CN115461095A - 一种用于生产脱细胞组织支架的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产脱细胞组织支架的方法。本发明还涉及通过所述方法生产的组织支架。具体为猪组织支架。该方法包括降低水平的阴离子洗涤剂,并避免使用动物来源的蛋白酶抑制剂以产生具有有利性能的组织支架。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产脱细胞组织支架的方法。本发明还涉及通过所述方法生产的组织支架。
背景技术
动物或人类来源的软组织移植物用于各种医疗程序,以手术修复或替换软组织。例如,这种移植物可用于在疝修补、骨盆器官脱垂或韧带重建中修复或重建组织。
为了使人组织(同种异体移植物)或动物组织(异种移植物)用作安全有效的组织支架,有必要确保移植物不含细菌和病毒,脱细胞,且不含DNA以防止移植物排斥,并保留其来源的天然组织的功能特性,包括生物力学特性和充当细胞外基质(ECM)的能力。
本领域已知,除了一种或多种蛋白酶抑制剂之外,使用阴离子洗涤剂如十二烷基硫酸钠(SDS)在脱细胞软组织中非常有效,同时保持其ECM结构以产生有效的生物支架(EP1392372B1)。然而,即使在相对低的浓度下,SDS也具有高度的细胞毒性,这可能导致移植物的生物相容性失效,这是因为洗涤剂残留物保留在移植物中。此外,某些蛋白酶抑制剂,如抑肽酶,通常是动物源性的,这与移植受体暴露于人畜共患疾病(例如,包括牛海绵状脑病在内的传染性海绵状脑疾病)的风险有关,这在医疗产品的背景下是不可接受的。
当前处理方法的另一个问题是,当使用非人组织时,从移植物本身有效去除病毒。重要的是通过将潜在的人畜共患病原体(例如猪细小病毒(PPV)和猪内源性逆转录病毒(PERV))降低到安全水平来确保异种移植物在生物学上是安全的。为此,动物组织必须暴露于消毒/灭菌过程中,该过程已被证明可将人畜共患病减少高达6-log。然而,这种幅度的降低通常不能通过传统的灭菌方法实现,例如以25kGy的剂量进行伽马辐照。
本发明旨在提供一种用于生产脱细胞组织支架的改进方法,其克服或部分改善与本领域已知方法相关的问题。
发明内容
在一个方面,本发明涉及用于生产脱细胞组织支架的方法,该方法包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂孵育所述组织;
·用低渗溶液孵育组织至少一次,用高渗溶液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
应当理解,本发明方法的步骤不需要按上述提供的顺序进行。另外地,或可替换地,两个或多个步骤可以合并成一个步骤。仅作为示例,用低渗缓冲液孵育组织至少一次和用阴离子洗涤剂孵育组织的步骤可以合并成一个步骤。在本说明书的其他地方提供了示例性的步骤序列。
此外,每个孵育的多个步骤可以包括在该方法中。例如,该方法可以包括用脱脂剂孵育组织的多个步骤。
合适地,起始组织可以选自皮肤、半月板、肌腱、韧带、软骨、肌肉、血管和器官。
合适地,脱脂剂可以是极性溶剂。合适地,极性溶剂可以是丙酮。合适地,脱脂剂的浓度可为约80%至约100%(v/v)。
合适地,阴离子洗涤剂可以是十二烷基硫酸钠(SDS)或脱氧胆酸钠。合适地,阴离子洗涤剂(例如,SDS或脱氧胆酸钠)的浓度可以等于或小于0.2%(w/v)。
合适地,该方法不包括蛋白酶抑制剂。合适地,该方法不包括动物来源的蛋白酶抑制剂。合适地,该方法可以包括非动物来源的蛋白酶抑制剂。合适地,该方法可以包括非动物来源的金属蛋白酶抑制剂。合适地,非动物来源的蛋白酶抑制剂可以是EDTA。合适地,非动物来源的蛋白酶抑制剂的浓度可为约0.1%(w/v)。
合适地,该方法还包括一个或多个冲洗步骤,合适地在细胞裂解的每个步骤之后,因此合适地,在用低渗溶液孵育组织至少一次和用高渗溶液孵育组织至少一次和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环之后,进行一个或多个冲洗步骤。
合适地,该方法不包括α-半乳糖苷酶。
合适地,DNA去除将通过使用DNA去除剂来实现,DNA去除剂可以选自由核酸内切酶或其他分解DNA以实现从组织中洗脱的处理组成的组。核酸内切酶可选自人核酸内切酶,其选自DNA酶I型、DNA酶II型、DNAIII型和RNA酶,或其他来源,包括细菌衍生的核酸内切酶或其两种或多种的任何组合。合适地,核酸内切酶可以是细菌衍生的核酸内切酶,例如基因工程化的粘质沙雷氏菌(Seratia marcessens)核酸内切酶,其可以选自任何可商购的核酸内切酶,例如合适地,核酸内切酶的浓度可为约0.5至约50U/ml。合适地,核酸内切酶的浓度为约5U/ml。
合适地,该方法可以包括用抗微生物剂孵育支架的步骤。合适地,抗微生物剂可以是氧化剂。合适地,氧化剂可以是过乙酸。合适地,过乙酸的浓度可为约500至约10,000ppm。合适地,浓度为约0.05%至1%。
合适地,本发明的方法包括使组织经受电离辐射的步骤。合适地,电离辐射的剂量为约15至约50kGy。
合适地,本发明的方法需要3天至14天,合适地3天至12天,合适地3天至10天,合适地3天至7天,合适地5天至14天,合适地5天至12天,合适地5天至10天,合适地5天至7天。
在另一方面,本发明涉及通过本发明的方法生产的脱细胞组织支架。
合适地,脱细胞组织支架可以基本上不含阴离子洗涤剂(例如SDS)残留物。
合适地,脱细胞组织支架可以基本上不含蛋白酶抑制剂,合适地不含动物来源的蛋白酶抑制剂。
合适地,脱细胞组织支架可以基本上不含半乳糖-α-1,3-半乳糖(也称为α-gal)蛋白。
合适地,组织支架可以是复合组织支架。合适地,复合组织支架可以是半月板组织支架(例如,猪半月板组织支架)、真皮组织支架(例如,猪真皮组织支架)、或肌腱组织支架(例如,猪肌腱组织支架)。
除非上下文另有要求,本公开中阐述的考虑应被视为适用于根据本发明的方法和支架。
在本说明书的整个说明书和权利要求书中,词语“包括”和“包含”及其变型表示“包括但不限于”,并且它们不旨在(并且不)排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。
在本说明书的整个说明书和权利要求书中,单数形式包括复数形式,除非上下文另有要求。特别地,在使用不定冠词的情况下,除非上下文另有要求,否则本说明书应理解为涵盖复数以及单数。
结合本发明的特定方面、实施方式或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应被理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方式或实施例,除非与其不相容。
下面进一步详细描述本发明的各个方面。
附图说明
在下文,将参考附图进一步描述本发明的实施方式,其中:
图1显示了通过本发明的方法生产的脱细胞组织支架的图像。可以看出,材料的组织结构得到保留。A是脱细胞半月板支架。B是脱细胞真皮支架。C是图1B的脱细胞真皮支架的另外的视图。
具体实施方式
本发明基于发明人开发的用于制备生物支架的新方法,该方法具有优于现有方法的几个优点。
具体地,本发明人已经发现,通过包括至少一个用高渗溶液孵育和用低渗溶液孵育的优化步骤,和/或至少一个冷冻/解冻组织的优化步骤,可以显著降低获得脱细胞组织支架所需的阴离子洗涤剂的浓度。
阴离子洗涤剂,如SDS,具有高度的细胞毒性,并在组织支架中留下加工残留物,这些残留物可能具有细胞毒性,因此对支架的生物相容性产生负面影响,即使在SDS已被洗掉之后。本发明人已经发现,可以降低使用的阴离子洗涤剂(例如SDS)的浓度,使得组织支架可以基本上不含加工残留物,从而通过修改和优化脱细胞过程中的其他步骤来改善支架的生物相容性。
本发明方法的另一个优点是不再需要使用本领域常用的蛋白酶抑制剂。这是有益的,因为许多方法使用动物来源的蛋白酶抑制剂,如抑肽酶,其来源于牛并与人畜共患疾病传播风险相关。本发明人已经发现,在细胞裂解后添加冲洗步骤可以充分去除脱细胞组织中存在的蛋白酶,此外,在细胞裂解的每个步骤期间减少处理时间可以减少从细胞释放的蛋白酶的影响。这意味着不再需要使用蛋白酶抑制剂。在降低人畜共患疾病传播风险的同时,这也提高了该过程的效率。
此外,还发现本发明的方法显著减少脱细胞组织中存在的半乳糖-α-1,3-半乳糖(也称为α-gal)蛋白的量。这是有利的,因为α-gal蛋白可能在受试者中引起免疫反应。在现有技术的方法中,去除α-gal通常需要用α-半乳糖苷酶处理组织的附加步骤,该α-半乳糖苷酶降解α-gal。发明人已经发现,在本方法中,该步骤不必按顺序以从支架上去除基本上所有的α-gal。本发明的方法使支架基本上不含α-gal。
方法步骤
本发明涉及用于生产脱细胞组织支架的方法,该方法包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂孵育所述组织;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
如本说明书其他地方所述,该方法的步骤不必按上述提供的顺序进行。
合适地,该方法在某些情况下可以包括用蛋白酶抑制剂孵育组织的步骤。合适地是非动物来源的蛋白酶抑制剂。
因此,用脱脂剂孵育组织的步骤可以在用阴离子洗涤剂孵育组织的步骤、用低渗缓冲液孵育组织至少一次和用高渗缓冲液孵育至少一次、和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环的步骤、以及用蛋白酶抑制剂孵育组织和用DNA去除剂孵育组织的步骤之前进行。
合适地,用阴离子剂孵育组织的步骤可以在用脱脂剂孵育组织的步骤之后进行。
合适地,用阴离子试剂孵育组织的步骤可以在用DNA去除剂孵育组织的步骤之前进行。
合适地,用DNA去除剂孵育组织的步骤可以在用阴离子试剂孵育的步骤之后进行。
本领域技术人员将知道该方法步骤的顺序的其他变化。本发明的两个或多个步骤可以合并成一个步骤。
合适地,用阴离子洗涤剂孵育组织的步骤可以与用低渗缓冲液孵育组织的步骤相结合。
本发明的方法的两个或多个步骤可以组合的其他方式对于本领域技术人员来说是显而易见的。
组织支架
如本文所用,术语“组织支架”是指设计用于模拟天然细胞外基质的生物结构支架。合适地,组织支架可促进在其中生长的细胞的附着、迁移、增殖和/或三维组织。
脱细胞组织支架可通过本发明的方法由从人或动物受试者或人或动物尸体获得的组织制备。在本公开的上下文中,从用于制造脱细胞组织支架的人或动物受试者获得的组织可称为“起始组织”或“组织”。
合适地,起始组织可以选自由皮肤(或皮肤的一部分,如真皮)、半月板、肌腱、韧带、软骨、肌肉、血管和器官(如心脏、肾脏、肝脏等)组成的组。合适地,起始组织可以是皮肤或半月板或肌腱。仅作为示例,起始组织可以是真皮,例如猪真皮,或起始组织可为猪半月板或猪肌腱。
合适地,获得起始组织的动物可以是例如,猪、非人灵长类动物、牛、羊或马。
在本公开的上下文中,术语“脱细胞”意味着支架基本上不含细胞组分(例如,细胞膜、核酸、脂质、类脂物质和细胞质组分)。然而,应当理解,脱细胞支架将保留细胞外基质(ECM)。
如本文所用,短语“细胞外基质(ECM)”是指由组织细胞产生并分泌到周围细胞外空间和/或基质中的物质网络,其通常与组织细胞一起赋予组织其机械和结构性能。通常,ECM包括纤维元素(特别是胶原、弹性蛋白或网硬蛋白)、细胞粘附多肽(如纤连蛋白、层粘连蛋白和粘附糖蛋白)和空间填充分子(如糖胺聚糖(GAG)、蛋白聚糖)。
“基本上不含”细胞物质是指支架基本上不含细胞组分和/或基本上不含核酸。
通过使用苏木精和伊红染色的显微镜检查,可以确定支架基本上不含细胞组分。合适地,支架至少80%不含自然存在于产生支架的起始组织中的细胞组分。合适地,支架可以至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或更多的不含细胞组分。
通过测量处理后支架中的剩余核酸量,可以确定支架基本上不含细胞物质。合适地,支架也基本上不含核酸,如下文所定义。合适地,如果DNA量小于约50ng/mg,则可以从支架充分去除DNA。合适地,如果DNA小于约50ng/mg,则支架基本上不含细胞物质。合适地,DNA量小于支架干重的约50ng/mg。
因此,合适地,在以下任一情况下,支架基本上不含细胞物质:(i)其至少80%不含如上定义的细胞组分,或(ii)DNA含量小于约50ng/mg。
合适地,支架在以下情况时基本上不含细胞物质:(i)其至少80%不含如上定义的细胞组分,和(ii)DNA含量小于约50ng/mg。
脱细胞的程度可以通过组织化学方法确定,例如,使用标准技术用苏木精和伊红对组织进行染色,其使细胞膜和细胞核可视化。免疫组织化学染色是其中可确定脱细胞程度的另一种方法。免疫组织化学染色可以可视化细胞特异性标志物,如平滑肌肌动蛋白和组织相容性抗原(缺乏此类标志物表明脱细胞)。另一种可以确定脱细胞程度的方法是DNA定量。等于或小于50n/mg的DNA量可用作脱细胞的指标。适用于评估脱细胞的其他方法将为本领域技术人员所知。
合适地,脱细胞组织支架可以基本上不含α-gal。在该上下文中,“基本上不含”意味着支架中的α-gal的量在临床上可接受的水平内。合适地,与生产支架的起始组织中天然存在的α-gal的量相比,支架可以包括20%或更少、19%或更少、18%或更少、17%或更少、16%或更少、15%或更少、14%或更少、13%或更少、12%或更少、11%或更少、10%或更少、9%或更少、8%或更少、7%或更少、6%或更少、5%或更少、4%或更少、3%或更少、2%或更少、1%或更少的α-gal。本领域技术人员应知道用于确定α-gal的量的方法。仅作为示例,可通过使用可商购的试剂盒(例如可从MyBioSource获得的试剂盒)进行ELISA来测量α-gal。
脱脂剂
在本发明的方法中,起始组织与脱脂剂一起孵育。如本文所用,术语“脱脂剂”是指从起始组织中去除脂质和/或类脂物质的试剂,使得起始组织基本上不含脂质和/或类脂物质。脂质和/或类脂物质可以包括但不限于,复杂脂质、简单脂质、甘油三酯、脂肪酸、甘油磷脂(磷脂)、纯脂肪如脂肪酸酯、甘油、脑苷脂、蜡和甾醇类如胆固醇和麦角固醇。脂质和/或类脂物质可以来源于起始组织本身。
在脱脂剂的上下文中,“基本上不含”是指组织在与脱脂剂孵育之前至少80%不含组织上存在的脂质和/或类脂物质。合适地,与起始组织相比,组织可以是至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或更多的不含脂质和/或类脂物质。
脂质和/或类脂物质可能不溶于水,因此影响后续的水基处理,例如洗涤。合适地,脂质和/或类脂物质可以溶于极性溶剂。因此,脱脂剂可以是极性溶剂。如本文所用,术语“极性溶剂”是指通过酸碱相互作用、氢键、偶极-偶极相互作用和/或通过偶极诱导的偶极相互作用力与其他化合物相互作用的溶剂。
合适地,极性溶剂可选自丙酮、异丙醇、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、或其两种或多种的混合物。更合适地,极性溶剂可以是丙酮。
合适地,极性溶剂的浓度可为约80%至约100%v/v。在一个实施方式中,极性溶剂的浓度为约99%v/v。
应当理解,在本发明的方法中,可以将组织与脱脂剂孵育足够的时间段以从组织中去除脂质和/或类脂物质。合适地,直到去除期望的脂质和/或类脂物质,使组织基本上不含所述脂质和/或类脂物质。
合适地,与脱脂剂的孵育期可为约10分钟至约24小时、约1小时至约5小时,合适地为约2小时至约3小时。
合适地,与脱脂剂的孵育期可为约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约10小时、约15小时、约20小时、约24小时或更长。合适地,孵育期可为约2至3小时。
在一个实施方式中,脱脂剂为浓度为约99%v/v的丙酮。在这样的实施方式中,孵育期为约2-3小时。
在一个实施方式中,孵育期为约2小时。
在一个实施方式中,孵育期为约3小时。
在一个实施方式中,可以存在用脱脂剂孵育组织的多于一个步骤。在一个实施方式中,可以存在与脱脂剂的多于一个孵育期。在一些实施方式中,可以存在与脱脂剂的两个孵育期。合适地,每个孵育期可以是不同的总时间长度,并且可以包括不同的时间段。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·将起始组织与脱脂剂孵育约2-3小时,其中脱脂剂为99%(v/v)丙酮;
·用阴离子洗涤剂孵育所述组织;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
如本文所用,术语“孵育(incubation)”或“孵育(incubating)”是指将组织与相关试剂接触(相关试剂为脱脂剂、阴离子洗涤剂、低渗溶液、高渗溶液、非动物源蛋白酶抑制剂、DNA去除剂或抗微生物剂)。在本公开的上下文中,孵育期是指组织与相关试剂接触(即用其孵育)的总时间量。
孵育期可以是等于总孵育期的一个连续时间段,或是总计等于总孵育期的多个时间段。仅作为示例,在与丙酮孵育的上下文中,孵育期可以包括一个连续的时间段,或例如三个时间段。
本领域技术人员应认识到,在时间段之间可能存在静置(rest)时段。合适地,组织可以在时间段之间静置。合适地,相关溶液可以在一个或多个时间段之间被替换,例如使得组织与新鲜的相关溶液一起孵育。例如,脱脂剂的孵育期可以是2小时,包括三个40分钟的时间段,其中在每个时间段之间更换脱脂剂。
在一个实施方式中,与脱脂剂的孵育期为2小时,包括三个40分钟的时间段。
在一个实施方式中,与脱脂剂的孵育期为3小时,包括三个1小时的时间段。
在一个实施方式中,与脱脂剂的孵育期为33小时,包括两个1小时的时间段和一个31小时的延长时间段。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·将起始组织与脱脂剂孵育约3小时,其中脱脂剂为99%(v/v)丙酮,并且其中该孵育包括三个1小时的时间段;
·用阴离子洗涤剂孵育所述组织;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育所述组织,从而获得脱细胞组织支架。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·将起始组织与脱脂剂孵育约2小时,其中脱脂剂为99%(v/v)丙酮,并且其中该孵育包括三个40分钟的时间段;
·用阴离子洗涤剂孵育所述组织;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育所述组织,从而获得脱细胞组织支架。
在一个实施方式中,该方法仅包括用脱脂剂孵育起始组织的一个步骤。在一个实施方式中,该步骤持续约2小时,其中脱脂剂为99%(v/v)丙酮,并且其中孵育包括三个40分钟的时间段。在另一个实施方式中,该方法包括用脱脂剂孵育起始组织的两个步骤。在一个实施方式中,第一步骤可以持续约33小时,且第二步骤可以持续约3小时,其中第一步骤包括两个1小时的时间段和一个31小时的时间段,并且其中第二步骤包括三个1小时的时间段。
阴离子洗涤剂
本发明的方法包括在阴离子洗涤剂中孵育组织的步骤。
合适地,可以在与脱脂剂孵育之前或之后进行与阴离子洗涤剂的孵育。更合适地,该步骤可以在与脱脂剂孵育后进行。
如本文所用,术语“阴离子洗涤剂”是指具有带负电荷亲水端的表面活性剂。阴离子洗涤剂可以通过破坏蛋白质-蛋白质相互作用而破坏膜和变性蛋白质。
合适地,阴离子洗涤剂可以选自由十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、月桂酸钠、硬脂酸钠、多库酯钠(dioctyl sodium sulfosuccinate)、两性N-月桂酰肌氨酸钠以及其任何两种或更多种的混合物组成的组。更合适地,阴离子洗涤剂选自由以下组成的组:SDS、脱氧胆酸钠、烷基苯磺酸盐、烷基磺酸盐、烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、氟化脂肪酸盐、硅酮、脂肪醇硫酸盐、聚氧乙烯脂肪醇醚硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、聚氧乙烯脂肪醇磷酸盐醚、烷基醇酰胺、烷基磺酸乙酰胺、烷基琥珀酸磺酸盐、氨基醇烷基苯磺酸盐、环烷酸盐、烷基酚磺酸盐和聚氧乙烯单月桂酸盐。在一个实施方式中,阴离子洗涤剂是SDS。
合适地,阴离子洗涤剂(例如SDS或脱氧胆酸钠)的浓度可以为约0.001%至约0.1%(w/v)、约0.002%至约0.018%(w/v)、约0.004%至约0.016%(w/v)、约0.006%至约0.014%(w/v)、或约0.008至约0.012%(w/v)。
合适地,阴离子洗涤剂(例如SDS或脱氧胆酸钠)的浓度可以为约0.2%或更低(w/v)、约0.18%或更低(w/v)、约0.16%或更低(w/v)、约0.14%或更低(w/v)、约0.12%或更低(w/v)、约0.1%或更低(w/v)、约0.08%或更低(w/v)、约0.06%或更低(w/v)、约0.04%或更低(w/v)、约0.02%或更低(w/v)、约0.01%或更低(w/v)、约0.008%或更低(w/v)、约0.006%或更低(w/v)、约0.004%或更低(w/v)、约0.002%或更低(w/v)、或约0.001%或更低(w/v)。
在一个实施方式中,阴离子洗涤剂(例如SDS或脱氧胆酸钠)的浓度为约0.01%(w/v)。
在一个实施方式中,阴离子洗涤剂(例如SDS或脱氧胆酸钠)的浓度为约0.1%(w/v)。
阴离子洗涤剂可以在任何合适的溶液中稀释以达到期望的浓度。溶液可以是低渗、等渗或高渗溶液。更合适地,溶液可以是低渗的。
合适地,溶液可选自tris缓冲液、tris/EDTA缓冲液(0.1%Tris/0.1%EDTA)、三[羟基甲基]-氨基甲烷盐酸盐(tris-HCl,10-100mM)、(4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙烷磺酸(HEPES,10-100mM)、PBS的稀释溶液(例如,含有0.2克的KC1、0.2克的KH2P04、8克的NaCl的溶液,或含有2.16克的Na2HP04*7H20的1000ml H2O的溶液,以及生理盐水的稀释溶液(例如,含0.9%的NaCl)。
在一个实施方式中,溶液是低渗tris缓冲液。
合适地,与阴离子洗涤剂(例如SDS或脱氧胆酸钠)的孵育期时间足够长,以实现组织中的细胞裂解。合适地,这可以为约10至约100小时,合适地为约20至约80小时。
合适地,与阴离子洗涤剂的孵育期可以为约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约26小时、约28小时、约30小时、约35小时、约40小时、约45小时、约50小时、约55小时、约60小时、约65小时、约70小时、约75小时、约80小时、约85小时、约90小时、约95小时、约100小时、或更长。
应当理解,与阴离子洗涤剂的孵育期可以取决于使用的起始组织的类型和/或洗涤剂本身。仅作为示例,猪真皮可以与阴离子洗涤剂(如SDS)孵育约21或24小时,而猪半月板可以与阴离子洗涤剂(如SDS)孵育约80小时,而猪肌键可以与阴离子清洁剂孵育约48小时。本领域技术人员能够适当地通过确定组织中是否发生细胞裂解来确定与阴离子洗涤剂的最佳孵育时间长短,这可以例如使用显微镜检查来确定。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·将起始组织与脱脂剂孵育约2-3小时,其中脱脂剂为99%(v/v)丙酮;
·用阴离子洗涤剂孵育组织,其中阴离子洗涤剂为0.01%(w/v)SDS;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育所述组织,从而获得脱细胞组织支架。
在一个实施方式中,将组织与阴离子洗涤剂0.01%SDS孵育21或24小时。
在一个实施方式中,将组织与阴离子洗涤剂0.01%SDS孵育80小时,包括四个20小时的时间段。
在一个实施方式中,该方法包括用阴离子洗涤剂0.1%SDS孵育组织的两个步骤。在一个实施方式中,每个步骤为约24小时。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·将起始组织与脱脂剂孵育约3小时,其中脱脂剂为99%(v/v)丙酮,并且其中孵育包括三个1小时的时间段;
·将组织与阴离子洗涤剂孵育约24小时,其中阴离子洗涤剂为0.01%(w/v)SDS;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育所述组织,从而获得脱细胞组织支架。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·将起始组织与脱脂剂孵育约2小时,其中脱脂剂为99%(v/v)丙酮,并且其中孵育包括三个40分钟的时间段;
·用阴离子洗涤剂孵育所述组织约80小时,其中阴离子洗涤剂为0.01%(w/v)SDS,并且其中孵育包括四个20小时的时间段;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
低渗和高渗溶液
本发明的方法包括用低渗溶液孵育组织至少一次,用高渗溶液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环的步骤。合适地,这些步骤用于裂解组织中存在的细胞。
合适地,用低渗溶液孵育组织至少一次和用高渗溶液孵育组织至少一次达到与使组织经受至少一个冷冻/解冻循环类似的效果;这两个步骤都用于裂解细胞。合适地,可以使用任一步骤,或者两者结合使用。合适地,因此该方法可以包括用低渗溶液孵育组织至少一次和用高渗溶液孵育至少一次,或者合适地,该方法可以包括使组织经受至少一个冷冻/解冻循环。可替换地,该方法可以包括用低渗溶液孵育组织至少一次和用高渗溶液孵育至少一次,和使组织经受至少一个冷冻/解冻循环。
“冷冻/解冻循环”是指将组织冷冻(例如,将其置于液氮中,或置于-80℃或-20℃的冰箱中),然后解冻(例如,在2-8℃或34℃或37℃下或在室温下)。
合适地,组织可以经受多次冷冻/解冻循环。合适地,组织可以经受一至五个冷冻/解冻循环。在一个实施方式中,组织经受两个或三个冷冻/解冻循环。
术语“低渗溶液”是指溶质浓度低于组织细胞内溶质浓度的溶液。术语“高渗溶液”是指溶质浓度大于组织细胞内溶质浓度的溶液。
仅作为示例,低渗溶液可以选自由tris/EDTA缓冲液(0.1%Tris/0.1%EDTA)、三[羟基甲基]-氨基甲烷盐酸盐(tris-HCl,10-100mM)、(4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙烷磺酸(HEPES,10-100mM)、PBS的稀释溶液(例如,含有0.2克的KC1、0.2克的KH2PO4、8克的NaCl的溶液,或含有2.16克的Na2HPO4*7H2O的1000ml H2O的溶液,以及生理盐水的稀释溶液(例如,含0.9%的NaCl)组成的组。本领域技术人员将熟知其他低渗溶液。
在一个实施方式中,低渗溶液是0.1%tris/0.1%EDTA。
与低渗溶液的孵育期可以为约30分钟至100小时,合适地为10小时至约100小时,或约20小时至80小时。
合适地,与低渗溶液的孵育期可以为约30分钟、1小时、5小时、10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约26小时、约28小时、约30小时、约35小时、约40小时、约45小时、约50小时、约55小时、约60小时、约65小时、约70小时、约75小时、约80小时、约85小时、约90小时、约95小时、约100小时、或更长。
应当理解,与低渗溶液的孵育期可以取决于使用的起始组织的类型和/或低渗溶液本身。例如,与较不低渗的溶液相比,更低渗的溶液可能需要更短的孵育期。仅作为示例,猪真皮可以在低渗溶液中孵育约21-24小时,而猪半月板可以与低渗溶液孵育约40分钟,而猪肌腱可以与低渗溶液孵育高达24小时,合适地在一些情况下1-4小时,并且在一些情况下为24小时。例如,技术人员可通过使用上述方法评估组织何时脱细胞来确定合适的孵育时间。
如本说明书其他地方所提到的,阴离子洗涤剂可在低渗溶液中稀释至期望的浓度。在这样的实施方式中,用阴离子洗涤剂孵育组织的步骤和用低渗溶液孵育组织至少一次的步骤可合并成一个步骤。
因此,在一个实施方式中,该方法包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂和低渗溶液孵育组织;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
本发明的方法包括用低渗溶液孵育组织至少一次的步骤。合适地,组织可以用低渗溶液孵育一次、两次、三次或更多次。在一个实施方式中,组织可以用低渗溶液孵育两次。在一个实施方式中,组织可以用低渗溶液孵育六次。
合适地,当组织用低渗溶液孵育两次或更多次时,其中一次孵育可以与用阴离子洗涤剂孵育组织的步骤相结合。这可以通过在低渗剂中将阴离子洗涤剂稀释至期望的浓度来实现。合适地,可以在与阴离子洗涤剂孵育之前或之后进行与低渗溶液的第二孵育。
因此,在一个实施方式中,该方法包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂和第一低渗溶液孵育组织;
·用第二低渗溶液孵育组织至少一次,和用高渗溶液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
合适地,在与阴离子洗涤剂孵育的步骤之前进行与低渗溶液的孵育的情况下,其可以在与脱脂剂孵化的步骤之前或之后进行。更合适地,在与阴离子洗涤剂孵育的步骤之前进行与低渗溶液的孵育的情况下,其可以在与脱脂剂孵化的步骤之后进行。在低渗溶液中孵育组织的步骤可以在使组织经受至少一个冷冻/解冻循环之前或之后进行。合适地,在低渗溶液中孵育组织的步骤可以在使组织经受至少一个冷冻/解冻循环之前进行。在用低渗溶液孵育组织的步骤之后可以是用高渗溶液孵育组织的步骤。用高渗溶液孵育可以在用低渗溶液孵育之后直接进行。可替换地,用高渗溶液孵育可以在组织经受至少一个冷冻/解冻循环之后进行。
合适地,在一个实施方式中,在与阴离子洗涤剂孵育的步骤之前进行与低渗溶液孵育的情况下,该方法可以包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用第一低渗溶液孵育组织;
·使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;
·用第一高渗溶液孵育组织;
·用阴离子洗涤剂和可选的第二低渗溶液孵育组织;
·用第二高渗溶液孵育组织;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
合适地,在与阴离子洗涤剂孵育后进行与低渗溶液的孵育的情况下,其也可以在组织与脱脂剂孵育组织和/或与高渗溶液孵育之后进行。在这样的实施方式中,该方法可以包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂孵育组织;
·用高渗溶液孵育组织;
·用低渗溶液孵育组织;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
合适地,第一和第二溶液可以是相同的溶液或不同的溶液。合适地,该方法的任何组分的第一和第二溶液选自本文所述的组分。这同样适用于相同组分的任何数量的溶液,例如可以使用第三和第四高渗溶液,合适地,这些溶液可以都是相同的溶液或选自本文所述的那些溶液中的不同溶液。
在一个实施方式中,该方法可以包括用低渗处理孵育组织的六个步骤。合适地,前两步包括用低渗溶液孵育1-4小时的时间段。合适地,第三、第四、第五和第六步骤包括用低渗溶液孵育24小时。合适地,第三、第四、第五和第六步骤中的至少一个包括阴离子洗涤剂。合适地,第一和第二步骤可以各自在冷冻/解冻循环之前。
在一个实施方式中,该方法可以包括用低渗处理孵育组织的两个步骤。合适地,两个步骤的时间为约21小时。合适地,至少一个步骤包括阴离子洗涤剂。
如本文所用,术语“高渗溶液”是指溶质浓度大于细胞内溶质浓度的溶液。
仅作为示例,高渗溶液可以选自例如,tris/氯化钠溶液(0.6%Tris/8-9%氯化钠溶液)、糖溶液、盐溶液、5%葡聚糖(糖)和0.45%氯化钠、5%葡聚糖和0.9%氯化钠盐以及10%葡聚糖的水溶液。在一个实施方式中,高渗溶液是0.6%Tris/8-9%氯化钠溶液。
在一个实施方式中,高渗溶液是tris/氯化钠溶液(0.6%Tris/8.2%氯化钠溶液)。
合适地,高渗溶液的孵育期可以为约1小时至约48小时、约4小时至30小时、约8小时至约24小时。
合适地,与高渗溶液的孵育期可以为约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约32小时、约34小时、约36小时、约38小时、约40小时、约42小时、约44小时、约46小时、约48小时、或更长。
应当理解,与高渗溶液的孵育期可以取决于使用的起始组织的类型和/或高渗溶液。仅作为示例,猪真皮可以用高渗溶液孵育约21-24小时,而猪半月板可以用高渗透溶液孵育约8小时,而猪肌键可以用高渗溶液孵育约18小时。本领域技术人员能够通过对所讨论的组织进行常规实验来确定合适的孵育时间。
在一个实施方式中,与高渗tris/氯化钠溶液(0.6%Tris/8.2%氯化钠溶液)的孵育期为21-24小时。
在一个实施方式中,与高渗tris/氯化钠溶液(0.6%Tris/9%氯化钠溶液)的孵育期为8小时。在一个实施方式中,该方法包括两个与高渗tris/氯化钠溶液(0.6%Tris/9%氯化钠溶液)的孵育期,每个孵育期为8小时。
在一个实施方式中,与高渗tris/氯化钠溶液(0.6%Tris/8.2%氯化钠溶液)的孵育期为约18小时。
合适地,该方法包括用高渗溶液孵育组织至少一次。合适地,该方法包括用高渗溶液孵育组织一次、两次、三次或更多次。更合适地,该方法可以包括用高渗溶液孵育组织一次或两次。在一个实施方式中,该方法包括用高渗溶液孵育组织一次。
在其中组织用高渗溶液孵育一次的实施方式中,用高渗液孵育组织的步骤可以在用阴离子洗涤剂(有或没有低渗溶液)孵育之后进行。
在其中组织用高渗溶液孵育两次的实施方式中,用高渗液孵育组织的步骤可以在用阴离子洗涤剂孵育之前(有或没有低渗溶液)进行一次,和在用阴离子洗涤剂孵育之后(有或没有低渗溶液)进行一次。
在一个实施方式中,该方法包括:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂和第一低渗溶液孵育组织;
·用高渗溶液孵育组织;
·用第二低渗溶液孵育组织;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。在一个实施方式中,该方法包括:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂和第一低渗溶液孵育组织24小时,其中所述第一低渗液包括0.1%tris/0.1%EDTA溶液;
·用高渗溶液孵育组织24小时,其中高渗溶液包括0.6%Tris/8-9%氯化钠溶液;
·用第二低渗溶液孵育组织24小时,其中第二低渗溶液包括0.1%tris/0.1%EDTA溶液;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。在一个实施方式中,该方法包括:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用第一高渗溶液孵育组织;
·用阴离子洗涤剂和低渗溶液孵育组织;
·用第二高渗溶液孵育组织;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。在一个实施方式中,该方法包括:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用第一高渗溶液孵育组织至多达8小时,其中第一高渗液包括0.6%tris/9%氯化钠溶液;
·用阴离子洗涤剂和低渗溶液孵育组织4个20小时时间段,其中低渗溶液包括0.1%Tris/0.1%EDTA溶液;
·用第二高渗溶液孵育组织至多达8小时,其中第二高渗溶液包括0.6%Tris/8-9%氯化钠溶液;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
在一个实施方式中,该方法包括:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用第一低渗溶液孵育组织;
·使组织经受一个或多个冷冻/解冻循环;
·用第一高渗溶液孵育组织;
·用阴离子洗涤剂和第二低渗溶液孵育组织;
·用第二高渗溶液孵育组织;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
在一个实施方式中,该方法包括:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用第一低渗溶液孵育组织,其中第一低渗液包括0.1%
Tris/0.1%EDTA溶液;
·使组织经受三个冷冻/解冻循环;
·用第一高渗溶液孵育组织高达8小时,其中第一高渗液包括0.6%tris/8-9%氯化钠溶液;
·用阴离子洗涤剂和第二低渗溶液孵育组织4个20小时时间段,其中第二低渗溶液包括0.1%Tris/0.1%EDTA溶液;
·用第二高渗溶液孵育组织高达8小时,其中第二高渗溶液包括0.6%Tris/8-9%氯化钠溶液;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
蛋白酶抑制剂
合适地,本发明的方法不包括蛋白酶抑制剂,尤其是不包括动物来源的蛋白酶抑制剂。因此,合适地,该方法不包括用蛋白酶抑制剂孵育组织的步骤。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂孵育组织;
·用低渗溶液孵育组织至少一次,用高渗溶液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架,
其中所述方法不包含动物来源的蛋白酶抑制剂。
然而,虽然对本发明的方法不一定是需要的,但该方法可以包括用非动物来源的蛋白酶抑制剂孵育组织的步骤。如本文所用,术语“蛋白酶抑制剂”是指抑制蛋白酶的蛋白水解活性的试剂。术语“非动物来源”是指蛋白酶抑制剂不是从动物来源获得的抑制剂,并且不会在动物体内自然产生。
合适地,非动物来源的蛋白酶抑制剂可以是金属蛋白酶抑制剂。合适地,选自任何螯合剂。合适地,螯合剂充当蛋白酶抑制剂并防止组织的分解。合适地,非动物来源的蛋白酶抑制剂选自例如EDTA、NTA、ATMP、EDTMP和HEDP。在一个实施方式中,非动物来源的蛋白酶抑制剂是EDTA。
合适地,非动物来源的蛋白酶抑制剂以约0.01%至约1%、约0.05%至约0.5%、或约0.75%至约0.25%的浓度使用。
合适地,非动物来源的蛋白酶抑制剂以约1%、约0.75%、约0.5%、约0.25%、约0.1%、约0.05%或约0.01%的浓度使用。在一个实施方式中,非动物来源的蛋白酶抑制剂以约0.1%的浓度使用。
在一个合适的实施方式中,非动物来源的蛋白酶抑制剂是浓度为约0.1%的EDTA。
应当理解,用非动物来源的蛋白酶抑制剂孵育组织的步骤可以在用DNA去除剂孵育该组织的步骤之前或在用DNA去除剂孵育该组织的步骤之后进行。
合适地,用非动物来源的蛋白酶抑制剂孵育组织的步骤可以与用低渗剂孵育该组织的步骤相结合。
合适地,用低渗溶液孵育组织的步骤可以与用非动物来源的蛋白酶抑制剂孵育该组织的步骤相结合。合适地,在低渗溶液和非动物来源的蛋白酶抑制剂中组合孵育组织是在与脱脂剂、阴离子洗涤剂(有或没有低渗剂)和高渗溶液孵育之后进行的。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·将起始组织与脱脂剂孵育约2-3小时,其中脱脂剂为99%(v/v)丙酮;
·用阴离子洗涤剂孵育组织,其中阴离子洗涤剂为0.01%(w/v)SDS;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用非动物来源的蛋白酶抑制剂孵育组织,其中蛋白酶抑制剂为0.1%EDTA,并用DNA去除剂孵育该组织,从而获得脱细胞的组织支架。
合适地,非动物来源的蛋白酶抑制剂可以在任何合适的溶液中稀释至期望浓度。仅作为示例,非动物来源的蛋白酶抑制剂(例如EDTA)可以在磷酸盐缓冲盐水中或在低渗缓冲溶液(0.1%tris)中稀释。
应当理解,当非动物来源的蛋白酶抑制剂(例如EDTA)在低渗溶液中稀释时,用低渗溶液和非动物来源的蛋白酶抑制剂孵育组织的步骤可以合并成一个步骤。作为示例,在这样的实施方式中,本发明的方法包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂孵育组织;
·用高渗溶液孵育组织;
·用低渗溶液孵育组织;以及
·用非动物来源的蛋白酶抑制剂和第二低渗溶液孵育组织,其中非动物来源蛋白酶抑制剂是EDTA;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
在一个实施方式中,当非动物来源的蛋白酶抑制剂未在低渗溶液中稀释时,该方法可以包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用第一低渗溶液孵育组织;
·使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;
·用第一高渗溶液孵育组织;
·用阴离子洗涤剂孵育组织;
·用第二高渗溶液孵育组织;
·用DNA去除剂孵育组织;以及
·用非动物来源的蛋白酶抑制剂孵育组织,其中非动物来源的蛋白酶抑制剂是EDTA;从而获得脱细胞组织支架。
可选地,阴离子洗涤剂还可以包括低渗溶液。
合适地,与非动物来源的蛋白酶抑制剂(例如EDTA)的孵育期足以抑制组织中的蛋白酶,合适地,这可以是约0.5小时至48小时,或约1小时至约24小时。
合适地,与非动物来源的蛋白酶抑制剂的孵育期可以为约0.5小时、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约20小时、约22小时、约24小时、约28小时、约30小时、约36小时,约42小时、或48小时、或更长。
应当理解,与非动物来源的蛋白酶抑制剂的孵育期可以取决于使用的起始组织的类型和/或抑制剂本身。仅作为示例,猪真皮可以与抑制剂如EDTA一起孵育约24小时,而猪半月板可以与抑制剂例如EDTA一起孵育约3小时。本领域技术人员能够通过对所讨论的组织进行常规实验来确定合适的孵育时间。
在一个实施方式中,与非动物来源的蛋白酶抑制剂0.1%EDTA的孵育期为24小时。
在一个实施方式中,与非动物来源的蛋白酶抑制剂0.1%EDTA的孵育期为3小时。
发明人出乎意料地发现,即使不使用蛋白酶抑制剂时(合适地,即使仅使用非动物来源的蛋白酶抑制剂时),本发明的方法也可以产生脱细胞组织支架。抑肽酶是一种蛋白酶抑制剂,特别是牛胰腺胰蛋白酶抑制剂。由于其来源于牛,其可能会传播人畜共患疾病。合适地,该方法不使用或不包含动物来源的蛋白酶抑制剂。合适地,该方法不使用或不包含抑肽酶。
合适地,本发明的方法还可以包括一个或多个冲洗步骤,以帮助去除组织内裂解细胞释放的蛋白酶。
因此,合适地,冲洗步骤可以在用低渗溶液孵育组织之后、用高渗溶液孵育组织之后、和/或在使组织经受冷冻/解冻循环之后进行。
合适地,该方法包括在细胞裂解的每个步骤之后的冲洗步骤。
因此,合适地,冲洗步骤在用低渗溶液孵育组织之后、和用高渗溶液孵育组织之后、以及在使组织经受冷冻/解冻循环之后进行。因此,合适地,该方法可以包括多个冲洗步骤。合适地,每个冲洗步骤可以包括组织的一次或多次冲洗。合适地,每个冲洗步骤包括组织的至少三次冲洗。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂孵育组织;
·用低渗溶液孵育组织至少一次,用高渗溶液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;
·冲洗组织;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂孵育组织;
·用低渗溶液孵育组织;
·冲洗组织;
·用高渗溶液孵育组织;
·冲洗组织;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂孵育组织;
·用低渗溶液孵育组织;
·冲洗组织;
·用高渗溶液孵育组织;
·冲洗组织;
·使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;
·冲洗组织;以及
·用DNA去除剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
合适地,冲洗组织包括用冲洗溶液冲洗组织。合适地,冲洗溶液是等渗溶液。合适地,冲洗溶液是盐水溶液。
合适地,在包括这样一个或多个冲洗步骤的每个实施方式中,该方法不包括蛋白酶抑制剂。
在一些实施方式中,该方法可以包括用蛋白酶(protease)或朊酶(proteinaseenzyme)孵育组织的步骤。合适地是动物来源的蛋白酶或朊酶。在一个实施方式中,使用胰蛋白酶,合适地猪衍生的胰蛋白酶。在一个实施方式中,用蛋白酶或朊酶孵育组织约72小时的时间段。
DNA去除剂
本发明的方法包括用DNA去除剂孵育组织的步骤。如本文所用,术语“DNA去除剂”是指变性和/或切割DNA的试剂。
合适地,DNA去除剂可以选自例如核酸内切酶、酸或碱。
合适地,核酸内切酶可以是人核酸内切酶。合适地,所述核酸内切酶可选自DNA酶I型、DNA酶II型、DNA III型、RNA酶,或其两种或多种的任何组合。可替换地,核酸内切酶可以是细菌衍生的核酸内切酶,或人和细菌衍生的核酸内切酶的组合、其两种或多种的任何组合。合适地,核酸内切酶可以是DNA酶I型。合适地,核酸内切酶可以是细菌衍生的核酸内切酶,例如基因工程化的粘质沙雷氏菌(Seratia marcessens)核酸内切酶,其可以选自任何可商购的核酸内切酶,例如
合适地,核酸内切酶的浓度范围可以为约0.5至50U/ml。在一个实施方式中,核酸内切酶的浓度为约5U/ml。
合适地,核酸内切酶可以存在于反应缓冲液中。合适地,反应缓冲液可以包括Tris和六水合氯化镁。合适地,反应缓冲液可以包括0.6%的Tris和0.2%的六水合氯化镁。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·将起始组织与脱脂剂孵育约2-3小时,其中脱脂剂为99%(v/v)丙酮;
·用阴离子洗涤剂孵育组织,其中阴离子洗涤剂为0.01%(w/v)SDS;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育组织,其中DNA去除剂是5U/ml的DNA酶I型,从而获得脱细胞组织支架。
合适地,与DNA去除剂的孵育期足够长,以将DNA去除至低于50ng/mg的水平。合适地,这可以为约2至约24小时,合适地为约2至约12小时。合适地,与DNA去除剂的孵育期可以为约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、或更长。
应当理解,与DNA去除剂的孵育期可以取决于使用的起始组织的类型和/或试剂本身。仅作为示例,猪真皮可以用DNA去除剂如核酸内切酶孵育约3小时,而猪半月板可以用DNA去除剂如核酸内切酶孵育约22小时,而猪肌腱可以孵育约6小时。如果DNA量小于约50ng/mg,则可以从组织中充分去除DNA。本领域技术人员将理解,可以通过涉及不同浓度和/或与DNA去除剂孵育时间的常规实验来优化从组织中去除DNA。
在一个实施方式中,与DNA去除剂5U/ml的核酸内切酶的孵育期为3小时。
在一个实施方式中,与DNA去除剂5U/ml的核酸内切酶的孵育期为22小时,包括两个2小时的时间段和一个18小时的时间段。
在一个实施方式中,与DNA去除剂5U/ml的核酸内切酶的孵育期为6小时,包括三个2小时的时间段。
用DNA去除剂孵育组织的步骤可以在用非动物来源的蛋白酶抑制剂(如果存在)孵育该组织的步骤之前或之后进行。
抗微生物剂
本发明的方法还可以包括在抗微生物剂中孵育组织的步骤。在从非人起始组织生产脱细胞组织支架的方法的上下文中,该步骤可能特别有益,因为此类组织与传播人畜共患疾病的风险相关。
如本文所用,术语“抗微生物剂”是指具有抗菌、抗真菌、抗病毒和/或抗寄生虫活性的任何天然、合成或半合成化合物。在本公开的上下文中,这种活性可以包括减少起始组织和/或组织支架中的活细菌、真菌、病毒和/或寄生虫的数量,和/或减少体内使用时组织支架的受体受到污染和随后感染的机会。可以通过限制、防止和/或抑制微生物的生长和/或杀死微生物来实现减少活微生物的数量。
合适地,抗微生物剂可以是氧化剂。如本文所用,术语“氧化剂”是指能够氧化微生物细胞膜,导致微生物细胞裂解和死亡的试剂。
合适地,氧化剂可以是过乙酸(PAA)。合适地,PAA的浓度可以为约500至约10,000ppm。合适地,PAA的浓度可以为约500ppm至1500ppm。在一个实施方式中,PAA的浓度为1000ppm,以其他方式写为0.1%。
合适地,氧化剂(例如PAA)可以具有约6至约8的pH。更合适地,氧化剂(例如PAA)可以具有约7的pH。
合适地,氧化剂可以存在于缓冲液中,合适地例如PBS缓冲液。
应当理解,抗微生物剂可以包括单个抗微生物剂或两种或多种抗微生物剂。例如,抗微生物剂可以包括两种抗微生物剂。
在其中抗微生物剂包括两种或多种抗微生物剂的实施方式中,至少一种试剂可以是温和氧化剂(例如PAA)。合适地,在其中抗微生物剂包括两种或多种抗微生物剂的实施方式中,至少一种试剂可以是温和氧化剂(例如PAA),并且至少一种试剂可以是抗生素。
合适地,抗生素可以选自由青霉素-链霉素、链霉素、氨苄西林、放线菌素D、羧苄青霉素、头孢噻肟、膦胺霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素和多粘菌素B组成的组。
在本发明的方法中,可以将组织与抗微生物剂(例如温和氧化剂,例如PAA)孵育足够的时间,直到组织基本上不含活微生物。合适地,孵育可以为约15分钟至约24小时,合适地为约30分钟至约12小时,合适地为约1小时至约6小时,合适地为约2小时至约6小时。
更合适地,与抗微生物剂(例如氧化剂,例如PAA)的孵育可以持续为约1小时。在该上下文中,“基本上不含”是指组织在与抗微生物剂孵育之前至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%或更多地不含存在于组织中的微生物。本领域技术人员能够通过例如常规实验确定从组织中去除微生物的适当孵育时间。
在一个实施方式中,与0.1%PAA的抗微生物剂孵育为1小时或约3小时。
与抗微生物剂孵育的步骤可以进行至少一次、两次、三次或更多次。合适地,与抗微生物剂孵育的步骤可以进行一次或两次。仅作为示例,与抗微生物剂(例如氧化剂,例如PAA)的孵育可以在与脱脂剂孵育之前和/或在与蛋白酶抑制剂或DNA去除剂孵育之后进行。合适地,可直接在包装脱细胞组织支架之前与PAA孵育。此外,可在使组织经受至少一个冷冻/解冻循环的步骤之后,进行与抗微生物剂的进一步孵育。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·可选地用抗微生物剂孵育起始组织;
·用脱脂剂孵育组织;
·用阴离子洗涤剂孵育组织;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;
·用DNA去除剂孵育组织;以及
·用抗微生物剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·将起始组织与脱脂剂孵育约2-3小时,其中脱脂剂为99%(v/v)丙酮;
·用阴离子洗涤剂孵育组织,其中阴离子洗涤剂为0.01%(w/v)SDS;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;
·用DNA去除剂孵育组织,其中DNA去除剂是5U/ml的DNA酶I型;以及
·用抗微生物剂孵育组织,其中抗微生物剂为0.1%PAA,从而获得脱细胞组织支架。
在一个实施方式中,该方法可以包括与抗微生物剂孵育的两个步骤。合适地,其中所述抗微生物剂为0.1%PAA。合适地,第一步骤包括与抗微生物剂孵育约1小时的时间段。合适地,第二步骤包括与抗微生物剂孵育约3小时的时间段。
电离辐射
动物组织通常必须暴露于消毒/灭菌过程中,该过程已被证明可将人畜共患病减少6-log。然而,这种幅度的降低通常不能通过传统的灭菌方法实现,例如以25kGy的剂量进行伽马辐照。本发明人出乎意料地发现,这样的灭菌水平可以通过使用电离辐射来实现。因此,本发明的方法可进一步包括使脱细胞生物支架经受电离辐射的步骤。合适地,电离辐射可以为约15kGy至约50kGy。合适地,电离辐射可以为约18kGy至25kGy,合适地,离子辐射可以为25kGy至27.5kGy。
合适地,电离辐射可以在包装组织之前或之后进行。合适地,电离辐射可以在包装组织之后进行。
合适地,电离辐射可以在有或没有干冰的情况下进行。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂孵育组织;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;
·用DNA去除剂孵育组织;
·用抗微生物剂孵育组织,从而获得脱细胞组织支架;
·可选地包装支架;以及
·使支架经受电离辐射。
在一些实施方式中,该方法包括以下步骤:
·将起始组织与脱脂剂孵育约2-3小时,其中脱脂剂为99%(v/v)丙酮;
·用阴离子洗涤剂孵育组织,其中阴离子洗涤剂为0.01%(w/v)SDS;
·用低渗缓冲液孵育组织至少一次,用高渗缓冲液孵育至少一次,和/或使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;
·用DNA去除剂孵育组织,其中DNA去除剂是5U/ml的DNA酶I型;
·用抗微生物剂孵育组织,其中抗微生物剂为0.1%PAA,从而获得脱细胞组织支架;
·可选地包装支架;以及
·使支架经受约18kGy至25kGy、合适地25kGy至27.5kGy的电离辐射。
本领域技术人员应认识到,在本发明方法的每个孵育步骤之间,可以冲洗或洗涤组织至少一次。合适地,组织可以在每个孵育步骤之间冲洗或洗涤至少两次或三次。仅作为示例,冲洗或洗涤可以用盐水进行。可替换地,冲洗或洗涤可以用缓冲液,例如洗涤缓冲液或众所周知的缓冲液,如PBS进行。合适地,盐水可以包括0.9%氯化钠溶液。合适地,洗涤缓冲液可以包括0.1%EDTA和0.1%磷酸盐缓冲盐水溶液。合适地,PBS可以包括0.1%磷酸盐缓冲盐水溶液。
本发明的特定实施方式
在一个实施方式中,该方法可适用于猪肌腱组织支架。合适地,其中起始组织是猪肌腱。
在一个实施方式中,本发明的方法包括:
(a)用脱脂剂孵育起始组织;
(b)用低渗溶液孵育组织;
(c)使组织经受至少一个冷冻/解冻循环;
(d)用抗微生物剂孵育组织;
(e)用低渗溶液孵育组织;
(f)用阴离子洗涤剂孵育组织;
(g)用低渗溶液孵育组织;
(h)用阴离子洗涤剂孵育组织;
(i)用DNA去除剂孵育组织;
(j)用高渗溶液孵育组织;
(k)用抗微生物剂孵育组织。
在一个实施方式中,脱脂剂是丙酮,合适地为99%(v/v)丙酮。在一个实施方式中,步骤(a)包括将起始组织与脱脂剂孵育约2小时。在一个实施方式中,步骤(a)包括将起始组织与脱脂剂孵育三轮,合适地每轮包括约40分钟。
在一个实施方式中,低渗溶液是包含0.1%tris和0.1%EDTA的低渗tris缓冲液。在一个实施方式中,步骤(b)包括用低渗溶液孵育组织约1-4小时。在一个实施方式中,步骤(e)包括用低渗溶液孵育组织约24小时。在一个实施方式中,步骤(g)包括用低渗溶液孵育组织约24小时。
在一个实施方式中,该方法包括两个冷冻/解冻循环。合适地,每个循环在低渗溶液中进行。
在一个实施方式中,该方法可以包括存储组织的步骤。合适地,组织可以在冷冻后存储。合适地,这可以在方法结束时进行,或者在方法的中途进行,合适地在步骤(c)的中途进行。合适地,存储步骤可长达12个月的时间。
在一个实施方式中,抗微生物剂是PAA,合适地为0.1%PAA。在一个实施方式中,步骤(d)包括用抗微生物剂孵育组织约1小时。在一个实施方式中,步骤(k)包括用抗微生物剂孵育组织约3小时。
在一个实施方式中,阴离子洗涤剂是SDS,合适地为0.1%(w/v)SDS。在一个实施方式中,SDS存在于低渗溶液中,合适地存在于Tris缓冲液中。在一个实施方式中,步骤(f)包括用阴离子洗涤剂孵育组织约24小时。在一个实施方式中,步骤(h)包括用阴离子洗涤剂孵育组织约24小时。
在一个实施方式中,DNA去除剂为缓冲液中的5U/ml的缓冲液可以包含0.6%的Tris和0.2%的六水合氯化镁。在一个实施方式中,步骤(i)包括用DNA去除剂孵育组织约6小时。在一个实施方式中,步骤(i)包括将组织与DNA去除剂孵育三轮,合适地每轮包括约2小时。
在一个实施方式中,高渗溶液是0.6%Tris和8.2%氯化钠。在一个实施方式中,步骤(j)包括用高渗溶液孵育组织约18小时。
在一个实施方式中,在如上所述的方法中存在一个或多个洗涤步骤。在一个实施方式中,洗涤步骤可以存在于步骤(a)和(b)之间、步骤(h)和(i)之间、步骤(i)和(j)之间、步骤(j)和(k)之间、和/或步骤(k)之后。在一个实施方式中,步骤(a)和(b)之间、步骤(h)和(i)之间以及步骤(k)之后的洗涤步骤用盐水进行。在一个实施方式中,步骤(i)和(j)之间的洗涤步骤使用洗涤缓冲液进行。在一个实施方式中,步骤(j)和(k)之间的洗涤步骤使用PBS进行。
合适地,该方法的大部分步骤在约37℃下进行。然而,合适地,步骤(a)和步骤(b)在18-30℃下进行。
合适地,该方法还包括如本文别处所述的末端灭菌步骤。
在另一个实施方式中,该方法可适用于猪真皮组织支架。合适地,其中起始组织是猪真皮。
在一个实施方式中,本发明的方法包括:
(a)用抗微生物剂孵育起始组织;
(b)用脱脂剂孵育组织;
(c)用朊酶孵育组织;
(d)用脱脂剂孵育组织;
(e)用阴离子洗涤剂孵育组织;
(f)用高渗溶液孵育组织;
(g)用低渗溶液孵育组织;
(h)用DNA去除剂孵育组织;
(i)用抗微生物剂孵育组织。
在一个实施方式中,抗微生物剂是PAA,合适地为0.1%PAA。在一个实施方式中,步骤(a)包括用抗微生物剂孵育组织约1小时。在一个实施方式中,步骤(i)包括用抗微生物剂孵育组织约3小时。
在一个实施方式中,脱脂剂是丙酮,合适地为99%(v/v)丙酮。在一个实施方式中,步骤(b)包括将起始组织与脱脂剂孵育约33小时。在一个实施方式中,步骤(b)包括将起始组织与脱脂剂孵育三轮,合适地,第一轮和第二轮为约1小时,且第三轮为约31小时。在一个实施方式中,步骤(d)包括将起始组织与脱脂剂孵育约3小时。在一个实施方式中,步骤(d)包括将起始组织与脱脂剂孵育三轮,合适地每轮包括约1小时。
在一个实施方式中,朊酶是天然朊酶。在一个实施方式中,朊酶是胰蛋白酶,合适地缓冲液中的0.2%猪衍生的胰蛋白酶,缓冲液可包含0.6%Tris和0.2%六水合氯化镁。在一个实施方式中,步骤(c)包括用朊酶孵育组织约72小时。
在一个实施方式中,阴离子洗涤剂是SDS,合适地为0.01%(w/v)SDS。在一个实施方式中,SDS存在于低渗溶液中,合适地存在于Tris缓冲液中。在一个实施方式中,步骤(e)包括用阴离子洗涤剂孵育组织约21小时。
在一个实施方式中,高渗溶液是0.6%Tris和8.2%氯化钠。在一个实施方式中,步骤(f)包括用高渗溶液孵育组织约21小时。
在一个实施方式中,低渗溶液是0.1%Tris和0.1%EDTA。在一个实施方式中,步骤(g)包括用低渗溶液孵育组织约21小时。
在一个实施方式中,该方法还可以包括对组织脱毛的步骤。合适地,该步骤可以在步骤(c)和(d)之间进行。合适地,脱毛可能需要8小时。合适地,在脱毛步骤之前和之后存在至少一个洗涤步骤。
在一个实施方式中,该方法还可以包括保持步骤,合适地,其中将组织保持在盐水中。合适地,保持步骤可以在最终步骤(i)之前进行。合适地,保持步骤可以高达72小时。
在一个实施方式中,在如上所述的方法中存在一个或多个洗涤步骤。在一个实施方式中,洗涤步骤可以存在于步骤(a)和(b)之间、步骤(b)和(c)之间、步骤(c)和(d)之间、步骤(d)和(e)之间、步骤(g)和(h)之间、步骤(h)和(i)之间和/或步骤(i)之后。在一个实施方式中,洗涤步骤用盐水进行。
合适地,该方法的大部分步骤在约14℃下进行。然而,合适地,步骤(a)和步骤(i)在约27℃下进行。然而,合适地,步骤(b)和步骤(d)在约21.5℃下进行。
合适地,该方法还包括如本文别处所述的末端灭菌步骤。
脱细胞组织支架
本发明提供了通过本文所述的方法生产的脱细胞组织支架。
本发明人出乎意料地发现,本发明的方法从组织中去除阴离子洗涤剂(例如SDS)残留物。不希望受该假设束缚,本发明人认为,由于在该方法的其他步骤中使用的过程条件的优化,特别是在与高渗和低渗溶液孵育和/或冷冻/解冻循环中使用的过程条件,阴离子洗涤剂残留物的去除是可能的。
因此,本发明的脱细胞组织支架基本上不含阴离子洗涤剂(如SDS)残留物。“基本上不含”是指组织支架至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高达100%不含来自阴离子洗涤剂的加工残留物。合适地,通过本文所述的方法,本发明的组织支架包含比本领域中生产的那些支架更少的阴离子洗涤剂残留物。
因此,本发明的脱细胞组织支架基本上不含半乳糖-α-1,3-半乳糖(也称为α-gal)蛋白。“基本上不含”是指与生产支架的起始组织中天然存在的α-gal的量相比,组织支架可以包括20%或更少、19%或更少、18%或更少、17%或更少、16%或更少、15%或更少、14%或更少、13%或更少、12%或更少、11%或更少、10%或更少、9%或更少、8%或更少、7%或更少、6%或更少、5%或更少、4%或更少、3%或更少、2%或更少、1%或更少的α-gal。合适地,通过本文所述的方法,本发明的组织支架包含比本领域生产的那些支架更少的α-gal蛋白残基。
合适地,组织支架是复合组织支架。在一个实施方式中,复合组织支架是半月板组织支架。
实施例
实施例1:猪真皮
预处理:解剖猪真皮并将其切成1-2mm厚。
将组织在0.1%过乙酸(PAA)中洗涤1小时,然后用盐水洗涤。
将组织用99%(v/v)丙酮洗涤三次,持续1小时,然后用盐水洗涤三次以去除丙酮。
然后将该组织在0.2%胰蛋白酶中孵育72小时以允许手动脱毛,然后用盐水再洗涤三次,用丙酮洗涤三次。
脱细胞:将组织在低渗tris缓冲液中的0.01%SDS中洗涤至多达24小时,然后用0.6%Tris/9%氯化钠溶液的高渗溶液洗涤24小时,并用低渗缓冲液(0.1%Tris/0.1%EDTA)进一步洗涤24小时。
用5000U/l核酸内切酶洗涤3小时,然后在盐水中洗涤三次去除DNA。
将组织切割成一定尺寸,然后在0.1%PAA中病毒灭活、最终包装和在25kGy下最终灭菌。
为了证明有效的脱细胞,使用Qiagen-DNAeasy血液和组织试剂盒和NanoQuant系统测试组织的DNA残留,并且还用苏木精和伊红染色(图1)。证实平均DNA含量为16ng/mg。<50ng/mg被认为是脱细胞的标准。
实施例2:猪半月板
预处理:解剖猪半月板并将其切成7-8mm厚。
将组织在99%(v/v)丙酮中洗涤三次,每次40分钟,然后在盐水中洗涤三次以去除丙酮。
然后将组织在低渗tris缓冲液中洗涤40分钟,并进行三次冷冻/解冻循环。组织在-80℃下冷冻。
脱细胞化:将组织解冻并在0.1%过乙酸(PAA)中洗涤1小时。
然后将组织在0.6%Tris/9%氯化钠溶液的高渗溶液中洗涤至多达8小时,然后在低渗tris缓冲液中在0.01%SDS中孵育至多达20小时4次,然后在0.6%Tris/9%氯化钠溶液的高渗溶液中洗涤至多达8小时。然后将组织在盐水中洗涤40分钟3次。用5000U/l的核酸内切酶洗涤2小时2次,然后进行18小时的核酸内切酶孵育,然后进行三次盐水洗涤去除DNA。
通过将组织在0.01%EDTA/0.1%磷酸盐缓冲盐水溶液中孵育至多达3小时,然后在盐水中洗涤7次并在磷酸盐缓冲盐水中洗涤3次,持续40分钟,从组织中去除加工残留物。
将组织在0.1%PAA中洗涤以确保病毒灭活,随后在盐水中洗涤三次,最后一次盐水洗涤90小时,然后最终包装并在25kGy下最终灭菌。
为了证明有效的脱细胞,使用Qiagen-DNAeasy血液和组织试剂盒和NanoQuant系统测试组织的DNA残留,并且还用苏木精和伊红染色。证实平均DNA含量为14ng/mg,而<50ng/mg被认为是脱细胞的标准。
图1显示了在保持材料的组织结构的同时实现脱细胞的组织。图1A显示了脱细胞的半月板支架。图1B显示脱细胞的真皮支架。在这两种情况下,组织的组织结构都得到了保留。图1C是图1B中的支架的另一个视图。
实验数据
1.猪真皮的α-gal表征
使用MyBioSourceα-gal ELISA试剂盒(MBS262885)对α-gal进行定量。通过实施例1的方法脱细胞的组织首先使用高剪切混合器均化,并使用标准α-gal ELISA试剂盒方法进行提取和处理。提取后,通过测量样品在450nm处的吸光度对α-gal进行定量。
表1
从表1的结果可以看出,本发明的方法显著减少了组织支架中α-gal的量。
2.本发明的方法与EP1392372B1中描述的方法的比较
使用ISO 10993-5(提取法)评估根据EP1392372B1脱细胞的组织和根据本文实施例2脱细胞的组织的细胞毒性。
表2
注意:细胞毒性分级为0-4,4为更具细胞毒性。2级以下的产品作为医疗器械是可接受的,但3级和4级产品作为医疗器械是不可接受的。
从表2中的数据可以看出,实施例2(V2)中进行的本发明方法比现有技术方法更好地去除DNA含量和更好地去除细胞毒性SDS残留。
Claims (25)
1.一种用于生产脱细胞组织支架的方法,所述方法包括以下步骤:
·用脱脂剂孵育起始组织;
·用阴离子洗涤剂孵育所述组织;
·用低渗溶液孵育所述组织至少一次,用高渗溶液孵育所述组织至少一次,和/或使所述组织经受至少一个冷冻/解冻循环;以及
·用DNA去除剂孵育所述组织,从而获得脱细胞组织支架。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述起始组织选自由以下组成的组:皮肤、半月板、肌腱、韧带、软骨、肌肉、血管和器官。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法,其中,所述脱脂剂是极性溶剂。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述极性溶剂是丙酮。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述脱脂剂的浓度为约80%至约100%(v/v)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述阴离子洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)或脱氧胆酸钠。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述阴离子洗涤剂的浓度等于或小于0.2%(w/v)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述低渗溶液包含0.1%tris/0.1%EDTA。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述组织与低渗溶液孵育30分钟至100小时,优选10小时至100小时、优选20小时至80小时。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述高渗溶液包含0.6%tris/8-9%氯化钠溶液。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述组织与高渗溶液孵育1小时至48小时,优选4小时至30小时、优选8小时至24小时。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述方法不包含动物来源的蛋白酶抑制剂。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述方法还包括冲洗所述组织的一个或多个步骤。
14.根据权利要求13所述的方法,其中,所述方法包括在以下步骤中的每个之后冲洗所述组织的步骤:用低渗溶液孵育、用高渗溶液孵育、以及使所述组织经受至少一个冷冻/解冻循环。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,核酸内切酶是人或细菌的,优选地其中核酸内切酶选自由以下组成的组:DNA酶I型、DNA酶II型、DNAIII型、RNA酶,或它们中的两种或更多种的任何组合。
16.根据权利要求15所述的方法,其中,所述核酸内切酶的浓度为约0.5至约50U/ml,优选5U/ml。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述方法还包括用抗微生物剂孵育所述组织的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述抗微生物剂是氧化剂,优选地其中所述氧化剂是过乙酸。
19.根据权利要求17至18中任一项所述的方法,其中,所述抗微生物剂的浓度为约0.05%(w/v)至1%(w/v)。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法,还包括使所述组织经受电离辐射的步骤,优选地其中所述电离辐射的剂量为约15至约50kGy,优选为约25kGy。
21.一种脱细胞组织支架,通过根据权利要求1至20中任一项所述的方法生产。
22.根据权利要求21所述的脱细胞组织支架,其中,所述脱细胞组织支架基本上不含阴离子洗涤剂残留。
23.根据权利要求22所述的脱细胞组织支架,其中,所述阴离子洗涤剂残留是SDS残留。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的脱细胞组织支架,其中,所述组织支架是半月板组织支架、真皮组织支架、或肌腱组织支架。
25.根据权利要求24所述的脱细胞组织支架,其中,所述半月板组织支架是猪半月板组织支架、猪真皮组织支架或猪肌腱组织支架。
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