CN117551748A - 一种用于荧光定量pcr检测的引物、应用及检测方法 - Google Patents

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CN117551748A CN202311865274.2A CN202311865274A CN117551748A CN 117551748 A CN117551748 A CN 117551748A CN 202311865274 A CN202311865274 A CN 202311865274A CN 117551748 A CN117551748 A CN 117551748A
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周仲春
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沈焕明
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Abstract

本发明公开了一种用于荧光定量PCR检测的引物、应用及检测方法，所述引物的序列包括从5’到3’方向依次连接的荧光探针特异性识别序列、环部序列、连接序列和靶基因特异性识别序列。本发明提供的引物具有特殊的发夹结构设计，利用DNA聚合酶进行PCR扩增，产生的荧光信号与扩增循环数呈指数密切相关，可用于待测靶标的扩增曲线分析。通过调整其中连接序列的设定能产生多个不同的Tm值，通过熔解曲线分析实现单通道多个靶基因的检测，避免了常规Tag引物无法实现扩增曲线分析及在熔解曲线分析中存在引物与荧光探针竞争结合模板的问题，显著提升荧光探针结合模板的效率，增强荧光信号强度，提升单管检测的靶标数。

Description

一种用于荧光定量PCR检测的引物、应用及检测方法
技术领域
本发明涉及PCR检测技术领域，具体地，涉及一种用于荧光定量PCR检测的引物、应用及检测方法。
背景技术
多重探针熔解曲线分析法(multiplex PCR probe melting curve analysis)通过PCR技术结合荧光探针的熔解曲线分析技术，实现一个反应中同时检测多个靶标。常用的探针包括采用双标记和自淬灭的TaqMan探针或分子信标探针。检测原理为：当探针游离于溶液中处于无规则卷曲状态时，或分子信标由于茎部碱基的互补配对形成茎环结构时，探针上标记的荧光基团与淬灭基团相对靠近，荧光信号较弱；而当反应体系中存在靶标序列时，探针与靶标序列互补配对，形成伸展状态，荧光基团和淬灭基团相对远离，发射出较强的荧光信号。当扩增完成，产物量达到最高峰，荧光信号也最强，此时再对扩增产物进行升温检测，则杂交在产物上的探针与靶标序列逐渐解离，形成无规则卷曲状态，荧光信号逐渐减弱，绘制温度与荧光信号的变化曲线图，即可进行熔解曲线分析。
目前，多重探针熔解曲线分析法主要是基于Taq DNA聚合酶来实现的，主要策略是通过在其中一条扩增引物5’端添加一段外源序列(Tag)，通过不对称聚合酶链式反应(As-PCR)产生大量含有与Tag序列互补的扩增子序列，外源的荧光探针序列与Tag序列的互补序列(cTag)结合，扩增之后进行熔解曲线分析产生一个熔解温度(Tm)，通过设定不同的Tag序列(改变探针与靶标序列的匹配程度)，即可产生多个不同的Tm值，实现多重检测。该方法虽然能有效地实现多重熔解曲线分析，但是存在Tag引物与荧光探针竞争结合cTag的情况，从而大大减弱了熔解曲线分析的荧光信号强度，不利于多重检测分析中多重熔解曲线连峰的形成。因此，该方法扩增效率不高且特异性较低，不利于大群体样本的多靶标检测。
发明内容
为了解决现有技术中缺少用于多重探针熔解曲线分析法的高效、简便且特异性强的引物、探针和检测体系问题，本发明提供了一种用于荧光定量PCR检测的引物、应用及检测方法。
本发明的第一个目的是提供一种用于荧光定量PCR检测的引物。
本发明的第二个目的是提供所述引物在单重和/或多重荧光定量PCR检测中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种用于多重荧光定量PCR检测的引物探针组合物。
本发明的第四个目的是提供所述引物探针组合物的在多重荧光定量PCR检测中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种用于多重荧光定量PCR检测的组合物。
本发明的第六个目的是提供一种同步检测多个靶基因的多重荧光定量PCR检测方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明提供了一种适用于多重探针熔解曲线分析的新型发夹引物，该发夹引物包含了一段靶基因特异性识别序列(F)和一段茎环结构序列，茎环结构序列包含了茎部分(stem)区域和一段短的Loop序列，该stem区域包含了荧光探针特异性识别序列(与荧光探针反向互补配对的序列，即Top Strand)和连接序列(Bottom Strand)，Loop序列的3’端插入一个延伸阻滞基团。
当未进行PCR扩增反应时，发夹结构引物连接序列与荧光探针特异性识别序列紧密结合，荧光探针无法与其特异性识别序列结合形成双链，因此处于单链卷曲状态，荧光基团与淬灭基团靠近，无荧光信号产生。
当进行PCR扩增时，发夹引物(F)通过靶基因特异性识别序列结合靶DNA模板，启动延伸；经过一轮扩增之后，反向引物(R)以发夹引物(F)启动延伸的产物为模板进行扩增，当延伸至发夹结构5’端时，Taq DNA聚合酶的5’→3’外切酶启动切割活性，使其继续延伸至延伸阻滞基团处停止延伸；第三轮扩增时，发夹引物(F)以反向引物(R)的扩增产物为模板进行扩增，此时由于模板含有发夹引物的连接序列的反向互补序列，使得发夹引物(F)的连接序列随同靶基因特异性识别序列优先与模板结合，游离出荧光探针特异性识别序列；之后，荧光探针与游离出的荧光探针特异性识别序列结合形成双链，此时荧光探针的荧光基团与淬灭基团远离发出荧光。
通过实时监测荧光信号产生扩增曲线，扩增之后直接进行熔解曲线分析。通过设定不同的连接序列(改变荧光探针与连接序列的匹配程度)，即可产生多个不同的Tm值，实现多重检测。
一种用于荧光定量PCR检测的引物，所述引物即为发夹引物，其序列包括从5’到3’方向依次连接的15bp～45bp的荧光探针特异性识别序列、3bp～30bp的环部序列、15bp～45bp的连接序列和15bp～30bp的靶基因特异性识别序列；
所述荧光探针特异性识别序列(即Top Strand)包含与荧光探针靶向结合的序列，所述荧光探针用于与所述引物联用进行荧光定量PCR检测；
所述环部序列(即Loop)为无关序列，其3’末端设有延伸阻滞基团，所述无关序列与荧光定量PCR检测所用的荧光探针序列和待测靶基因的序列均无关；
所述连接序列(Bottom Strand)包含与所述荧光探针特异性识别序列反向互补配对的序列；
所述靶基因特异性识别序列包含靶向结合待测靶基因的序列，即按照常规的引物设计方法针对待测靶基因的序列设计得到的荧光定量PCR引物的序列，用于靶向结合靶标序列。
优选地，所述荧光探针特异性识别序列的长度为20bp～30bp。
更优选地，所述荧光探针特异性识别序列的长度与所述荧光探针的序列长度相同。
进一步优选地，所述荧光探针特异性识别序列的长度为27bp或30bp。
优选地，所述环部序列的长度为4bp～10bp。
更优选地，所述环部序列的长度为5bp。
进一步优选地，所述环部序列的碱基全部相同，即为AAAAA、TTTTT、CCCCC或GGGGG。
更进一步优选地，所述环部序列为AAAAA。
优选地，所述连接序列的长度为20bp～30bp。
更优选地，所述连接序列的长度与所述荧光探针特异性识别序列的长度相同。
进一步优选地，所述连接序列的长度为27bp或30bp。
优选地，所述靶基因特异性识别序列的长度为18bp～22bp。
本发明对所述延伸阻滞基团的种类没有特殊限定，包括但不限于C3 Spacer、C6Spacer、dSpacer、Inverted dA等具有延伸阻滞作用的延伸阻滞基团均能实现本发明的目的。因延伸阻滞基团的修饰性能和适配碱基的需求，适应性调整或优化被修饰碱基的种类，也能实现本发明的目的。
优选地，所述环部序列的3’末端设有的延伸阻滞基团为C3 Spacer。
具体地，检测TP53基因的所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；检测SOX4基因的所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；检测EGFR基因的所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；检测KRAS基因的所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；检测PDGFRA基因的所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；检测KIT基因的所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；检测BRAF基因的所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；检测PIK3CA基因的所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
任一所述引物在单重和/或多重荧光定量PCR检测中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种用于多重荧光定量PCR检测的引物组，所述引物组包含检测不同待测靶基因的若干个引物对，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物为Tm值不同的任一所述的引物，所述Tm值由调节所述荧光定量PCR检测所用的荧光探针的序列与所述荧光探针特异性识别序列的匹配程度得到，所述Tm值的大小与所述匹配程度成正比，即荧光定量PCR检测所用的荧光探针的序列与荧光探针特异性识别序列的匹配程度越高，则Tm值越大；反之则Tm值越小；所述反向引物由常规方法得到。
优选地，所述Tm值由调节所述连接序列得到，不同的连接序列得到不同的荧光探针特异性识别序列，进而改变所述荧光定量PCR检测所用的荧光探针的序列与所述荧光探针特异性识别序列的匹配程度。
具体地，检测TP53基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；检测SOX4基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；检测EGFR基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；检测KRAS基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；检测PDGFRA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.15所示；检测KIT基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；检测BRAF基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；检测PIK3CA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
任一所述引物组在多重荧光定量PCR检测中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种用于多重荧光定量PCR检测的引物探针组合物，包含检测不同待测靶基因的引物对和一个通用荧光探针；其中，各引物对中的正向引物或反向引物为所述引物，各引物对含有的所述引物的Tm值不同，所述Tm值不同的引物通过调节所述引物中的荧光探针特异性识别序列与所述通用荧光探针的匹配程度得到，所述Tm值的大小与所述匹配程度成正比；
所述引物的序列包括从5’到3’方向依次连接的15bp～45bp的荧光探针特异性识别序列、3bp～30bp的环部序列、15bp～45bp的连接序列和15bp～30bp的靶基因特异性识别序列；所述荧光探针特异性识别序列包含与荧光探针靶向结合的序列；所述环部序列为无关序列，其3’末端设有延伸阻滞基团；所述连接序列包含与所述荧光探针特异性识别序列反向互补配对的序列；所述靶基因特异性识别序列包含与待测靶基因靶向结合的序列。
优选地，所述荧光探针特异性识别序列的长度为20bp～30bp。
更优选地，所述荧光探针特异性识别序列的长度与所述荧光探针的序列长度相同。
进一步优选地，所述荧光探针特异性识别序列的长度为27bp或30bp。
优选地，所述环部序列的长度为4bp～10bp。
更优选地，所述环部序列的长度为5bp。
进一步优选地，所述环部序列的碱基全部相同，即为AAAAA、TTTTT、CCCCC或GGGGG。
更进一步优选地，所述环部序列为AAAAA。
优选地，所述连接序列的长度为20bp～30bp。
更优选地，所述连接序列的长度与所述荧光探针特异性识别序列的长度相同。
进一步优选地，所述连接序列的长度为27bp或30bp。
优选地，所述靶基因特异性识别序列的长度为18bp～22bp。
本发明对所述延伸阻滞基团的种类没有特殊限定，包括但不限于C3 Spacer、C6Spacer、dSpacer、Inverted dA等具有延伸阻滞作用的延伸阻滞基团均能实现本发明的目的。因延伸阻滞基团的修饰性能和适配碱基的需求，适应性调整或优化被修饰碱基的种类，也能实现本发明的目的。
优选地，所述环部序列的3’末端设有的延伸阻滞基团为C3 Spacer。
优选地，所述引物组包含若干个不同待测靶基因的引物对，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物为所述Tm值不同的引物。所述反向引物由常规方法得到。
更优选地，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.22所示。
进一步优选地，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，则所述正向引物中，所述荧光探针特异性识别序列包含核苷酸序列如SEQ ID NO.23～26任一所示的序列。
进一步优选地，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，则所述正向引物中，所述荧光探针特异性识别序列包含核苷酸序列如SEQ ID NO.27～30任一所示的序列。
优选地，所述荧光探针包括TaqMan探针和/或分子信标探针。
更优选地，所述荧光探针为TaqMan探针。
具体地，检测TP53基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；检测SOX4基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；检测EGFR基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；检测KRAS基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；4个基因共用1个TaqMan探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
具体地，检测PDGFRA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；检测KIT基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；检测BRAF基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；检测PIK3CA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；4个基因共用1个TaqMan探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
任一所述引物探针组合物在多重荧光定量PCR检测中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种用于多重荧光定量PCR检测的组合物，包含DNA聚合酶和任一所述的引物探针组合物。
本发明对所述DNA聚合酶的种类没有特殊限定，包括但不限于Taq DNA酶、链置换酶等具有5’-3’核酸外切或链置换活性的DNA聚合酶均能实现本发明的目的。
优选地，所述DNA聚合酶为Taq DNA酶。
所述组合物在多重荧光定量PCR检测中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种同步检测多个靶基因的多重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：以待测样本的核酸为模板，使用所述的组合物进行PCR扩增，所述PCR扩增的程序包括扩增和熔解两个阶段，根据所得熔解曲线进行分析。
优选地，所述PCR扩增的反应体系为：PCR反应Mix，9μL～11μL；10μM～20μM所述组合物中的引物，各0.5μL～1μL；10μM～20μM所述组合物中的荧光探针，0.5μL～1μL；模板，10ng～100ng；ddH2O补足至20μL；所述PCR反应Mix包含DNA聚合酶。
更优选地，所述PCR扩增的反应体系为：PCR反应Mix，10μL；10μM所述引物组合物中的引物，各0.8μL；10μM所述组合物中的荧光探针，0.8μL；模板，20ng；ddH2O补足至20μL。
优选地，所述PCR反应程序为：93℃～96℃，4min～6min；93℃～96℃，10s～20s，58℃～62℃，0.8min～1.2min，40个～50个循环，采集荧光；44℃～46℃，4min～6min；44℃→92℃，0.01℃/s～0.05℃/s，熔解曲线分析。
更优选地，所述PCR反应程序为：95℃，5min；95℃，15s，60℃，1min，45个循环，采集荧光；45℃，5min；45℃→90℃，0.03℃/s，熔解曲线分析。
进一步优选地，所述熔解曲线分析的方式为Continuous。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的发夹引物具有特殊的结构设计，减轻了非特异性扩增和引物二聚体的形成，通过调整其中连接序列的设定即能产生多个不同的Tm值，利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，其产生的荧光信号和扩增循环数呈指数密切相关，可用于待测靶标的扩增曲线和多重熔解曲线分析。本发明避免了常规Tag引物无法实现扩增曲线分析以及在熔解曲线分析中存在引物与荧光探针竞争结合模板的问题，显著提升荧光探针结合模板的效率，增强荧光信号强度，提升单管检测的靶标数。
附图说明
图1为折叠形态的发夹引物的结构示意图。
图2为发夹引物的检测原理示意图。
图3为实施例2的单重荧光定量PCR检测的结果图；A～D依次为EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因的扩增曲线图；E～H依次为EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因的熔解曲线峰图。
图4为实施例2的多重荧光定量PCR检测的结果图；A为EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因的四重扩增曲线图；B为EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因的四重熔解曲线峰图。
图5为对比例1的单重荧光定量PCR检测的结果图；A～D依次为EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因的扩增曲线图；E～H依次为EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因的熔解曲线峰图。
图6为对比例1的多重荧光定量PCR检测的结果图；A为EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因的四重扩增曲线图；B为EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因的四重熔解曲线峰图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1发夹引物的结构组成及检测原理
本发明基于现有的Tag引物，提供一种适用于单重或多重荧光定量PCR检测的发夹引物，能结合荧光探针(如：TaqMan探针)实现一个反应体系检测多个靶标的多重探针熔解曲线分析法。
1、发夹引物的结构组成
本发明提供的发夹引物，设有从5’到3’方向依次连接的荧光探针特异性识别序列(Top Strand)、环部序列(Loop)、连接序列(Bottom Strand)和靶基因特异性识别序列，其中连接序列(Bottom Strand)和靶基因特异性识别序列能构成常规的Tag引物。
荧光探针特异性识别序列靶向结合荧光定量PCR检测所用的荧光探针，并与荧光探针的序列长度相同，与荧光定量PCR检测所用的荧光探针互补配对。
环部序列为长度为5bp的无关序列，与荧光探针和靶基因均无关，3’末端设有延伸阻滞基团。
连接序列的长度与荧光探针特异性识别序列的长度相同，与荧光探针特异性识别序列互补配对形成双链。另外，能通过设定不同的连接序列，得到不同的荧光探针特异性识别序列，从而改变荧光探针与荧光探针特异性识别序列的匹配程度，形成不同的错配碱基，即能产生多个不同的Tm值，从而实现多重检测。荧光探针与荧光探针特异性识别序列的匹配程度越高，则Tm值越大；反之则Tm值越小。
靶基因特异性识别序列的长度为18bp～22bp，即按照常规的引物设计方法针对待测靶基因的序列设计得到的荧光定量PCR引物的序列，用于靶向结合靶标序列。
环部序列位于荧光探针特异性识别序列和连接序列之间，荧光探针特异性识别序列与连接序列互补配对，在碱基互补配对作用下使得线性的发夹引物链折叠形成如图1所示的发夹结构。
2、发夹引物的检测原理
以本发明提供的发夹引物作为正向引物(F)，与常规设计的反向引物(R)和TaqMan探针进行荧光定量PCR扩增的检测原理如图2所示，具体如下：
(1)第一轮扩增
折叠形态的发夹引物(即发夹结构)以靶标序列所在的游离DNA单链(即模板链)为模板，靶基因特异性识别序列靶向结合目标序列，启动延伸，完成扩增，得到产物链1，产物链1的5’端携带有发夹引物；
(2)第二轮扩增
反向引物(R)以产物链1为模板，靶向结合后启动延伸，当延伸至产物链1中的发夹引物的5’端时，Taq DNA聚合酶发挥5’→3’外切酶活性，切割荧光探针特异性识别序列形成游离的单个碱基，并继续延伸，直至发夹引物的阻滞修饰碱基处，停止延伸，完成扩增，得到产物链2；
(3)第三轮扩增
由于产物链2含有发夹引物的连接序列的反向互补序列和靶基因特异性识别序列的反向互补序列，使得连接序列和靶基因特异性识别序列与产物链2之间的结合力相比与荧光探针特异性识别序列之间的结合力更大，因此发夹引物的发夹结构被打开，整体由折叠形态转为线性形态，游离出荧光探针特异性识别序列。
线性形态的发夹引物以产物链2为模板，靶向结合后启动延伸；同时，卷曲状态的单链TaqMan探针识别并靶向结合线性形态的发夹引物中游离的荧光探针特异性识别序列，互补配对形成伸展状态的双链荧光探针，发出荧光信号。
(4)扩增结果分析
通过PCR过程中实时监测荧光信号的产生，获得扩增曲线；通过PCR之后进行升温和荧光监测获得熔解曲线。通过设定发夹引物不同的连接序列，能调节荧光探针和荧光探针特异性结合序列之间的Tm值，即能产生多个错峰的熔解曲线，从而实现多重检测。
实施例2发夹引物在单重和多重荧光定量PCR检测中的应用
1、引物及探针的设计与合成
根据实施例1提供的发夹引物，分别针对TP53基因(NCBI号：7157)、SOX4基因(NCBI号：6659)、EGFR基因(NCBI号：1956)和KRAS基因(NCBI号：3845)，设计并合成用于荧光定量PCR扩增检测各基因的发夹引物，作为正向引物(F)，具体序列信息如表1所示，其中TP53基因的荧光探针特异性识别序列为5’-CCAGTGAGTCCACCGACAGCTGTCTCG-3’(SEQ ID NO.23)，SOX4基因的荧光探针特异性识别序列为5’-AGTCACAGTCCACCGACAGCTGTCTCC-3’(SEQ IDNO.24)，EGFR基因的荧光探针特异性识别序列为5’-AGTCACAGTCCACCGACAGCTTAGAAT-3’(SEQ ID NO.25)，KRAS基因的荧光探针特异性识别序列我5’-AGTCTGAGTCCACCGACAGCTGTCTCG-3’(SEQ ID NO.26)。
针对上述4个基因，按照常规方法设计并合成得到各基因的反向引物(R)和通用TaqMan探针(P)，具体序列信息如表1所示。
表1发夹引物、反向引物及TaqMan探针的序列信息
注：上述发夹引物的序列中，“_”表示荧光探针特异性识别序列，表示环部序列，/>表示连接序列，/>表示靶基因特异性识别序列，“/iInvd/”表示延伸阻滞基团C3Spacer。
2、模板的制备
以健康人的血液样本提取的基因组DNA作为模板。
3、单重荧光定量PCR检测
(1)实验方法
使用模板和表1中的检测引物及探针，分别针对4个基因进行单重荧光定量PCR检测和溶解曲线分析，所用反应体系如表2所示，所用反应程序如表3所示。
表2发夹引物的单重荧光定量PCR的反应体系
表3发夹引物的单重荧光定量PCR的反应程序
(2)实验结果
使用本发明的发夹引物，对EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因进行单重荧光定量PCR，所得扩增曲线如图3中的A～D所示，可见每一个基因都有其对应的扩增曲线，可以清晰判读其Ct值，依次为28.66、28.4、29.11和26.1。
使用本发明的发夹引物，对EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因进行单重荧光定量PCR之后，再进行熔解曲线分析，所得熔解曲线峰如图3中的E～H所示，可见其Tm值依次为58.13℃、66.5℃、70.66℃和73.72℃，说明依据发夹引物的荧光探针特异性识别序列和探针之间的匹配程度，不同基因产生了大小不同的Tm值，能明显区分4种基因的熔解曲线峰。
以上结果表明，本发明提供的发夹引物能用于单重荧光定量PCR定量检测，同时也能用于基于熔解曲线分析的定性检测，结果容易判读。
4、多重荧光定量PCR检测
(1)实验方法
使用模板和表1中的检测引物及探针，针对4个基因在一个反应管中进行单通道多重荧光定量PCR检测，所用反应体系如表4所示，所用反应程序如表3所示。
表4发夹引物的多重荧光定量PCR的反应体系
(2)实验结果
使用本发明的发夹引物，对EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因进行多重荧光定量PCR，所得扩增曲线结果如图4中的A所示，可见4个基因的采集到的信号都集中在一个扩增曲线上，无法实现单个基因的定量分析或定性判别。
使用本发明的发夹引物，对EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因进行多重荧光定量PCR之后进行熔解曲线分析，所得熔解曲线峰如图4中的B所示，可见产生四个明显的连峰，各峰相对应各基因的Tm值依次为55.27℃(EGFR)、64.94℃(SOX4)、70.33℃(KRAS)和75.16℃(TP53)，与单重荧光定量PCR的熔解曲线分析所得的各基因Tm值的趋势一致，大小基本相同，相邻峰的Tm值偏差为4.83℃～9.67℃。
以上结果表明，本发明提供的发夹引物能用于单通道多重荧光定量PCR与多重熔解曲线分析的联用，实现不同基因的定性检测，结果容易判读。
对比例1 Tag引物在单重和多重荧光定量PCR检测中的应用
1、引物及探针的设计与合成
分别针对TP53基因(NCBI号：7157)、SOX4基因(NCBI号：6659)、EGFR基因(NCBI号：1956)和KRAS基因(NCBI号：3845)，按照常规方法，设计并合成用于荧光定量PCR扩增检测各基因的Tag引物(作为正向引物(F))、反向引物(R)和通用TaqMan探针(P)具体序列信息如表5所示。
表5 Tag引物、反向引物及TaqMan探针的序列信息
注：上述Tag引物的序列中，“_”表示Tag序列，表示靶基因特异性识别序列。
2、模板的制备
与实施例2相同。
3、单重荧光定量PCR检测
(1)实验方法
使用模板和表5中的检测引物及探针，分别针对4个基因进行单重荧光定量PCR检测，所用反应体系如表6所示，所用反应程序如表3所示。
表6 Tag引物的单重荧光定量PCR的反应体系
(2)实验结果
使用Tag引物，对EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因进行单重荧光定量PCR，所得扩增曲线如图5中的A～D所示，可见每一个基因对应的扩增曲线荧光信号较低或者无法产生扩增曲线，并且Ct值均大于36，结果不易判读。
使用Tag引物，对EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因进行单重荧光定量PCR之后，再进行熔解曲线分析，所得熔解曲线峰如图5中的E～H所示，可见EGFR基因不能产生明显的熔解峰和对应的Tm值，而SOX4基因、KRAS基因和TP53基因虽然能产生明显的熔解峰和Tm值，Tm值依次为58.72℃、67.56℃和75.92℃，相邻峰的Tm值偏差为8.36℃～8.84℃，但是熔解峰较低，结果不易判读。
以上结果表明，Tag引物在单重荧光定量PCR中产生的信号较弱，不适用于定量检测和熔解曲线分析，导致部分基因无法产生预期的熔解曲线峰和Tm值。
4、多重荧光定量PCR检测
(1)实验方法
使用模板和表5中的检测引物及探针，针对4个基因进行多重荧光定量PCR检测，所用反应体系如表7所示，所用反应程序如表3所示。
表7 Tag引物的多重荧光定量PCR的反应体系
(2)实验结果
使用Tag引物，对EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因进行多重荧光定量PCR，所得扩增曲线如图6中的A所示，可见4个基因的采集到的信号都集中在一个扩增曲线上，无法实现单个基因的定量分析或定性判别。
使用Tag引物，对EGFR基因、SOX4基因、KRAS基因和TP53基因进行多重荧光定量PCR之后进行熔解曲线分析，所得熔解曲线峰如图6中的B所示，可见KRAS基因未产生熔解曲线峰，只能产生EGFR基因、SOX4基因和TP53基因的熔解曲线连峰，Tm值分别为58.27℃、67.56℃和75.92℃。
以上结果表明，Tag引物在多重荧光定量PCR中容易因与探针竞争结合扩增模板，而导致产生的信号较弱，多重熔解曲线分析中无法产生全部待测基因对应的熔解曲线连峰，不能实现不同基因的定性检测。
实施例3发夹引物在单重和多重荧光定量PCR检测中的应用
1、引物及探针的设计与合成
根据实施例1提供的发夹引物，分别针对PDGFRA基因(NCBI号：5156)、KIT基因(NCBI号：3815)、BRAF基因(NCBI号：673)和PIK3CA基因(NCBI号：5290)，设计并合成用于荧光定量PCR扩增检测各基因的发夹引物，作为正向引物(F)，还按照常规方法设计并合成得到各基因的反向引物(R)和通用TaqMan探针(P)，具体序列信息如表8所示。
其中PDGFRA基因的荧光探针特异性识别序列为5’-CGACGTCGAGTCAGGCAGGCACGGTCACGG-3’(SEQ ID NO.27)，KIT基因的荧光探针特异性识别序列为5’-CGACGTCGAGTCAGGCAGGCACGGTCTGCC-3’(SEQ ID NO.28)，BRAF基因的荧光探针特异性识别序列为5’-GCTCGTCGAGTCAGGCAGGCACGGTCTGCC-3’(SEQ ID NO.29)，PIK3CA基因的荧光探针特异性识别序列5’-GCTGGTCGAGTCAGGCAGGCACGGTGTGCC-3’(SEQ ID NO.30)。
表8发夹引物、反向引物及TaqMan探针的序列信息
注：上述发夹引物的序列中，“_”表示荧光探针特异性识别序列，表示环部序列，/>表示连接序列，/>表示靶基因特异性识别序列，“/iInvd/”表示延伸阻滞基团C3Spacer。
2、模板的制备
与实施例2相同。
3、单重荧光定量PCR检测
(1)实验方法
使用模板和表8中的检测引物及探针，分别针对4个基因进行单重荧光定量PCR检测，所用反应体系如表2所示，所用反应程序如表3所示。
(2)实验结果
使用本发明的发夹引物，对PDGFRA基因、KIT基因、BRAF基因和PIK3CA基因进行单重荧光定量PCR，每一个基因都有其对应的扩增曲线，可以清晰判读其Ct值；之后再进行熔解曲线分析，不同基因产生了大小不同的Tm值，能明显区分4种基因的熔解曲线峰。表明本发明提供的发夹引物用于单重荧光定量PCR定量检测，同时也能用于基于熔解曲线分析的定性检测，结果容易判读。
4、多重荧光定量PCR检测
(1)实验方法
使用模板和表8中的检测引物及探针，分别针对4个基因进行单重荧光定量PCR检测，所用反应体系如表4所示，所用反应程序如表3所示。
(2)实验结果
使用本发明的发夹引物，对PDGFRA基因、KIT基因、BRAF基因和PIK3CA基因进行多重荧光定量PCR，所得扩增曲线可见4个基因的采集到的信号都集中在一个扩增曲线上，无法实现单个基因的定量分析或定性判别；之后进行熔解曲线分析，所得熔解曲线峰产生四个明显的连峰，与单重荧光定量PCR的熔解曲线分析所得的各基因Tm值的趋势一致，大小基本相同。表明，本发明提供的发夹引物能用于单通道多重荧光定量PCR与多重熔解曲线分析的联用，实现不同基因的定性检测，结果容易判读。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于荧光定量PCR检测的引物，其特征在于，所述引物的序列包括从5’到3’方向依次连接的15bp～45bp的荧光探针特异性识别序列、3bp～30bp的环部序列、15bp～45bp的连接序列和15bp～30bp的靶基因特异性识别序列；
所述荧光探针特异性识别序列包含与荧光探针靶向结合的序列；
所述环部序列为无关序列，其3’末端设有延伸阻滞基团；
所述连接序列包含与所述荧光探针特异性识别序列反向互补配对的序列；
所述靶基因特异性识别序列包含与待测靶基因靶向结合的序列。
2.权利要求1所述引物在单重和/或多重荧光定量PCR检测中的应用。
3.一种用于多重荧光定量PCR检测的引物探针组合物，其特征在于，包含检测不同待测靶基因的引物对和一个通用荧光探针；
其中，各引物对中的正向引物或反向引物为权利要求1所述引物，各引物对含有的权利要求1所述引物的Tm值不同，所述Tm值不同的引物通过调节所述引物中的荧光探针特异性识别序列与所述通用荧光探针的匹配程度得到，所述Tm值的大小与所述匹配程度成正比。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其特征在于，所述各引物对的正向引物为所述Tm值不同的权利要求1所述引物。
5.根据权利要求4所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.22所示。
6.根据权利要求5所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，则所述正向引物中，所述荧光探针特异性识别序列包含核苷酸序列如SEQ ID NO.23～26任一所示的序列。
7.根据权利要求5所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，则所述正向引物中，所述荧光探针特异性识别序列包含核苷酸序列如SEQ ID NO.27～30任一所示的序列。
8.权利要求3～7任一所述引物探针组合物的在多重荧光定量PCR检测中的应用。
9.一种用于多重荧光定量PCR检测的组合物，其特征在于，包含DNA聚合酶和权利要求3～7任一所述的引物探针组合物。
10.一种同步检测多个靶基因的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样本的核酸为模板，使用权利要求9所述的组合物进行PCR扩增，所述PCR扩增的程序包括扩增和熔解两个阶段，根据所得熔解曲线进行分析。
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