CN117582553A - 一种用于生物组织内细胞去除的方法 - Google Patents
一种用于生物组织内细胞去除的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117582553A CN117582553A CN202310947751.3A CN202310947751A CN117582553A CN 117582553 A CN117582553 A CN 117582553A CN 202310947751 A CN202310947751 A CN 202310947751A CN 117582553 A CN117582553 A CN 117582553A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- treatment
- decellularization
- amino acid
- biological
- surfactant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 102
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 113
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims abstract description 7
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 70
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 61
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 49
- -1 polysaccharide lipid Chemical class 0.000 claims description 39
- 239000003876 biosurfactant Substances 0.000 claims description 37
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 21
- 238000000053 physical method Methods 0.000 claims description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 20
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 18
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 claims description 17
- FCBUKWWQSZQDDI-UHFFFAOYSA-N rhamnolipid Chemical compound CCCCCCCC(CC(O)=O)OC(=O)CC(CCCCCCC)OC1OC(C)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 FCBUKWWQSZQDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 15
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 claims description 15
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 13
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 13
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N Peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 101000718529 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Alpha-galactosidase Proteins 0.000 claims description 12
- NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N alpha-D-Gal-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- AZKVWQKMDGGDSV-BCMRRPTOSA-N Genipin Chemical compound COC(=O)C1=CO[C@@H](O)[C@@H]2C(CO)=CC[C@H]12 AZKVWQKMDGGDSV-BCMRRPTOSA-N 0.000 claims description 11
- AZKVWQKMDGGDSV-UHFFFAOYSA-N genipin Natural products COC(=O)C1=COC(O)C2C(CO)=CCC12 AZKVWQKMDGGDSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 10
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 10
- ZTOKUMPYMPKCFX-CZNUEWPDSA-N (E)-17-[(2R,3R,4S,5S,6R)-6-(acetyloxymethyl)-3-[(2S,3R,4S,5S,6R)-6-(acetyloxymethyl)-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxyoctadec-9-enoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCC/C=C/CCCCCCC(C)O[C@@H]1O[C@H](COC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COC(C)=O)O1 ZTOKUMPYMPKCFX-CZNUEWPDSA-N 0.000 claims description 9
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 9
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 9
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 9
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 claims description 9
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004080 punching Methods 0.000 claims description 8
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 8
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 7
- GYDYJUYZBRGMCC-INIZCTEOSA-N (2s)-2-amino-6-(dodecanoylamino)hexanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)NCCCC[C@H](N)C(O)=O GYDYJUYZBRGMCC-INIZCTEOSA-N 0.000 claims description 6
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- HCZKYJDFEPMADG-UHFFFAOYSA-N nordihydroguaiaretic acid Chemical compound C=1C=C(O)C(O)=CC=1CC(C)C(C)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 HCZKYJDFEPMADG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 5
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940008841 1,6-hexamethylene diisocyanate Drugs 0.000 claims description 3
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000004203 4-hydroxyphenyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AKGWUHIOEVNNPC-LURJTMIESA-N Arg-OEt Chemical compound CCOC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N AKGWUHIOEVNNPC-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 claims description 3
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 claims description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 240000007839 Kleinhovia hospita Species 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 claims description 3
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 claims description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 3
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 claims description 3
- 101000693530 Staphylococcus aureus Staphylokinase Proteins 0.000 claims description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims description 3
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 claims description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 3
- ASMQGLCHMVWBQR-UHFFFAOYSA-M diphenyl phosphate Chemical compound C=1C=CC=CC=1OP(=O)([O-])OC1=CC=CC=C1 ASMQGLCHMVWBQR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 claims description 3
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000006628 dp medium Substances 0.000 claims description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000002313 glycerolipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims description 3
- RRAMGCGOFNQTLD-UHFFFAOYSA-N hexamethylene diisocyanate Chemical compound O=C=NCCCCCCN=C=O RRAMGCGOFNQTLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 claims description 3
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 claims description 3
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000400 lauroyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 3
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 3
- 238000009931 pascalization Methods 0.000 claims description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 claims description 3
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 claims description 3
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 claims description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000004808 supercritical fluid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 39
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 32
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 21
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 21
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 229940045944 sodium lauroyl glutamate Drugs 0.000 description 7
- IWIUXJGIDSGWDN-UQKRIMTDSA-M sodium;(2s)-2-(dodecanoylamino)pentanedioate;hydron Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC(O)=O IWIUXJGIDSGWDN-UQKRIMTDSA-M 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- WBIQQQGBSDOWNP-UHFFFAOYSA-N 2-dodecylbenzenesulfonic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O WBIQQQGBSDOWNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 4
- 229940060296 dodecylbenzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 4
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 4
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 206010067868 Skin mass Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N fluoromethane Chemical compound FC NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 3
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 3
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 3
- 239000012567 medical material Substances 0.000 description 3
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 2
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 231100000132 chronic toxicity testing Toxicity 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 231100000017 mucous membrane irritation Toxicity 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- FCZYGJBVLGLYQU-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethoxy]ethanesulfonate Chemical compound [Na+].CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCS([O-])(=O)=O)C=C1 FCZYGJBVLGLYQU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000002888 zwitterionic surfactant Substances 0.000 description 2
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- WKALLSVICJPZTM-UHFFFAOYSA-N 3-[decyl(dimethyl)azaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O WKALLSVICJPZTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUBRCQBRKJXJEA-UHFFFAOYSA-N 3-[hexadecyl(dimethyl)azaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O TUBRCQBRKJXJEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002169 ethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000002219 extraembryonic membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- BITYAPCSNKJESK-UHFFFAOYSA-N potassiosodium Chemical compound [Na].[K] BITYAPCSNKJESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
- A61L27/362—Skin, e.g. dermal papillae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
- A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
- A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Zoology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明公开涉及一种用于生物组织内细胞去除的方法,基于生物表面活性剂和/或以生物质为基础(生物基表面活性剂)的表面活性剂的组织细胞去除工艺,以替代基于大多以石油副产物合成的常规表面活性剂的传统工艺,一种适合于大规模稳定生产的,新型且生物相容性优良的生物组织细胞去除工艺;制备常用的生物组织来源的医用脱细胞材料产品,具有脱细胞彻底,细胞毒性低,组织相容性高等特点,可用于临床上运动系统软组织的修复和加强。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域,特别涉及一种用于生物组织内细胞去除的方法。
背景技术
生物组织来源的医用材料目前在临床上应用十分广泛,包括同种异体或者异种来源的生物材料,如真皮基质,肌腱,体内膜(例如如心包膜、肠系膜、横膈膜、腹膜、羊膜,脐带、胎膜、肌膜,筋膜,小肠黏膜下层等)等材料。由于同种异体或者异种来源的材料存在免疫原性,不能直接应用于人体,否则会引起极强的免疫排斥反应,因此需要对原材料进行细胞去除处理,洗去残留的异体或异种细胞和核酸等成分,只保留物种间保守的胶原支架网络,进而可以大幅度的降低免疫排斥反应。
生物组织的细胞去除工艺除了需要具备脱细胞完全的基本特质,还需要符合以下条件:(1)保留生物胶原支架的正常三维结构和力学强度,这就要求细胞去除工艺不能单纯的只考虑去除细胞而采用激进的策略导致结构破坏;(2)减少脱细胞试剂的微量残留对于生物材料生物相容性的影响,减少脱细胞材料的体内毒性。尤其是在植入早期,有研究显示,微量的脱细胞试剂残留(<0.0001%)仍会在植入早期影响体内细胞的附着和生长,导致远期的失效;残留脱细胞试剂降解产物业已被证明仍保留较强的细胞毒性。
目前对于生物组织的脱细胞技术主要包括以下几种:(1)物理方法(冻融法、机械搅拌法、压力法等);(2)生物方法(酶等);(3)化学方法(处理试剂包括酸、碱、化学表面活性剂、高渗盐水、醇类、磷酸三丁酯等);这些方法需要根据处理的目标组织的不同而选择不同的强度、剂量或处理时间,可单独应用亦或联合/序贯应用提高脱细胞的效率。其中物理法脱细胞的效率不高,通常用于协助化学法和生物方法。
目前主流的生物方法和化学方法已经显露出一定的局限性。
生物酶法通常包括蛋白酶(如胰蛋白酶)、酯酶(磷脂酶A)和核酸酶(DNA酶和RNA酶)。其中以胰蛋白酶较为常见,其可以选择性地裂解细胞黏连蛋白中精氨酸和赖氨酸的羧基端,从而使细胞从组织表面脱落,但浸泡时间过长会破坏组织内的胶原结构,使得生物组织变得疏松多孔,显著降低最大失效载荷和刚度,这对于某些需要较强力学强度的生物材料是一个致命的弊端。此外,从生产的角度而言,酶的活性受较多因素的影响,例如温度,PH和抑制剂等,因此在生产中很难控制其作用稳定性,导致产品的处理均质性较差,不太适合大规模量产。
化学方法中,酸和碱的处理会导致胶原纤维的膨胀疏松,破坏胶原支架网络结构,并且酸和碱会中和胶原三螺旋的部分氨基和羧基结构,并且使得组织的葡糖氨基聚糖大量减少,影响组织弹性,导致胶原结构出现较大程度的破坏,显著降低组织的力学强度。
目前表面活性剂在生物组织脱细胞工艺中得到了广泛的使用,市面上常用的大多数化学合成表面活性剂通常由石油副产物合成,使其不可生物降解且对人类和环境都有危害。包括离子型和非离子型:非离子型表面活性剂较温和,通过破坏脂-脂或脂-蛋白连接而达到去细胞的目的,能够较好地保持蛋白质的原始结构,但是其脱细胞能力较差,单独使用经常导致细胞和核酸的残留,目前比较常用的非离子型去污剂包括Triton X-100等。阴离子型表面活性剂较剧烈,通过破坏脂质-脂质,脂质-蛋白质,DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用能彻底破坏细胞膜和核膜的完整性,溶解脂质双分子层结构,去细胞的作用更为全面,但对余留的组织破坏力也比较强,易使细胞外基质中的蛋白质变性;相比之下,两性离子表面活性剂可以在脱细胞过程中保护蛋白质的天然结构。目前比较常用的阴离子型表面活性剂包括十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-200等,两性离子表面活性剂包括3-3-胆固醇氨丙基二甲基氨基-1-丙磺酸(CHAPS)、磺基甜菜碱-10和磺基甜菜碱-16等。
目前很多专利已经涉及到使用上述传统的化学表面活性剂进行生物材料的脱细胞处理。例如CN105727367A采用TritonX-100和脱氧胆酸钠用于异种真皮基质的脱细胞处理;CN115607739A采用TritonX-100和十二烷基硫酸钠用于动物真皮的脱细胞处理;例如CN114848912A采用十二烷基硫酸钠溶液、聚山梨酯80溶液、TritonX-100溶液、TritonX-200溶液或脱氧胆酸钠溶液用于真皮基质的脱细胞处理。
值得注意的是,有研究显示,目前常用的化学表面活性剂,例如上述提到的种类,即使通过反复多次的清洗,残留的微量表面活性剂成分,无论是非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂,均影响生物材料体内植入时早期的生物相容性,其降解产物具有显著的体内毒性和刺激性,例如十二烷基硫酸钠是一种对人体微毒的阴离子表面活性剂,其生物降解度只有90%,对粘膜和上呼吸道有刺激作用;碳氟表面活性剂虽拥有独特性能,但在人体内易留存,从而使其应用受到一定限制;烷基酚聚氧乙烯醚的降解产物同样被发现可能对人体造成伤害。有报道称,医用生物材料内残留的十二烷基硫酸钠具有较强的细胞毒性,会抑制细胞的生长;来自Triton X-100、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠的试剂残留,浓度从0.1%增加到1.0%,既增加了表面活性剂降解片段的强度,也增加了细胞的不良结局。
因此,为有效避免常用的生物酶法和化学法(酸碱法或传统的化学表面活性剂法)的应用弊端,目前需要开发一种适合于大规模生产,并且能够产生具有优良生物相容性的产品的生物组织细胞去除工艺。
发明内容
本发明的目的:为了克服现有技术的缺陷,本发明提供了一种用于生物组织内细胞去除的方法,一种适合于大规模稳定生产的,新型且生物相容性优良的生物组织细胞去除工艺;制备常用的生物组织来源的医用脱细胞材料产品,具有脱细胞彻底,细胞毒性低,组织相容性高等特点,可用于临床上运动系统的软组织的修复和加强。
本发明公开涉及一种用于生物组织内细胞去除的方法,其特征在于:包括原材料处理、主脱细胞处理和脱细胞后处理;
原材料处理包括:
(1)采用同种异体或者异种的生物原材料,生物原材料包括同种异体和/或异种的生物材料,生物原材料为真皮基质、肌腱、体内膜,进行高压水冲洗和多轮浸泡,洗去残留的污物和可溶性的蛋白质;而后称重;
(2)利用物理、化学和生物酶法对残留在生物原材料上的无用组织进行彻底清除;
(3)将洁净的生物组织来源的原材料进行符合临床应用需求的具体形态塑造的物理精修,
当生物原材料为真皮基质时,对真皮基质进行减薄和片层处理;
当生物原材料为肌腱时,对肌腱组进行切割成形或破碎处理;
当生物原材料为体内膜时,对体内膜进行切割成形处理;
(4)具体形态塑造后,使用强碱性溶液、过氧乙酸、乙醇等溶液的一种或多种组合,单独或联合/序贯使用对生物原材料进行病毒灭活处理;
主脱细胞处理包括:使用生物表面活性剂和/或生物基表面活性剂进行脱细胞处理,生物表面活性剂为糖脂类、多糖脂、脂肽、中性类脂衍生物中的一种或多种组合,生物基表面活性剂为:氨基酸型表面活性剂和烷基糖苷类表面活性剂中的一种或多种组合;
脱细胞后处理包括,去除α-Gal抗原处理和/或交联处理;
当脱细胞后处理为去除α-Gal抗原处理时,采用α-半乳糖苷酶处理材料,降低或去除组织及细胞中的α-Gal抗原;α-半乳糖苷酶的浓度为1-100U/ml,处理时间为3小时-48小时,处理温度为4℃-37℃;
当脱细胞后处理为交联处理时,采用戊二醛、碳化二酰亚胺(EDC)、1,6-己二异氰酸酯py(HD)、京尼平、1,4-二(3,4-羟基苯)-2,3二甲基丁烷(NDGA)、环氧化合物、含有二硫化物官能团的二羧酸化合物、酰基叠氨化物及二苯基磷酸盐(DP-中PA)、乙醛酸中的至少一种进行化学交联改性。
本发明的再进一步设置:当脱细胞后处理为交联处理时,采用具有较低细胞毒性的碳化二酰亚胺和京尼平进行交联;碳化二酰亚胺的浓度是1-200nM,京尼平的浓度范围是0.01%-10%(wt/v),处理时间为30分钟~72小时,处理温度为4℃-37℃。
本发明的再进一步设置:还包括辅助脱细胞处理,在主脱细胞处理前和/或后以及主脱细胞处理中,采用物理法、生物酶法、化学法其中至少一种进行辅助脱细胞;
当采用物理法进行辅助脱细胞时,物理法为搅拌、震荡、反复冻融法、真空法、超声洗涤法、高静水压法、超临界流体法中的至少一种;
当采用生物酶法进行辅助脱细胞时,生物酶法为胰酶、中性蛋白酶、Dispase酶、胃蛋白酶、DNA酶、RNA酶、磷脂酶A2中的至少一种进行处理;
当采用化学法进行辅助脱细胞时,化学法为有机溶剂,高渗,低渗溶液中的至少一种进行处理。
本发明的再进一步设置:当主脱细胞处理中采用糖脂类的生物表面活性剂进行处理时,糖脂类的生物表面活性剂为海藻糖脂、鼠李糖脂、槐糖脂、纤维二糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂中至少一种;
其中当采用阴离子表面活性剂鼠李糖脂或非离子型表面活性剂槐糖脂进行脱细胞处理时,鼠李糖脂或槐糖脂的浓度为0.1%-10%;生物原材料和溶液的质量体积比为1:1-1:10,处理时间为30分钟-14天,处理温度为4℃-37℃。
本发明的再进一步设置:当使用氨基酸型表面活性剂进行主脱细胞处理时氨基酸型表面活性剂为亲水基以氨基酸为主的一类生物基表面活性剂:
氨基酸型表面活性剂根据取代基的位置分为N-取代的氨基酸型表面活性剂、C-取代的氨基酸型表面活性剂、N-和C-取代的氨基酸型表面活性剂;
氨基酸型表面活性剂根据疏水尾巴的数目分为直链氨基酸型表面活性剂、Gemini(二聚体)型氨基酸型表面活性剂、甘油脂型氨基酸型表面活性剂、双头基两亲分子(Bola)型氨基酸型表面活性剂;
氨基酸型表面活性剂根据头基的类型分为阳离子型,阴离子型,两性离子型以及非离子型;
其中阳离子型的氨基酸型表面活性剂为椰油酰基精氨酸乙酯和酰基蛋白质的季铵盐的至少一种;
其中阴离子型的氨基酸型表面活性剂,亲水基常见为肌氨酸、甘氨酸、谷氨酸中的至少一种,亲脂基常见为椰油酰基、月桂酰基、十四酸、油酸及其卤化物和酯类中至少一种;
其中两性离子型的氨基酸型表面活性剂为月桂酰赖氨酸(LL)和烷氧基(2-羟丙基)精氨酸的至少一种。
本发明的再进一步设置:当氨基酸型表面活性剂为亲水基以氨基酸为主的一类生物基表面活性剂,优选的三类基团组合的氨基酸型表面活性剂,组合规则是一个亲水基+亲油基+一个无机盐基,该类氨基酸型表面活性剂浓度为0.1%-15%,生物原材料和溶液的质量体积比为1:1-1:10,处理时间为5分钟-7天,处理温度为4℃-37℃。
本发明的再进一步设置:当使用烷基糖苷类表面活性剂进行脱细胞处理时,烷基糖苷类表面活性剂(Alkyl Polyglucoside,简称APG),根据APG碳数的差异分为APG0810、APG1214、APG0814、APG0816、APG1216、APG1218,烷基糖苷类表面活性剂浓度为0.1%-10%,生物原材料和溶液的质量体积比为1:1-1:10,处理时间为5分钟-7天,处理温度为4℃-37℃。
本发明的再进一步设置:当联合使用生物表面活性剂和生物基表面活性剂进行脱细胞处理时,可联用和/或序贯使用生物表面活性剂和生物基表面活性剂进行脱细胞处理。
本发明的再进一步设置:还包括有终末处理包括如下步骤:
一、打孔和漂洗:对得到产品间断打孔,孔径可为0.1-5cm之间,间距可为0.1-5cm之间;对打孔后的产品或者未打孔的产品,用无菌PBS溶液洗涤-5-10次;终末纯化水100~1000%水洗,漂洗生物材料10-20次;
二、包装储存:采用冻干保存或生理盐水浸泡湿态保存;
三、消毒灭菌:采用环氧乙烷或辐照处理,对产品进行终末灭菌处理。
本发明的具体有益效果为:生物表面活性剂,微生物或植物在一定条件下培养时,在其代谢过程中分泌出的具有一定表面活性,集亲水基和疏水基结构于一分子内部的两亲化合物,其优势在于活性高、乳化性能好、空间结构复杂、表面张力低、具有高化学稳定性和热稳定性;
生物基表面活性剂,生物技术或化学方法合成的表面活性剂,模拟了烷基苷、蛋白质等天然两亲分子结构,相比较常规的皂基类和硫酸盐体系表面活性剂,具有刺激性小、生物降解性好、抗菌性好等特点,保证了人体的安全性,同时,还具有极好的表面性能,其中,氨基酸型表面活性剂和烷基糖苷类表面活性剂,这两者均表现出的优秀生物降解性和生物相容性、高安全性等优良特性;例如氨基酸型表面活性剂能被人体内的酶分解为脂肪酸和氨基酸,有研究发现,在大鼠、家兔进行亚急性试验、慢性毒性试验、粘膜刺激性等试验后,N-酰基氨基酸钠比十二烷基硫酸钠刺激性更很小,安全性更高;
将生物表面活性剂和/或以生物质为基础的表面活性剂应用到生物组织来源的脱细胞医用材料的规模生产中,并结合现有的辅助脱细胞工艺等步骤,制备符合注册条件的医用脱细胞材料产品,基于本发明的规模化生产的产品,具有脱细胞彻底,力学强度优良,生物相容性优,无免疫原性等特点。
附图说明
图1为本发明实施例1效果图;
图2为本发明实施例2效果图;
图3为本发明实施例3效果图。
实施方式
本发明公开涉及一种用于生物组织内细胞去除的方法,其特征在于:包括原材料处理、主脱细胞处理和脱细胞后处理;
原材料处理包括:
(1)采用同种异体或者异种的生物原材料,生物原材料包括同种异体和/或异种的生物材料,生物原材料为真皮基质、肌腱、体内膜,进行高压水冲洗和多轮浸泡,洗去残留的污物和可溶性的蛋白质;而后称重;
(2)利用物理、化学和生物酶法对残留在生物原材料上的无用组织(无用组织为脂肪和毛发、污渍等)进行彻底清除;
(3)将洁净的去脂肪脱毛的生物组织来源的原材料进行符合临床应用需求的具体形态塑造的物理精修,
当生物原材料为真皮基质时,对真皮基质进行减薄和片层处理;
当生物原材料为肌腱时,对肌腱组进行切割成形或破碎处理;
当生物原材料为体内膜时,对体内膜进行切割成形处理;
(4)具体形态塑造后,使用强碱性溶液(例如氢氧化钠或氢氧化钾溶液)、过氧乙酸、乙醇等溶液的一种或多种组合,单独或联合/序贯使用对生物原材料进行病毒灭活处理;
主脱细胞处理包括:使用生物表面活性剂和/或生物基表面活性剂进行脱细胞处理,生物表面活性剂为糖脂类、多糖脂、脂肽、中性类脂衍生物中的一种或多种组合,生物基表面活性剂为:氨基酸型表面活性剂和烷基糖苷类表面活性剂中的一种或多种组合;
脱细胞后处理包括,去除α-Gal抗原处理和/或交联处理;
当脱细胞后处理为去除α-Gal抗原处理时,采用α-半乳糖苷酶处理材料,降低或去除组织及细胞中的α-Gal抗原;α-半乳糖苷酶的浓度为1-100U/ml,处理时间为3小时-48小时,处理温度为4℃-37℃;
当脱细胞后处理为交联处理时,采用戊二醛、碳化二酰亚胺(EDC)、1,6-己二异氰酸酯py(HD)、京尼平、1,4-二(3,4-羟基苯)-2,3二甲基丁烷(NDGA)、环氧化合物、含有二硫化物官能团的二羧酸化合物、酰基叠氨化物及二苯基磷酸盐(DP-中PA)、乙醛酸中的至少一种进行化学交联改性。
如猪,牛和羊等来源组织及细胞中的α-Gal抗原与人体内存在的天然抗α-Gal抗体结合,会激活补体系统引起严重的超急性排斥反应,最终导致异种移植失败,优选地,采用α-半乳糖苷酶处理材料,降低或去除组织及细胞中的α-Gal抗原,为了使胶原组织中的胶原纤维更加稳定,使用外来交联处理使胶原分子发生个别螺旋区内的分子内交联、邻近不同分子间交联或原胶原和其它分子间交联,该步骤主要实现两个目的:一是提高胶原网络之间的结构强度,减少体内酶对于胶原网络的降解作用;二是封闭一些残存的抗原表位,减少材料植入体内的抗原反应。
本发明的再进一步设置:当脱细胞后处理为交联处理时,采用具有较低细胞毒性的碳化二酰亚胺和京尼平进行交联;碳化二酰亚胺的浓度是1-200nM,京尼平的浓度范围是0.01%-10%(wt/v),处理时间为30分钟~72小时,处理温度为4℃-37℃。
本发明的再进一步设置:还包括辅助脱细胞处理,在主脱细胞处理前和/或后以及主脱细胞处理中,采用物理法、生物酶法、化学法其中至少一种进行辅助脱细胞;
当采用物理法进行辅助脱细胞时,物理法为搅拌、震荡、反复冻融法、真空法、超声洗涤法、高静水压法、超临界流体法中的至少一种;
当采用生物酶法进行辅助脱细胞时,生物酶法为胰酶、中性蛋白酶、Dispase酶、胃蛋白酶、DNA酶、RNA酶、磷脂酶A2中的至少一种进行处理;
当采用化学法进行辅助脱细胞时,化学法为有机溶剂,高渗,低渗溶液中的至少一种进行处理。
本发明的再进一步设置:当主脱细胞处理中采用糖脂类的生物表面活性剂进行处理时,糖脂类的生物表面活性剂为海藻糖脂、鼠李糖脂、槐糖脂、纤维二糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂中至少一种;
其中当采用阴离子表面活性剂鼠李糖脂或非离子型表面活性剂槐糖脂进行脱细胞处理时,鼠李糖脂或槐糖脂的浓度为0.1%-10%;生物原材料和溶液的质量体积比为1:1-1:10,处理时间为30分钟-14天,处理温度为4℃-37℃。
本发明的再进一步设置:当使用氨基酸型表面活性剂进行主脱细胞处理时氨基酸型表面活性剂为亲水基以氨基酸为主的一类生物基表面活性剂:
氨基酸型表面活性剂根据取代基的位置分为N-取代的氨基酸型表面活性剂、C-取代的氨基酸型表面活性剂、N-和C-取代的氨基酸型表面活性剂;
氨基酸型表面活性剂根据疏水尾巴的数目分为直链氨基酸型表面活性剂、Gemini(二聚体)型氨基酸型表面活性剂、甘油脂型氨基酸型表面活性剂、双头基两亲分子(Bola)型氨基酸型表面活性剂;
氨基酸型表面活性剂根据头基的类型分为阳离子型,阴离子型,两性离子型以及非离子型;
其中阳离子型的氨基酸型表面活性剂为椰油酰基精氨酸乙酯和酰基蛋白质的季铵盐的至少一种;
其中阴离子型的氨基酸型表面活性剂,亲水基常见为肌氨酸、甘氨酸、谷氨酸中的至少一种,亲脂基常见为椰油酰基、月桂酰基、十四酸、油酸及其卤化物和酯类中至少一种;
其中两性离子型的氨基酸型表面活性剂为月桂酰赖氨酸(LL)和烷氧基(2-羟丙基)精氨酸的至少一种。
本发明的再进一步设置:当氨基酸型表面活性剂为亲水基以氨基酸为主的一类生物基表面活性剂,优选的三类基团组合的氨基酸型表面活性剂,组合规则是一个亲水基+亲油基+一个无机盐基,该类氨基酸型表面活性剂浓度为0.1%-15%,生物原材料和溶液的质量体积比为1:1-1:10,处理时间为5分钟-7天,处理温度为4℃-37℃。
优选地,氨基酸型表面活性剂的组成如以下所列:
亲水基 | 亲油基 | 无机盐 |
谷氨酸(RCONHCHCOOM1/CH2CH2COO-M2+)甘氨酸(RCONHCH2COOM)肌氨酸(RCONCH2COOMCH3)丙氨酸(RCONHCHCOOMCH3) | 月桂基椰油基C8、C10、C12、C14、C16、C18等 | 钠盐钾盐三乙醇胺盐 |
。
本发明的再进一步设置:当使用烷基糖苷类表面活性剂进行脱细胞处理时,烷基糖苷类表面活性剂(Alkyl Polyglucoside,简称APG),根据APG碳数的差异分为APG0810、APG1214、APG0814、APG0816、APG1216、APG1218,其中烷基糖苷类表面活性剂优选APG0810、APG1214、APG0814,烷基糖苷类表面活性剂浓度为0.1%-10%,生物原材料和溶液的质量体积比为1:1-1:10,处理时间为5分钟-7天,处理温度为4℃-37℃。
本发明的再进一步设置:当联合使用生物表面活性剂和生物基表面活性剂进行脱细胞处理时,可联用和/或序贯使用生物表面活性剂和生物基表面活性剂进行脱细胞处理。
本发明的再进一步设置:还包括有终末处理包括如下步骤:
一、打孔和漂洗:对得到产品间断打孔,孔径可为0.1-5cm之间,间距可为0.1-5cm之间;对打孔后的产品或者未打孔的产品,用无菌PBS溶液洗涤-5-10次;终末纯化水100~1000%水洗,漂洗生物材料10-20次;
二、包装储存:采用冻干保存或生理盐水浸泡湿态保存;
三、消毒灭菌:采用环氧乙烷或辐照处理,对产品进行终末灭菌处理。
本发明的具体有益效果为:生物表面活性剂,微生物或植物在一定条件下培养时,在其代谢过程中分泌出的具有一定表面活性,集亲水基和疏水基结构于一分子内部的两亲化合物,其优势在于活性高、乳化性能好、空间结构复杂、表面张力低、具有高化学稳定性和热稳定性;
生物基表面活性剂,生物技术或化学方法合成的表面活性剂,模拟了烷基苷、蛋白质等天然两亲分子结构,相比较常规的皂基类和硫酸盐体系表面活性剂,具有刺激性小、生物降解性好、抗菌性好等特点,保证了人体的安全性,同时,还具有极好的表面性能,其中,氨基酸型表面活性剂和烷基糖苷类表面活性剂,这两者均表现出的优秀生物降解性和生物相容性、高安全性等优良特性;例如氨基酸型表面活性剂能被人体内的酶分解为脂肪酸和氨基酸,有研究发现,在大鼠、家兔进行亚急性试验、慢性毒性试验、粘膜刺激性等试验后,N-酰基氨基酸钠比十二烷基硫酸钠刺激性更很小,安全性更高;
将生物表面活性剂和/或以生物质为基础的表面活性剂应用到生物组织来源的脱细胞医用材料的规模生产中,并结合现有的辅助脱细胞工艺等步骤,制备符合注册条件的医用脱细胞材料产品,基于本发明的规模化生产的产品,具有脱细胞彻底,力学强度优良,生物相容性优,无免疫原性等特点。
实施例
原材料处理:猪皮取自具备资质的屠宰厂,健康成年猪宰杀后剥皮带回,进行高压水冲洗和多轮浸泡,洗去残留的污物和可溶性的蛋白质;而后称重;进一步,利用物理法和脂肪酶法对残留在原材料的无用脂肪组织彻底清除,最优选采用,利用涂酶法和脱毛机对猪皮进行彻底的脱毛处理;进一步,将洁净的去脂肪脱毛猪皮减薄和裁剪成5cm×5cm×1mm的方块,再进一步,使用1%过氧乙酸对猪皮处理2h进行病毒灭活处理。
基于生物表面活性剂的主脱细胞处理:
针对猪来源的脱细胞真皮基质,在主脱细胞处理前,使用高渗盐水进行去表皮处理,去除角质层,便于后续脱细胞试剂的渗透,采用浓度为1-2M的氯化钠,溶液体积:猪皮质量=5:1,处理时间为24-96小时,而后将表皮掀去;
采用生物表面活性剂——鼠李糖脂进行脱细胞处理;浓度范围可为0.1%-10%;溶液体积:猪皮质量=5:1;处理时间为12小时;处理温度为25℃。
辅助脱细胞处理:
在上述的主脱细胞工艺处理中,辅助物理法进行辅助脱细胞;在进行鼠李糖脂脱细胞过程中,采用搅拌和震荡等物理方法促进脱细胞的进程。
在上述的主脱细胞工艺后,辅助生物酶法进行辅助脱细胞;在进行鼠李糖脂脱细胞过程后,采用DNA酶和RNA酶进行处理,以洗去残留的核酸类物质;DNA酶和RNA酶浓度范围可分别为10-100U/ml和5-50U/ml,溶液体积:猪皮质量=5:1~10:1,处理时间为24小时,处理温度为4℃。
脱细胞后处理步骤:进行去除α-Gal抗原处理,α-半乳糖苷酶的浓度可为10-50U/ml; 处理时间为48小时,处理温度为25℃。
终末处理步骤:(1)打孔和漂洗:将辅助脱细胞处理中得到的产品使用激光间断打孔,孔直径为0.5cm,间距为1cm;而后用纯化水100~1000%水洗10-20次;(2)包装储存:冻干保存;(3)消毒灭菌:采用环氧乙烷对产品进行终末灭菌处理。
按照上述5个步骤可制备得样品1-1。
本实例为重点突出呈现本发明制备采用生物表面活性剂鼠李糖脂进行脱细胞处理工艺的优势,仅将本实例的核心步骤主脱细胞处理的鼠李糖脂替换为常规化学合成阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠,该处理参数不变,其余步骤亦相同,以此可制备得样品1-2。
由图1-1的HE染色显示,鼠李糖脂能够产生和常规十二烷基硫酸钠相同的彻底脱细胞效应,但值得注意的是,本发明所制备的样品1-1胶原纤维网络更加致密,体现出本发明在脱细胞彻底的同时能更好的保护原生的胶原结构,减少处理工艺对于胶原网络的损害;进一步地,如图1-2所示,通过常规的细胞活性验证实验Cell Counting Kit-8(CCK8)实验证实,本发明所制备的样品1-1与成纤维细胞进行孵育时,具有相比于样品1-2显著更高的细胞活性。
实施例
原材料处理:猪腹膜取自具备资质的屠宰厂,健康成年猪宰杀后解剖取下腹膜组织,使用纯化水进行多轮浸泡,洗去残留的污物和可溶性的蛋白质;而后称重;进一步,利用物理法对残留在原材料的无用脂肪组织彻底清除;再进一步,将洁净的去脂肪腹膜裁剪成10cm×10cm的方块;再进一步,病毒灭活处理,使用0.1%过氧乙酸对猪皮处理2h。
基于生物基表面活性剂的主脱细胞处理:
采用生物基表面活性剂——月桂酰谷氨酸钠进行脱细胞处理,浓度范围为0.01%-10%,溶液体积:腹膜质量=5:1~10:1,处理时间为12小时;处理温度为25℃。
辅助脱细胞处理:
在上述的主脱细胞工艺处理中,辅助物理法进行辅助脱细胞,在进行月桂酰谷氨酸钠脱细胞过程中,采用搅拌和震荡等物理方法促进脱细胞的进程。
在上述的主脱细胞工艺后,辅助生物酶法进行辅助脱细胞;在进行月桂酰谷氨酸钠脱细胞过程后,采用DNA酶和RNA酶进行处理,以洗去残留的核酸类物质,DNA酶和RNA酶浓度范围可分别为10-100U/ml和5-50U/ml,溶液体积:腹膜质量=5:1,处理时间为12小时,处理温度为4℃。
脱细胞后处理:进行去除α-Gal抗原处理,α-半乳糖苷酶的浓度为10-50U/ml,处理时间为24小时,处理温度为25℃。
终末处理步骤:(1)用纯化水100~1000%水洗10-20次;(2)包装储存:湿态保存;(3)消毒灭菌:采用辐照灭菌对产品进行终末灭菌处理。
按照上述5个步骤可制备得样品2-1。
本实例为重点突出呈现本发明制备采用生物基表面活性剂月桂酰谷氨酸钠进行脱细胞处理工艺的优势,仅将实施例2的主脱细胞处理中的月桂酰谷氨酸钠替换为常规化学合成阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸,该处理参数不变。其余步骤亦相同。以此可制备得样品2-2。
由图2-1的HE染色显示,月桂酰谷氨酸钠能够产生和常规十二烷基苯磺酸相同的彻底脱细胞效应,但值得注意的是,本发明所制备的样品2-1胶原纤维网络更加致密,体现出本发明在脱细胞彻底的同时能更好的保护原生的胶原结构,减少处理工艺对于胶原网络的损害。进一步地,如图2-2所示,通过CCK8实验证实,本发明所制备的样品2-1与成纤维细胞进行孵育时,具有相比于样品2-2显著更高的细胞活性。
实施例
原材料处理:猪下肢肌腱取自具备资质的屠宰厂,健康成年猪宰杀后解剖取下肢肌腱组织,使用纯化水进行多轮浸泡,洗去残留的污物和可溶性的蛋白质;而后称重;进一步,利用物理法对残留在原材料的无用脂肪和筋膜组织彻底清除;再进一步,将洁净的下肢肌腱裁剪成的不同直径的长条状;最后进行病毒灭活处理:使用0.1%过氧乙酸和25%的乙醇混合溶液对肌腱处理2h。
辅助脱细胞处理:由于肌腱较为致密,在主脱细胞处理前设置辅助脱细胞处理步骤,具体为采用液氮/37℃生理盐水进行5-10次的反复冻融循环,液氮处理时间5min-2h,37℃生理盐水处理时间5min-2h。
基于生物基表面活性剂的主脱细胞处理:
采用生物基表面活性剂——椰油酰肌氨酸进行脱细胞处理,浓度范围为0.01%-10%,溶液体积:肌腱质量=5:1~10:1,处理时间为96小时;处理温度为25℃。
辅助脱细胞处理:
在上述的主脱细胞工艺处理中,辅助物理法进行辅助脱细胞,在进行月桂酰谷氨酸钠脱细胞过程中,采用搅拌和震荡等物理方法促进脱细胞的进程。
在上述的主脱细胞工艺后,辅助生物酶法进行辅助脱细胞:采用DNA酶和RNA酶进行处理,以洗去残留的核酸类物质,DNA酶和RNA酶浓度范围可分别为10-100U/ml和5-50U/ml,溶液体积:肌腱质量=3:1,处理时间为48小时,处理温度为4℃。
脱细胞后处理:
进行去除α-Gal抗原处理,α-半乳糖苷酶的浓度为10-50U/ml,处理时间为36小时,处理温度为25℃。
进行交联处理,采用京尼平进行交联处理,京尼平浓度优选为0.1%~2%;处理时间为24小时,处理温度为4℃。
终末处理步骤:(1)用纯化水100~1000%水洗10-20次;(2)包装储存:湿态保存;(3)消毒灭菌:采用辐照灭菌对产品进行终末灭菌处理。
按照上述6个步骤可制备得样品3-1。
本实例为重点突出呈现本发明制备采用生物基表面活性剂椰油酰肌氨酸进行脱细胞处理工艺的优势,仅将实施例2的主脱细胞处理中的椰油酰肌氨酸替换为常规化学合成阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸,该处理参数不变。其余步骤亦相同。以此可制备得样品3-2。
由图3-1的HE染色显示,椰油酰肌氨酸能够产生和常规十二烷基苯磺酸相同的彻底脱细胞效应,但值得注意的是,本发明所制备的样品3-1胶原纤维网络更加致密,排列更加有序,体现出本发明在脱细胞彻底的同时能更好的保护原生的胶原结构,减少处理工艺对于胶原网络的损害。进一步地,如图3-2所示,通过CCK8实验证实,本发明所制备的样品3-1与成纤维细胞进行孵育时,具有相比于样品3-2显著更高的细胞活性。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员而言,在不脱离本发明核心工艺和原理的前提下,还可以对本发明方法进行若干改进和修饰,但这些改进和修饰也落入本发明权利要求请求保护的范围内。
Claims (9)
1.一种用于生物组织内细胞去除的方法,其特征在于:包括原材料处理、主脱细胞处理和脱细胞后处理;
原材料处理包括:
(1)采用同种异体或者异种的生物原材料,生物原材料包括同种异体和/或异种的生物材料,生物原材料为真皮基质、肌腱、体内膜,进行高压水冲洗和多轮浸泡,洗去残留的污物和可溶性的蛋白质;而后称重;
(2)利用物理、化学和生物酶法对残留在生物原材料上的无用组织进行彻底清除;
(3)将洁净的生物组织来源的原材料进行符合临床应用需求的具体形态塑造的物理精修,
当生物原材料为真皮基质时,对真皮基质进行减薄和片层处理;
当生物原材料为肌腱时,对肌腱组进行切割成形或破碎处理;
当生物原材料为体内膜时,对体内膜进行切割成形处理;
(4)具体形态塑造后,使用强碱性溶液、过氧乙酸,过氧化氢、乙醇等溶液的一种或多种组合,单独或联合/序贯使用对生物原材料进行病毒灭活处理;
主脱细胞处理包括:使用生物表面活性剂和/或生物基表面活性剂进行脱细胞处理,生物表面活性剂为糖脂类、多糖脂、脂肽、中性类脂衍生物中的一种或多种组合,生物基表面活性剂为:氨基酸型表面活性剂和烷基糖苷类表面活性剂中的一种或多种组合;
脱细胞后处理包括,去除α-Gal抗原处理和/或交联处理;
当脱细胞后处理为去除α-Gal抗原处理时,采用α-半乳糖苷酶处理材料,降低或去除组织及细胞中的α-Gal抗原;α-半乳糖苷酶的浓度为1-100U/ml,处理时间为3小时-48小时,处理温度为4℃-37℃;
当脱细胞后处理为交联处理时,采用戊二醛、碳化二酰亚胺(EDC)、1,6-己二异氰酸酯py(HD)、京尼平、1,4-二(3,4-羟基苯)-2,3二甲基丁烷(NDGA)、环氧化合物、含有二硫化物官能团的二羧酸化合物、酰基叠氨化物及二苯基磷酸盐(DP-中PA)、乙醛酸中的至少一种进行化学交联改性。
2.根据权利要求1所述的一种用于生物组织内细胞去除的方法,其特征在于:当脱细胞后处理为交联处理时,采用具有较低细胞毒性的碳化二酰亚胺和京尼平进行交联;碳化二酰亚胺的浓度是1-200nM,京尼平的浓度范围是0.01%-10%(wt/v),处理时间为30分钟~72小时,处理温度为4℃-37℃。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于生物组织内细胞去除的方法,其特征在于:还包括辅助脱细胞处理,在主脱细胞处理前和/或处理后以及主脱细胞处理中,采用物理法、生物酶法、化学法其中至少一种进行辅助脱细胞;
当采用物理法进行辅助脱细胞时,物理法为搅拌、震荡、反复冻融法、真空法、超声洗涤法、高静水压法、超临界流体法中的至少一种;
当采用生物酶法进行辅助脱细胞时,生物酶法为胰酶、中性蛋白酶、Dispase酶、胃蛋白酶、DNA酶、RNA酶、磷脂酶A2中的至少一种进行处理;
当采用化学法进行辅助脱细胞时,化学法为有机溶剂、高渗溶液、低渗溶液中的至少一种进行处理。
4.根据权利要求3所述的一种用于生物组织内细胞去除的方法,其特征在于:当主脱细胞处理中采用糖脂类的生物表面活性剂进行处理时,糖脂类的生物表面活性剂为海藻糖脂、鼠李糖脂、槐糖脂、纤维二糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂中至少一种;
其中当采用阴离子表面活性剂鼠李糖脂或非离子型表面活性剂槐糖脂进行脱细胞处理时,鼠李糖脂或槐糖脂的浓度为0.1%-10%;生物原材料和溶液的质量体积比为1:1-1:10,处理时间为30分钟-14天,处理温度为4℃-37℃。
5.根据权利要求4所述的一种用于生物组织内细胞去除的方法,其特征在于:当使用氨基酸型表面活性剂进行主脱细胞处理时,氨基酸型表面活性剂为亲水基以氨基酸为主的一类生物基表面活性剂:
氨基酸型表面活性剂根据取代基的位置分为N-取代的氨基酸型表面活性剂、C-取代的氨基酸型表面活性剂、N-和C-取代的氨基酸型表面活性剂;
氨基酸型表面活性剂根据疏水尾巴的数目分为直链氨基酸型表面活性剂、Gemini(二聚体)型氨基酸型表面活性剂、甘油脂型氨基酸型表面活性剂、双头基两亲分子(Bola)型氨基酸型表面活性剂;
氨基酸型表面活性剂根据头基的类型分为阳离子型,阴离子型,两性离子型以及非离子型;
其中阳离子型的氨基酸型表面活性剂为椰油酰基精氨酸乙酯和酰基蛋白质的季铵盐的至少一种;
其中阴离子型的氨基酸型表面活性剂,亲水基具体为肌氨酸、甘氨酸、谷氨酸中的至少一种,亲脂基具体为椰油酰基、月桂酰基、十四酸、油酸及其卤化物和酯类中至少一种;
其中两性离子型的氨基酸型表面活性剂为月桂酰赖氨酸(LL)和烷氧基(2-羟丙基)精氨酸的至少一种。
6.根据权利要求5所述的一种用于生物组织内细胞去除的方法,其特征在于:当氨基酸型表面活性剂为亲水基以氨基酸为主的一类生物基表面活性剂,优选的三类基团组合的氨基酸型表面活性剂,组合规则是一个亲水基+亲油基+一个无机盐基,该类氨基酸型表面活性剂浓度为0.1%-15%,生物原材料和溶液的质量体积比为1:1-1:10,处理时间为5分钟-7天,处理温度为4℃-37℃。
7.根据权利要求6所述的一种用于生物组织内细胞去除的方法,其特征在于:当使用烷基糖苷类表面活性剂进行脱细胞处理时,烷基糖苷类表面活性剂(Alkyl Polyglucoside,简称APG),根据APG碳数的差异分为APG0810、APG1214、APG0814、APG0816、APG1216、APG1218,烷基糖苷类表面活性剂浓度为0.1%-10%,生物原材料和溶液的质量体积比为1:1-1:10,处理时间为5分钟-7天,处理温度为4℃-37℃。
8.根据权利要求7所述的一种用于生物组织内细胞去除的方法,其特征在于:当联合使用生物表面活性剂和生物基表面活性剂进行脱细胞处理时,可联用和/或序贯使用生物表面活性剂和生物基表面活性剂进行脱细胞处理。
9.根据权利要求1所述的一种用于生物组织内细胞去除的方法,其特征在于:还包括有终末处理,具体包括如下步骤:
一、打孔和漂洗:对得到产品间断打孔,孔径可为0.1-5cm之间,间距可为0.1-5cm之间;对打孔后的产品或者对未进行打孔的产品,用无菌PBS溶液洗涤-5-10次;终末纯化水100~1000%水洗,漂洗生物材料10-20次;
二、包装储存:采用冻干保存或生理盐水浸泡湿态保存;
三、消毒灭菌:采用环氧乙烷或辐照处理,对产品进行终末灭菌处理。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310947751.3A CN117582553A (zh) | 2023-07-31 | 2023-07-31 | 一种用于生物组织内细胞去除的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310947751.3A CN117582553A (zh) | 2023-07-31 | 2023-07-31 | 一种用于生物组织内细胞去除的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117582553A true CN117582553A (zh) | 2024-02-23 |
Family
ID=89912148
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310947751.3A Pending CN117582553A (zh) | 2023-07-31 | 2023-07-31 | 一种用于生物组织内细胞去除的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117582553A (zh) |
-
2023
- 2023-07-31 CN CN202310947751.3A patent/CN117582553A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2013289661B2 (en) | Decellularization method for preparing extracellular matrix support material | |
KR102126140B1 (ko) | 고순도 콜라겐 입자의 제조 및 이의 용도 | |
US10426868B2 (en) | Method for preparing an animal decellularized tissue matrix material and a decellularized tissue matrix material prepared thereby | |
US9957477B2 (en) | Method for enzymatic treatment of tissue products | |
AU2002310589B2 (en) | Decellularisation of matrices | |
US20190151507A1 (en) | Method for enzymatic treatment of tissue products | |
Dong et al. | The study of a new detergent (octyl-glucopyranoside) for decellularizing porcine pericardium as tissue engineering scaffold | |
CN112618799B (zh) | 鱼皮脱细胞真皮基质及其制备方法和应用 | |
Das et al. | Tissue-derived decellularized extracellular matrices toward cartilage repair and regeneration | |
Gu et al. | Preparation and evaluation of decellularized porcine carotid arteries cross-linked by genipin: the preliminary results | |
KR20130118418A (ko) | 생체조직 유래 소재의 탈세포 처리제, 이를 이용한 처리방법 및 이로부터 수득된 생체 재료 | |
JP2016534118A (ja) | 動物組織材料の消毒・滅菌方法及び動物組織浸漬溶液 | |
Kumar et al. | Effects of crosslinking treatments on the physical properties of acellular fish swim bladder | |
EP3549616B1 (en) | Method for enzymatic treatment of tissue products | |
CN117582553A (zh) | 一种用于生物组织内细胞去除的方法 | |
CN107029298A (zh) | 一种医用脱细胞真皮基质及其制备方法 | |
CN114306755B (zh) | 一种后巩膜加固术用生物补片及其制备方法 | |
US20210069381A1 (en) | Methods and systems for stiffening of tissue for improved processing | |
WO2008097885A2 (en) | Decellularization of soft tissue | |
CN115461095A (zh) | 一种用于生产脱细胞组织支架的方法 | |
ARATHY | EVALUATION OF HOST CELLULAR BEHAVIOURS TO DECELLULARISED EXTRACELLULAR MATRIX BASED PORCINE TUNICA VAGINALIS SCAFFOLDS IN RAT MODEL | |
TWI533860B (zh) | 細胞移除後生物結構 | |
WO2023214361A1 (es) | Método de descelularización de un tejido, matriz de tejido descelularizado y andamio para su uso en reparación de tejidos |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |