CN117589897A - 冠心病血清学预警生物标志物、检测试剂及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了冠心病血清学预警生物标志物，包括十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸和十七烷酸中的一种或多种。本发明还提供了检测试剂、试剂盒。本发明采用非入侵式、相对无创的检测手段，且操作简单、检测费用低，能够高灵敏度、高稳定性、高效率地诊断冠心病，实现冠心病早期预警，对于降低冠心病的致死率和致残率意义重大。

Description

冠心病血清学预警生物标志物、检测试剂及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物标志物相关技术领域，涉及生物技术、疾病诊断等技术领域。更具体地说，本发明涉及一种冠心病血清学预警生物标志物、检测试剂及试剂盒。
背景技术
冠心病又被称为冠状动脉粥样硬化性心脏病，主要是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。该病的主要危险因素包括年龄、血脂异常、高血压、糖尿病、肥胖和冠心病家族史等。临床上冠心病可以分为两大类：慢性冠脉综合征和急性冠脉综合征。其中慢性冠脉综合征又包括隐匿型冠心病、稳定型心绞痛、缺血性心肌病；急性冠脉综合征包括ST段抬高型心肌梗死、不稳定型心绞痛和非ST段抬高型心肌梗死。
冠心病的临床诊断依赖于多种检查手段，包括心电图、血清心肌酶谱(肌酸激酶及同工酶、肌钙蛋白等)、超声心电图、心脏放射性核素检查、冠状动脉CT血管造影(CTA)、冠状动脉造影和血管内超声等。然而心电图和血清心肌酶谱的变化都是继发于心肌损伤之后，难以对冠心病的发生起到早期预警的作用。而心脏放射性核素检查、冠脉CTA检查和冠状动脉造影等检查，虽然可以直观反映心肌的受损程度和冠状动脉的堵塞情况，但是这些均为侵入性检查，存在放射性损伤和过敏的风险，且检查费用高，难以推广用于临床冠心病的常规筛查和早期预警。因此，有必要设计一种能够克服上述缺陷的技术方案。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种冠心病血清学预警生物标志物、检测试剂及试剂盒，能够用于冠心病的早期筛查和早期干预，具有非入侵、无创、高灵敏度、高稳定性、高效率、简便和低成本的优点。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，根据本发明的一个方面，本发明提供了冠心病血清学预警生物标志物，包括十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸和十七烷酸中的一种或多种。
本发明还提供了检测试剂，包括检测所述的冠心病血清学预警生物标志物的试剂。
进一步地，利用UHPLC-MS/MS检测所述的冠心病血清学预警生物标志物。
进一步地，包括以下同位素内标物：胸腺嘧啶-d4、缬氨酸-d8、苯丙氨酸-d8、17-羟基孕酮-d8、二十二碳六烯酸-d5、胆酸-d4、鹅去氧胆酸-d4和肝胆酸-d4。
进一步地，检测血清样品中所述的冠心病血清学预警生物标志物。
进一步地，UHPLC-MS/MS检测过程中，色谱条件为：色谱柱：HSS T3(150×2.1mm,3.5μm)；流速：0.5mL/min；柱温：20℃；进样量：5μL；流动相：A为甲酸/水(1:1000,v/v)溶液，B为异丙醇/乙腈(2:7,v/v)溶液；洗脱梯度：0-4min，1-10％ B；4-8min，10-50％ B；8-15min，50-80％ B；15-25min，80-100％ B；25-27min，100％ B；洗脱条件在2min后恢复到初始状态；质谱条件为：正、负两种离子扫描，多反应监测数据采集模式，电喷雾离子源参数为：喷雾电压：5500V；离子源温度：600℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：40psi。
本发明还提供了试剂盒，其特征在于，包括所述的检测试剂。
本发明还提供了冠心病诊断系统，包括检测单元，用于检测血清样品中所述的冠心病血清学预警生物标志物含量。
进一步地，还包括计算单元，用于判断相比于健康组，血清样品中所述冠心病血清学预警生物标志物含量是否存在显著差异。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明筛选得到包括十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸和十七烷酸的冠心病血清学预警生物标志物，采用非入侵式、相对无创的检测手段，且操作简单、检测费用低，能够高灵敏度、高稳定性、高效率地诊断冠心病，实现冠心病早期预警，对于降低冠心病的致死率和致残率意义重大。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为健康组和冠心病组中FA12:0,FA14:0,FA16:0和FA17:0的多反应监测(MRM)谱图。
图2为质控样本中代谢物的变异系数统计直方图。
图3为冠心病组和健康组区分的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型：(A)OPLS-DA得分图，(B)OPLS-DA模型100次置换验证结果。
图4中(A)为OPLS-DA得分图，(B)为OPLS-DA模型100次置换验证结果。
图5为4种冠心病诊断血清生物标志物受试者工作特征曲线(ROC曲线)及雨云图。
图6为基于4种血清生物标志物所建立的人工神经网络模型，用于健康组和冠心病组的区分。
图7中(A)为人工神经网络模型用于健康组和冠心病组预测的准确性矩阵图，(B)为神经网络模型中4个变量的重要性柱形图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本申请的实施例提供了冠心病血清学预警生物标志物，包括十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸和十七烷酸中的一种或多种；优选地，包括人血清十二烷酸(FA12:0,CAS号143-07-7)、十四烷酸(FA14:0,CAS号544-63-8)、十六烷酸(FA16:0,CAS号57-10-3)和十七烷酸(FA17:0,CAS号506-12-7)四种，具体利用超高效液相色谱串联质谱联用技术(UHPLC-MS/MS)进行标志物检测；本申请的标志物利用变量投影重要性(VIP)、ROC曲线下面积(AUC)、FDR(Benjamini-Hochberg法校正的P值)、倍数变化(FC)等统计学参数进行筛选，并利用ROC曲线、雨云图、神经网络模型进行验证，能够采用非入侵式、相对无创的检测手段进行高灵敏度、高稳定性、高效率地诊断冠心病，实现冠心病早期预警，且操作简单、检测费用低，对于降低冠心病的致死率和致残率意义重大。
本申请的实施例还提供了检测试剂，包括检测所述的冠心病血清学预警生物标志物的试剂，即利用UHPLC-MS/MS检测所述的冠心病血清学预警生物标志物时所需使用的试剂；可选地，包括以下同位素内标物：胸腺嘧啶-d4、缬氨酸-d8、苯丙氨酸-d8、17-羟基孕酮-d8、二十二碳六烯酸-d5、胆酸-d4、鹅去氧胆酸-d4和肝胆酸-d4，用于与血清样本混合，进行UHPLC-MS/MS检测。
在另一个实施例中，检测血清样品中所述的冠心病血清学预警生物标志物；优选地，血清样品来源于空腹血清，并在-80℃冻存。
作为一种可行的UHPLC-MS/MS检测条件，色谱条件为：色谱柱：HSS T3(150×2.1mm,3.5μm)；流速：0.5mL/min；柱温：20℃；进样量：5μL；流动相：A为甲酸/水(1:1000,v/v)溶液，B为异丙醇/乙腈(2:7,v/v)溶液；洗脱梯度：0-4min，1-10％ B；4-8min，10-50％ B；8-15min，50-80％ B；15-25min，80-100％ B；25-27min，100％ B；洗脱条件在2min后恢复到初始状态；质谱条件为：正、负两种离子扫描，多反应监测数据采集模式，电喷雾离子源参数为：喷雾电压：5500V；离子源温度：600℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：40psi。
本申请的实施例还提供了试剂盒，包括所述的检测试剂，以便利用UHPLC-MS/MS及时进行冠心病血清学预警生物标志物检测。
本申请的实施例还提供了冠心病诊断系统，包括检测单元，用于检测血清样品中所述的冠心病血清学预警生物标志物含量；可选地，基于UHPLC-MS/MS构建检测单元。
在另一个实施例中，还包括计算单元，用于判断相比于健康组，血清样品中所述冠心病血清学预警生物标志物含量是否存在显著差异；计算单元与检测单元通信连接，用于对检测数据进行分析处理，当四种标志物存在显著差异，即可给出冠心病预警。
以下以具体实施例说明。
(一)临床志愿者入组与生物样本的收集：
1、入排标准：
冠心病组入选标准：年龄≥18岁；符合冠心病诊断标准，包括慢性冠脉综合征和急性冠脉综合征。冠心病发作时肌电图多存在ST-T段的缺血改变，冠状动脉造影是诊断的金标准，冠脉CTA也可以对冠心病进行初步筛查。如果体检发现心电图存在缺血的改变，可进一步行动态心电图检查，评估是否存在严重的缺血。冠状动脉造影可以直接观察到患者冠状动脉血管的情况，可以直观判断血管狭窄的程度以及有无闭塞。对于冠状动脉造影，血管狭窄50％以上可以明确为冠心病，可以进行冠心病的诊断。
健康组入选标准：年龄≥18岁；无心血管疾病史；无高血糖、高血压和血脂异；无家族史；目前未接受任何药物治疗。
排除标准：存在抗凝禁忌症、造影剂过敏、严重的心功能不全(Killip分级III、IV级或者6min步行实验<150m)、既往1年内发生过出血性脑卒中、恶性肿瘤、严重的呼吸功能衰竭、严重的肝肾功能不全、妊娠、哺乳期、精神病史、滥用药物史，以及合并其他严重疾病的患者。
冠心病患者来自我院心脏中心，健康者来自我院普外科腹外疝、血管外科静脉曲张患者，以上均由临床医师确诊。
2、知情同意：向患者详细介绍本项科学研究的目的与意义，患者自愿签署知情同意书，保障患者隐私，建立入组志愿者的临床信息库，详细记录患者的姓名、年龄、性别、吸烟、饮酒、病史和家族病史等信息，并记录其血糖、血脂和血压等临床实验室检查结果，并对患者进行编号。
3、临床患者入组：健康志愿者81例，冠心病患者63例。所有受试者的病例信息和临床实验室检查结果如表1所示。
4、收集入组患者的空腹血清样本，为尽量避免患者饮食差异，患者住院期间饮食均为统一的院内食谱。
表1.受试者临床病例信息和实验室检查指标
(二)代谢组学检测：
1、主要试剂
标准品购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)，Cayman Chemical(美国密歇根州安阿伯市)，Bidepharm(中国上海)或Steraloids(美国罗得岛州纽波特)；稳定同位素标记的内标(ISs)购自Cambridge Isotope Laboratories(美国马萨诸塞州剑桥市)，Cayman Chemical或Steraloids；MS级乙腈和HPLC级异丙醇购自Fisher Scientific(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)；HPLC级甲酸购自TEDIA Co.,Ltd.(美国俄亥俄州费尔菲尔德)；去离子水由Millipore公司的Milli-Q超纯水系统(美国马萨诸塞州贝德福德)制备。
2、样本信息：
样本类型：空腹血清
储存条件：-80℃冻存
临床生物样本前处理：低温冰箱中取出的血清样本置于4℃冰箱中自然解冻，解冻后的血清样本准确吸取50μL，置于1.5mL离心管中，加入10μL浓度为400ng/mL的同位素混合溶液，同位素混合溶液包括：胸腺嘧啶-d4，缬氨酸-d8，苯丙氨酸-d8、17-羟基孕酮-d8，二十二碳六烯酸-d5，胆酸-d4，鹅去氧胆酸-d4和肝胆酸-d4。血清和内标涡旋10秒混匀后，加入140μL冷甲醇，涡旋30s混匀，将样品置于-20℃孵育10min后，13800g4℃离心10min；收集含提取物和内标的上清液，用于UHPLC-MS/MS分析。
质控样本前处理：将临床生物样本的血清按照等比例混合后，得到的混合血清，混合血清与临床生物样本一起，按照上述的前处理方法进行处理后，得到质控样本。在UHPLC-MS/MS分析过程中，将质控样本均匀穿插于临床样本的检测序列中，用于前处理过程和序列运行过程中误差的考察。
3、仪器信息：UHPLC-MS/MS，仪器型号为Spark Holland液相色谱仪串联AB Sciex公司API 5500三重四级杆质谱仪。检测使用的色谱和质谱条件如下：
色谱条件：色谱柱：HSS T3(150×2.1mm,3.5μm)；流速：0.5mL/min；柱温：20℃；进样量：5μL；流动相：A为甲酸/水(1:1000,v/v)溶液，B为异丙醇/乙腈(2:7,v/v)溶液；洗脱梯度：0-4min，1-10％ B；4-8min，10-50％ B；8-15min，50-80％ B；15-25min，80-100％ B；25-27min，100％ B；洗脱条件在2min后恢复到初始状态；
质谱条件：正、负两种离子扫描，多反应监测数据采集模式，电喷雾离子源参数为：喷雾电压：5500V；离子源温度：600℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：40psi。
FA12:0,FA14:0,FA16:0和FA17:0检测的离子对和质谱参数如表2所示。健康组和冠心病组中FA12:0,FA14:0,FA16:0和FA17:0的MRM谱图如图1所示。
表2.冠心病诊断血清生物标志物的质谱检测参数
(三)代谢组学数据预处理
使用MultiQuant 3.2软件(AB SCIEX，美国)处理所得到的代谢组学数据，进行峰面积积分，化合物的浓度计算。计算质控样本的变异系数，排除质控样本中变异系数大于40％的代谢物，剩下的化合物进入下面的统计分析。
将得到的化合物浓度数据导入SIMCA 14.1软件(Umetrics AB，于默奥，瑞典)进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，第一主成分的变量投影重要性指标(VariableImportance in the Projection，VIP)是评估代谢物对于模型贡献程度的重要指标，VIP值越大，表明代谢物对OPLS-DA模型贡献越大，通常以VIP＞1作为代谢物重要性筛选的阈值。计算代谢物在冠心病组和健康组之间的倍数变化，筛选出其中FC>1.2的代谢物。然后利用在线分析工具MetaboAnalyst 4.0(https://www.metaboanalyst.ca/)对代谢数据进行接受者操作特性(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线分析并计算曲线下面积(AUC)值，AUC>0.80表明模型具有很好的预测性能；进行Student T检验获得P值，并通过Benjamini-Hochberg法进行错误发现率(False Discovery Rate，FDR)的计算，筛选FDR<0.05的代谢物。结合多变量和单变量分析结果筛选VIP>1、FC>1.2，FDR<0.05且AUC>0.80的代谢物，并将其定义为候选生物标志物。
(四)统计分析结果
使用UHPLC-MS/MS在血浆样本中共检测到196个代谢物，质控样本中代谢物的变异系数如图2所示，其中45％代谢物的变异系数小于10％。选择质控样本中变异系数小于40％的代谢物共179个，采用SIMCA软件进进行OPLS-DA分析，结果如图3A所示。内部交叉验证法检验模型的质量获得R2X＝0.491、R2Y＝0.877、Q2＝0.771。100次置换检验法检验模型的可靠性获得R2＝(0.0，0.48)，Q2＝(0.0，-0.55)，结果如图3B所示。在OPLS-DA模型中，R2Y和Q2越接近1，表明所建立的模型质量越高，当Q2>0.5时，即表明所建立的OPLS-DA模型较好；而在置换验证中，Q2<0表明OPLS-DA模型没有发生过度拟合。综上，本研究中基于代谢物的数据所构建的OPLS-DA模型具有良好的准确性和预测性，且不存在过度拟合，筛选出其中VIP值大于1的代谢物一共58个(图4A)，其中VIP值前五的代谢物分别为：FA 12:0、FA14:0、FA16:0、FA17:1和FA17:0。
考察代谢物在冠心病组和健康组之间的差异，计算各代谢物的FC值，满足FC>1.2的代谢物一共78个(图4A)。Student T假设检验探索了冠心病组和健康组之间的显著差异代谢物，并通过Benjamini-Hochberg法进行校正，最终找到65个FDR<0.05的显著差异代谢物(图4A)，经过。同时满足FC>1.2和FDR<0.05的代谢物如图4B火山图所示。
将代谢物进行ROC分析，筛选出其中AUC>0.8的代谢物，如图5所示。结合多变量统计分析、单变量分析和ROC分析的结果，在血清中一共筛选到4个同时满足VIP>1、FC>1.2，FDR<0.05且AUC>0.80的代谢物，包括FA 12:0、FA14:0、FA16:0和FA17:0，可以作为冠心病诊断的生物标志物，4个生物标志物的统计分析数值如表3所示，MRM色谱图如图1。
表3.冠心病诊断血清生物标志物
标志物 VIP AUC FDR FC
FA 12:0 2.10 0.91 2.0E-16 1.55
FA 14:0 1.97 0.82 8.4E-11 1.62
FA 16:0 1.92 0.83 1.9E-09 1.27
FA 17:0 1.82 0.83 4.6E-10 2.18
(五)人工神经网络模型的构建
通过以上的分析，筛选出来4个可以用于冠心病诊断的血清生物标志物，均为饱和脂肪酸类化合物。进一步基于4个标志物的浓度水平，构建了用于冠心病组和健康组区分的人工神经网络模型，结果如图6所示。如图7A所示，在人工神经网络模型的构建过程中，分别将75％(N＝108)和25％(N＝36)作为测试集和验证集，结果表明所建立的模型在冠心病组和健康组区分中具有良好的准确性和预测性能，且4个标志物对模型均具有较高的贡献(图7B)。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明冠心病血清学预警生物标志物、检测试剂及试剂盒的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.冠心病血清学预警生物标志物，其特征在于，包括十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸和十七烷酸中的一种或多种。
2.检测试剂，其特征在于，包括检测权利要求1所述的冠心病血清学预警生物标志物的试剂。
3.如权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，利用UHPLC-MS/MS检测所述的冠心病血清学预警生物标志物。
4.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，包括以下同位素内标物：胸腺嘧啶-d4、缬氨酸-d8、苯丙氨酸-d8、17-羟基孕酮-d8、二十二碳六烯酸-d5、胆酸-d4、鹅去氧胆酸-d4和肝胆酸-d4。
5.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，检测血清样品中所述的冠心病血清学预警生物标志物。
6.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，UHPLC-MS/MS检测过程中，色谱条件为：色谱柱：HSS T3(150×2.1mm,3.5μm)；流速：0.5mL/min；柱温：20℃；进样量：5μL；流动相：A为甲酸/水(1:1000,v/v)溶液，B为异丙醇/乙腈(2:7,v/v)溶液；洗脱梯度：0-4min，1-10％B；4-8min，10-50％B；8-15min，50-80％B；15-25min，80-100％B；25-27min，100％B；洗脱条件在2min后恢复到初始状态；质谱条件为：正、负两种离子扫描，多反应监测数据采集模式，电喷雾离子源参数为：喷雾电压：5500V；离子源温度：600℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：40psi。
7.试剂盒，其特征在于，包括权利要求2～6任一所述的检测试剂。
8.冠心病诊断系统，其特征在于，包括检测单元，用于检测血清样品中权利要求1所述的冠心病血清学预警生物标志物含量。
9.如权利要求8所述的冠心病诊断系统，其特征在于，还包括计算单元，用于判断相比于健康组，血清样品中所述冠心病血清学预警生物标志物含量是否存在显著差异。
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