CN117551680A - 提高酿酒酵母对木糖的利用效率的方法及其应用 - Google Patents
提高酿酒酵母对木糖的利用效率的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117551680A CN117551680A CN202210929340.7A CN202210929340A CN117551680A CN 117551680 A CN117551680 A CN 117551680A CN 202210929340 A CN202210929340 A CN 202210929340A CN 117551680 A CN117551680 A CN 117551680A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- saccharomyces cerevisiae
- xylose
- cst6
- gene
- transcription factor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 title claims abstract description 124
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 76
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 title claims abstract description 76
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 62
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 70
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 35
- 101150023402 CST6 gene Proteins 0.000 claims description 30
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 28
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 28
- 101150022676 CSTB gene Proteins 0.000 claims description 24
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 21
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 102100026891 Cystatin-B Human genes 0.000 claims description 9
- 101000912191 Homo sapiens Cystatin-B Proteins 0.000 claims description 9
- 101000884770 Homo sapiens Cystatin-M Proteins 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 8
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims description 7
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 12
- AUTALUGDOGWPQH-UBLOVXTBSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;(2r,3s,4r)-2,3,4,5-tetrahydroxypentanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O AUTALUGDOGWPQH-UBLOVXTBSA-N 0.000 abstract description 10
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000004127 xylose metabolism Effects 0.000 description 6
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 description 1
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
- C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/85—Saccharomyces
- C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，公开了一种提高酿酒酵母对木糖的利用效率的方法及其应用。本发明提供的方法能够提高重组酿酒酵母在葡萄糖木糖共发酵过程中对木糖的利用效率，同时，还具有提高乙醇的积累量的优势，提高原料利用率的同时，使得产品得率也得以提高，有效降低生产成本，提高生产效率，十分适合工业化大规模应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种提高酿酒酵母对木糖的利用效率的方法及其应用。
背景技术
随着社会和经济的发展，对可持续清洁能源的开发利用逐渐成为能源领域的热点。乙醇等以生物质为原料生产的生物能源燃料是近年来推广最为广泛的清洁能源之一。其具有原料可再生、生产过程污染较小等特征，并且由于原料生成过程固碳，燃烧过程放碳，因而形成碳循环，从而相比于使用化石能源而言，整体碳排放量大幅降低。
目前，用于生产燃料和化工品的主要生物质原料包括两类，一类是玉米等低价粮食作物，另一类是农林业废弃物等木质纤维素原料。由于玉米等低价粮食作物用于燃料乙醇等产品生产会产生与人、畜争粮，而且产品价格与粮食作物价格关联密切，随着粮食价格的走高，生产成本也逐渐上升。而相比之下，采用农林业废弃物等木质纤维素原料进行生物乙醇燃料生产既可以充分利用资源，还能促进就业，优化产业结构，从而受到了广泛关注。
采用木质纤维素原料进行乙醇生产时，主要以其水解液作为底物，采用酿酒酵母等高效发酵菌株进行发酵生产。然而，通常酿酒酵母不能代谢木糖，而通过代谢途径工程，在酿酒酵母中引入木糖代谢途径后，虽然赋予了重组酵母利用木糖的能力，但是，木糖利用效率远低于葡萄糖利用效率，并且发酵底物中葡萄糖等其他糖类的存在对木糖利用有明显负面影响，因此提高重组菌株在葡萄糖木糖混合发酵中利用木糖的效率成为了本领域迫切需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种提高酿酒酵母对木糖的利用效率的方法及其应用。该方法能提高重组酿酒酵母在葡萄糖木糖共发酵过程中对木糖的利用效率，同时，还具有提高乙醇的积累量的优势。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种提高酿酒酵母对木糖的利用效率的方法，所述方法包括破坏酿酒酵母中转录因子Cst6的活性。
本发明第二方面提供对木糖利用效率提高的酿酒酵母，所述酿酒酵母选自具有木糖代谢途径且转录因子Cst6的活性受到破坏的酿酒酵母。
本发明第三方面提供如上第一方面所述的方法和/或如上第二方面所述的酿酒酵母在乙醇生产中的应用。
本发明第四方面提供一种生产乙醇的方法，所述方法包括采用破坏转录因子Cst6活性的酿酒酵母对含木糖的底物进行发酵，其中，所述酿酒酵母选自具有木糖代谢途径的酿酒酵母。
通过上述技术方案，本发明能够取得如下有益效果：
(1)利用本发明提供的方法，能够有效提高重组酿酒酵母在葡萄糖木糖共发酵时木糖的利用效率；
(2)利用本发明提供的方法，还能够增加葡萄糖木糖共发酵时乙醇的积累，提高产量和生产效率；
(3)利用本发明提供的方法，通过提高木糖利用效率和乙醇积累，能够提高原料利用率和产品得率，从而降低生产成本。
实验证实，敲除CST6基因的重组菌株BSGX001(cst6Δ)和原木糖利用重组菌株BSGX001相比，在葡萄糖木糖共发酵中的木糖比利用速率(rxylose)提高了17.0％，发酵48小时乙醇积累量提高了10.5％。
附图说明
图1是用于基因敲除的DNA片段dCST6-KanMX的结构示意图。
图2是敲除CST6基因对菌株以不同碳源进行乙醇发酵的影响对比图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明中，转录因子Cst6是指一种亮氨酸拉链结构的转录因子，属于ATF/CREB家族，其编码基因(CST6基因)在GenBank中的登录号为Gene ID:854775。
本发明中，破坏转录因子Cst6的活性是指通过敲除或突变CST6基因，或者，通过干扰CST6基因的表达，使得该转录因子无法正常表达，或表达的出的转录因子活性下降或丧失(“下降或丧失”是指转录因子Cst6的活性降至原活性的20％或以下，例如降至原活性的20％、18％、15％、12％、10％、5％、2％、1％、0.5％、0.1％、0，或者上述任意两个数值的任意中间值)。未作特殊说明的情况下，本发明中，对转录因子Cst6的活性进行“破坏”与“抑制”的含义等同，可以互换使用。
本发明的发明人在研究中发现，当在酿酒酵母中引入木糖代谢途径后，虽然使得重组酿酒酵母能够利用木糖，提高了采用如木质纤维素原料水解液等含木糖的底物进行乙醇发酵的生产效率和产量，但是，底物中的其他糖(如葡萄糖、甘露糖、半乳糖等)的存在对于木糖的代谢具有负面影响，而且即使这些糖类代谢耗尽，这种负面影响仍无法消除，因此，若想要进一步提高重组酵母对含木糖底物的利用效率，提高对木糖的利用率十分必要。经过研究，本发明的发明人巧妙地发现，在引入了木糖代谢途径的重组酵母(例如重组酵母BSGX001，其保藏编号为CGMCC No.17264，已在CN201910304995.3中公开)中，若通过一定的手段对其转录因子Cst6的活性进行抑制，则能够有效提高该重组酵母对同时含有木糖和葡萄糖等其他糖类的底物中的木糖的利用效率。经过进一步研究，发明人还发现，采用这种进一步抑制转录因子Cst6活性的重组酵母，以含木糖的底物进行乙醇发酵生产时，相比于未抑制转录因子Cst6活性的重组酵母而言，其乙醇积累也有所提高。
基于上述发现，本发明一方面提供一种提高酿酒酵母对木糖的利用效率的方法，所述方法包括破坏酿酒酵母中转录因子Cst6的活性，其中，所述酿酒酵母选自具有木糖代谢途径的酿酒酵母。
本发明中，对于破坏酿酒酵母中转录因子Cst6的活性的方式没有特别限制，只要能够使其活性下降或丧失即可。根据本发明的优选实施方式，其中，破坏酿酒酵母中转录因子Cst6的活性的方式包括：敲除CST6基因、突变CST6基因使其表达的蛋白失去活性或干扰CST6基因的表达，使其无法表达出转录因子Cst6或表达出的转录因子Cst6的活性下降或丧失。本发明中，干扰CST6基因的表达的方式可以包括在发酵过程中加入干扰CST6基因表达的物质，或者对酿酒酵母进行进一步改造，引入干扰CST6基因表达的其他外源基因等。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，破坏酿酒酵母中转录因子Cst6的活性的方式为敲除CST6基因。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述酿酒酵母选自保藏编号为CGMCCNo.17264的酿酒酵母。
本发明第二方面提供对木糖利用效率提高的酿酒酵母，所述酿酒酵母选自具有木糖代谢途径且转录因子Cst6的活性受到破坏的酿酒酵母。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述酿酒酵母选自保藏编号为CGMCCNo.17264的酿酒酵母。
本发明中，对于提供的酿酒酵母破坏转录因子Cst6的活性的方式没有特别限制，任意本领域现有能够实现该目的的方法均可适用于本发明。例如可以包括敲除CST6基因、突变CST6基因使其表达的蛋白失去活性、引入其他外源基因从而干扰CST6基因的表达等。
本发明第三方面提供如上第一方面所述的方法和/或如上第二方面所述的酿酒酵母在乙醇生产中的应用。例如，采用如上所述的方法对酿酒酵母进行改造，而后采用改造后的酿酒酵母进行乙醇发酵生产。或者采用具有木糖代谢途径的酿酒酵母进行乙醇发酵生产时，通过加入干扰CST6基因表达的物质，从而提高乙醇发酵生产过程中酿酒酵母对木糖的利用效率。又或者采用具有如上特征的酿酒酵母利用含木糖的底物进行乙醇发酵生产等。
本发明第四方面提供一种生产乙醇的方法，所述方法包括采用破坏转录因子Cst6活性的酿酒酵母对含木糖的底物进行发酵，其中，所述酿酒酵母选自具有木糖代谢途径的酿酒酵母。
本发明中，对于所述底物的来源和具体成分没有特别限制，只要酿酒酵母能够利用其进行乙醇发酵即可。根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述底物包括木质纤维素原料水解液。
当采用木质纤维素原料水解液作为发酵底物时，该水解液中含有的葡萄糖、甘露糖、半乳糖等糖类也可被酿酒酵母(通过其存在的天然利用途径)利用并转化为乙醇，但是这些糖的存在对木糖的利用存在负面影响，从而影响了整体的乙醇生产效率和产量，而破坏转录因子Cst6活性后，酿酒酵母对于木糖的利用效率提高，同时，对于其他酿酒酵母可利用的糖类的利用效率没有不利影响。因此，优选地，所述底物中还可以含有葡萄糖、甘露糖和半乳糖中的至少一种作为碳源。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述底物中葡萄糖和木糖的重量比为1：0.5-5。
优选地，葡萄糖和木糖的重量比为1:0.5-1.5。例如，可以为1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5，或者也可以为上述任意两个比值之间的任意中间值。
根据本发明的优选实施方式，其中，采用敲除CST6基因、突变CST6基因使其表达的蛋白失去活性或干扰CST6基因的表达的方式破坏所述酿酒酵母中转录因子Cst6的活性。优选为敲除CST6基因。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述酿酒酵母选自保藏编号为CGMCCNo.17264的酿酒酵母。
本发明中，对于具体的发酵方式和条件没有特别限制。为了进一步提高乙醇生产效率，根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述发酵的条件包括初始OD600＝0.5-5，转速100-300rpm，温度25-35℃。优选发酵时间为24-72h。
优选地，所述发酵的条件包括初始OD600＝0.5-2，转速150-250rpm，温度27-32℃。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中，出发菌株BSGX001(简称BSGX001)是一株引入并优化木糖代谢途径的重组酿酒酵母，其保藏编号为CGMCC No.17264，具体构建方法参见CN201910304995.3。未作特殊说明的情况下，采用的试剂或材料均为购自正规生物或化学试剂/材料供应商的商购产品，试剂均为分析纯。
以下实施例中采用的培养基如下：
YPD培养基：按照2重量％蛋白胨，1重量％酵母粉，2重量％葡萄糖的用量比例称取原料并溶于去离子水中。115℃高压灭菌30min后冷却即得YPD液体培养基。在灭菌前加入2％重量％琼脂粉，灭菌后待冷却至不烫手(约50℃)倒平板，冷却凝固即得YPD培养平板。
葡萄糖-木糖共糖发酵培养基(以葡萄糖和木糖为碳源)：按照酵母基础氮源(YNB)1.7g/L，(NH4)2SO4 5g/L，CSM-URA 0.77g/L的用量比例称取原料并溶于去离子水中，配制溶液1。同时准备40重量％葡萄糖溶液和40重量％木糖溶液。分别115℃高压灭菌30min，冷却后，按照终浓度为葡萄糖20g/L，木糖20g/L的浓度，将上述糖溶液加入到溶液1中，即得葡萄糖-木糖共糖发酵液体培养基。
以下实施例中，采用遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法对出发菌株BSGX001进行改造，从而通过敲除CST6基因的方式破坏其转录因子Cst6的活性。具体方法可以参考Methods in yeast genetics and genomics:a Cold Spring HarborLaboratory course manual 2015edition(Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold SpringHarbor Laboratory Press,2005)。
实施例1PCR获得用于基因敲除的DNA片段
以质粒pUG6(GenBank:AF298793.1)为模板，dCST6s和dCST6a为引物(具体序列详见表1)，采用以下表1中的体系和条件扩增带有CST6同源重组臂的KanMX表达框DNA片段dCST6-KanMX。
dCST6-KanMX的结构示意图如图1所示，其中，CST6上游同源臂和CST6下游同源臂分别和染色体上CST6基因开放阅读框上游和下游序列同源；KanMX表达框指两端带有同向loxP序列的能够表达蛋白使菌株具有G418抗性特征的一整段DNA序列。包括启动子TEFpromorter，开放阅读框KanR，以及终止子TEF terminator。
表1
实施例2获得敲除CST6基因的重组菌株
用实施例1获得的片段dCST6-KanMX转化菌株BSGX001，在含有200μg/mL G418的YPD培养平板筛选得到转化子。经提取转化子染色体并进行PCR验证的方式对筛选到的转化子进行验证(采用的引物及PCR体系和条件详见表1)，其中，PCR产物长度为2157bp的是没有正确敲除的转化子，PCR产物长度为1688bp的是正确的CST6被敲除的转化子BSGX001(cst6Δ)。转化子BSGX001(cst6Δ)染色体上的CST6基因座位的DNA序列被表达框序列替换了，从而使得该转化子无法表达Cst6转录因子。
实施例3突变体菌株的葡萄糖木糖共发酵效果测试
将出发菌株BSGX001和重组菌株BSGX001(cst6Δ)分别在葡萄糖木糖共发酵，比较出发菌株和重组菌株对木糖的利用速率以及乙醇的积累量。
操作过程如下：分别将出发菌株和重组菌株接种到含20g/L葡萄糖的SC-URA培养基，30℃培养14±2h，转接菌株到装有50mL SC-URA培养基的300mL三角瓶中，碳源为20g/L葡萄糖，初始OD600为1.0，200rpm，30℃培养12h。培养结束后，5500rpm离心3分钟，用无菌水洗1-2次，重新悬浮在50mL葡萄糖-木糖共糖发酵培养基中，初始OD600＝2.5，在30℃下，200rpm发酵培养48h。
对发酵培养过程中的出发菌株BSGX001和重组菌株BSGX001(cst6Δ)的菌体量(以OD600值作为评判指标)、发酵体系中葡萄糖、木糖和乙醇的浓度进行监测。其中，葡萄糖、木糖、乙醇的浓度的HPLC分析使用Bio-Rad公司LC-20A系统，层析柱使用HPX-87H(Bio-Rad)，用Bio-Rad公司的RID-10A示差检测器检测。流动相为5mmol/L H2SO4，流速0.6mL/min，柱温箱温度保持45℃。利用如下公式，计算木糖利用速率(rxylose)。
其中r是从取样点m到采样点n阶段的比利用率；A、B和t分别是采样点n、i和m的木糖浓度、生物量浓度(即，菌体干重，通过对对应OD600值的发酵液进行离心，收集菌体烘干后称重测定)和时间。
结果详见图2，其中，—□—代表菌株BSGX001在发酵过程中各时间点的细胞量，用OD600表示；—■—代表菌株BSGX001(cst6Δ)在发酵过程中各时间点的细胞量，用OD600表示；—△—代表菌株BSGX001在发酵过程中各时间点的葡萄糖浓度；—▲—代表菌株BSGX001(cst6Δ)在发酵过程中各时间点的葡萄糖浓度；——代表菌株BSGX001在发酵过程中各时间点的木糖浓度；—/>—代表菌株BSGX001(cst6Δ)在发酵过程中各时间点的木糖浓度；—○—代表菌株BSGX001在发酵过程中各时间点的乙醇浓度；—●—代表菌株BSGX001(cst6Δ)在发酵过程中各时间点的乙醇浓度。
从图2中可以看出，敲除CST6基因的重组菌株BSGX001(cst6Δ)在葡萄糖木糖共发酵中，菌株生长和出发菌株BSGX001相当，但木糖的利用效率，以及乙醇的生产速率均显著高于出发菌株。其中，BSGX001(cst6Δ)比出发菌株的木糖利用速率(rxylose)提高了17.0％，从0.088±0.004g/L/h/g干重细胞，提高到0.103±0.001g/L/h/g干重细胞；BSGX001(cst6Δ)发酵48小时的乙醇积累量相比出发菌株提高了10.5％，从13.3±0.4g/L提高到14.7±0.5g/L。以上结果表明，敲除CST6基因使得转录因子Cst6活性丧失的方式能够显著提高酿酒酵母BSGX001的木糖利用能力。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种提高酿酒酵母对木糖的利用效率的方法，其特征在于，所述方法包括破坏酿酒酵母中转录因子Cst6的活性，其中，所述酿酒酵母选自具有木糖代谢途径的酿酒酵母。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，破坏酿酒酵母中转录因子Cst6的活性的方式包括：敲除CST6基因、突变CST6基因使其表达的蛋白失去活性或干扰CST6基因的表达，优选为敲除CST6基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述酿酒酵母选自保藏编号为CGMCCNo.17264的酿酒酵母。
4.对木糖利用效率提高的酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母选自具有木糖代谢途径且转录因子Cst6的活性受到破坏的酿酒酵母。
5.根据权利要求4所述的酿酒酵母，其中，所述酿酒酵母选自保藏编号为CGMCCNo.17264的酿酒酵母。
6.权利要求1-3中任意一项所述的方法，和/或，权利要求4或5所述的酿酒酵母在乙醇生产中的应用。
7.一种生产乙醇的方法，其特征在于，所述方法包括采用破坏转录因子Cst6活性的酿酒酵母对含木糖的底物进行发酵，其中，所述酿酒酵母选自具有木糖代谢途径的酿酒酵母。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述底物包括木质纤维素原料水解液；
优选地，所述底物中还含有葡萄糖、甘露糖和半乳糖中的至少一种作为碳源；
更优选地，所述底物中葡萄糖和木糖的重量比为1：0.5-5；
和/或，所述酿酒酵母选自保藏编号为CGMCC No.17264的酿酒酵母。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，采用敲除CST6基因、突变CST6基因使其表达的蛋白失去活性或干扰CST6基因的表达的方式破坏所述酿酒酵母中转录因子Cst6的活性。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述发酵的条件包括初始OD600＝0.5-5，转速100-300rpm，温度25-35℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210929340.7A CN117551680A (zh) | 2022-08-03 | 2022-08-03 | 提高酿酒酵母对木糖的利用效率的方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210929340.7A CN117551680A (zh) | 2022-08-03 | 2022-08-03 | 提高酿酒酵母对木糖的利用效率的方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117551680A true CN117551680A (zh) | 2024-02-13 |
Family
ID=89809708
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210929340.7A Pending CN117551680A (zh) | 2022-08-03 | 2022-08-03 | 提高酿酒酵母对木糖的利用效率的方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117551680A (zh) |
-
2022
- 2022-08-03 CN CN202210929340.7A patent/CN117551680A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wisselink et al. | Novel evolutionary engineering approach for accelerated utilization of glucose, xylose, and arabinose mixtures by engineered Saccharomyces cerevisiae strains | |
| Chen | Development and application of co-culture for ethanol production by co-fermentation of glucose and xylose: a systematic review | |
| Hu et al. | Thermotolerant Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces cerevisiae strains representing potentials for bioethanol production from Jerusalem artichoke by consolidated bioprocessing | |
| EP2686433B1 (en) | Methods for improving ethanol yield by acetic acid addition | |
| Flores et al. | Simultaneous saccharification and fermentation of Agave tequilana fructans by Kluyveromyces marxianus yeasts for bioethanol and tequila production | |
| Dandi et al. | Bioprospecting of thermo-and osmo-tolerant fungi from mango pulp–peel compost for bioethanol production | |
| Seo et al. | Rewiring metabolism of Clostridium thermocellum for consolidated bioprocessing of lignocellulosic biomass poplar to produce short-chain esters | |
| US11535872B2 (en) | Microbial strains and uses thereof | |
| Li et al. | Fermentation process and metabolic flux of ethanol production from the detoxified hydrolyzate of cassava residue | |
| CN102220382B (zh) | 采用重组酿酒酵母工程菌株发酵生产乙醇的方法 | |
| CN108823113A (zh) | 高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法 | |
| CN104024419A (zh) | 使用了重组酵母的乙醇的制造方法 | |
| JP6228323B2 (ja) | 高効率エタノール発酵菌 | |
| Ge et al. | Metabolic pathway analysis of the xylose-metabolizing yeast protoplast fusant ZLYRHZ7 | |
| CN117551680A (zh) | 提高酿酒酵母对木糖的利用效率的方法及其应用 | |
| CN111235048B (zh) | 一株木糖利用酵母及其用途 | |
| CN106554924B (zh) | 生产乙醇的重组酿酒酵母菌株、其构建方法以及利用该菌株生产乙醇的方法 | |
| CN108841736A (zh) | 一种具有多重耐受性的乙醇浓醪发酵高产菌株及其应用 | |
| CN117625423A (zh) | 对木糖的利用效率提高的酿酒酵母及其应用和生产乙醇的方法 | |
| CN112011472A (zh) | 一株具有xr-xdh途径的可快速发酵木糖的酿酒酵母菌株及构建方法 | |
| Zou et al. | Scale‐up batch fermentation of bioethanol production from the dry powder of Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) tubers by recombinant Saccharomyces cerevisiae | |
| Hebbale et al. | Prioritizing Wild Yeast Strains for Macroalgal Bioethanol Production | |
| Amin et al. | Comparative study of D-xylose conversion to ethanol by immobilized growing or non-growing cells of the yeast Pachysolen tannophilus | |
| US11441117B2 (en) | Fermentation efficiency using yeast containing prions | |
| JP6240344B2 (ja) | 高効率エタノール発酵菌 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |