CN117589659A - 一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测方法技术领域，具体是一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，包括以下步骤，依次向流式细胞管中加入抗凝血样本，抗体包被微球，荧光标记的检测抗体，以及结合缓冲液，震荡孵育，向样本管中加入溶血剂，经漩涡混匀仪混匀，静置后得到裂解红细胞，对裂解红细胞溶液进行离心，弃去上清，向样本管中加入洗涤缓冲液，经涡旋和离心后弃去上清，向每个样本管中加洗涤缓冲液，摇晃样本使微球重悬，得到供上机流式细胞仪同时进行淋巴细胞表型和细胞因子检测的样本，样本上机检测，一份样本同时检测淋巴细胞表型和细胞因子，降低检测成本，同时通过在缓冲液中加入表面活性剂的方式，解决淋巴细胞表型和细胞因子检测相互干扰的问题。
Description
技术领域
本发明涉及检测方法技术领域，具体是一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法。
背景技术
淋巴细胞亚群的比例的增高或者降低，都提示了免疫功能紊乱，而细胞因子参与机体免疫反应和炎症反应，是非常灵敏的炎症指标，在疾病发展过程中动态监测细胞因子水平，可及时发现疾病转重倾向，及时治疗、避免或降低病情的恶化风险，实现“治未重”，提高临床治疗有效率；
目前基于流式细胞术的TBNK亚群和CBA细胞因子的检测是建立在两种不同的方法之上，一种检测方法对应一种待检测物，分别检测样本的淋巴细胞表型和血浆/血清中的细胞因子含量，该方式存在检测周期长、样本量大、复杂和检测成本高的问题，为此，我们提出了一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法。
发明内容
为了解决现有方式存在检测周期长、样本量大、复杂和检测成本高的问题。
本发明提出一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，包括以下步骤，
A，依次向流式细胞管中加入抗凝血样本，抗体包被微球，荧光标记的检测抗体，以及结合缓冲液；
B，震荡孵育；
C，向样本管中加入溶血剂，经漩涡混匀仪混匀，静置后得到裂解红细胞；
D，对裂解红细胞溶液进行离心，弃去上清；
E，向样本管中加入洗涤缓冲液，经涡旋和离心后弃去上清；
F，向每个样本管中加洗涤缓冲液，摇晃样本使微球重悬，得到供上机流式细胞仪同时进行淋巴细胞表型和细胞因子检测的样本，样本上机检测。
优选的，步骤A中，抗体包被微球使用的微球是聚苯乙烯乳胶微球，微球直径在1-10um之间，抗体通过抗体偶联的方式附着在微球表面。
优选的，步骤A中，荧光标记的检测抗体，抗体标记应用偶联技术，使用的荧光素包括但不限于FITC、PE和APC。
优选的，步骤A中，结合缓冲液结合缓冲液由0.1MPBS，0.2%BSA，0.1%proclin300以及表面活性剂组成。
优选的，步骤A中，抗凝血样本的量为100μl，抗体包被微球的量为1-10ul，荧光标记的检测抗体的量为1-10ul。
优选的，步骤B中，震荡孵育的时间为1～3小时，环境温度控制在37℃，无光源直接照射。
优选的，步骤C中，溶血剂加入量为2ml，漩涡混匀仪混匀时间不少于10s，静置时间不少于10分钟。
优选的，步骤D中，离心机的转速设定为1000～1500rpm，离心时间为5分钟。
优选的，步骤E中，涡旋时间为3至10秒，1000～1500rpm离心5分钟。
优选的，步骤F中，洗涤缓冲液由0.01MPBS，0.02%BSA，0.1%proclin30组成，涡旋8～12s。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明中，一份样本同时检测淋巴细胞表型和细胞因子，省时省力，降低检测成本；
2、本发明中，通过在缓冲液中加入表面活性剂的方式，解决淋巴细胞表型和细胞因子检测相互干扰的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明中荧光标记抗体检测细胞表位的原理图；
图2是本发明中微球流式免疫荧光发光法检测原理图；
图3是本发明中流式细胞散点图；
图4是本发明中细胞表型分析图；
图5是本发明图3中的细胞6因子分析图；
图6是本发明中细胞因子标准曲线分析图；
图7是本发明中检测流程图。
具体实施方式
为使得本申请的申请目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而非全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例
本实施例是制备一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，技术路线如图7所示，包括以下步骤：
A，依次向流式细胞管中加入100μl抗凝血样本，1-10ul抗体包被微球，抗体包被微球使用的微球是聚苯乙烯乳胶微球，微球直径在1-10um之间，抗体通过抗体偶联的方式附着在微球表面，1-10ul荧光标记的检测抗体，抗体标记应用偶联技术，使用的荧光素包括但不限于FITC、PE和APC，以及结合缓冲液，结合缓冲液结合缓冲液由0.1MPBS，0.2%BSA，0.1%proclin300以及表面活性剂组成；
B，在37℃的温度且无光源直接照射的环境下震荡孵育1～3小时；
C，向样本管中加入2ml溶血剂，经漩涡混匀仪进行10s以上的混匀，静置不少于10分钟后得到裂解红细胞；
D，对裂解红细胞溶液离心5分钟，离心的转速为1000～1500rpm，离心后弃去上清；
E，向样本管中加入洗涤缓冲液，经涡旋和离心后弃去上清；
F，向每个样本管中加洗涤缓冲液，洗涤缓冲液由0.01MPBS，0.02%BSA，0.1%proclin30组成，反复摇晃样本使微球重悬，得到供上机流式细胞仪同时进行淋巴细胞表型和细胞因子检测的样本，样本上机检测上机流式细胞仪进行检测，同时提供淋巴细胞表型和细胞因子的检测报告。
参见图2，检测过程中，细胞因子结合抗体包被微球和荧光标记抗体，形成供检测的样本。
参见图3-图6，在孵育阶段抗原抗体相互结合时，所使用的缓冲液中加入有表面活性剂，在抗原和抗体结合的过程中，表面活性剂可能发挥以下作用：
增强溶解和分散性：表面活性剂增加溶液中抗原和抗体的可溶性，使它们更容易在液体中分散和相互接触，有助于提高反应的速率和效率；
减少表面张力：表面活性剂降低液体表面的张力，抗原和抗体均匀分散和扩散在溶液中，使它们更容易接触和结合。这对于在液体中进行生物分子结合是非常有利的；
增加表面可及性：表面活性剂可能使液体中的生物分子更容易被抗体识别和结合，因为它们可以更轻松地进入抗体的结合位点；
减小非特异性吸附：表面活性剂还可以减小非特异性吸附，即抗原和抗体与容器表面或其他不相关物质的非特异性结合，有助于保持生物分子之间的特异性相互作用；
防止非特异性结合：表面活性剂可以减少非特异性的结合，通过改变溶剂条件防止抗原或抗体与非目标分子发生不必要的相互作用，有助于提高检测的特异性；
稳定分散体系：表面活性剂可以稳定分散体系，防止抗原和抗体在液体中沉淀或聚集，这确保它们保持均匀分布，有利于相互作用。
表面活性剂可以改变抗原和抗体所处环境的界面性质，影响它们的相互作用和结合能力，使用表面活性剂，可以提高抗原和抗体结合的灵敏度，使其在实验中更容易检测，同时，通过调整表面电荷，表面活性剂可以影响抗原和抗体之间的电荷相互作用，如氢键和范德华力，从而增强它们的亲和性，使结合更牢固。
以上所述，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，其特征在于：包括以下步骤，
（A），依次向流式细胞管中加入抗凝血样本，抗体包被微球，荧光标记的检测抗体，以及结合缓冲液；
（B），震荡孵育；
（C），向样本管中加入溶血剂，经漩涡混匀仪混匀，静置后得到裂解红细胞；
（D），对裂解红细胞溶液进行离心，弃去上清；
（E），向样本管中加入洗涤缓冲液，经涡旋和离心后弃去上清；
（F），向每个样本管中加洗涤缓冲液，摇晃样本使微球重悬，得到供上机流式细胞仪同时进行淋巴细胞表型和细胞因子检测的样本，样本上机检测。
2.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，其特征在于：步骤（A）中，抗体包被微球使用的微球是聚苯乙烯乳胶微球，微球直径在1-10um之间，抗体通过抗体偶联的方式附着在微球表面。
3.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，其特征在于：步骤（A）中，荧光标记的检测抗体，抗体标记应用偶联技术，使用的荧光素包括但不限于FITC、PE和APC。
4.根据权利要求3所述的一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，其特征在于：步骤（A）中，结合缓冲液结合缓冲液由0.1MPBS，0.2%BSA，0.1%proclin300以及表面活性剂组成。
5.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，其特征在于：步骤（A）中，抗凝血样本的量为100μl，抗体包被微球的量为1-10ul，荧光标记的检测抗体的量为1-10ul。
6.根据权利要求5所述的一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，其特征在于：步骤（B）中，震荡孵育的时间为1～3小时，环境温度控制在37℃，无光源直接照射。
7.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，其特征在于：步骤（C）中，溶血剂加入量为2ml，漩涡混匀仪混匀时间不少于10s，静置时间不少于10分钟。
8.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，其特征在于：步骤（D）中，离心机的转速设定为1000～1500rpm，离心时间为5分钟。
9.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，其特征在于：步骤（E）中，涡旋时间为3至10秒，1000～1500rpm离心5分钟。
10.根据权利要求1所述的一种淋巴细胞表型和细胞因子联合检测方法，其特征在于：步骤（F）中，洗涤缓冲液由0.01MPBS，0.02%BSA，0.1%proclin30组成，涡旋8～12s。
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