象或疾病早期发作(I期)期间症状的预防和/或改善。这种积极治疗反应不仅限于给药途径，可包括给予供体、供体组织(如器官灌注)、宿主、其任何组合等。具体地，本文提供的方法涉及抑制、预防、减少、减轻或减弱患者中Rett综合征的进展。因此例如，疾病的改善可表征为缺乏一些或全部的临床可观察到的症状，一些或全部临床可观察到的症状的发生率降低，或一些或全部临床可观察到的症状的改变。

可以使用体内小鼠模型检测和测量改变Rett综合征相关症状的活性。在某些实施方式中，可以采用Mecp2小鼠模型。小鼠融合了Rett综合征特征性Mecp2突变。Mecp2小鼠模型显示了与Rett综合征不同阶段相关的一些主要病理：焦虑、类似于绞手的重复动作，如后肢扣爪、呼吸问题，如呼吸暂停或呼吸模式不规则、记忆障碍、肌肉张力和运动缺陷。应理解，本领域技术人员将认识到，已经描述了其他模型并将其用于研究Rett综合征的疾病机制和症状治疗，并且本公开不应局限于任何一种特定模型。

抗SEMA4D结合分子，例如抗体或抗原结合片段、变体或其衍生物或其他生物制剂或小分子，可与Rett综合征的至少一种或多种其他治疗组合使用；其中在给予抗SEMA4D结合分子(例如抗体或抗原结合片段、变体或其衍生物)治疗之前、期间或之后给予额外治疗。因此，在组合疗法包括将抗-SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的给予与另一种治疗剂的给予相组合的情况中，本发明的方法涵盖共同给予、使用单独制剂或单药制剂、同时或以任意顺序连续给予。

VIII.药物组合物和给药方法

本领域技术人员熟知或不难确定制备和给予抗SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的方法。抗SEMA4D结合分子(例如抗体或抗原结合片段、变体或其衍生物)的给药途径可以是例如口服、肠外、鞘内、脑室内注射或通过吸入或局部给药。本文所用的术语胃肠外包括例如，静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给药。虽然所有这些给药形式均明确认为在本发明范围内，但给药形式的例子是注射液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注。合适的注射用药物组合物可包含缓冲剂(如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(如聚山梨酯)，以及任选的稳定剂(如人白蛋白)等。然而，在与本文所教授内容相符的其它方法中，抗SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可直接递送到不良细胞群的位点，从而增加患病组织与治疗剂的接触。

如本文所讨论的，抗SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，可以药物有效量给药，用于体内治疗Rett综合征。在这方面，应理解，将配制本发明公开的结合分子以利于给药并提高活性物质的稳定性。在某些实施方式中，本发明的药物组合物包含药学上可接受的无毒无菌运载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。为了本申请的目的，药物有效量的抗SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，应被认为是指足以实现与靶标有效结合并实现益处(例如改善与Rett综合征相关的症状)的量。

本发明所用的药物组合物包含药学上可接受的运载体，包括例如，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂，血清蛋白质如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

胃肠道外给药制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的示例是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性运载体包括例如，水、醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，药学上可接受的运载体包括但不限于：0.01-0.1M，例如，约0.05M的磷酸盐缓冲液或0.9％盐水。其它常见的胃肠外载剂包括磷酸钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液或固定油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格右旋糖的那些物质等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

更具体地，适于注射应用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时)或分散液，以及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。在这种情况下，该组合物必须无菌，并应该是达到存在易注射性(easy syringability)程度的流体。它应该在制造和储存条件下稳定，并且应该在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。运载体可以是包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可以维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂覆材料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。适用于本文所述治疗方法的制剂可参见《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)(马克出版公司(Mack Publishing Co.))第16版(1980)。

也可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)实现防止微生物的作用。在许多情况下，可以包括等渗剂，例如糖，多元醇，例如甘露醇，山梨糖醇或氯化钠。可在组合物中包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝和明胶)以延长可注射组合物的吸收。

在任何情况下，制备无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物(如抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，本身或与其它活性剂联合)掺入含有本文所列一种成分或多种成分组合的合适溶剂，然后如需要进行过滤除菌。通常，将活性活化物掺入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载剂中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉末情况中，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，得到由其之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。注射制剂在无菌条件下按照本领域已知方法加工，装入容器(如安瓿、袋、瓶、注射器或小管)中，并密封。此外，可以试剂盒的形式包装并销售制剂。这类制品可具有标签或药品说明书，表明相关组合物可用于治疗患有或倾向于患有疾病或病症的对象。

胃肠外制剂可以是单次推注剂量，输注或负荷推注剂量，随后是维持剂量。可在具体固定或可变的间隔处给予这些组合物，例如，每天一次或者"按需"基础。

用于本公开的某些药物组合物可以可接受的剂型口服给予，包括例如，胶囊、片剂、水性悬液或溶液。也可通过鼻气溶胶或吸入来给予某些药物组合物。这类组合物可制备成盐水溶液，其中采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂和/或其他常规增溶剂或分散剂。

将与运载体材料结合以产生单一剂型的抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)的量将根据所处理的宿主和特定给药模式而变化。可以单剂型、多剂型或在确立的时间段内的输注中给予组合物。也可调整给药方案，以提供最优所需反应(例如，治疗或预防性反应)。

在本发明范围内，抗SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可按照上述治疗方法给予人或其它动物，其给予量足以产生疗效。所述抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可以常规剂型给予所述人或其它动物，该剂型根据已知技术将本发明抗体与常规的药学上可接受运载体或稀释剂混合来制备。本领域技术人员应认识到，药学上可接受运载体或稀释剂的形式和特点由混合的活性成分含量、给药途径和其它熟知变量决定。本领域技术人员还将理解，可使用包含本公开的抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或抗原结合片段、变体或衍生物的一种或多种物质的混合物。

所谓“治疗有效剂量或量”或“有效量”是指一定量的抗SEMA4D结合分子，例如抗体或抗原结合片段、变体或其衍生物，其在给药时对Rett综合征患者的治疗产生积极的治疗反应。积极治疗反应可以缓解疾病症状；减少、减轻、延缓或停止症状发生；减少、减轻、延缓症状的严重程度；抑制，例如阻抑、延缓、预防、停止或逆转症状表现；在某种程度上缓解与该病症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；提高生活质量；或这些效果的组合。在某些实施方式中，给予治疗有效剂量或量缓解、减少、减轻、延缓或停止一种或多种症状发生；减少、减轻、延缓一种或多种症状的严重程度；抑制、例如阻抑、延缓、预防、停止或逆转一种或多种症状表现，其中症状可包括不规则呼吸模式、过度换气、睡眠呼吸暂停、焦虑、身体震颤、重复的手部动作，如绞手、轻拍、扣爪等，协调和/或运动困难，精细或粗略运动控制的发展延迟、粗略或精细运动控制的降低、认知能力降低、记忆力下降、沟通能力的延迟或降低、失神、肌无力、异常姿势、癫痫发作、胃肠道问题、异常心肺耦合、骨密度降低、早发性骨质疏松症、磨牙症、血脂异常、胆囊炎症、脊柱侧弯、泌尿功能障碍、睡眠障碍、生活质量差(与非Rett综合征“正常”对象相比)及其组合。(见Vashi N和Justice MJ.MammalianGenome(2019)30:90–110)。

本公开的组合物用于预防症状发生率降低的治疗有效剂量根据许多不同的因素而变化，包括给药方式、靶点、患者的生理状态、疾病的病理阶段、给药的其他药物、以及治疗是预防性还是治疗性。可使用本领域技术人员已知的常规方法对治疗剂量进行滴定以优化安全性和功效。

根据本公开，本领域普通技术人员可以容易地确定至少一种抗SEMA4D结合分子(例如抗体或其结合片段、变体或衍生物)的给药量，而无需过度实验。影响至少一种抗SEMA4D结合分子(例如抗体、抗原结合片段、其变体或衍生物)的给药模式和相应量的因素包括但不限于接受治疗的个体的疾病严重程度、疾病历史、疾病阶段以及年龄、身高、体重、健康状况，以及身体状况。类似地，抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或片段、变体或衍生物的给予量取决于给药方式、对象是否接受单一剂量或多剂量的此种药剂。

本发明还提供了抗SEMA4D结合分子(例如本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)在制备用于治疗Rett综合征患者的药物中的用途。在某些实施方式中，制备所述药物用于Rett综合征的第一临床阶段，即上文定义的I期的对象。在另一个实施方式中，制备药物用于Rett综合征后期临床阶段的对象，例如上文定义的II期、III期或IV期。在某些实施方式中，制备药物用于已经用至少一种其他疗法预先治疗的对象。通过“预治疗”或“预处理”，对象在接受包含抗SEMA4D结合分子(例如抗体或抗原结合片段、变体或其衍生物)的药物之前已经接受了一种或多种其他疗法(例如，用至少一种其他疗法治疗了Rett综合征的一种或多种症状)。“预治疗”或“预处理”包括在用包含抗-SEMA4D结合分子例如本文公开的单克隆抗体VX15/2503,67或76，或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物治疗开始之前2年内、18个月内、1年内、6个月内、2个月内、6周内、1个月内、4周内、3周内、2周内、1周内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内、或者甚至1天内已经用至少一种其他疗法进行治疗的对象。对象不必对采用先前的一种或多种疗法进行的预治疗有反应。因此，接受包含抗-SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的药物的对象对采用先前疗法的预治疗，或对先前疗法中的一种或多种(其中预治疗包括多种疗法)可能已有响应或可能未能响应。

除非另有说明，本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，Sambrook等编(1989)Molecular Cloning A LaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》)(第2版；冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press))；Sambrook等编(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，(纽约州的冷泉港实验室出版社(Cold Springs HarborLaboratory，NY))；D.N.Glover编，(1985)DNA Cloning(《DNA克隆》)，第I和II卷；Gait编(1984)Oligonucleotide Synthesis(《寡核苷酸合成》)；Mullis等，美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编(1984)Nucleic Acid Hybridization(《核酸杂交》)；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation(《转录和翻译》)；Freshney(1987)Culture OfAnimal Cells(《动物细胞培养》)(ARL公司(Alan R.Liss，Inc.))；Immobilized Cells AndEnzymes(《固定的细胞和酶》)(IRL出版社)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide ToMolecular Cloning(《分子克隆实践指南》)；论文，Methods In Enzymology(《酶学方法》)(学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，纽约州)；Miller和Calos编(1987)GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(《哺乳动物细胞的转基因载体》)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory))；Wu等编，Methods In Enzymology(《酶学方法》)，第154和155卷；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》)(学术出版社(AcademicPress)，伦敦)；Weir和Blackwell编(1986)Handbook Of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo(《小鼠胚胎操作》)，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，(1986)；和Ausubel等(1989)Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(马里兰州巴尔的摩的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，Baltimore，Md.))。

抗体工程的一般原理可参见Borrebaeck编(1995)Antibody Engineering(《抗体工程》)(第2版；牛津大学出版社(Oxford Univ.Press))。蛋白质工程的一般原理可参见Rickwood等编(1995)Protein Engineering，A Practical Approach(《蛋白质工程，实践方法》)，(英国牛津的牛津大学出版社的IRL出版公司(IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.))。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理可参见：Nisonoff(1984)MolecularImmunology(《分子免疫学》)(第2版；马萨诸塞州桑德兰的辛奥尔联合公司(SinauerAssociates，Sunderland，Mass.))；和Steward(1984)Antibodies,Their Structure andFunction(《抗体的结构和功能》)(Chapman和Hall，纽约州纽约市)。此外，本领域已知且没有具体描述的免疫学标准方法通常按照下述文献所述进行：Current Protocols inImmunology(《新编免疫学实验指南》)，纽约州的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)；Stites等编(1994)Basic and Clinical Immunology(《基础和临床免疫学》)(第8版；Appleton和Lange，康涅狄格州的诺沃克(Norwalk，Conn.))和Mishell和Shiigi(编)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(《细胞免疫学的选用方法》)(W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Co)，纽约州)。

列出免疫学通用原理的标准参考文献包括：Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》)，约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约州；Klein(1982)J.，Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination(《免疫学：自身-非自身区别的科学》)(约翰韦利父子公司，纽约州)；Kennett等编(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(《单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新领域》)(普莱努公司(Plenum Press)，纽约州)；Campbell(1984)"MonoclonalAntibody Technology"in Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology"(《生化和分子生物学实验室技术》中的“单克隆抗体技术”)，Burden等编(的埃尔斯威尔公司(Elsevere)，阿姆斯特丹)；Goldsby等编(2000)Kuby Immunnology(《库比免疫学》)(第4版；H.弗里曼公司(H.Freemand&Co.))；Roitt等(2001)Immunology(《免疫学》)(第6版；伦敦：摩兹比公司(Mosby))；Abbas等(2005)Cellular and Molecular Immunology(《细胞和分子免疫学》)(第5版；埃尔斯威尔健康科学分公司(Elsevier Health SciencesDivision))；Kontermann和Dubel(2001)Antibody Engineering(《抗体工程》)(施普林格公司(Springer Verlag))；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》)(冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))；Lewin(2003)Gene VIII(《基因VIII》)(普伦蒂斯霍尔出版社(Prentice Hall)2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)(冷泉港出版社)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer(《PCR引物》)(冷泉港出版社)。

将上文中引用的所有参考文献以及其中引用的所有参考文献通过引用全文纳入本文。

通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。

实施例

实施例1：在Mecp2T158A Rett综合征小鼠模型中测试抗-SEMA4D结合分子对Rett综合症相关症状的影响

实验设计。

Mecp2^T158A Rett综合征小鼠模型由Goffin等人(Nature Neuroscience，第15卷，274–283页(2012))创建，并详细概括了人类疾病的表型特征。苏氨酸158突变是在Rett综合征患者中观察到的最常见的Mecp2突变，并在转基因小鼠中产生高度可变的表型。Mecp2^T158A/y半合子雄性小鼠(以下称为Mecp2小鼠)在不同年龄表现出一系列症状，通常在4-6周龄开始出现症状。在半合子Mecp2^T158A/y和野生型C57BL/6雄性小鼠上进行了临床前试验。

半合子Mecp2^T158A/y和野生型C57BL/6雄性小鼠在4周龄时(当Mecp2^T158A/y小鼠出现症状前)或8周龄时(当Mecp2^T158A/y小鼠有症状时)，用抗SEM4D(Mab 67)或同种型对照单克隆抗体治疗(表1)。所有小鼠通过腹腔注射接受50mg/kg的抗SEM4D(Mab 67)或同种型对照抗体(Mab 2B8小鼠IgG1)10周。有症状前的小鼠(4周组；“4周”)和4周对照每周注射两次，而有症状的小鼠(8周组；“8周”)和8周对照在试验的前四周每周注射两次，在试验的第5-10周之间每周注射一次。

表1.临床前实验的实验计划

根据表2中的标准，每周对RTT特异性症状的严重程度进行表型评分，包括震颤和后肢扣爪。每两周，使用旋转棒、高架十字迷宫和全身体积描记术测试评估协调、运动、认知和呼吸模式测量。这些行为测试在3-4天内进行，以减少小鼠的焦虑和疲劳。小鼠每周称重1次。

表2.Mecp2^T158A小鼠Rett综合征特异性症状评分标准。

旋转棒。将小鼠置于加速旋转棒装置(图1)上进行3次试验，试验之间至少休息15分钟。每次试验最多持续3分钟，在此期间，每15秒加速5rpm，从5rpm加速到6rpm。记录每次试验中从棒上跌落的潜伏期。

高架十字迷宫。如先前发表的(Komada等人，2008，Vis.Exp.，22年12月22日(22)：1088)，将每只小鼠置于高架十字迷宫装置的横截面中(图2)5分钟。记录了在闭合和开放臂中花费的时间以及进入闭合和开放臂的次数。

全身体积描记术。在暗室中，每只小鼠在全身体积描记仪(图3)的一个小室中停留了3小时，没有受到干扰。通过EMKA iox软件记录和分析每只动物的呼吸模式(表3)。

表3.在全身体积描记术测试中测量的参数。

行为测试结束后，处死小鼠，处理脑组织进行福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)免疫组化。对于所有测试，使用重复测量的双向方差分析测试进行统计分析。

4周龄症状前小鼠(4周龄)的分析。

抗-SEMA4D改善了症状前小鼠的后肢扣爪表型并减少了身体震颤。

Mecp2小鼠的后肢扣爪是一种姿势反应，类似于Rett综合征患者特有的典型绞手。Mecp2小鼠的表型后肢扣爪如图4A所示。评分标准为0至2，如表2所示，用于评估后肢扣爪的严重程度。在为期10周的研究中，接受同种型对照抗体的症状前小鼠的后肢扣爪情况逐渐恶化，评分约为1.8。相比之下，抗SEMA4D治疗小鼠的后肢扣爪在三周时达到峰值(约1.1分)，并在两周内下降，最终在研究剩余时间内稳定在约0.75分。在整个研究过程中，野生型小鼠没有表现出后肢扣爪。(图4B)

身体震颤是人Rett综合征的众多症状之一。Mecp2小鼠随着疾病进展而出现震颤。在整个为期10周的研究中，使用表2中列出的0至2的评分标准来评估全身震颤的严重程度。接受同种型抗体对照的症状前小鼠身体震颤从第1周到第8周逐渐恶化，最终稳定在约1.6到1.7分。抗-SEMA4D治疗的Mecp2小鼠在治疗的前四周内与同种型对照小鼠的震颤水平相同，达到约1分，然后在为期10周的研究的其余时间中降至约0.75分。在为期10周的研究中，野生型小鼠没有出现震颤。(图5)这些结果表明，抗SEMA4D抗体治疗改善了Rett综合征症状前阶段的特征性典型姿势，并减少了与该阶段疾病相关的身体震颤。

抗-SEMA4D改善症状前小鼠的协调和运动。

随着时间的推移，Rett综合征儿童在使用控制运动、协调和沟通的肌肉方面存在越来越多的问题。Mecp2小鼠在协调和运动方面表现出类似的问题。

如上所述，在旋转棒装置上测试四周龄小鼠的运动和协调。结果示于图6。可以看出，同种型抗体治疗的Mecp2小鼠在第一周后未能改善，第三周后运动和协调性恶化。相比之下，抗SEMA4D治疗的Mecp2小鼠保留了最初的协调和运动能力，在研究过程中显示出可测量的改善，尽管程度与野生型小鼠不同。

抗-SEMA4D可预防或减少症状前小鼠的认知丧失。

高架十字迷宫(EPM)测试使用一个高架十字(+)设备，该设备具有两个开放臂和两个封闭臂。该行为模型基于小鼠对开放空间的普遍反感。这种反感表现为喜欢呆在封闭空间或靠近有界空间的边缘，这就意味着动物将其运动限制在设备的封闭臂上。在高架十字迷宫中，增加在开放臂中停留的时间比例(开放臂时间/开放或封闭臂的总时间)和增加进入开放臂(进入开放臂次数/进入开放或封闭臂总数)来表明焦虑减少。进入臂的总数和进入封闭臂次数用作总体活动的度量。

在本研究中，EPM用于确定Mecp2蛋白缺陷导致的认知受损如何影响EPM任务中小鼠的行为，以及抗SEMA4D治疗是否影响受损小鼠的认知。将野生型、同种型抗体处理对照组和抗SEMA4D处理组中的每只小鼠置于高架十字迷宫装置的横截面中(图2)5分钟。记录了在闭合和开放臂中花费的时间以及进入闭合和开放臂的次数。Mecp2小鼠在研究开始时没有表现出认知缺陷，在测试的前三周内，抗SEMA4D处理的Mecp2小鼠与野生型小鼠一样，表现出对开放臂反感特性的认知。相比之下，同种型抗体处理的对照Mecp2小鼠无法了解EPM开放臂的反感特性。野生型小鼠和抗SEMA4D处理的Mecp2小鼠在开放臂中花费的时间明显少于同种型抗体处理的Mecp2小鼠(图7A)，并且与同种型抗体处理的小鼠相比，减少进入开放臂的次数，也证明了其认识到开放臂的危险性。(图7B)这些结果表明，MeCP2小鼠的抗焦虑样行为不仅与先天焦虑水平有关，而且与它们无法认识到与EPM任务开放臂相关的潜在危险有关。用抗SEMA4D抗体治疗维持了症状前Mecp2小鼠的认知，使小鼠能够识别并避免开放臂的潜在危险。

这些结果表明，在疾病的症状前期，抗SEMA4D治疗维持了认知，即防止了未经治疗的Mecp2小鼠的认知下降。

抗-SEMA4D改善症状前小鼠的呼吸模式。

RTT患者表现出复杂的呼吸表型，包括过度换气、呼吸暂停、Valsalva捏鼻鼓气法终止的呼吸暂停、强迫深呼吸和呼吸暂停性呼吸，以及心率控制和心肺整合异常。严重节律失常的呼吸是Rett综合征的标志，并严重影响患者及其家属的生活质量。

最近对RTT小鼠模型的研究揭示了可能导致呼吸功能障碍的神经功能缺陷，特别是神经递质和神经调节因子表达异常模式导致的神经化学信号转导缺陷。为了确定Mecp2小鼠中阻断SEMA4D信号是否会影响Rett综合征对象的呼吸模式，如上所述，对Mecp2鼠进行全身体积描记术。如图8A和B所示，抗SEMA4D处理的小鼠表现出与野生型小鼠相似的呼吸模式(吸气和呼气)。同种型抗体处理的Mecp2小鼠表现出不规则的呼吸模式，与抗SEMA4D处理的Mecp2小鼠相比，其吸气和呼气次数更少。这些数据表明，抗SEMA4D治疗可以预防与Rett综合征相关的呼吸异常。

8周龄症状小鼠(8周龄)的分析。

抗-SEMA4D改善了有症状小鼠的后肢扣爪表型并减少了身体震颤。

表2中列出的评分标准范围为0至2，用于评估野生型、对照组和抗SEMA4D治疗的8周龄有症状Mecp2小鼠在10周内后肢扣爪的严重程度。在为期10周的研究中，接受同种型对照抗体的有症状小鼠的后肢扣爪情况逐渐恶化，达到约1.8分，与同种型对照症状前小鼠相似(图5B)。相比之下，抗SEMA4D治疗小鼠的后肢扣爪在测试开始时为最高水平(约1.4分)，并在测试期间下降并保持在该水平以下。在整个研究过程中，野生型小鼠没有表现出后肢扣爪。(图9)

表2中列出的0至2的评分标准用于评估有症状Mecp2小鼠10周研究期间全身震颤的严重程度。接受同种型抗体控制的有症状小鼠身体震颤从第1周到第10周逐渐恶化，最终稳定在约1.8分。抗SEMA4D治疗的Mecp2小鼠的震颤逐渐减少，直到第五周，然后稳定在低于1的分数，即低于同种型抗体对照小鼠的一半。在为期10周的研究中，野生型小鼠没有出现震颤。(图10)

这些结果表明，抗SEMA4D抗体治疗改善了Rett综合征在有症状阶段的特征性典型姿势，就像在疾病症状前阶段一样，并显著减少了身体震颤，无论是在疾病症状前阶段还是有症状阶段给予。

抗-SEMA4D改善有症状Mecp2小鼠的协调和运动。

为了确定如果在肌肉控制出现问题后给予抗SEMA4D抗体治疗是否会影响协调和运动，在加速旋转棒装置上测试有症状小鼠和对照。如上所述，每两周将有症状小鼠(8周龄)置于加速旋转棒装置上进行3次试验，试验之间至少休息15分钟。结果示于图11。可以看出，同种型抗体治疗的Mecp2小鼠在第一周后未能改善，在测试期间运动和协调性恶化。相比之下，抗SEMA4D治疗的Mecp2小鼠在研究过程中显著改善，甚至超过了野生型小鼠的技能水平，野生型小鼠在整个测试过程中保持了相对稳定的技能水平。

抗-SEMA4D在有症状小鼠中增强认知。

EPM用于确定用抗-SEMA4D治疗有症状小鼠(8周龄)是否影响受损小鼠的认知。将野生型、同种型抗体处理对照组和抗SEMA4D处理组中的每只小鼠置于高架十字迷宫装置的横截面中(图2)5分钟。记录了在闭合和开放臂中花费的时间以及进入闭合和开放臂的次数。野生型小鼠与抗SEMA4D处理的Mecp2小鼠一样，显示对开放臂的反感特性的认知，而同种型抗体处理的对照Mecp2鼠无法学会对EPM开放臂的反感特性。如同用症状前小鼠显示的，野生型小鼠和抗SEMA4D处理的Mecp2小鼠在开放臂中花费的时间明显少于同种型抗体处理的Mecp2小鼠(图12A)，并且与同种型抗体处理的小鼠相比，减少进入开放臂的次数，也证明了其认识到开放臂的危险性。(图12B)。这些结果表明，用抗SEMA4D抗体治疗有症状的小鼠可以提高认知能力，正如抗SEMA4D治疗可以防止症状前小鼠认知能力下降一样。

抗-SEMA4D改善有症状小鼠的呼吸模式。

为了确定阻断SEMA4D信号转导是否对有症状的对象的呼吸模式有积极影响，如上所述，对抗SEMA4D治疗的对照Mecp2和野生型小鼠进行全身体积描记术。简言之，将野生型、抗SEMA4D处理的Mecp2小鼠和同种型抗体处理的Mecp2小鼠置于图3所示的暗室中的全身体积描记仪的一个小室中3小时，无干扰。通过EMKA iox软件记录和分析每只动物的呼吸模式(表3)。

如图13A和图13B所示，抗SEMA4D治疗的小鼠在治疗三周后表现出改善的呼吸模式(吸气和呼气)，接近野生型小鼠。同种型抗体处理的Mecp2小鼠表现出不规则的呼吸模式，与抗SEMA4D处理的Mecp2小鼠相比，其吸气和呼气次数更少。这些数据表明，抗SEMA4D治疗可以改善出现呼吸症状后的呼吸不规律。

表4下文总结了上述研究的结果。

表4

Rett小鼠神经元中SEMA4D上调。

对约8个月大雌性小鼠(Mecp2^T158A和野生型同窝对照C57BL/6)的福尔马林固定石蜡包埋切片进行SEMA4D(CD100多克隆抗体-Invitrogen-PA5-47711)和神经元标志物HuC/HuD染色。(单克隆抗体(16A11)-Invitrogen:A-21271).海马区的代表图如图14所示。可以看出，SEMA4D在Rett小鼠的神经元中显著上调，而与野生型对照相比，Rett小鼠中神经元标志物HuC/HuD的表达没有差异。

序列表

<110> 瓦西尼斯公司（VACCINEX, INC.）

<120> 脑信号蛋白-4D结合分子在RETT综合征治疗中的应用

<130> 8555.039Z

<140> 63/043,945

<141> 2020-6-25

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> 人脑信号蛋白-4D

<400> 1

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1 5 10 15

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Gly Ala Arg Glu Ala Val Phe Ala Val Asn Ala Leu Asn Ile Ser Glu

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115 120 125

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130 135 140

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225 230 235 240

Glu Tyr Glu Phe Val Phe Arg Val Leu Ile Pro Arg Ile Ala Arg Val

245 250 255

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Ser Phe Leu Lys Ala Arg Leu Ile Cys Ser Arg Pro Asp Ser Gly Leu

275 280 285

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290 295 300

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325 330 335

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355 360 365

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

Gln Leu Phe Gln Asp Phe Glu Pro Val Gln Thr Leu Leu Leu Ser Ser

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545 550 555 560

Tyr Arg Gln His Phe Phe Lys His Gly Gly Thr Ala Glu Leu Lys Cys

565 570 575

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705 710 715 720

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<210> 2

<211> 861

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus sp.)

<220>

<223> 小鼠脑信号蛋白-4D

<400> 2

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1 5 10 15

Val Leu Arg Thr Ala Val Ala Phe Ala Pro Val Pro Arg Leu Thr Trp

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50 55 60

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

Ser His Ser Pro Leu Arg Thr Glu Tyr Ala Ile Pro Trp Leu Asn Glu

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Glu Gly Glu Asp Asp Lys Val Tyr Phe Phe Phe Thr Glu Val Ser Val

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Glu Tyr Glu Phe Val Phe Lys Leu Met Ile Pro Arg Val Ala Arg Val

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275 280 285

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Gly Leu Ser Ala Val Cys Ala Tyr Thr Leu Ala Thr Val Glu Ala Val

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370 375 380

Asn Leu Pro Asp Lys Thr Leu Gln Phe Val Lys Asp His Pro Leu Met

385 390 395 400

Asp Asp Ser Val Thr Pro Ile Asp Asn Arg Pro Lys Leu Ile Lys Lys

405 410 415

Asp Val Asn Tyr Thr Gln Ile Val Val Asp Arg Thr Gln Ala Leu Asp

420 425 430

Gly Thr Phe Tyr Asp Val Met Phe Ile Ser Thr Asp Arg Gly Ala Leu

435 440 445

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450 455 460

Gln Leu Phe Arg Asp Ser Glu Pro Val Leu Thr Leu Leu Leu Ser Ser

465 470 475 480

Lys Lys Gly Arg Lys Phe Val Tyr Ala Gly Ser Asn Ser Gly Val Val

485 490 495

Gln Ala Pro Leu Ala Phe Cys Glu Lys His Gly Ser Cys Glu Asp Cys

500 505 510

Val Leu Ala Arg Asp Pro Tyr Cys Ala Trp Ser Pro Ala Ile Lys Ala

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565 570 575

Phe Gln Lys Ser Asn Leu Ala Arg Val Val Trp Lys Phe Gln Asn Gly

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Glu Leu Lys Ala Ala Ser Pro Lys Tyr Gly Phe Val Gly Arg Lys His

595 600 605

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725 730 735

Ser Leu Leu Leu Phe Ile Phe Val Leu Phe Leu Cys Leu Phe Ser Tyr

740 745 750

Asn Cys Tyr Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Gln Cys Leu Lys Phe Arg Ser

755 760 765

Ala Leu Leu Leu Gly Lys Lys Thr Pro Lys Ser Asp Phe Ser Asp Leu

770 775 780

Glu Gln Ser Val Lys Glu Thr Leu Val Glu Pro Gly Ser Phe Ser Gln

785 790 795 800

Gln Asn Gly Asp His Pro Lys Pro Ala Leu Asp Thr Gly Tyr Glu Thr

805 810 815

Glu Gln Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Pro Thr Asp Arg Glu Asp Ser

820 825 830

Gln Arg Ile Asp Glu Leu Ser Ala Arg Asp Lys Pro Phe Asp Val Lys

835 840 845

Cys Glu Leu Lys Phe Ala Asp Ser Asp Ala Asp Gly Asp

850 855 860

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> 抗-SEMA4D VHCDR1

<400> 3

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1 5 10

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> 抗-SEMA4D VHCDR2

<400> 4

Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> 抗-SEMA4D VHCDR3

<400> 5

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1 5

<210> 6

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<223> VX/2503 VH

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

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85 90 95

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100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<223> Mab 67 VH

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Asn Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> 抗-SEMA4D VL CDR1

<400> 8

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn

1 5 10 15

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> 抗-SEMA4D VL CDR2

<400> 9

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> 抗-SEMA4D VL CDR3

<400> 10

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 11

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<223> VX/2503 VL

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 12

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<223> Mab 67 VL

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<223> Mab 76 VH

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Tyr Gly Trp Thr Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> Mab76 VHCDR1

<400> 14

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> Mab 76 VH CDR2

<400> 15

Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> Mab 76 VHCDR3

<400> 16

Asp Pro Tyr Gly Trp Thr Met Asp Ser

1 5

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<223> Mab 76 VL

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> Mab 76 VL CDR1

<400> 18

His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> Mab76 VL CDR2

<400> 19

Lys Ala Ser Asn Leu His Thr

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> Mab 76 VL CDR3

<400> 20

Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 21

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<223> 人 Mab D2517 VH

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val

35 40 45

Ala His Met Asn Gln Asp Gly Gly Ala Arg Tyr Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Trp Gly Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> 人 Mab D2517 HCDR1

<400> 22

Asp Tyr Trp Met Val

1 5

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> 人 Mab D2517 HCDR2

<400> 23

His Met Asn Gln Asp Gly Gly Ala Arg Tyr Tyr

1 5 10

<210> 24

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> 人 Mab D2517 HCDR3

<400> 24

Asp Pro Trp Gly Tyr

1 5

<210> 25

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<220>

<223> 人 Mab D2517 VL

<400> 25

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala

20 25 30

Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Glu Gln Glu Ala Ala Trp

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

100

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> 人 Mab D2517 LCDR1

<400> 26

Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Val

1 5 10

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> 人 Mab D2517 LCDR2

<400> 27

Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<223> 人 Mab D2517 LCDR3

<400> 28

Gln Ala Trp Glu Gln Glu Ala Ala Trp Val

1 5 10

Claims (18)

1.一种特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离的结合分子，用于治疗有需要的对象的Rett综合征。

2.如权利要求1所述用途的分离的结合分子，其中所述结合分子竞争性抑制选自VX15/2503、D2517、D2585和Mab 67的参考单克隆抗体与SEMA4D的特异性结合。

3.如权利要求1或2所述用途的分离的结合分子，其中所述结合分子抑制SEMA4D与其受体或其受体部分的相互作用。

4.如权利要求3所述用途的分离的结合分子，其中所述受体选自丛蛋白-B1和丛蛋白-B2以及CD72。

5.如权利要求1至4中任一项所述用途的分离的结合分子，其中所述结合分子抑制SEMA4D受体介导的信号转导。

6.如权利要求1所述的分离的结合分子，其中所述分离的结合分子特异性结合与选自VX15/2503、D2517或Mab 67的参考单克隆抗体相同的SEMA4D表位。

7.如权利要求1至6中任一项所述用途的分离的结合分子，其中所述分离的结合分子包含抗体或其抗原结合片段。

8.如权利要求7所述用途的分离的结合分子，其中所述抗体或其抗原结合片段是VX15/2503、D2517或Mab 67。

9.如权利要求7所述用途的分离的结合分子，其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述可变重链包含VHCDR1-3，所述VHCDR1-3分别包含SEQ IDNo：3、4和5，所述可变轻链包含VLCDR1-3，所述VLCDR1-3分别包含SEQ ID NO:8、9和10。

10.如权利要求9所述用途的分离的结合分子，其中所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12。

11.如权利要求7所述用途的分离的结合分子，其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述可变重链包含VHCDR1-3，所述VHCDR1-3分别包含SEQ IDNo：22、23和24，所述可变轻链包含VLCDR1-3，所述VLCDR1-3分别包含SEQ ID NO:26、27和28。

12.如权利要求11所述用途的分离的结合分子，其中所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:25。

13.如权利要求1至12所述任一项用途的分离的结合分子，其中所述对象处于Rett综合征1期。

14.如权利要求13所述用途的分离的结合分子，其中所述用途减轻Rett综合征疾病阶段症状，所述症状选自神经精神症状、认知症状、运动功能障碍、身体发育迟缓、沟通发育迟缓、沟通技能丧失、睡眠障碍、心跳不规则、呼吸模式不规则、重复抽动动作、身体震颤及其任何组合。

15.权利要求14所述用途的分离的结合分子，其中缓解症状包括预防或减少焦虑样行为、增加认知、增加协调、增加运动、促进身体发育、减少身体震颤、减少重复运动、增加运动技能、增加沟通技能、减少睡眠障碍、减少躁动、减少不安、减少呼吸不规则及其任何组合。

16.如权利要求1至12中任一项所述用途的分离的结合分子，其中所述对象处于Rett综合征的II期、III期或IV期。

17.如权利要求16所述用途的分离的结合分子，其中所述用途减轻Rett综合征症状，所述Rett综合症状选自神经精神症状、认知症状、身体发育迟缓、运动功能障碍、心跳和呼吸不规则、沟通能力下降、脊柱侧弯、睡眠障碍、癫痫发作、胃肠道问题、重复抽动动作、身体震颤及其任何组合。

18.根据权利要求17所述用途的分离的结合分子，其中缓解症状包括减少焦虑样行为、增加认知、增加协调、增加运动、促进身体发育、减少身体震颤、减少重复运动、增加运动技能、增加沟通技能或其任何组合。