CN117567626B - 一种抗瓜氨酸化清道夫受体a多肽抗体及其在制备诊断类风湿关节炎的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体及其在制备诊断类风湿关节炎的产品中的应用，属于生物诊断技术领域。一种抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体，与瓜氨酸化清道夫受体A多肽或瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原特异性结合的抗体；所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其中精氨酸进行瓜氨酸化修饰。实验表明，所述抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体可以作为诊断标志物在制备诊断类风湿关节炎的产品中应用。
Description
技术领域
本发明属于生物诊断技术领域，具体涉及一种抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体（anti-citrullinated SR-A peptide antibody, anti-CSP抗体）及其在制备诊断类风湿关节炎的产品中的应用。
背景技术
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是以对称性、侵袭性的骨破坏为特征的自身免疫性疾病，可导致不同程度的关节功能障碍及合并症。虽然RA的研究取得了长足发展，但仍面临着早期诊断困难、特异性生物诊断标志物有限的挑战。
目前，常用的RA诊断标志物有类风湿因子（rheumatoid factor, RF）和抗瓜氨酸化蛋白抗体（anti-citrullinated protein antibody, ACPA）。ACPA以抗CCP抗体（抗环瓜氨酸肽抗体）为代表。RF在RA中的诊断敏感性在70%~75%之间，特异性在80%~85%之间，抗CCP抗体在RA诊断的特异性可达95%，然而敏感性为67%。目前临床上仍有接近40%的RA患者面临着缺乏诊断标记物的困境。因此，筛选RA新型生物诊断标记物，对于提高RA的精准、早期诊断具有重要的科学价值和临床意义。
清道夫受体A（SR-A）是三聚体Ⅱ型跨膜糖蛋白，作为一种模式识别受体，其主要在先天免疫系统中发挥关键作用。然而，最近研究也阐述了其参与了适应性免疫。越来越多的研究表明SR-A在自身免疫性疾病特别是RA中的重要作用。SR-A可以激活ERK和JNK信号通路，增加IL-6表达，进一步刺激破骨细胞的形成。此外，SR-A也可以直接参与RA的发展。在抗原诱导性关节炎（antigen induced arthritis, AIA）小鼠中，滑膜组织SR-A表达水平显著升高，而SR-A基因敲除状态下，软骨破坏几乎完全消失。
申请人前期研究发现，RA患者血清存在可溶性SR-A，其水平显著升高，更重要的是，我们首次发现血清中可溶性SR-A对RA具有显著的诊断价值，敏感性66.41%。特异性91.45%，阳性预测值（PPV）80.19%，阴性预测值（NPV）83.94%，具有较好的临床应用价值。进一步研究发现，SR-A-/-小鼠展现关节炎抵抗的表型，而SR-A可以促进关节炎小鼠的发病，并加重疾病的严重程度。SR-A中和抗体或抑制剂则可改善关节炎小鼠病情的严重程度，并显著抑制破骨细胞分化和进一步的骨破坏。
RA是以自身抗体产生为主要特点的自身免疫性疾病。尽管前期研究表明RA患者血清中可溶性SR-A特异性升高，其B细胞抗原表位仍不明确。另外，瓜氨酸化是RA发病中的关键驱动因素，目前已发现RA患者体内存在多种ACPA，具有一定的诊断价值，并参与RA的发病。SR-A在RA患者中是否发生瓜氨酸化修饰，其自身抗体的诊断价值仍需进一步研究证实。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体，能够特异性结合瓜氨酸化清道夫受体A多肽，且在诊断类风湿关节炎中具有良好的敏感性和特异性。
本发明提供了一种抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体，与瓜氨酸化清道夫受体A多肽或瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原特异性结合的抗体；
所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原是由瓜氨酸化清道夫受体A在N端添加半胱氨酸残基并偶联载体蛋白形成。
优选的，所述载体蛋白包括以下任意一项：牛血清蛋白、人血清蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白和兔血清蛋白。
优选的，包括单克隆抗体和/或多克隆抗体。
本发明提供了所述抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体作为诊断标志物在制备诊断类风湿关节炎的产品中的应用。
本发明提供了瓜氨酸化清道夫受体A多肽或瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原在制备诊断类风湿关节炎的产品中的应用，所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述产品包括试剂或试剂盒。
优选的，所述试剂或试剂盒包括抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体标准品或参考品。
优选的，所述诊断类风湿关节炎的产品是基于以下至少一种免疫检测技术制备得到：ELISA、免疫印迹技术、免疫层析检测技术、免疫组化技术、免疫荧光技术和化学发光技术；
优选的，所述产品的检测样本包括：血清、血浆和关节液。
本发明提供了一种基于ELISA技术诊断类风湿关节炎的试剂盒，包括以下组分：包被有瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原的检测板、稀释液、洗涤液、酶标二抗、显色底物和终止液；
所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供了一种抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体，与瓜氨酸化清道夫受体A多肽或瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原特异性结合的抗体；所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过软件预测及分子模拟比对筛选出SR-A可能的B细胞自身抗原表位并进行合成，检测anti-CSP抗体在类风湿关节炎（RA）患者、其他自身免疫病（干燥综合征、系统性红斑狼疮、骨关节炎、强直性脊柱炎、成人Still病、银屑病关节炎、痛风、ANCA相关性血管炎）患者及健康人/健康对照血清中的抗体水平。结果表明，anti-CSP在RA中明显升高，而在其他自身免疫病及健康人中无明显变化，这提示其在RA诊断中的特异性和敏感性。同时评估anti-CSP抗体在RA诊断中的效能，结果表明血清中anti-CSP抗体在RA患者中的诊断敏感性为60.00%，特异性为91.10%，阳性预测值为80.97%，阴性预测值为79.87%。更为重要的是，anti-CSP抗体对早期RA及自身抗体阴性RA也具有较好的诊断价值。
附图说明
图1为RA及其他常见自身免疫病、健康对照血清中anti-CSP抗体水平检测结果；**p < 0.01，***p < 0.001；
图2为anti-CSP抗体在RA中的诊断价值结果；A为RA、OA、SS、SLE患者及HC血清中的anti-CSP抗体水平；B为检测队列ROC曲线及曲线下面积（AUC）分析结果；
图3为anti-CSP抗体在早期RA中的诊断价值结果，***p < 0.001；
图4为anti-CSP抗体在抗CCP抗体/RF阴性RA中的诊断价值结果，***p < 0.001。
具体实施方式
本发明提供一种抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体，与瓜氨酸化清道夫受体A多肽或瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原特异性结合的抗体；所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明中，所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽是在通过软件预测和分子模拟筛选得到多肽（SEQ ID NO：1，KGDRGAIGFPGSRGLPGYAGR），并在所述多肽的基础上将其中的精氨酸进行瓜氨酸化得到。所述瓜氨酸化有利于提高检测阳性率。
在本发明中，所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原优选是在瓜氨酸化清道夫受体A多肽的N端添加半胱氨酸残基后并偶联载体蛋白形成。载体蛋白的偶联有利于提高瓜氨酸化清道夫受体A多肽的免疫原性。所述载体蛋白优选包括以下任意一项：牛血清蛋白、人血清蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白和兔血清蛋白。本发明对载体蛋白的偶联位置没有特殊限制，采用本领域所熟知的在瓜氨酸化清道夫受体A的N端或C端偶联均可。本发明对所述人工抗原的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的人工抗原的制备方法即可。
本发明对所述抗体的种类没有特殊限制，凡是血清中能够特异性与瓜氨酸化清道夫受体A多肽发生免疫反应的抗体即可，例如包括单克隆抗体和/或多克隆抗体。
本发明提供了所述抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体作为诊断标志物在制备诊断类风湿关节炎的产品中的应用。
本发明提供了瓜氨酸化清道夫受体A多肽或瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原在制备诊断类风湿关节炎的产品中的应用，所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明中，所述产品优选包括试剂或试剂盒。所述试剂或试剂盒优选包括抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体标准品或参考品。所述诊断类风湿关节炎的产品优选是基于以下至少一种免疫检测技术制备得到：ELISA、免疫印迹技术、免疫层析检测技术、免疫组化技术、免疫荧光技术和化学发光技术。
本发明提供了一种基于ELISA技术诊断类风湿关节炎的试剂盒，包括以下组分：包被有瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原的检测板、稀释液、洗涤液、酶标二抗、显色底物和终止液；所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明中，所述包被有瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原的检测板的制备方法，优选包括以下步骤：用包被液（碳酸盐溶液）稀释所述瓜氨酸化SR-A多肽形成的人工抗原至10 μg/mL，包被紫外照射过夜的酶标板，每孔100 μL，4℃包板过夜；用0.05%PBST洗板3次；向酶标板加入含3% BSA的PBST封闭2h；用0.05% PBST洗板3次，晾干。
在本发明中，所述试剂盒的使用方法没有特殊限制，按照本领域所熟知的ELISA检测方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体及其在制备诊断类风湿关节炎的产品中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
通过软件预测和分子模拟比对出SR-A中的可能RA抗原表位并进行筛选多肽
通过IEDB数据库进行抗原表位预测，并进一步通过分子模拟及IEDB数据库进行可能的抗原表位多肽的筛选，最终筛选到SR-A的305-325位点为可能的自身抗原肽，进而进行多肽合成，具体氨基酸序列为KGDRGAIGFPGSRGLPGYAGR（SEQ ID NO:1）。
实施例2
一种瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原的制备方法
对SR-A多肽的精氨酸进行瓜氨酸化，得到瓜氨酸化SR-A多肽，序列如下：KGD-Cit-GAIGFPGS-Cit-GLPGYAG-Cit（SEQ ID NO:2）。在瓜氨酸化SR-A多肽的N端添加一个半胱氨酸残基，按照SMCC方法将瓜氨酸化SR-A多肽与载体蛋白BSA偶联，制备得到瓜氨酸化清道夫受体A多肽的人工抗原。
实施例3
一种基于ELISA技术诊断类风湿关节炎的试剂盒，包括以下组分：
（1）包被有瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原的检测板，按照以下方法制备得到：ELISA包被液稀释合成的瓜氨酸化SR-A多肽至10 μg/mL，包被紫外照射过夜的96孔酶标板，每孔100 μL，4℃包板过夜；用0.05% PBST洗板3次，300 μL/孔，2 min/次，用力甩去洗液并拍干；加入3% BSA-PBST（200 μL/孔），室温封闭2小时；用0.05% PBST洗板3次，300 μL/孔，2 min/次，用力甩去洗液并拍干，真空包装即可。
（2）稀释液：含1% BSA的PBST溶液；
（3）洗涤液：0.05% PBST溶液；
（4）酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG；
（5）显色底物：TMB显色液；
（6）终止液：2 mol/L稀硫酸溶液。
实施例4
一种基于ELISA技术诊断类风湿关节炎的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
（1）将包被有瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原的检测板从冰箱中取出放置室温，拆开外包装；
（2）孵育血清：1% BSA-PBST稀释血清（1：100），100 μL/孔，37℃孵育1小时；
（3）洗板：用0.05% PBST洗板3次，300 μL/孔，2 min/次，用力甩去洗液并拍干；
（4）二抗孵育：加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG（1% BSA-
PBST 1：13000稀释，100 μL/孔），37℃孵育30 min；
（5）洗板：用0.05% PBST洗板3次，300 μL/孔，2 min/次，用力甩去洗液并拍干；
（6）显色：加入提前恢复至室温的单组分TMB显色液（100 μL/孔），避光反应10min；
（7）终止：加入2 mol/L稀硫酸（100 μL/孔），终止反应，酶标仪测定OD450 nm、OD570 nm的OD值；
（8）结果计算：每板均设置阳性对照标准血清，阳性对照标准血清为通过挑选OD值大于1.5的10例RA血清，等体积混匀所得。最终结果用AU（Arbitrary units）值表示，按照公式I计算抗体的含量：
AU值=[ODCSP肽-OD非特异背景]待测血清/[ODCSP肽-OD非特异背景]阳性标准血清×100 公式I。
实施例5
小样本检测抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体（anti-CSP抗体）在RA和疾病对照以及健康人中的水平
采用实施例3的试剂盒检测了anti-CSP抗体在RA（n=80）和其他常见自身免疫性疾病，如骨关节炎（osteoarthritis，OA，n=30）、干燥综合征（Sjögren syndrome，SS，n=30）、系统性红斑狼疮（system lupus erythematosus, SLE，n=30）、强直性脊柱炎（ankylosingspondylitis, AS，n=23）、成人Still病（adult onset still disease, AOSD，n=25）、银屑病关节炎（psoriatic arthritis, PsA，n=19）、痛风（Gout，n=22）和ANCA相关性血管炎（ANCA-associated vasculitis, AAV，n=25）及健康对照（HC，n=60）中的水平。
如图1所示，与HC和疾病对照组相比，RA血清中anti-CSP抗体水平特异性升高。
实施例6
大样本队列研究抗瓜氨酸化清道夫受体A多肽抗体（anti-CSP抗体）在RA中的诊断价值
实施例5的小样本研究结果表明，血清中存在anti-CSP抗体，并在RA患者血清中特异性升高，这提示血清中anti-CSP抗体可能作为一个潜在的RA诊断标志物。为了进一步研究anti-CSP抗体在RA中的临床诊断价值，我们设计了一个大样本队列研究，包含RA 305例、OA 105例、SS 105例、SLE 111例和HC 206例。
如图2中A所示，anti-CSP抗体在RA患者中的表达水平显著高于其他疾病患者。如图2中B所示，ROC曲线的AUC为0.807。
实施例7
anti-CSP抗体在RA诊断中效能评估
为了进一步评估anti-CSP抗体在RA诊断中的效能，将HC组anti-CSP抗体 AU值的均值加2倍标准差设定为cut-off值（AU值=18.80），按照公式II~公式V计算anti-CSP抗体在RA诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。
敏感性=真阳性人数/（真阳性+假阴性人数） 公式II
特异性=真阴性人数/（真阴性+假阳性人数） 公式III
阳性预测值=真阳性人数/（真阳性+假阳性人数） 公式IV
阴性预测值=真阴性人群/（真阴性+假阴性人数） 公式V
结果显示，血清中anti-CSP抗体在RA患者中的诊断敏感性为60.00%，特异性为91.10%，阳性预测值为80.97%，阴性预测值为79.87%（见表1）。
表1 anti-CSP抗体RA诊断中的敏感性和特异性
| 疾病 | 例数 | 阳性例数 | 敏感性（%） | 特异性（%） | 阳性预测值（%） | 阴性预测值（%） |
| RA | 305 | 183 | 60.00 | 91.10 | 80.97 | 79.87 |
| OA | 105 | 6 | 5.71 | |||
| SS | 105 | 13 | 12.38 | |||
| SLE | 111 | 13 | 11.71 | |||
| HC | 206 | 11 | 6.31 |
实施例8
Anti-CSP抗体在早期RA中的诊断价值
通过ELISA的方法，检测早期RA患者血清中anti-CSP抗体水平。其中，病程 ≤ 24个月RA患者为129例，病程 ≤ 12个月RA患者为78例，病程 ≤ 6个月RA患者为51例。
结果见图3。anti-CSP抗体在病程 ≤ 24个月、≤ 12个月和 ≤ 6个月的阳性率分别为55.81%、50.00%和47.06%。随着病程的延长，anti-CSP抗体的阳性率呈逐渐升高的趋势。
实施例9
Anti-CSP抗体在自身抗体阴性RA中的诊断价值
目前RA的诊断标志物主要有抗CCP抗体和RF，但仍有部分患者的抗CCP抗体和RF呈阴性，因此本实施例进一步分析检测了anti-CSP抗体在抗CCP抗体/RF阴性RA患者中的诊断价值。
结果见图4。抗CCP抗体阴性RA患者（anti-CCP-RA）和RF阴性RA患者（RF-RA）中的anti-CSP抗体的阳性率分别为46.38%和38.21%。更重要的是，在抗CCP抗体和RF双阴性的血清阴性RA患者（（anti-CCP+RF）-RA）中，anti-CSP抗体的阳性率仍可达33.06%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.瓜氨酸化清道夫受体A多肽或瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原在制备诊断类风湿关节炎的ELISA检测试剂盒中的应用，所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;
所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原是由瓜氨酸化清道夫受体A多肽在N端添加半胱氨酸残基并偶联载体蛋白形成；所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒的检测样本为血清。
3.一种基于ELISA技术诊断类风湿关节炎的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：包被有瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原的检测板、稀释液、洗涤液、酶标二抗、显色底物和终止液；
所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽形成的人工抗原是由瓜氨酸化清道夫受体A多肽在N端添加半胱氨酸残基并偶联载体蛋白形成；所述载体蛋白为牛血清白蛋白；
所述瓜氨酸化清道夫受体A多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
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