CN117551576A - 一种降解石油污染的短芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一种降解石油污染的短芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117551576A CN117551576A CN202311517451.8A CN202311517451A CN117551576A CN 117551576 A CN117551576 A CN 117551576A CN 202311517451 A CN202311517451 A CN 202311517451A CN 117551576 A CN117551576 A CN 117551576A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- petroleum
- brevibacillus
- hcsy
- strain
- brevis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 title claims abstract description 21
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 241000458359 Brevibacillus sp. Species 0.000 claims abstract description 19
- 241000555281 Brevibacillus Species 0.000 claims abstract description 17
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 28
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 18
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 claims description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 5
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 5
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 14
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000033962 Fontaine progeroid syndrome Diseases 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 2
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000186312 Brevibacterium sp. Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000032798 delamination Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003673 groundwater Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 125000005575 polycyclic aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005067 remediation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000003390 teratogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
- B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
- C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
- C02F3/343—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used for digestion of grease, fat, oil
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
- C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
- C02F3/344—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used for digestion of mineral oil
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F2101/00—Nature of the contaminant
- C02F2101/30—Organic compounds
- C02F2101/32—Hydrocarbons, e.g. oil
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Abstract
本发明涉及一种降解石油污染的短芽孢杆菌及其应用。本发明提供的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY‑05，保藏编号为CGMCC NO.26265。本发明提供的菌株短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY‑05具有降解石油的效果。可将本发明的菌株应用于石油污染的治理中，菌体在降解石油后，其菌体本身可通过自然降解而去除，不仅可用于处理被石油污染的环境，还不会对环境产生二次污染。
Description
技术领域
本发明涉及一株由石油污染土壤中筛选出来的具有降解石油效果的菌株，该菌株对污染土壤的石油具有降解的作用。
本发明所称的短芽孢杆菌，命名为：短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05，已于2022年12月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNO.26265。
背景技术
随着石油工业的发展，受石油污染土地的面积不断扩大。加之长期以来生产技术及生态观念等方面的落后，石油采集及后续加工使用过程造成的污染问题十分严重。
石油的主要组分有烷烃、苯、甲苯、二甲苯等多种复杂芳香烃。其中多环芳烃类具有强烈的致癌致畸作用。石油混入土壤后阻碍根系的呼吸和对水分的吸收，而且会随着径流进入周围的流域和地下水，给油田周围的环境带来严重的生态问题。
土壤的石油污染修复可按手段性质不同，分为物理方法、化学方法和生物方法。物理和化学方法具有见效快的优点，但修复费用昂贵、生态效应不佳且具有次生污染的风险。而生物修复则可以将石油组分转化为无害的无机化合物(水和二氧化碳)，具有费用低、效率高、生态友好的优点，被视为一项具有广阔前景的高新技术。
现有关于土壤石油生物修复的研究多为外源添加氮、磷等复合营养物质刺激土壤中原生菌群的活性，实现污染土壤的生物修复，但由于土著微生物的数量有限、生长缓慢，导致修复效率低下。因此，分离环境适应强、降解效能高的菌种或菌群，外源添加到石油污染土壤中有望成为提高石油污染土壤生物修复效率的有效手段。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供一种具有降解石油污染能力的短芽孢杆菌(Brevibacillussp.)HCSY-05，已于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.26265。
本发明的另一目的是提供利用保藏编号为CGMCC NO.26265的短芽孢杆菌(Brevibacillussp.)HCSY-05降解石油污染。方法如下：
1)菌株的培养：将保藏编号为CGMCC NO.26265的短芽孢杆菌(Brevibacillussp.)HCSY-05置于培养基中培养；
2)将培养后的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05按体积百分比5-20％加入到含有石油的溶液中或被石油污染的土壤中。
进一步的，所述培养基是：NaCl 0.75g，磷酸氢钾0.9g，磷酸二氢钾0.9g，硫酸铵0.9g，蒸馏水150mL，原油0.15g，pH为中性左右。
进一步的，将培养后的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05按体积百分比15％加入到含有石油的溶液中或被石油污染的土壤中。
进一步的，所述降解石油污染是降解石油中的脂肪烃。
本发明的有益效果是：
本发明提供的菌株短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05具有降解石油的效果。可将本发明的菌株应用于石油污染的治理中，菌体在降解石油后，其菌体本身可通过自然降解而去除，不仅可用于处理被石油污染的环境，还不会对环境产生二次污染。
附图说明
短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，保藏单位地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。保藏日期为2022年12月26日，保藏编号为CGMCC NO.26265。
图1是PCR扩增产物电泳图谱。
图2是菌株的进化树图。
图3是原油色谱图。
图4是短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05降解底物色谱图。
图5是短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05最佳投加量降解率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
实施例1短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05的获得与鉴定(一)短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05的筛选
在辽宁省鞍山市某原炼油厂附近采集不同土层的石油污染土壤样品，称取土样20g，放入盛有100mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，以32℃、转速150r/min的速度在恒温摇床中培养24h，震荡后静置。等待界面出现明显的固液分离后，将上清液转到准备好的石油无机盐培养基中进行微生物的活化培养，在条件设置为32℃、转速150r/min的恒温摇床中培养7d，重复操作3次。
取第3次驯化得到的菌液中的优势菌群，用梯度稀释法进行104、105、106、107倍梯度浓度稀释后，将其依次涂布于石油无机盐培养基中进行富集，在32℃恒温培养箱中培养2d，能在石油无机盐培养基上长出来的则是具有降解石油的优势菌种。
石油无机盐培养基组成：NaCl0.75g，磷酸氢钾0.9g，磷酸二氢钾0.9g，硫酸铵0.9g，蒸馏水150mL，原油0.15g，pH为中性左右。
采用平板划线法进行分离，将在石油无机盐培养基中富集的菌株，分别用接种环蘸取少量液体在平板培养基上依次划线，随后将平板放置在设定为32℃的恒温培养箱中倒置培养24h，能在石油平板上长出来的则是石油降解菌，共得到7株菌株，编号为1#～7#。
取各菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32℃、150r/min恒温摇床中培养24h，按体积百分比15％的接种量接种到100mL石油无机盐培养基中，32℃、150r/min恒温摇床中培养7d，设置空白对照。最终发现7株菌株降解效果有明显差异，其中肉眼观察接种菌株5#的培养基中石油呈絮状、不粘于瓶壁，一部分漂浮在培养基液体表面上，一部分存留培养基内使溶液悬浊，区别于接种其它菌株的培养基，其降解率达到89.63％，菌株5#命名为HCSY-05。
A.菌株5#的形态与特征：
菌落呈现乳白色、不透明、边缘整齐且光滑。显微镜下为链状结构，宽2微米，长3.5微米，为革兰氏阳性菌。
B.菌株5#的生理生化特性
菌株无排油效果，能使明胶液化产生明胶酶，会产生一种能够分解色氨酸的酶，无法产生淀粉酶，且在分解利用葡萄糖产生丙酮酸后不会进一步生成有机酸。
C.菌株5#的16SrDNA的测序
菌株5#的基因组总DNA提取：按常规方法，经菌株培养，菌体收集，菌体裂解，DNA提取，沉淀，洗涤，抽(晾)干7个步骤，最终得到基因组总DNA，取10μL用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
菌株鉴定通用引物如表1：
表1
PCR反应体系见表2：
表2
| 试剂 | 体积(μl) |
| Template(基因组DNA 20-50ng/μl) | 0.5 |
| 10×Buffer(with Mg2+) | 2.5 |
| dNTP(各2.5mM) | 1 |
| 酶 | 0.2 |
| F(10uM) | 0.5 |
| R(10uM) | 0.5 |
| 加双蒸H2O至 | 25 |
PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，共30个循环，72℃延伸1.5min，72℃终止10min。
PCR扩增产物取10μL用1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物电泳图谱如图1所示。由图1可见，PCR扩增产物的长度为3kb左右。
DNA测序由生工生物(上海)股份有限公司完成。测得的DNA序列如SEQ ID No.1所示。
D.菌株5#的系统进化树制作及分析
系统进化树如图2所示，分析如表3。从图2和表3可见，菌株5#与短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)的16S rDNA序列的同源性为99％。
表3
E.结论
参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》，对菌株5#进行16S rDNA测序，然后进行同源性比较，结果发现与短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)的16S rDNA序列的同源性为99％。因此结合生理生化指标可得，菌株5#归属于短芽孢杆菌(Brevibacillussp.)。
实施例2：短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05降解石油的效果(一)短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05的培养
培养基配方：NaCl0.75g，磷酸氢钾0.9g，磷酸二氢钾0.9g，硫酸铵0.9g，蒸馏水150mL，原油0.15g，pH为中性左右。
将100mL配好的培养基装入250mL的三角瓶中，121℃灭菌20min，常温冷却后，接种2环短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05于三角瓶中，然后放入恒温摇床中振荡培养，调整转数为150r/min，温度为32℃。
(二)短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05降解石油底物分析
石油无机盐培养基：NaCl 0.75g，磷酸氢钾0.9g，磷酸二氢钾0.9g，硫酸铵0.9g，蒸馏水150mL，原油0.15g，pH为中性左右，121℃灭菌20min。
在无菌条件下移取体积比为15％的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05，接种到100mL石油无机盐培养基的三角瓶中，分别将恒温摇床的温度设置为32℃，以空白石油无机盐培养基作对照，在150r/min的恒温摇床中培养7d。肉眼可见接种菌株的培养基中的石油呈絮状，一部分絮状石油漂浮在培养基液体表面，还有一部分留在培养基内部使溶液呈悬浊状态，与空白对照有明显差别。
降解后产物通过气质联用分析原油以及菌株的降解底物中的有机成分，仪器的运行参数具体如表4。
表4 GCMS分析方法与参数
| 名称 | 条件 |
| 色谱柱 | HP-5MS 30m*0.25mm*0.25um |
| 载气 | He |
| 模式 | 0.1微升进样量，分流比1:20 |
| 进样温度 | 280℃ |
| 升温程序 | 40℃，保持5min，10℃/min升温至250℃，5℃升温至280℃保持5min |
| 电子源 | EI |
| 全扫描方式 | 质量扫描30-550amu |
A.原油的组分GCMS分析
将实验所用原油通过GCMS实验分析，得出原油中的有机物的主要成分GCMS的色谱图如图3和表5所示。
表5原油中的主要成分
B.短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05降解石油底物分析
对加入短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05培养7d后的降解产物进行GCMS实验，降解底物色谱图如图4和表6所示：
表6短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05降解底物中主要的有机物
C.结论
在无菌条件下，接种体积比为15％的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05的石油无机盐培养基，以空白石油无机盐培养基作对照，在32℃、150r/min的恒温摇床中培养7d后，原油的降解率可达到89.63％。
经过GCMS分析，得出短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05将原油降解后的主要产物是脂肪烃，占比达到30％以上，其中主要的物质为三十二烷，峰号为表6中43和32号峰，具体占比为4.98％和4.35％，保留时间为23min，与原油中的主要成分相比，短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05的降解底物中的脂肪烃占比有所减少，芳香烃的占比增加，说明短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05在降解原油的过程中主要是降解脂肪烃。
(三)短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05降解石油效率分析
在无菌条件下分别移取体积比为5％、10％、15％、20％的短芽孢杆菌(Brevibacillussp.)HCSY-05菌悬液，接种到100mL石油无机盐培养基的锥形瓶中，分别将恒温摇床的温度设置为32℃，以空白石油无机盐培养基作对照，在150r/min的恒温摇床中培养7d。将摇床上培养了7d的石油无机盐培养基倒在分液漏斗中进行分层，将萃取液倒入到100ml的烧杯中，上层废弃液放入废液杯中，并取15mL的溶剂石油醚对装有无机盐培养基的锥形瓶润洗，并将润洗液倒入分液漏斗中，并进行充分的震荡，重复操作2次，并保持静置20min。待分层后取出其中的上层清液于容量瓶中，向分液漏斗中加入15mL石油醚溶液冲洗其内壁，最后将萃取液汇集到烧杯内。而后通过加入石油醚将上述4组萃取液分别定容至50mL容量瓶中，充分摇匀，再利用移液管从容量瓶中吸取1mL定容之后的溶液至35mL的容量瓶中，并加入石油醚定容，以达到稀释的目的。利用紫外分光光度计将石油醚作为空白参比，在确定好的最佳吸收波长341.0nm下对上述4组的吸光度值分别进行测定。结果如图5和表7所示。
表7
| 菌株接种量(体积百分比) | 降解率(％) |
| 5％ | 88.3％ |
| 10％ | 88.91％ |
| 15％ | 89.63％ |
| 20％ | 86.5％ |
。
Claims (6)
1.一种降解石油污染的短芽孢杆菌，其特征在于：所述降解石油污染的短芽孢杆菌，命名为：短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05，于2022年12月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.26265。
2.权利要求1所述的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05在降解石油污染中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，方法如下：
1)菌株的培养：将保藏编号为CGMCC NO.26265的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05置于培养基中培养；
2)将培养后的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)HCSY-05按体积百分比5-20％加入到含有石油的溶液中或被石油污染的土壤中。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养基是：NaCl 0.75g，磷酸氢钾0.9g，磷酸二氢钾0.9g，硫酸铵0.9g，蒸馏水150mL，原油0.15g，pH为中性。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将培养后的短芽孢杆菌(Brevibacillussp.)HCSY-05按体积百分比15％加入到含有石油的溶液中或被石油污染的土壤中。
6.根据权利要求2-5所述的应用，其特征在于，所述降解石油污染是降解石油中的脂肪烃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311517451.8A CN117551576A (zh) | 2023-11-15 | 2023-11-15 | 一种降解石油污染的短芽孢杆菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311517451.8A CN117551576A (zh) | 2023-11-15 | 2023-11-15 | 一种降解石油污染的短芽孢杆菌及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117551576A true CN117551576A (zh) | 2024-02-13 |
Family
ID=89817947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311517451.8A Pending CN117551576A (zh) | 2023-11-15 | 2023-11-15 | 一种降解石油污染的短芽孢杆菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117551576A (zh) |
-
2023
- 2023-11-15 CN CN202311517451.8A patent/CN117551576A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108949634B (zh) | 一种可降解重质原油的石油降解菌及其分离方法与应用 | |
| CN109055282B (zh) | 一株肺炎克雷伯氏菌新菌株及其分离方法和应用 | |
| CN105132323B (zh) | 一株耐盐芽孢杆菌及其在高盐废水处理中的应用 | |
| CN110724650B (zh) | 一种石油降解菌tdyn1t及其应用 | |
| CN103589659A (zh) | 一株球状红球菌wj4及其在邻苯二甲酸酯污染土壤修复中的应用 | |
| CN103484447A (zh) | 一种石油降解酶制剂的制备方法与应用 | |
| CN107523513B (zh) | 一种可快速降解17β-雌二醇的复合菌及其制备方法和应用 | |
| CN113046267B (zh) | 一种赤红球菌及其应用 | |
| CN108676763B (zh) | 一种高耐锑卡氏变形杆菌dshn0704及其分离筛选方法和应用 | |
| CN104845899A (zh) | 红球菌(Rhodococcus sp.)2G在降解邻苯二甲酸酯中的应用 | |
| CN104805035A (zh) | 一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯的红球菌(Rhodococcus sp.)2G | |
| CN105349481B (zh) | 一种红豆杉根际多环芳烃降解菌的筛选方法及应用 | |
| CN111440756A (zh) | 一种利用嗜热菌处理石油污水的方法 | |
| CN104805018B (zh) | 一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯的壤霉菌(Agromyces sp．)MT‑E | |
| CN106801025A (zh) | 一株油基泥浆钻井岩屑降解功能菌及其应用 | |
| CN117551576A (zh) | 一种降解石油污染的短芽孢杆菌及其应用 | |
| CN104046580A (zh) | 用于降解多环芳烃类有机污染物的鞘氨醇杆菌菌株及其应用 | |
| CN100439491C (zh) | 一株球形芽孢杆菌及其应用 | |
| CN112779189A (zh) | 一株土壤变形杆菌及其应用 | |
| Shi et al. | Effects of biochar immobilized microorganisms on the enzyme activity and remediation of petroleum hydrocarbon in contaminated soil | |
| CN110734878A (zh) | 一种耐高氨氮hn-ad的菌株分离方法 | |
| CN111154702A (zh) | 一种降解石油污染的阴沟肠杆菌及其应用 | |
| CN104845891B (zh) | 一种降解多种邻苯二甲酸酯的壤霉菌菌悬液及其应用 | |
| CN115029275B (zh) | 一种氯苯降解菌及其应用 | |
| CN114134079B (zh) | 一株四环素类抗生素降解菌、方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |