CN117564296A - 可降解锌合金激光3d打印器件的表面微纳结构制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于金属材料的表面处理技术领域，涉及激光束加工，具体为一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，通过3D打印技术制备锌合金样品，利用飞秒激光分步扫描方法，在锌合金样品表面通过大能量密度扫描形成非周期性结构的基础上，再通过小能量密度扫描得到周期性结构，两种结构双重作用形成分级复合微纳结构。本发明方法实现了3D打印锌合金材料表面的微结构化、表面能态的精确加工，提高表面的细胞粘附与增殖分化能力，增强其细胞活性。通过细胞毒性与增殖试验测试，结果表明此方案可有效提高诱导细胞粘附与增殖能力，使得细胞活性增强。
Description
技术领域
本发明属于金属材料的表面处理技术领域，涉及激光束加工，具体为一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，应用于医用可降解锌合金材料表面处理，有利于细胞粘附与增殖分化。
背景技术
可降解锌基合金是一种新型的生物医用金属材料，锌作为人体必需的微量元素之一，对骨骼的生长发育发挥重要作用。同时锌合金有着适中的降解速率，为可降解金属的腐蚀速率与骨组织愈合之间的不匹配提供了解决方案。目前，3D打印锌合金表现出良好的力学及腐蚀性能，成为新一代具有潜力的骨植入材料。
细胞在植入物表面的粘附与生长状况是影响患者体内组织修复的长期稳定性的关键因素。材料表面的细胞活性以及生物相容性限制了其临床医学应用范围，所以对植入物材料表面的化学成分、润湿性、粗糙度以及形貌等有着更高的要求。因此，为提高材料表面细胞活性，稳定植入物的促成骨功能，调节其表面特性成为材料科学和生物医学领域的一种有前途的手段。
现阶段对提高医用金属材料表面细胞活性的表面处理方法有很多，传统的表面改性方法包括物理涂层改性、化学浸泡改性、离子注入等，例如通过等离子喷涂、溅射和脉冲激光沉积等方法在其金属表面涂覆生物活性羟基磷灰石（HAP）涂层。然而，生物活性涂层经常发生剥离与脱落现象，并且大多的涂层都需要进行烧结处理，这将会降低涂层与金属的结合力影响整体的机械性能，效果不稳定的同时还存在化学污染、成本高以及工艺复杂等问题，限制了其临床应用。在材料表面装载药物是提高生物活性的一种有效方法，但这种方法存在药物释放难以控制进而导致全身毒性的安全隐患。因此，在保证安全的同时提高植入物表面的细胞活性仍是一个巨大的挑战。
表面形貌对生物相容性有着重要影响，材料表面微纳结构的独特取向不仅可以增强植入物和人体组织之间的机械结合力，同时还可诱导细胞的增殖分化。拥有微纳结构的表面将有利于水分、无机盐和其他营养物以及代谢物的转移与交换，这也可以促进细胞的渗出。此外，表面微纳结构可提供更大的表面积，这将改善蛋白质的吸附以及增强成骨细胞和植入物表面之间的连接。细胞在典型微纳结构表面上的粘附、增殖、分化和基因表达比在光滑表面上更加紧密。然而，采用传统的喷砂后进行酸处理的方法制备微纳结构，将会导致一些砂粉嵌入植入物表面难以去除，这将降低植入物的生物相容性。此外，该方法得到的微纳结构分布不均匀，给骨关节与植入物之间结合处的定量分析带来难题。通过反应离子腐蚀（RIE）和电化学显微镜加工（EMM）技术可制备出规则分布的微结构，但可能会引入化学异质性，这将可能抑制成骨细胞的增殖，不利于生物相容性。
激光加工技术可以在材料表面提供适当的粗糙度和规则分布的微纳结构，近年来得到快速发展。其中，飞秒激光因具有高精度、高复现、低损伤阈值、瞬时高温和热影响区小甚至可忽略等独特优势，在生物医学领域被广泛关注。特别是飞秒激光诱导周期性表面结构（LIPSS)使得细胞和组织在具有凹槽的基底上粘附与生长，增强了生物相容性。但是周期结构单调、缺乏灵活性及指向性也给飞秒激光加工用于生物材料表面改性带来了挑战与难题。
因此，如何利用具有独特优势的飞秒激光加工制备特殊的表面微纳结构来有效诱导细胞粘附增长，提高细胞活性与生物相容性已成为医用金属材料表面处理急需解决的重要问题。
发明内容
本发明目的是提供一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，提高细胞的粘附与增殖分化能力，增强细胞活性。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，包括如下步骤：
（1）、将采用选区激光熔化（SLM）工艺制备的锌合金材料在微纳构型前进行前处理，记作锌合金样品。
（2）、将锌合金样品放置于飞秒激光加工系统中的机床运动平台上，并将激光束的焦点位置调到锌合金样品的表面，选择加工的起止位置以及加工环境介质。
（3）、利用扫描振镜控制软件制定加工程序：扫描路径的选取、扫描方式以及扫描速度大小的设定，同时确定激光能量密度。
（4）、绘制所需的加工图案：启动扫描振镜，开启激光光闸，使得激光光束垂直入射到锌合金样品表面，按照规定路径进行扫描加工图案并在锌合金样品表面形成微纳结构。
（5）、表面形貌观察：利用扫描电镜（SEM）对飞秒激光加工锌合金样品表面的微纳结构形貌进行观察。
（6）、体外细胞毒性测试：将细胞直接接种到锌合金样品表面上，通过 Live/dead荧光染色法并使用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察细胞形态特征来判断表面微纳结构所引发细胞毒性的大小，以此评估其诱导细胞粘附增殖能力以及细胞活性。
本发明方法通过飞秒激光在可降解锌合金材料表面精确加工制备微纳结构，改善材料的表面能态，实现诱导细胞的粘附增殖，促进细胞活性以及生物相容性。
优选的，飞秒激光加工环境介质是空气、氮气或氩气气氛，同时需保证无尘。
优选的，步骤（3）中，采用分步扫描加工分级复合微纳结构；首先在锌合金样品表面部分区域通过激光大能量密度扫描形成非周期性结构，其次通过激光小能量密度在锌合金样品整个表面扫描得到周期性结构；激光大能量密度为1.5~3J/cm2，激光小能量密度为0.3~0.8J/cm2，扫描速度为100~1000mm/s，离焦量为-5mm~5mm。进一步选择，激光大能量密度为2~2.5J/cm2，激光小能量密度为0.4~0.5J/cm2，扫描速度为100~200mm/s，离焦量为0mm。
优选的，步骤（4）中，加工图案可以为方形网格、六边形网格、菱形网格、圆环形网格以及正弦波浪结构。当加工图案为方形网格时，方形网格宽度为50~200μm、高度为30~50μm，且相邻方形网格间的沟槽宽度为50~200μm。
优选的，步骤（6）中，体外细胞毒性测试在37℃环境下，将来源于新生小鼠颅骨的MC3T3-E1成骨细胞在添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和链霉素的阿尔法改良伊格尔培养基（α-MEM）中进行培养，将细胞直接接种到锌合金样品表面上，分别培养1天和5天后观察细胞生长情况。细胞毒性与增殖试验的代表性LSCM荧光图像如图6至图11所示。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明方法基于激光3D打印结合飞秒脉冲激光诱导与激光直写，采用分步扫描方式在锌合金材料表面构筑分级复合微纳结构，诱导细胞粘附与增长，提高植入材料表面的细胞活性及生物相容性。相较于一般的单一周期性微纳结构，本方法所加工构筑的表面分级复合微纳结构更有利于保证植入材料的长期稳定性以及耐久性。
2、本发明通过两步分步法精确制备出微米级或纳米级的表面分级复合结构，处理过程相对简单，不会引入有害物质，且该结构的设计将缩短整个材料表面制备典型特征微纳结构所需的时间，进一步提高了制备效率。
3、本发明制备的表面分级复合微纳结构具有独特的取向和良好的诱导细胞生长的能力，由特定的网格以及沟槽底部与图案表面的不同微纳结构所形成的分级复合结构给细胞的粘附与增殖提供了更大的表面积及生长位点，增强了生物活性。
本发明设计合理，为生物医用金属植入材料的表面处理领域提供新的设计方案，具有很好的实际应用价值。
附图说明
图1表示实施例1飞秒激光两步法制备分级复合微纳结构中第一步扫描的样品部分区域示意图（形成方形结构和沟槽）。
图中：1-方形，2-沟槽。
图2表示实施例1飞秒激光两步法制备分级复合微纳结构中第二步扫描的样品全部区域示意图。
图3表示实施例1飞秒激光加工的分级复合微纳结构中方形表面的扫描图。
图4表示实施例1飞秒激光加工的分级复合微纳结构中沟槽表面的扫描图。
图5表示实施例1制备的锌合金样品Ⅰ微纳结构表面细胞铺展图。
图6表示实施例1制备的锌合金样品Ⅰ表面培养1天后细胞毒性与增殖结果图。
图7表示实施例2制备的锌合金样品Ⅱ表面培养1天后细胞毒性与增殖结果图。
图8表示对照组锌合金样品光滑表面培养1天后细胞毒性与增殖结果图。
图9表示实施例1制备的锌合金样品Ⅰ表面培养5天后细胞毒性与增殖结果图。
图10表示实施例2制备的锌合金样品Ⅱ表面培养5天后细胞毒性与增殖结果图。
图11表示对照组锌合金样品光滑表面培养5天后细胞毒性与增殖结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明实施例中的技术方案进行具体详细说明。
实施例1
一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，包括如下步骤：
步骤1、通过SLM工艺制备可降解Zn-Mg锌合金，在微纳构型前进行前处理，即依次使用600、800、1200、2000目砂纸和阻尼抛光布对样品进行磨抛处理，然后在含有丙酮、乙醇的混合清洗溶液中进行超声清洗10分钟后将其烘干，作为锌合金样品Ⅰ。
步骤2、将锌合金样品Ⅰ放置于飞秒激光加工系统中的机床运动平台上，并将激光束的焦点位置调到锌合金样品Ⅰ的表面，靠近锌合金样品Ⅰ边缘的位置作为加工的起点位置，加工环境介质选择空气。
步骤3、利用扫描振镜控制软件制定加工程序：扫描路径的选取、扫描方式以及扫描速度大小的设定，同时确定激光能量密度；通过扫描振镜控制软件来绘制加工图案。
首先选择2.5J/cm2大能量密度在锌合金样品Ⅰ表面部分区域扫描得到横向和纵向宽度均为180μm的沟槽2（沟槽深30μm），则同时获得高为30μm、边长为70μm的方形1，如图1所示，部分区域指的是在沟槽区域进行扫描。然后选择0.5J/cm2小能量密度在整个表面进行扫描进一步得到周期性波纹结构，如图2所示，整个表面指在沟槽区域及方形表面进行扫描。其中设置扫描速度为100mm/s，离焦量为0mm。
步骤4、绘制所需的加工图案：启动扫描振镜，开启激光光闸，使得激光光束垂直入射到锌合金样品Ⅰ表面，按照规定路径进行扫描加工图案并在锌合金样品Ⅰ表面形成分级复合微纳结构，加工图案为方形网格结构。
对加工后的锌合金样品Ⅰ表面在丙酮溶液中利用超声波清洗20分钟以去除激光烧蚀过程中产生的表面飞溅物和杂质。
步骤5、表面形貌观察：利用SEM对飞秒激光加工锌合金样品Ⅰ表面的分级复合微纳结构形貌进行观察。由图4所示的局部放大图可观察到基于第一步大能量密度扫描下在沟槽底部得到的非周期性微驼峰结构；由图3所示的局部放大图可观察到基于第二步小能量密度扫描下在方形顶部所得到的周期性波纹结构。特定的方形网格结构、沟槽底部的非周期性微驼峰与方形顶部的周期性波纹结构组成分级复合微纳结构。
步骤6、体外细胞毒性测试：在37℃下进行体外细胞毒性测试，将来源于新生小鼠颅骨的MC3T3-E1成骨细胞在添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和链霉素的阿尔法改良伊格尔培养基（α-MEM）中进行培养。将细胞直接接种到锌合金样品Ⅰ表面上，通过 Live/dead 荧光染色法并使用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察细胞形态特征，分别培养1天和5天后观察细胞生长情况，细胞在锌合金样品Ⅰ的微纳结构上的铺展如图5所示，可以观察到微结构表面上细胞铺展良好，紧紧的粘附在结构表面，同时发现局部细胞伸出丝状伪足。
细胞毒性与增殖结果：本实施例1培养1天如图6所示，培养5天如图9所示；对照组培养1天如图8所示，培养5天如图11所示。
由活/死染色的荧光照片可以看出，与对照组锌合金样品的光滑表面相比，拥有分级复合微纳结构的锌合金样品Ⅰ表面细胞数量明显更多，说明经过飞秒激光加工后的样品表面拥有更好的细胞活力。分级复合微纳结构显然更加促进了细胞的增殖与分化。
实施例2
一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，包括如下步骤：
步骤1、通过SLM制备出Zn-Mg-Zr锌合金，在微纳构型前进行前处理，即依次使用600、800、1200、2000目砂纸和阻尼抛光布对样品进行磨抛处理，然后在含有无水乙醇的清洗溶液中进行超声清洗10分钟后将其烘干，作为锌合金样品Ⅱ。
步骤2、将锌合金样品Ⅱ放置于飞秒激光加工系统中的机床运动平台上，并将激光束的焦点位置调到锌合金样品Ⅱ的表面，靠近锌合金样品Ⅱ边缘的位置作为加工的起点位置，加工环境介质选择空气。
步骤3、利用扫描振镜控制软件制定加工程序：扫描路径的选取、扫描方式以及扫描速度大小的设定，同时确定激光能量密度；通过扫描振镜控制软件来绘制加工图案。
首先选择2J/cm2大能量密度在锌合金样品Ⅱ表面部分区域扫描得到横向和纵向宽度均为200μm的沟槽（沟槽深30μm），则同时获得高为30μm、边长为100μm的方形结构。然后选择0.4J/cm2小能量密度在整个表面进行扫描进一步得到周期性波纹结构。其中设置扫描速度为200mm/s，离焦量为0mm。特定的方形网格、沟槽底部的微驼峰与方形顶部的周期性波纹结构组成分级复合的微纳结构。
步骤4、绘制所需的加工图案：启动扫描振镜，开启激光光闸，使得激光光束垂直入射到锌合金样品Ⅱ表面，按照规定路径进行扫描加工图案并在锌合金样品Ⅱ表面形成分级复合微纳结构，加工图案为方形网格结构。
对加工后的锌合金样品Ⅱ表面在丙酮溶液中利用超声波清洗20分钟以去除激光烧蚀过程中产生的表面飞溅物和杂质。
步骤5、表面形貌观察：利用SEM对飞秒激光加工锌合金样品Ⅱ表面的分级复合微纳结构形貌进行观察，特定的方形网格、沟槽底部的非周期性微驼峰与方形顶部的周期性波纹结构组成分级复合微纳结构。
步骤6、体外细胞毒性测试：在37℃下进行体外细胞毒性测试，将来源于新生小鼠颅骨的MC3T3-E1成骨细胞在添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和链霉素的阿尔法改良伊格尔培养基（α-MEM）中进行培养。将细胞直接接种到锌合金样品Ⅱ表面上，通过 Live/dead荧光染色法并使用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察细胞形态特征，分别培养1天和5天后观察细胞生长情况。
细胞毒性与增殖结果：本实施例2培养1天如图7所示，培养5天如图10所示；对照组培养1天如图8所示，培养5天如图11所示。
由活/死染色的荧光照片可以看出，与对照组锌合金样品的光滑表面相比，拥有分级复合微纳结构的锌合金样品Ⅱ表面细胞数量明显更多，说明经过飞秒激光加工后的样品表面拥有更好的细胞活力。分级复合微纳结构显然更加促进了细胞的增殖与分化。
实施例3
一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，包括如下步骤：
步骤1、通过SLM制备出Zn-Mg-Li锌合金，在微纳构型前进行前处理，即依次使用600、800、1200、2000目砂纸和阻尼抛光布对样品进行磨抛处理，然后在含有无水乙醇的清洗溶液中进行超声清洗10分钟后将其烘干，作为锌合金样品Ⅲ。
步骤2、将锌合金样品Ⅲ放置于飞秒激光加工系统中的机床运动平台上，并将激光束的焦点位置调到锌合金样品Ⅲ的表面，靠近样品边缘的位置作为加工的起点位置，加工环境介质选择空气。
步骤3、利用扫描振镜控制软件制定加工程序：扫描路径的选取、扫描方式以及扫描速度大小的设定，同时确定激光能量密度；通过扫描振镜控制软件来绘制加工图案。
首先选择2.5J/cm2大能量密度在锌合金样品Ⅲ表面部分区域扫描得到横向和纵向宽度均为200μm的沟槽（沟槽深30μm），则同时获得高为30μm、边长为100μm的方形结构。然后选择0.5J/cm2小能量密度在整个锌合金样品Ⅲ表面进行扫描进一步得到周期性波纹结构。其中扫描速度为100mm/s，离焦量为0mm。
步骤4、绘制所需的加工图案：启动扫描振镜，开启激光光闸，使得激光光束垂直入射到锌合金样品Ⅲ表面，按照规定路径进行扫描加工图案并在锌合金样品Ⅲ表面形成分级复合微纳结构，加工图案为方形网格。
对加工后的锌合金样品Ⅲ表面在无水乙醇溶液中利用超声波清洗20分钟以去除激光烧蚀过程中产生的表面飞溅物和杂质。
步骤5、表面形貌观察：利用SEM对飞秒激光加工锌合金样品Ⅲ表面的分级复合微纳结构形貌进行观察。特定的方形网格、沟槽底部的非周期性微驼峰与方形顶部的周期性波纹结构组成分级复合的微纳结构。
步骤6、体外细胞毒性测试：在37℃下进行体外细胞毒性测试，将来源于新生小鼠颅骨的MC3T3-E1成骨细胞在添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和链霉素的阿尔法改良伊格尔培养基（α-MEM）中进行培养。将细胞直接接种到锌合金样品Ⅲ表面上，通过 Live/dead荧光染色法并使用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察细胞形态特征，分别培养1天和5天后观察细胞生长情况。结果发现分级复合微纳结构的表面表现出更好的细胞活性，显然更加促进了细胞的增殖与分化。
总之，可降解锌合金作为骨植入材料，其表面的生物活性以及生物相容性对于长期植入的稳定性和骨结合、组织修复尤为重要。本发明所述的可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，通过3D打印技术制备锌合金样品，利用飞秒激光分步扫描方法，在样品表面通过大能量密度扫描形成非周期性微驼峰结构的基础上，再通过小能量密度扫描得到周期性波纹结构，两种结构双重作用形成分级复合微纳结构。实现了3D打印锌合金材料表面的微结构化、表面能态的精确加工，提高表面的细胞粘附与增殖分化能力，增强其细胞活性。通过细胞毒性与增殖试验测试，结果表明此方案可有效提高诱导细胞粘附与增殖能力，使得细胞活性增强。
上述实施例中，采用的激光加工设备为高度集成化的飞秒激光加工系统，主要由Light Conversion 公司的 Phroas-20型飞秒激光器、Aerotech A320型数控运动系统、光路传输系统和集成控制柜等四部分组成，但本发明对飞秒激光加工系统没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品即可。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖本发明的权利要求保护范围中。
Claims (10)
1.一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）、将采用选区激光熔化工艺制备的锌合金材料在微纳构型前进行前处理，记作锌合金样品；
（2）、将锌合金样品放置于飞秒激光加工系统中的机床运动平台上，并将激光束的焦点位置调到锌合金样品的表面；
（3）、利用扫描振镜控制软件制定加工程序：扫描路径的选取、扫描方式以及扫描速度大小的设定，同时确定激光能量密度；
（4）、绘制所需的加工图案：启动扫描振镜，开启激光光闸，进行扫描加工图案并在锌合金样品表面形成微纳结构。
2.根据权利要求1所述的一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，其特征在于：还包括步骤（5），如下：
（5）、表面形貌观察：利用扫描电镜对飞秒激光加工锌合金样品表面的微纳结构形貌进行观察。
3.根据权利要求2所述的一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，其特征在于：还包括步骤（6），如下：
（6）、体外细胞毒性测试：将细胞直接接种到锌合金样品表面上，通过Live/dead荧光染色法并使用激光共聚焦显微镜观察细胞形态特征来判断表面微纳结构所引发细胞毒性的大小，以此评估其诱导细胞粘附增殖能力以及细胞活性。
4.根据权利要求1所述的一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，其特征在于：飞秒激光加工环境介质是空气、氮气或氩气。
5.根据权利要求1至4任一所述的一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，其特征在于：步骤（3）采用分步扫描加工分级复合微纳结构；首先在锌合金样品表面部分区域通过激光大能量密度扫描形成非周期性结构，其次通过激光小能量密度在锌合金样品整个表面扫描得到周期性结构；激光大能量密度为1.5~3J/cm2，激光小能量密度为0.3~0.8J/cm2，扫描速度为100~1000mm/s，离焦量为-5mm~5mm。
6.根据权利要求5所述的一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，其特征在于：激光大能量密度为2~2.5J/cm2，激光小能量密度为0.4~0.5J/cm2，扫描速度为100~200mm/s，离焦量为0mm。
7.根据权利要求6所述的一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，其特征在于：步骤（4）中加工图案为方形网格、六边形网格、菱形网格、圆环形网格或者正弦波浪结构。
8.根据权利要求7所述的一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，其特征在于：加工图案为方形网格时，网格宽度为50~200μm，高度为30~50μm，且相邻方形网格间的沟槽宽度为50~200μm。
9.根据权利要求8所述的一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，其特征在于：步骤（4）中，对加工后的锌合金样品表面在丙酮溶液中利用超声波清洗20分钟并烘干。
10.根据权利要求3所述的一种可降解锌合金激光3D打印器件的表面微纳结构制备方法，其特征在于：步骤（6）中，体外细胞毒性测试在37℃环境下，将小鼠颅骨的MC3T3-E1成骨细胞在阿尔法改良伊格尔培养基中进行培养，将细胞直接接种到锌合金样品表面上，分别培养1天和5天后观察细胞生长情况。
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