CN117545738A - 1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲酰基)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]吡咯烷-2-腈 - Google Patents

1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲酰基)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]吡咯烷-2-腈 Download PDF

Info

Publication number
CN117545738A
CN117545738A CN202180047448.7A CN202180047448A CN117545738A CN 117545738 A CN117545738 A CN 117545738A CN 202180047448 A CN202180047448 A CN 202180047448A CN 117545738 A CN117545738 A CN 117545738A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
formula
disease
pyrrolidine
carbonitrile
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180047448.7A
Other languages
English (en)
Inventor
T·塔拉戈克鲁亚
R·普拉德斯科萨诺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ankerui Treatment Co
Original Assignee
Ankerui Treatment Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ankerui Treatment Co filed Critical Ankerui Treatment Co
Publication of CN117545738A publication Critical patent/CN117545738A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/16—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及式(1)的具有药理活性的1‑[1‑(4‑苄氧基‑3,5‑二氟‑苯甲酰基)‑4‑氟‑吡咯烷‑2‑羰基]吡咯烷‑2‑腈衍生物，涉及此类化合物的制备的方法，涉及包含它们的药物组合物，以及涉及它们在治疗和/或预防认知障碍中的用途。

Description

1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲酰基)-4-氟-吡咯烷-2-羰 基]吡咯烷-2-腈
技术领域
本发明涉及具有药理活性的化合物，更具体而言涉及1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲酰基)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]吡咯烷-2-腈、其立体异构体及其盐，涉及此类化合物的制备方法，涉及包含它们的药物组合物，以及涉及它们在治疗和/或预防神经退行性疾病和/或认知障碍中的用途。
背景技术
脯氨酰寡肽酶(EC 3.4.21.26)(POP)，也称为脯氨酰内肽酶(PREP)，是催化L-脯氨酸残基的C端侧的肽的水解的丝氨酸蛋白酶。它广泛分布在哺乳动物中，并且可以从各种器官(包括大脑)中纯化。
该酶在与学习和记忆功能相关的含脯氨酸神经肽的分解中起重要作用(Wilk Set al.,Life Sci.1983；33:2149-57；O'Leary RM,O'Connor B,J.Neurochem.1995；65:953-63)。
脯氨酰寡肽酶抑制的作用已在治疗与神经退行性过程相关的认知缺陷中进行了测试。帕金森病在猴子中通过用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)处理产生，MPTP是产生物质P的消耗的神经毒素。随后用S-17092(强效的POP抑制剂)治疗，增加了认知任务的性能(Schneider JS et al.,Neuropsychopharmacology 2002；26(2):176-82)。还发现了POP抑制防止α-突触核蛋白离体的寡聚化(TT et al.,Br.J.Pharmacol.2012；166(3):1097-113)。在阿尔茨海默病(AD)的情况下，动物模型中的几项体内实验表明，POP抑制导致神经保护和认知增强作用(Kato A et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.1997；283(1):328-35and Toide K et al.,Rev.Neurosci.1998；9(1):17-29)。当皮质和小脑颗粒细胞通过用POP抑制剂ONO-1603治疗来阻止年龄诱导的细胞凋亡时，Katsube组最初观察到神经保护作用(Katsube N et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.1999；288(1):6-13)。
用POP抑制剂治疗认知缺陷的临床试验仅在少数病例中进行。在I期临床研究中，Morain组(Morain P et al.,Br.J.Clin.Pharmacol.2000；50(4):350-9)发现上述S-17092脯氨酰内肽酶抑制剂在健康老年受试者中具有认知增强特性，且具有明显的剂量依赖性；此外，未检测到不良反应。后来的研究表明，这种化合物具额外的轻微情绪稳定特性(Morain P et al.,Neuropsychobiology 2007；55(3-4):176-83)。
脯氨酰寡肽酶的活性已被报道，在几种神经退行性疾病中会发生改变(死后)，所述疾病包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病、亨廷顿病和多发性硬化症(MS)(Mantle D etal.,Clin.Chim.Acta 1996；249(1-2):129-39)。
也有大量的证据表明神经炎症在神经退行性疾病诸如AD、MS和帕金森病的发病机制中起作用(Hirsch EC et al.,Lancet Neurol.2009；8(4):382-97,Philips T et al.,Lancet Neurol.2011；10(3):253-63)。POP被认为是牵涉到从大脑中的Tβ4释放抗炎四肽Ac-SDKP的主要酶(Yang F et al.,Hypertension 2004；43(2):229-36,Nolte WM et al.,Biochemistry2009；48(50):11971-81)。这表明抑制POP可以帮助减少神经炎症，并且因此POP抑制剂可以有用于治疗具有炎症成分的神经退行性疾病，诸如阿尔茨海默病和帕金森病，特别是帮助改善与这些疾病相关的认知障碍。
遍布大脑皮质区的老年斑是典型的AD的神经病理学标志。这些斑块的主要蛋白质成分是淀粉样β肽(Aβ)。Aβ的沉积引发了大脑中的神经元功能紊乱和死亡。这种肽来自于β-淀粉样前体蛋白(APP)。在正常情况下，APP被α分泌酶裂解以生成可溶性的APPα，这阻止了Aβ生成。
有趣的是，POP抑制增加了细胞内的IP3水平，这可以有助于刺激APPα产生，这将转而减少Aβ生成。
此外，Rossner(Rossner S et al.,Neurochem.Res.2005；30(6-7):695-702)发现受Aβ斑块影响的AD患者的大脑结构中POP免疫反应神经元较少。
此外，似乎物质P可以抑制β-淀粉样蛋白的神经毒性作用(Kowall NW et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991；88(16):7247-51)。脯氨酰寡肽酶抑制剂抑制物质P的代谢，帮助维持物质P的水平，这可以抑制β-淀粉样蛋白的神经毒性作用。
鉴于上述作用，据认为脯氨酰寡肽酶抑制剂可以是对治疗阿尔茨海默病有用的药物，帮助防止脑损伤和改善与该疾病有关的认知障碍。
脯氨酰寡肽酶也与可能与多发性硬化症(MS)相关的几个因素有关。例如，POP参与小胶质细胞毒性的调节(Klegeris A et al.,Glia 2008；56(6):675-85)。事实上，POP和MS之间的直接联系已经确立；具有复发-缓解型MS(RR-MS)的患者的血浆POP活性显著降低(Tenorio-Laranga J et al.,J Neuroinflammation 2010；7:23)。有趣的是，降低与疾病症状的严重程度相关，但与患者年龄无关。相反，在健康对照组中观察到POP活性与年龄之间的负相关，并且在老年对照组中，水平与MS患者中发现的那些相当。
帕金森病的神经病理学标志是黑质致密部中黑色化的多巴胺能神经元与称为路易体的细胞内包涵体的进行性退化。路易体的主要成分是140个氨基酸的蛋白质，α-突触核蛋白。在某些条件下，α-突触核蛋白单体相互作用形成前纤维状聚集体或原纤丝，这可以产生细胞毒性不溶性原纤维。这些原纤维不能被蛋白酶体降解，并且它们损害了这种细胞内蛋白水解系统的功能。这导致α-突触核蛋白原纤丝(以及被蛋白酶体降解的其他蛋白质)在细胞质中的积累(Bennett MC,Pharmacol.Ther.2005；105(3):311-31)，并且因此，在帕金森病患者的大脑中α-突触核蛋白原纤丝增加。这些原纤维与α突触核蛋白过表达细胞和小鼠模型中的神经毒性有关(Masliah E et al.,Science 2000；287(5456):1265-9；GosaviN et al.,J.Biol.Chem.2002；277(50):48984-92)。错误折叠的α突触核蛋白的异常积累可以导致线粒体变化，这可以促进氧化应激并引起细胞死亡(Hsu LJ et al.,Am.J.Pathol.2000；157(2):401-10)。此外，已知α-突触核蛋白基因中的三点突变(A53T、A30P或E46K)参与帕金森病家族形式的发病机制(Polymeropoulos MH et al.,Science1997；276(5321):2045-7；Zarranz JJ et al.,Ann.Neurol.2004；55(2):164-73)。
在体外表明，当蛋白质与野生型猪POP的克隆孵育时，α-突触核蛋白的聚集速率增强，并且这种增强取决于POP浓度(Brandt I et al.,Peptides 2008；29(9):1472-8)。此外，没有POP活性的突变变体(S544A)没有加速聚集速率。
通过添加POP抑制剂也可以防止增强的聚集，这表明该作用取决于POP酶活性。实验数据表明POP抑制剂可以阻断人α-突触核蛋白过表达神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中由氧化应激诱导的α-突触核蛋白聚集增加(TT et al.,Br.J.Pharmacol.2012；166(3):1097-113)。POP与SH-SY5Y细胞中的α-突触核蛋白共定位，并且在与POP抑制剂孵育后这种共定位消失，表明POP与α-突触核蛋白之间的相互作用。用POP抑制剂进行5天的治疗减少了A30Pα-突触核蛋白转基因小鼠的大脑中可溶性α-突触核蛋白的量。在这方面，POP抑制剂已被报道通过调节自噬来增强α突触核蛋白清除(/>TT et al.,PharmacologicalResearch 2020；151:104558)。
因此，抑制脑POP活性可以防止α-突触核蛋白聚集，并且因此防止路易体中存在的细胞毒性原纤丝的形成。因此，POP抑制剂在治疗神经退行性疾病方面可能潜在的具有治疗价值，其中已经描述了加速的α-突触核蛋白聚集。
能够抑制POP的化合物对预防由东莨菪碱在大鼠中诱导的实验性认知障碍有效，推断POP抑制剂具有缓解助记功能障碍的功能(Yoshimoto T et al.,J.Pharmacobiodyn.1987；10:730-5)。
在大鼠Morris水迷宫中测试了迷迭香酸(一种非竞争性POP抑制剂(IC50值相对较高，为63.7μM)的亚慢性施用的效果，并报告了空间记忆中的增强(Park DH et al.,Fitoterapia2010；81(6):644-8)。
已经发现有躁郁症的患者在血清中具有高水平的POP的活性。近年来，POP作为治疗这种疾病的靶标越来越重要，特别是由于他参与了肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)的代谢。IP3是神经肽的级联信号转导中的关键分子。通过与特定受体结合，神经肽诱导IP3的增加，IP3与内质网的膜上的其受体结合并诱导Ca2+的释放，Ca2+被认为在学习和记忆中起着至关重要的作用。最近的研究结果表明POP调节IP3的浓度(Komatsu Y J.Neurosci.1996；16:6342-52)。因此，已知真核盘基网柄菌中POP的基因的破坏经由IP3的升高诱导对锂的抗性(Schulz I et al.,Eur.J.Biochem.2002；269:5813-20)，并且还降低了POP的蛋白水解活性，这是POP在胶质瘤细胞反义人中高浓度IP3的原因。当用特定的POP抑制剂处理这些细胞时也观察到这种作用(Williams RS et al.,EMBO J.1999；18:2734-45)。
IP3信号传导通路参与几种药物治疗情绪稳定剂(锂、卡马西平和丙戊酸)的作用，并且调节IP3信号传导的机制缺陷可造成躁郁症。此外，常用于治疗躁郁症的情绪稳定剂药物(丙戊酸)直接抑制重组POP的活性(Cheng L et al.,Mol.CeII.Neurosci.2005；29:155-61)。总之，有强有力的证据表明POP抑制剂有用于预防和/或治疗哺乳动物的双相情感障碍。因此，提供POP的新型抑制剂在这种病症或疾病的治疗中是有趣的。
总之，已经表征了几种POP抑制剂在各种认知任务中的作用，并且一致认为POP抑制剂对学习和记忆具有积极影响(Morain P et al.,CNS Drug.Rev.2002；8(1):31-52；Shinoda M et al.,Eur.J.Pharmacol.1996；305(1-3):31-8；Marighetto A et al.,Learn.Mem.2000；7(3):159-69；Toide K et al.,Pharmacol.Biochem.Behav.1997；56(3):427-34；Schneider JS et al.,Neuropsychopharmacology 2002；26(2):176-82)。
几个专利和专利申请公开了POP抑制剂：WO 2008/077978 A1，WO 2005/027934A1，JP2011-037874A2，WO 2005/002624 A1，WO 2004/060862 A2，WO 03/04468A1；DE 19603 510A1，US 2006/0100253 A1和US 6,159,938 A，但只有少数化合物经历了体内研究(JTP-4819、S-17092、Z-321、ONO-1603、Y-29794、ZTTA、Z-Pro-Prolinal和KYP-2047)。从这个列表中，列表中的前四个抑制剂已经进入临床试验，并且它们中没有一种进入市场。
WO 2014/072498 A1公开了POP抑制剂，该抑制剂对POP具有高亲和力，并且具有良好的穿越血脑屏障到达大脑的能力，其中当用于治疗认知障碍时，抑制剂的作用发生在大脑。这是该化合物成为用于认知障碍的治疗的良好候选者的重要特征。
在WO 2014/072498 A1中描述了其中公开的化合物的制剂可以适用于任何施用途径。然而，在所述申请中公开的唯一体内实例中，化合物是皮下施用的。
能够通过口服途径施用POP抑制剂将是一个优势，因为从患者的角度来看，这是最方便的。
因此，需要确定新的POP抑制剂，其特别适合口服施用并有效地到达大脑，当所述POP抑制剂用于认知障碍的治疗时，大脑是作用位点。血清素受体拮抗剂拮抗剂(5-HT1A受体)通常用作抗抑郁药。然而，它们引起显著的性功能障碍(Uphouse L,Pharmacol.Biochem.Behav.2014；0:31-42)，限制了其在成年人群中慢性治疗的用途。因此，对情绪障碍的认知有积极影响且没有此类不良事件的POP抑制剂将对患者的生活质量具有显著影响。
发明内容
本发明人现已成功发现1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲酰基)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]吡咯烷-2-腈、其立体异构体及其盐不仅能够高效抑制POP，而且表现出高胃肠道渗透能力，实现高脑暴露，使其在口服施用时特别有效，并且与5-HT1A受体几乎没有结合，避免了负面副作用诸如性功能障碍。
因此，本发明的一个方面涉及具有式(I)的1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲酰基)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]吡咯烷-2-腈：
(其中式中的星号表示手性中心的存在)、其立体异构体及其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面涉及制备上述限定的式(I)化合物、其立体异构体及其药学上可接受的盐的方法。
本发明的另一方面涉及包含至少一种上述限定的式(I)化合物、其立体异构体及其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体、佐剂或媒介物的药物或药物组合物。
本发明的另一方面涉及如上限定的式(I)的化合物、其立体异构体及其药学上可接受的盐，其作为药物使用，特别是用于预防和/或治疗认知障碍和/或神经退行性疾病诸如突触核蛋白病(由于突触核蛋白的积累的疾病，诸如帕金森病、REM睡眠行为障碍、路易体病或多系统萎缩)。特别地，认知障碍可以与选自精神分裂症、重度抑郁症、双相情感障碍、REM睡眠行为障碍、阿尔茨海默病、额颞痴呆、帕金森病、路易体病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底变性或肌萎缩侧索硬化症的疾病有关。
本发明的另一方面涉及用于治疗或预防哺乳动物中认知障碍的方法，其中将治疗量的如上限定的式(I)的化合物、其立体异构体及其药学上可接受的盐施用于需要所述治疗的患者。在具体实施方式中，障碍是与选自精神分裂症、重度抑郁症、双相情感障碍、REM睡眠行为障碍、阿尔茨海默病、额颞痴呆、帕金森病、路易体病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底变性或肌萎缩侧索硬化症的疾病相关的认知障碍。
本发明的另一方面涉及如上限定的式(I)化合物、其立体异构体及其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，特别是用于预防和/或治疗认知障碍，更具体而言与选自精神分裂症、重度抑郁症、双相情感障碍、REM睡眠行为障碍，阿尔茨海默病、额颞痴呆、帕金森病、路易体病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底变性或肌萎缩侧索硬化症的疾病相关的认知障碍。这些方面及其优选实施方式另外也在权利要求中限定。
附图说明
图1显示了实施例1、比较实施例3和比较实施例4的化合物的POP抑制测定的结果。
图2显示了实施例1、比较实施例3和比较实施例4的化合物的PAMPA测定的结果。
图3显示了实施例1和比较实施例3的化合物的Caco-2测定的结果。
图4显示了实施例1和比较实施例3的化合物的体内脑暴露测定的结果。
图5a和5b显示了实施例1和比较实施例3的化合物的NOR任务测定的结果。
图6显示了实施例1和比较实施例3的化合物与5-HT1A受体结合的结果。
图7显示了(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈的IR光谱。
图8显示了(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈的1H-NMR光谱。
图9显示了(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈的IR光谱。
图10显示了(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈的1H-NMR光谱。
具体实施方式
在本发明的上下文中，下列术语具有下面详述的含义。
术语“盐”必须理解为根据本发明使用的活性化合物的任何形式，其中所述化合物以离子形式或带电并与反离子(阳离子或阴离子)偶联或在溶液中。该定义还包括季铵盐和活性分子与其他分子和离子的络合物，特别是经由离子相互作用形成的络合物。该定义特别地包括生理上可接受的盐；该术语必须理解为等同于“药理学上可接受的盐”或“药学上可接受的盐”。
在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的盐”意味着在以适当的方式用于治疗、应用或使用(特别是在人类和/或哺乳动物中)时在生理上耐受的任何盐(通常意味着它不是有毒的，特别是由于反离子的结果)。这些生理上可接受的盐可以由阳离子或碱形成，并且在本发明的上下文中，被理解为由根据本发明使用的至少一种化合物——通常是酸(去质子化)——诸如阴离子形成的盐，特别是当用于人类和/或哺乳动物时。这些生理上可接受的盐也可以用阴离子或酸形成，并且在本发明的上下文中，被理解为是由根据本发明使用的至少一种化合物——通常质子化，例如在氮中——诸如阳离子和至少一个生理耐受的阴离子形成的盐，特别是当用于人类和/或哺乳动物时。该定义在本发明的上下文中具体包括由生理耐受的酸形成的盐，即具有生理耐受性有机或无机酸的特定活性化合物的盐——特别是当用于人类和/或哺乳动物时。这种类型的盐的实例是用下列形成的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、甲磺酸、甲酸、乙酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、扁桃酸、富马酸、乳酸或柠檬酸。
由上述式(I)表示的本发明的化合物可以包括由分子中存在三个手性中心产生的对映异构体。单一对映异构体和其中两种或多种的任意混合物均落入本发明的范围内。
除非另有说明，否则本发明的化合物还意指包括同位素标记形式，即仅在一个或多个同位素富集原子存在下不同的化合物。例如，具有本结构的但用氘或氚取代至少一个氢原子，或用富含13C或14C的碳取代至少一个碳，或用富含15N的氮取代至少一个氮的化合物都在本发明的范围内。
式(I)化合物或其盐优选地为药学上可接受的或基本纯的形式。药学上可接受的形式是指，具有药学上可接受的纯度水平，不包括正常的药物添加剂，诸如稀释剂和载体，并且不包括在正常剂量水平下被认为有毒的材料，等等。药物质的纯度水平优选地在50％以上，更优选地在70％以上，最优选地在90％以上。在优选实施方式中，式(I)化合物或其盐在95％以上。
如前所述，术语“药学上可接受的盐”指的是在施用给接受者时能够(直接或间接地)提供本文中描述的化合物的任何盐。然而，应当理解的是，非药学上可接受的盐也落入本发明的范围内，因为这些盐可以有用于制备药学上可接受的盐、溶剂化物和前药。盐的制备可以通过本领域已知的方法进行。
如本文中使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”包括根除、去除、恢复、减轻、改变或控制疾病或病况，诸如认知障碍。
如本文中使用的，术语“预防(prevention)”、“防止(preventing)”、“预防性(preventive)”、“预防(prevent)”和“预防(prophylaxis)”指的是式(I)的化合物在疾病或病况(诸如认知障碍)发作之前避免、最小化或使其难发作或发展的能力。
因此，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”和/或“防止(preventing)”或“预防(prevention)”作为一个整体，至少意味着抑制或改善与困扰受试者的病况相关的症状，其中抑制和改善在广义上用于涉及至少减少参数的大小，例如，与正在治疗的病况诸如认知障碍相关的症状。因此，本发明的方法还包括其中病况被完全抑制的情况，例如，阻止发生，或停止，例如终止，使得受试者不再经历该病况。因此，本方法包括防止和管理认知障碍。
术语“认知障碍”和“轻度认知损害”在本文中可互换使用，以指定特征在于与思维、学习或记忆相关的心理活动缺陷的任何病况。此类病症的实例包括失认症、健忘症、失语症、失用症、谵妄、痴呆和学习障碍。
认知障碍可以(而且经常是)与(即由......造成或在......存在下发生)其他特征在于神经元或参与神经元之间信号传输的其他结构的损害或丧失的病况相关。因此，认知障碍可以与神经退行性疾病相关，诸如阿尔茨海默病、皮质基底节变性、克雅氏病、额颞叶变性、亨廷顿病、多发性硬化症、常压脑积水、有机慢性脑综合征、帕金森病、皮克病、血管性痴呆、路易体病、多系统萎缩、进行性核上麻痹。
认知障碍也可以与其他损害中枢神经系统的正常功能的病况相关，包括精神疾病，诸如焦虑症、分离性障碍；情绪障碍，诸如双相情感障碍、精神分裂症；以及躯体形式和人为障碍。
这里描述的化合物可用于治疗失认症、失忆症、失语症、失用症、痴呆、学习障碍和其他认知障碍。
可以用本发明的方法治疗的痴呆的实例包括AIDS痴呆症综合征、宾斯旺格病、路易体痴呆、额颞叶痴呆、多梗阻痴呆、皮克病、语义性痴呆和血管性痴呆。
可以用本发明的方法治疗的学习障碍的实例包括阿斯伯格综合症、注意力缺陷障碍、注意力缺陷多动障碍、自闭症、儿童崩解症、唐氏综合症和雷特综合征。
可以用本发明的方法治疗的失语症的实例包括进行性非流利性失语症。
这里描述的化合物也可用于治疗具有精神活动缺陷的患者，这些缺陷是轻微的，或者在其他方面不会显著干扰日常生活。轻度认知损害是此类病况的实例：具有轻度认知损害的患者表现出痴呆的症状(例如，语言或记忆困难)，但这些症状的严重程度使得痴呆的诊断可能不合适。这里描述的化合物可用于治疗轻度认知损害和其他类似地不太严重的认知障碍形式。
因此，本发明的另一方面是用于治疗或预防哺乳动物中认知障碍的方法，其中将治疗量的本发明的化合物施用于需要所述治疗的患者。
在具体实施方式中，治疗或预防的方法是通过口服途径向需要所述治疗的患者施用治疗量的本发明化合物来进行的。
在具体实施方式中，本发明的化合物以包含在0.01和1.90mg/kg之间的日剂量口服施用，例如0.01、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.0、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75、1.80、1.85或1.90mg/kg。本发明的化合物可以以上述任何一种指示的每日口服剂量施用，每日一次、每日两次、每天三次、每天四次、每天五次或每天六次。
在本发明的具体实施方式中，这里描述的化合物可用于治疗具有与精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病或帕金森病相关的认知障碍的患者。
在本发明的具体实施方式中，化合物具有以下式(Ia)：
属于式(I)的本发明的具体单个化合物包括下面列出的化合物：
·(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(R)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(S)-1-((2R,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(R)-1-((2R,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(R)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(S)-1-((2R,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(R)-1-((2R,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
或其药学上可接受的盐。
上述限定的式(I)的化合物可以通过可用的合成程序获得，如下列一般方案所示：
在第一步中，将式(II)的酯溶解或悬浮在极性有机溶剂(优选地质子极性有机溶剂)诸如乙醇(EtOH)或甲醇或极性有机溶剂的混合物中。加入水性碱溶液，通过将混合物(通常在回流下)保持在包含室温和溶剂混合物的回流温度之间的温度下进行水解反应，直到水解完成，通常持续0.5至4小时的时期，优选地1-2小时。碱溶液优选地为无机性质的，诸如稀碱，例如NaOH。然后将反应混合物留至达到室温并优选地浓缩至反应体积的约五分之一。然后将反应混合物缓慢加入酸溶液中，诸如1M HCl溶液以实现中和，同时在冰浴中冷却。如果酸化导致沉淀，则过滤固体并用水洗涤，提供式(VII)的产物。如果没有获得沉淀，则用适当的有机溶剂诸如乙酸乙酯将所得溶液萃取数次，将有机相干燥并蒸发。式(VII)粗制品通过快速色谱法纯化。
式(III)的胺的去保护是在弱酸性条件下实现的，诸如在0℃至室温的低温下，在有机溶剂(诸二噁烷)中或与TFA/DCM混合物添加到氯化氢溶液中。将反应物在室温下搅拌1-3小时。然后将溶剂蒸发至干，以得到式(VI)的胺的盐酸盐或三氟乙酸盐，这取决于所使用的酸。
式(IX)的化合物由式(VII)的羧酸和式(VI)的胺在Schotten-Baumann条件下制备。因此，将氯化剂诸如草酰氯加入到式(VII)的羧酸在有机溶剂诸如甲苯中的溶液中。将反应在50℃至80℃之间的温度下搅拌1至2小时，以允许形成式(VIII)的羧酰氯。在溶剂蒸发之后，所得粗制品在有机溶剂诸如THF中溶解，并在低温诸如0℃下加入式(VI)的胺的含水碱性溶液中，通常是式(VI)的胺的NaOH水溶液。将反应混合物在低温下搅拌1至2小时，并且在室温下搅拌2至4小时。然后，蒸发溶剂，并通过加入HCl溶液将剩余的水馏分调节至酸性pH(3-4)，并用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，干燥，过滤并蒸发。必要时通过快速色谱法纯化粗制品。
然后将式(IX)的产物在碱(诸如N,N-二异丙基乙胺(DIEA))的存在下与式(IV)的吡咯烷-2-腈偶联，并由偶联试剂(诸如碳化二亚胺)辅助。特别地，将式(IX)的化合物溶解在非质子有机溶剂诸如二氯甲烷中，并与DIEA一起加入碳化二亚胺中，例如固体负载的碳化二亚胺诸如N-环己基碳化二亚胺、N'-甲基聚苯乙烯。5分钟之后，加入式(IV)的吡咯烷-2-腈和额外的DIEA。将反应物在室温下搅拌8至16小时。然后，过滤反应混合物，并用质子惰性有机溶剂洗涤剩余的固体。滤液蒸发至干。然后通过制备型RP-HPLC纯化粗制品。
可选地，式(I)的化合物可以如下列方案和下面的描述中说明的来制备：
将胺官能化树脂诸如式(X)的Sieber酰胺树脂放置在装有聚乙烯多孔盘的注射器中。树脂通过用适当的有机溶剂(诸如二氯甲烷(DCM)和二甲基甲酰胺(DMF))洗涤而溶胀。当树脂的胺基团受到保护时(即在Sieber酰胺树脂的情况下)，通过用胺碱溶液诸如DMF中的哌啶溶液处理来实现保护基团(诸如芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基团)的去除。
从树脂中去除保护基团后，使用活化剂(诸如三唑(即TBTU))和胺碱(诸如DIEA)在适当的有机溶剂(诸如DMF)中将受Fmoc保护的式(V)的脯氨酸附接于树脂上。将混合物搅拌1至2小时。在过滤和洗涤之后，可以使用Kaiser测试监测偶联的程度，在需要时进行重新偶联。通过用胺碱溶液(诸如DMF中的哌啶溶液和/或哌啶/DBU/甲苯/DMF的混合物)处理来去除Fmoc以产生式(XI)的产物。可以使用对硝基苯酯NF31测试来评估Fmoc去除。
式(XI)的产物与式(IX)的产物偶联，以在存在或不存在添加剂(诸如HOAt)的情况下，使用活化剂(诸如PyBOP)和胺碱(诸如DIEA)在适当的有机溶剂(诸如DMF)中产生式(XII)的产物。在1至2小时的总反应时间期间手动搅拌混合物。系统性重新偶联是使用相同的量和时间完成的。可以使用对硝基苯酯NF31测试来监测偶联的程度。
可选地，式(XII)的产物也可以通过先将产物(XI)逐步偶联到式(XIII)的化合物上，然后去除Fmoc保护基团，然后与式(VII)的化合物偶联而获得。
将式(XII)的产物(将其用适当的有机溶剂诸如DCM彻底洗涤并干燥)转移到烧瓶中，在少量有机溶剂中向烧瓶中加入三氟乙酸酐和吡啶。将混合物在20至40℃的温度下保持8至16小时。然后，过滤反应混合物并用相同的有机溶剂洗涤树脂。收集滤液并将溶剂蒸发至干。将所得粗制品溶解在适当的溶剂诸如乙酸乙酯中，并用饱和NaHCO3溶液和5％aq.KHSO4溶液洗涤。将有机相干燥、过滤和蒸发。将粗制品吸收到H2O:CH3CN中并冻干以产生式(I)的肽腈。
可选地，式(XII)的肽基树脂可以用TFA/H2O/TIS的混合物处理1-2小时。然后，过滤树脂并用TFA洗涤，收集滤液并将溶剂蒸发至干。将粗制品重悬于H2O:CH3CN的混合物中并冻干。所得粗制肽酰胺在适当的有机溶剂诸如DCM中被吸收，并在例如五氧化二磷、四氯化钛、亚硫氯酰、三氟乙酸酐/吡啶或三苯基膦/四氯化碳存在下转化为腈。将混合物在室温下保持8至16小时，蒸发溶剂并将残留物吸收在乙酸乙酯中。随后用aq.KHSO4溶液和aq.NaHCO3溶液洗涤有机溶液。有机相的干燥和蒸发产生式(I)的肽腈。
将粗制品通过RP-HPLC纯化。
在上述用于制备本发明化合物的方法产生立体异构体的混合物的情况下，这些异构体可以通过常规技术诸如制备色谱分离。如果存在手性中心，则可以以外消旋形式制备化合物，或者可以通过对映体特异性合成或通过拆分来制备单个对映异构体。
用作起始产物的式(II)、(III)、(IV)和(V)的化合物以及式(VII)的一些化合物是商业上可获得的，并且也可以使用该领域专家熟知的方法制备。
因此，在本发明的一个方面提供了用于制备式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药或溶剂化物的方法。
在一个实施方式中，该方法包括以下步骤：
a)使式(IX)的化合物与式(XI)的化合物反应：
其中聚合物代表在本文中公开的合成方法的反应条件下是惰性的并且在本文中使用的溶剂中不溶但可溶胀的聚合物，诸如低交联聚苯乙烯和聚乙二醇接枝的聚苯乙烯聚合物。
以产生式(XII)的化合物：
b)将式(XII)的化合物水解以产生式(XIV)的化合物：
以及
c)使式(XIV)的化合物经受能够将甲酰胺基团转化为腈基团的条件，以产生式(I)
化合物：
其中步骤b)和c)可以单独进行或一步反应。
在本发明的另一个实施方式中，制备式(I)化合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药或溶剂化物的方法包括以下步骤：
a)使式(IX)的化合物与式(IV)的化合物反应：
在仍然另一个实施方式中，该方法包括以下步骤：
a)使式(XI)的化合物与式(XIII)的化合物反应：
其中聚合物代表在本文中公开的合成方法的反应条件下是惰性的并且在本文中使用的溶剂中不溶但可溶胀的聚合物，诸如低交联聚苯乙烯和聚乙二醇接枝的聚苯乙烯聚合物。
b)去除Fmoc保护基团
c)与式(VII)的化合物反应：
d)从载体聚合物中水解所得产物以产生式(I)的化合物：
已经发现通式(I)的化合物可用于治疗认知障碍，特别是与中枢神经系统的其他疾病或病况相关的认知障碍。
在本发明的具体实施方式中，认知障碍是与选自精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病和帕金森病的疾病相关的认知障碍。
本发明进一步提供药物或药物组合物，其包含本发明的化合物或其药学盐、衍生物、前药或立体异构体，以及药学上可接受的载体、佐剂或媒介物，用于施用至患者。
根据本发明的药物组合物的辅助材料或添加剂可以选自载体、赋形剂、载体材料、润滑剂、填料、溶剂、稀释剂、着色剂、风味调节剂诸如糖、抗氧化剂、粘合剂、粘结剂、崩解剂、抗粘附剂、助流剂和/或凝集剂。在栓剂的情况下，这可能意味着蜡或脂肪酸酯或防腐剂，乳化剂和/或用于肠胃外应用的载体。这些辅助材料和/或添加剂的选择以及要使用的量将取决于药物组合物的应用的形式。
根据本发明的药物或药物组合物可以以任何适合应用于人类和/或动物，优选地人类(包括婴儿、儿童和成人)的形式，并且可以通过本领域普通技术人员已知的标准程序生产。因此，根据本发明的制剂可适于局部或全身应用，特别是用于皮肤、透皮、皮下、肌内、关节内、腹膜内、静脉内、动脉内、膀胱内、骨内、海绵体内、鼻内、肺、颊、舌下、眼、玻璃体内、经皮、直肠、阴道、口腔、硬膜外、鞘内、心室内、脑内、脑室内、脑室内、脑池内、脊柱内、椎周、颅内、经由有或没有泵装置的针头或导管输送，或其他应用途径。
在本发明的优选实施方式中，药物组合物是口服形式，固体或者液体。口服施用的合适剂型可以是片剂、丸剂、囊片、凝胶帽、口香糖、胶囊、颗粒剂、滴剂、糖浆剂或溶液，并且可以含有本领域已知的常规赋形剂，诸如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯树胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；压片润滑剂，例如硬脂酸镁；崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉乙醇酸钠或微晶纤维素；或药学上可接受的润湿剂，诸如十二烷基硫酸钠。
在另一个实施方式中，药物组合物以用于非胃肠外鼻内施用的产品的形式，优选地以用于鼻内施用的产品的形式。鼻内施用通常通过使用鼻腔喷雾剂、挤压瓶和滴管作为输送装置进行。为了与这些装置一起使用，药物组合物是本发明的化合物的有利地液体溶液或悬浮液。
组合物可以通过常规的混合、填充或压片的方法制备。重复的混合操作可用于将活性剂分布遍及使用大量填料的那些组合物中。此类操作是本领域中常规的。片剂可以例如通过湿法或干法造粒来制备，并任选地根据正常制药实践中众所周知的方法包衣，特别是用肠溶包衣。
药物组合物还可适于肠胃外施用，诸如适当单位剂型中的无菌溶液、悬浮液或可重构的干制剂、气溶胶或喷雾剂。可以使用合乎需要的赋形剂，诸如填充剂、缓冲剂或表面活性剂。
本发明的组合物可以配制成溶解形式或贴剂中的沉积物，用于经皮应用。
皮肤应用包括软膏、凝胶、乳膏、乳液、悬浮液或乳液。
直肠应用的合适形式是通过栓剂的方式。
提到的制剂将使用标准方法制备，诸如西班牙和美国药典以及类似参考文献中描述或提及的那些方法。
在本发明的一个实施方式中，优选的为式(I)的化合物以治疗有效量使用。医生将确定最适合的本治疗剂的剂量，并且其将随着施用的形式和所选的具体化合物而变化，并且此外，其将随着治疗下的患者、患者的年龄、疾病类型或正在治疗的病况而变化。当组合物被口服施用时，可以需要较大量的活性剂以产生与肠道外给予的较小量相同的效果。这些化合物以与可比较的治疗剂相同的方式使用，并且剂量水平与通常与这些其他治疗剂一起使用的剂量水平具有相同的数量级。活性化合物通常每天施用一次或多次，例如每天1、2、3或4次，典型的每日总剂量在0.011至1.90mg/kg/天的范围内。
本发明的化合物和组合物可以与其它药物一起使用以提供联合治疗。其它药物可以形成相同组合物的一部分，或者作为单独的组合物提供，用于同时或在不同时间施用。
特别地，式(I)的至少一种化合物和至少一种另一药物的组合可以至少与药学上可接受的载体、添加剂、佐剂或媒介物一起配制，用于其同时、单独或顺序施用。这意味着式(I)的化合物和其他药物的组合可以施用如下：
a)作为是相同药物制剂的一部分的组合，然后两者总是同时被施用。
b)作为两个单元的组合，每个单元具有它们之一，引起同时、顺序或单独施用的可能性。在具体实施方式中，式(I)的化合物独立于其它药物施用(即在两个单元中)但同时施用。在另一个具体实施方式中，首先施用式(I)的化合物，然后单独或顺序施用其它药物。在又一个具体实施方式中，首先施用其他药物，然后单独或顺序地施用式(I)地化合物，如限定的。
在本发明的上下文中，使用了下列首字母缩略词和缩写，其含义详述如下：
AcOEt 乙酸乙酯
AD 阿尔茨海默病
AUC 曲线下面积
BBB 血脑屏障
Boc 叔丁氧羰基
BSA 牛血清白蛋白
DBU 1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCM 二氯甲烷
DMEM Dulbecco改良的Eagle培养基
DI 鉴别指数
DIEA N,N’-二异丙基乙胺
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
EtOH 乙醇
Fmoc 9-芴甲氧基羰基
FPLC 快速蛋白液相色谱
FTIR 傅里叶变换红外分光计
HBSS Hanks平衡盐溶液
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
hPOP 人脯氨酰寡肽酶
IP 腹膜内的
IP3 肌醇三磷酸
IPTG 异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷
LB 溶原性肉汤
MALDI-TOF 基质辅助激光解吸/离子化——飞行时间
MK-801 地佐环平
MS 多发性硬化症
NMR 核磁共振
NOR 新物体认知
OD 光密度
PAMPA 平行人工膜渗透性试验
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PC 磷脂酰胆碱
PE 磷脂酰乙醇胺
pETM10 质粒pETM10
PI 磷脂酰肌醇
POP 脯氨酰寡肽酶
PS 磷脂酰丝氨酸
PyBOP (苯并三唑-1-基氧)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
RP-HPLC 反相高性能液体色谱
SD 标准偏差
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
TBTU O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐
TEER 经内皮电阻
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TIS 三异丙基硅烷
Tris 三(羟甲基)氨基甲烷
Tβ4 胸腺素β-4蛋白
UPLC 超性能液相色谱法
Z-G-P-AMC (N-苄氧基羰基-Gly-Pro-甲基香豆素-7-酰胺)
下列实施例仅说明本发明的某些实施方式，并且不能被认为是以任何方式对其进行限制。
实施例
用于实施例中描述的制剂的特定合成条件
过程A：式(II)的酯水解成式(VII)的羧酸
将式(II)的酯(1mmol)溶于95％EtOH中。加入NaOH(3.7mmol)，并将反应保持在回流中大约2小时。然后让它达到室温。将反应混合物浓缩至大约15-20mL，然后将该溶液缓慢加入到1M HCl溶液中，同时在冰浴中冷却。通过过滤收集的白色固体沉淀物，用水洗涤并在下一个合成步骤之前充分干燥。在没有沉淀出现的情况下，用AcOEt(3x)提取所得溶液，干燥有机相并蒸发。如果需要，粗制品通过快速色谱法纯化。
过程B：去保护式(III)的Boc保护胺以产生式(VI)的胺
将式(III)的Boc保护胺(1mmol)在0℃下缓慢加入到在二噁烷(20ml)中的4M HCl中。将反应在室温下搅拌2小时。然后将溶剂蒸发至干，以得到式(VI)的胺的盐酸盐。
过程C：通过形成式(VIII)的羧酸氯来将式(VI)的胺与式(VII)的羧酸偶联。
将草酰氯(1.5mmol)加入到甲苯(5ml)中式(VII)的羧酸(1mmol)的溶液中。将反应在50℃下搅拌1.5小时，以允许形成式(VIII)的羧酸氯。在溶剂蒸发之后，将所得粗品溶解在THF中，并在0℃下加入到式(VI)的胺的NaOH水溶液(1.1mmol)中。将反应混合物在0℃下搅拌1.5小时，并且在室温下搅拌3小时。然后，蒸发THF，并通过加入1M HCl溶液将剩余的水馏分调节至酸性pH(3-4)，并用AcOEt萃取。有机相用盐水洗涤，干燥，过滤并蒸发。式(IX)的粗制品在必要时通过快速色谱法纯化。
过程D：式(IX)的产物与式(IV)的吡咯烷-2-腈在溶液中的偶联
将式(IX)的产物(1.2mmol)溶解在DCM中，并且与DIEA(1mmol)一起加入到N-环己基碳化二亚胺，N'-甲基聚苯乙烯(3mmol)中。5分钟之后，加入式(IV)的(S)-吡咯烷-2-腈(1mmol)和DIEA(1mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。然后，过滤反应混合物并用DCM洗涤剩余的固体。将滤液蒸发至干。然后通过制备型RP-HPLC纯化粗制品并冻干以产生式(I)的产物。
过程E：用于固相合成的一般过程
树脂的溶胀/调节：将式(X)的Sieber酰胺树脂(1eq)放置在装有聚乙烯多孔盘的注射器中。树脂通过用DCM和DMF洗涤而膨胀。通过用在DMF中的20％哌啶溶液处理来实现芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基团的去除。
然后，使用DMF中的TBTU(4eq)和DIEA(8eq)将式(V)的Fmoc保护的脯氨酸(4eq)附接于树脂。在90分钟内间歇性地手动搅拌混合物。在过滤和洗涤之后，使用Kaiser测试来监测偶联的程度，在需要时进行重新偶联。通过用在DMF中的20％哌啶溶液处理，然后用哌啶/DBU/甲苯/DMF(20:5:5:70)溶液处理，去除Fmoc以产生式(XI)的产物。使用对硝基苯酯NF31测试来评估Fmoc去除(在Madder,A.et al.,Eur.J.Org.Chem.1999；(11):2787-91中描述)。
使用在DMF中的PyBOP(2eq)、HOAt(6eq)和DIEA(6eq)将式(IX)的产品(2eq)与式(XI)的产品偶联，以产生式(XII)的产品。在总反应时间90分钟内间歇性地手动搅拌混合物。系统性重新偶联是使用相同的量和时间完成的。使用对硝基苯酯NF31测试来监测偶联的程度。
可选地，使用在DMF中的PyBOP(4eq)、HOAt(12eq)和DIEA(12eq)将式(XIII)的产品(4eq)与式(XI)的产品偶联。在总反应时间90分钟内间歇性地手动搅拌混合物。使用对硝基苯酯NF31测试来监测偶联的程度，并且如果必要的话进行重新偶联。通过用在DMF中的20％哌啶溶液处理并且用哌啶/DBU/甲苯/DMF(20:5:5:70)溶液处理来去除Fmoc基团。随后，使用DMF中的PyBOP(4eq)、HOAt(12eq)和DIEA(12eq)将式(VII)的产品(4eq)并入，以获得式(XII)的产品。在总反应时间90分钟内间歇性地手动搅拌混合物。使用对硝基苯酯NF31测试来监测偶联的程度，并如果必要的话进行重新偶联。
将式(XII)的产品用DCM彻底洗涤并干燥，转移到圆底烧瓶中，并且加入在DCM(大约2mL/100mg)中的三氟乙酸酐(5eq)和吡啶(10eq)。将混合物在室温下保持过夜。然后，过滤反应混合物并用DCM洗涤树脂。收集滤液并将溶剂蒸发至干。将所得粗品溶解在AcOEt中，并用饱和NaHCO3溶液和5％aq.KHSO4溶液洗涤。将有机相干燥、过滤和蒸发。将粗品在H2O:CH3CN(1:1)中吸收并冻干以产生式(I)的肽腈。
可选地，式(XII)的肽基树脂可以用TFA/H2O/TIS(95:2.5:2.5，大约2-5mL/100mg)的混合物处理1-2小时。然后，过滤树脂并用TFA洗涤，收集滤液，并将溶剂蒸发至干。将粗品重悬于H2O:CH3CN(1:1)的混合物中并冻干。将所得粗肽酰胺在DCM中吸收，并加入三氟乙酸酐(5eq)和吡啶(10eq)。将混合物在室温下保持过夜，蒸发溶剂并将残留物吸收到AcOEt中。随后用aq.5％KHSO4溶液和aq.10％NaHCO3溶液洗涤有机溶液。有机相的干燥和蒸发产生式(I)的肽腈。
粗制品通过RP-HPLC纯化。
实施例1
(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
通过上述程序E中描述的逐步偶联，将商业上可获得的式(V)的Fmoc保护的L-脯氨酸(Fmoc-L-Pro-OH)(249,7mg，0.7mmol)，式(VII)的(2S,4R)-4-氟-1-Fmoc-吡咯烷-2-羧酸(533mg，1.5mmol)和式(VII)的4-苄氧基-3,5-二氟苯甲酸(271mg，1mmol)依次偶联到商业上可获得的Sieber酰胺树脂(333.3mg，0.2mmol，1eq)上。通过RP-HPLC纯化提供156mg(0.341mmol)的最终产品。
mp 137.6-139.1℃.FTIR：1642、1582、1517、1414、1381、1317、1230、1203、1172、1064、1036cm-1。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ(ppm)：7.42(2H，m)、7.35(3H，m)、7.12(2H，m)、5.30(1H，m)、5.23(1H，m)、4.93(1H，dd)、4.82(1H，m)、3.87(2H，m)、4.08/3.69(2H，m)、2.58/2.36(2H，m)、2.26(2H，m)、2.24(2H，m)。
实施例2
(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
该化合物是按照实施例1中描述的方法制备的，但用(2S,4S)-4-氟-1-Fmoc-吡咯烷-2-羧酸替换(2S,4R)-4-氟-1-Fmoc-吡咯烷-2-羧酸。通过RP-HPLC纯化提供138mg(0.302mmol)的最终产品。
mp 135-137℃.FTIR：3483、2954、1653、1581、1518、1437、1417、1383、1356、1321、1234、1203、1172、1065、1039、1005、960、901、856、762、737、696cm-1。
比较实施例3:
(S)-1-((2S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二甲氧基苯甲酰)-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
从商业上可获得的Sieber酰胺树脂(250mg，0.19mmol，1eq)、商业上可获得的Fmoc--L-脯氨酸(Fmoc-L-Pro-OH)(258mg，0.77mmol)和((S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二甲氧基苯甲酰)-4,4-二氟吡咯烷-2-羧酸)(161mg，0.38mmol)开始，按照上面描述的过程E制备该产品。通过RP-HPLC纯化提供18mg(0.036mmol)的最终产品。
比较实施例4:
(S)-1-((S)-1-(4-(苄氧基)-3-氟苯甲酰)-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
通过上述过程E中描述的逐步偶联，将商业上可获得的Fmoc保护的L-脯氨酸(Fmoc-L-Pro-OH)(150mg，0.45mmol)、Fmoc-4,4-二氟-L-脯氨酸(166mg，0.45mmol)和4-苄氧基-3-氟苯甲酸(109mg，0.45mmol)依次偶联到商业上可获得的Sieber酰胺树脂(200mg,0.15mmol,1eq)上。通过RP-HPLC纯化提供14mg(0.030mmol)的最终产品。
药理学数据
测定新型化合物对(人类)脯氨酰寡肽酶活性的抑制作用
脯氨酰寡肽酶(POP)的表达和纯化
根据文献过程(TarragóT et al.,ChemBioChem 2006；7:827-33)，通过在大肠杆菌中的表达和使用His尾部融合的亲和纯化来获得POP，总结如下：
hPOP表达：将大肠杆菌BL21感受态细胞用pETM10 hPOP进行转化。为了诱导表达，用一个菌落接种含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基(50mL)的预培养物，并且在37℃下生长过夜。第二天，用该过夜培养物(10mL)接种LB培养基(500mL)的两个培养物。将接种的培养物在37℃和220rpm下生长，直到OD595为1.2(2.5-3小时)。然后加入IPTG(终浓度为1mM)，并在25℃下进行诱导过夜。收获细胞(3500g，15min，4℃)，并且将沉淀物悬浮在悬浮缓冲液(50mL)[Tris-HCl pH 8(50mM)，NaCl(300mM)，咪唑(1mM)]中，使用四个循环(每个循环包括15秒的超声处理和15秒的休息)进行超声处理，强度为50％，脉冲为0.5次，样品保持在冰上。超声处理之后，样品被离心(40000g，30min，4℃)，上清液立即用于POP纯化。使用explorer FPLC系统进行纯化。以1mL/min的流速将上清液施加于之前用5个柱体积的悬浮缓冲液进行平衡的HiTrapQuelating柱(5mL)。用悬浮缓冲液洗柱子，直到280nm处的吸光度恢复到基础水平。然后用5体积的洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8,300mM NaCl,30mM咪唑)冲洗该柱。用4体积的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8,300mM NaCl,500mM咪唑)进行洗脱。在整个洗脱过程中收集馏分(4mL)。检查所有馏分中的POP活性，对阳性馏分进行SDS-PAGE分析，并用Biosafe Comassie Stain G-250染色。收集阳性馏分并使用HiPrep 26/10脱盐柱，用Tris-HCl(50mM，pH8)为缓冲液进行脱盐。重组的hPOP用Bio-Rad公司的蛋白质检测法进行定量，以BSA为标准。准备重组酶的等分试样，并且立即用液氮冷冻并储存在-80℃。
POP抑制试验
POP活性是按照Toide等人(Toide K et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.1995；274:1370-8)描述的方法测定的，使用Z-G-P-AMC(N-苄氧基羰基-Gly-Pro-甲基香豆素-7-酰胺)作为POP底物。反应是在96孔微孔板中进行的，这允许同时监测多个反应。对于每个反应，将活性缓冲液(134μl,100mM Na/K磷酸盐缓冲液，pH 8.0)与hPOP(范围从20到60nM，取决于hPOP批次的活性)和相应的新化合物溶液(3μl)在37℃预孵育15分钟。在DMSO(100mM)中制备新化合物的储备溶液，并用DMSO从该储备溶液中制备稀释液。
预孵育之后，加入Z-G-P-AMC(10μl，在40％1,4-二噁烷中3mM)(3μl，在40％1,4-二噁烷中1.5mM，在条件B中)，并将反应在37℃下孵育1小时。通过加入乙酸钠(150μl，1M，pH4)停止反应，并用荧光法测量AMC的形成。激发和发射波长分别为360/40和485/20nm。
测量每种化合物的几个浓度点(范围从25pM至400μM)。根据eq 1计算脯氨酰寡肽酶的抑制活性。对于每种新化合物而言，测量hPOP存在(a)和不存在(b)的情况下的荧光。在不存在抑制性化合物的情况下，从hPOP的样品中获得最大荧光(0％抑制活性)。为了估计新化合物的抑制效力，按化合物的对数浓度对活性作图，使用GraphPad Prism软件调整为S形曲线，并从所得曲线确定IC50值，其定义为抑制50％的POP活性所需的化合物的浓度。
其中：
a对应于存在底物+测试化合物+hPOP的情况下的荧光强度
b对应于存在底物+测试化合物的情况下的荧光强度
c对应于存在底物+hPOP的情况下的荧光强度
d对应于存在底物的荧光强度。
新化合物对人类脯氨酰寡肽酶表现出高抑制效力。结果总结在表1中。
表1：人类脯氨酰寡肽酶的抑制。
/>
表1的数据如图1所示。在所述图中，棒代表平均值±标准偏差(SD)。
测定化合物的渗透性性能
平行人工膜渗透性试验(PAMPA)
Kansy M et al.,J.Med.Chem.1998；41(7):1007-10中描述的平行人工膜渗透性试验(PAMPA)用于确定化合物通过被动扩散穿过血脑屏障(BBB)的能力(Di L et al.,Eur.J.Med.Chem.2003；38(3):223-32)。在200μM的初始浓度下测量化合物的有效渗透性(Pe)。缓冲溶液按照制造商的指示由商业浓缩溶液制备。使用0.5M NaOH溶液将pH调节至7.4。在DMSO中制备新化合物的储备溶液，并用缓冲溶液稀释至最终200μM浓度(0.5％DMSO含量)。分离PAMPA三明治状物，每个供给孔用200μL的化合物溶液填充。将接收板放入供给板中，确保膜的底面与缓冲液接触。将4μL的十二烷中的磷脂(20mg/mL)的混合物加入每个孔的过滤器中，并向每个接收孔中加入200μL的缓冲溶液。将板盖上并在100rpm的轨道搅拌下在室温下在饱和湿度气氛下孵育4小时。4小时之后，通过HPLC分析接收和供给隔室的内容物：将来自供给板的每个孔的150μL和来自接收板的每个孔的150μL转移到HPLC小瓶中，将每个样品注入反相C18柱(150mm x4.6mm x5μm，)(100μL/从接收孔中进样，10μL/从供给孔进样，用于t0参照)。通过MALDI-TOF光谱法也证实了转运。
使用的磷脂混合物是猪极性脑脂质提取物，由Avanti极性脂质提供，具有下列组成：12.6％磷脂酰胆碱(PC)，33.1％磷脂酰乙醇胺(PE)，18.5％磷脂酰丝氨酸(PS)，4.1％磷脂酰肌醇(PI)，0.8％磷脂酸和30.9％的其他化合物。
使用等式2计算4小时之后的有效渗透性(Pe)，使用等式3计算转运的百分比(T％)，使用等式4计算磷脂膜的化合物保留(R％)：
其中：
T是时间(h)
CA(t)是时间t时接收孔中的化合物浓度，CD(t)是时间t时供给孔中的化合物浓度
以及CD(t0)是t0时供给孔中的化合物浓度。
基于表2所示的指示性Pe值，新型化合物显示良好的跨过BBB的渗透性(表3)
表2：指示性Pe值
指示性Pe值(cm/s) CNS内部的转运
Pe>＝4·10-6 良好
2·10-6<＝Pe<4·10-6 不确定的
Pe<2·10-6 不好
表3：新化合物的有效渗透性(Pe)和转运的百分比
化合物(实施例号) Pe(x10-6 cm/s) SD ％T SD ％R SD
1 4.7 0.1 18.1 0.4 24 3.5
比较实施例3 22.14 5.86 29.92 4.80 10.93 1.60
比较实施例4 - - 10.43 2.06 - -
表3的数据如图2所示。在所述图中，棒代表平均值±标准偏差(SD)。
Caco-2试验
Caco-2细胞被广泛用作预测Huma药物吸收的体外模型。Caco-2细胞系来源于人结直肠癌，并且在培养时，细胞自发分化成极化的肠上皮细胞的单层。
跨过Caco-2细胞的单层的药物渗透性已被证明与人体体内吸收密切相关(ZhaoYH et al.,2001,J.Pharmaceut.Sci.90:749-784)，并已成为预测肠道吸收的确定已久的体外方法(Kansy Met al.,2001,Pharmcacokinetic optimization in drug research,Ed.Testa B et al.,447-646)。
使用CacoReay渗透性试剂盒(ReadyCell，巴塞罗那，西班牙)进行实验。
在收到试剂盒的同一周，根据与试剂盒一起提供的用户手册液化细胞的运输培养基，在这之后用新鲜的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，低葡萄糖)替换运输培养基。
三天之后，相当于细胞培养的第20天，通过测量细胞屏障的经内皮电阻(TEER)来检查屏障系统的质量和细胞之间紧密连接的存在。TEER值为200Ω·cm2(或更高)表明屏障系统可接收用于吸收试验。通过在紫外光下将电极浸入乙醇(70％)中灭菌30分钟。后来，将电极在DMEM培养基中平衡30分钟，在室温下预热。在室温下进行TEER测量，获得1357±168Ω·cm2的平均值，证实了细胞屏障的完整性。
在渗透性试验之前，制备转运缓冲液(HBSS(1x)-Ca2+/Mg2+)并加热至37℃，以避免实验过程中的细胞温度应力。与此同时，将待测化合物溶解至在转运缓冲液(HBSS(1x)-Ca2 +/Mg2+)中终浓度为50μM。含有0.5％的DMSO，该量被细胞很好地耐受，并且不会影响屏障完整性。化合物在50μM的浓度下进行测试。
在渗透性试验之前，通过抽吸去除顶端和基底隔室的DMEM。在每个隔室中留有10μL培养基的体积，以防止细胞干燥并破坏其屏障性能。两个隔室均用转运缓冲液冲洗，基底(底部)隔室用300μL的转运缓冲液填充，顶端(顶部)隔室用75μL转运缓冲液填充。
通过抽吸完全去除基底隔室的内容物，并再次用250μL转运缓冲液填充。还通过抽吸去除顶端隔室的内容物，留下10μL的转运缓冲液以避免细胞干燥。向每个孔中加入65μL的待测化合物溶液。
对于转运实验(顶端到基底)，将细胞与含有化合物的溶液在37℃下孵育2小时。后来，回收隔室的内容物并通过HPLC进行分析(柱C18 Sunfire 100mm x 4.6mm，3.5mm，水；流速1mL/min；梯度0-100％B在8分钟内，A＝0.045％三氟乙酸在H2O中和B 0.036％三氟乙酸在乙腈中，在220nm处检测)。所有实验一式三份进行。
从隔室中去除样品后，为了在试验过程中检查细胞屏障的完整性，再次用250μL转运缓冲液填充基底隔室，并用65μL的浓度为20μM的在转运缓冲液中的荧光黄(LY)溶液填充顶端隔室。将细胞屏障与LY溶液在37℃下孵育1小时。LY用作渗透性试验的屏障完整性标志物。孵育之后，收集隔室的内容物并使用荧光计进行分析。
对于全功能的Caco-2屏障，1小时之后LY的渗透性应小于0.7％。在试验之后，LY渗透性低于该转运平均值，这表明在评估化合物期间屏障的屏障完整性。
在Caco-2渗透性试验中，根据下列等式计算化合物的转运的百分比(T％)：
其中t是时间(小时)，CA(t)是时间t时基底隔室(接收室)中的化合物浓度，CD(t0)是时间0时顶端隔室(供给室)中的化合物浓度。
表4：渗透性(Caco-2试验)
化合物(实施例号) ％T SD
1 45 3
比较实施例3 5.7 1
如上所示，实施例1的化合物的胃渗透性远高于比较实施例3的胃渗透性。在所述图中，棒代表平均值±标准偏差(SD)。
表4的数据如图3所示。
体内脑暴露
对于每种化合物，使用实验当天年龄为7-8周的24只成年雄性小鼠进行研究，并在两组之间随机分配。实验在3组动物上进行，如下表所述：
在化合物施用之后，在腹膜内(比较实施例3)或口服施用(实施例1)后的几个时间点进行终末血(terminal blood)。
用磷酸盐缓冲盐水进行心内(transcardiac)灌注后，还收集了大脑。所有样品均储存在-80℃直至生物分析。
将血浆样品在室温(RT)下解冻，并且样品用2倍体积的乙腈沉淀蛋白质，含有20ng/mL非那西汀作为内标物。将样品彻底混合，然后在2,200x g下离心20分钟。将上清液用150mM磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)1:1稀释，并且移液到UPLC 96孔板上等待分析。
对脑样品进行称重，在室温下解冻，并通过在具有4倍体积的磷酸盐缓冲盐水的珠匀浆器中匀浆组织来制备以分析。匀浆处理与血浆样品类似。
在将空白血浆和脑匀浆掺料(spiking)至实施例1和比较实施例3的0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、500、1000、2000、2000和10000ng/mL浓度后，与实际研究样品类似制备参照(校准)样品。在将空白血浆和脑匀浆掺料至实施例1或比较实施例3的20、200和2000ng/mL之后，与实际研究样品类似制备质量控制样品。
从小鼠血浆和脑中定量比较实施例3和实施例1化合物的水平。使用采用UPLC/QE-Orbitrap-Mass质谱的符合目的的(fit-on-purpose)生物分析方法分析样品。
使用Graphpad PrismTM 5.0绘制化合物随时间变化的浓度(ng/mL)，并计算血浆和脑组织的曲线下面积(AUC)。血浆与脑的比率计算如下。
表5：脑暴露
化合物(实施例号) ％BBB
1 25.3
比较实施例3 21
表5的数据如图4所示。
如上所示，当通过口服施用使用实施例1的化合物时，即使当所述化合物腹膜内施用，也可能实现比通过其他化合物实现的脑暴露更高的脑暴露。
微粒体稳定性(大鼠)
微粒体稳定性可用于预测化合物是否会克服第一次代谢的传递并在口服施用之后达到全身暴露。预测化合物在血流中一次的半衰期也是有用的。
根据由供应商(BD Bioscience)提供的指示对大鼠(Sprague-Dawley)合并肝微粒体(目录号452501)中化合物的稳定性进行了调查。在DMSO中制备待测化合物的储备溶液(500μM)。将2μL的化合物以1μM终浓度在以下的混合物中孵育：
-713μL的H2O
-200μL的0.5M磷酸钾(pH 7.4)
-50μL的NADPH再生系统溶液A(BD Bioscience目录号451220)
-10μL的NADPH再生系统溶液B(BD Bioscience目录号451200)
将所得混合物加热至37℃持续5分钟。在这之后，加入终浓度为0.5mg/mL的25μL的肝微粒体。将混合物在37℃下以轨道搅拌(100rpm)孵育。在选定的时间点，提取100μL等分试样并与100μL乙腈混合。将得到的沉淀物在涡旋中摇动1分钟。将样品在4℃下保持30分钟，在这之后将样品在4℃下以20,000x g离心30分钟。过滤出上清液，随后通过UPLC-MS分析。所有稳定性测试一式两份进行。
表6：微粒体稳定性(大鼠)
化合物(实施例号) 半衰期(分钟)
实施例1 12
比较实施例3 <5
比较实施例4 <5
这些数据表明，比较实施例3和比较实施例4将不会克服口服施用之后的第一遍代谢。因此，口服施用之后不会达到体循环。实际上，比较实施例3在口服施用之后没有显示出疗效，被检测到药物的血浆水平非常低。
小鼠中的PK
静脉推注施用后化合物的药代动力学在雄性瑞士白化小鼠中进行。该研究是根据机构动物伦理委员会(IAEC)的指导方针和根据印度动物实验控制和监督委员会(CPCSEA)的要求进行的。
使用稀疏采样设计(n＝3/时间点)按每种化合物在12只小鼠中进行研究以产生复合图谱。将化合物溶解在盐水(0.9NaCl)中2％中，浓度为0.5mg/mL。使用由26G针头导向的1mL BD注射器以2mL/kg的剂量体积通过侧尾静脉由静脉推注施用给小鼠1mg/kg单次剂量的化合物溶液。
在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24和48小时收集血液样品(n＝3/时间点)。在每个时间点，通过眶后神经丛穿刺收集120μL血液，并将其转移到含有200mM K2EDTA溶液(每mL血液20μL)的带标记微量离心管中。将血液样品在4±2℃下以5000x g离心5分钟。血浆样品储存在-60℃以下直至生物分析。
血浆样品使用LC-MS/MS方法进行分析，其中LLOQ为1.06ng/mL。使用经过验证的Phoenix软件(版本6.3)的非隔室分析工具计算血浆中的药代动力学参数。通过线性梯形规则计算浓度时间曲线下面积(AUClast)。血浆峰值浓度(Cmax)和达到血浆峰值浓度的时间(Tmax)是观测值。清除(CL)和分布的体积(Vss)是预测值。
表7：药代动力学(小鼠)
化合物(实施例号) AUClast(ng·h/mL) CL(mL/min/kg) Vss(L/kg)
1 127 99.6 1.19
比较实施例3 131 126 0.64
比较实施例4 22.7 697 9.06
比较实施例4显示了小鼠中静脉内(iv)施用之后的非常高的清除，这表明该化合物遭受较高的第一遍代谢(与微粒体稳定性数据一致)，表明该化合物在口服施用之后将不会达到体循环。
新化合物对认知障碍动物模型中学习和记忆的影响
在认知障碍的药理学模型中评估了新化合物作为认知增强剂的其功效。在未经处理和MK-801处理的啮齿动物(小鼠或大鼠)中评估新化合物的效果。MK-801是N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的非竞争性拮抗剂，其在各种学习和记忆范式中损害动物的表现(Castellano Cet al.,Curr.Drug Targets 2001；2:273–83.；Riedel G et al.,Behav.Brain Res.2003；140:1–47)。MK-801还对啮齿动物的行为产生各种影响，包括感觉处理缺陷、运动过强、刻板症和共济失调。由MK-801治疗诱导的行为表型已被广泛用作认知缺陷的动物模型(Bardgett ME et al.,Brain Res.Bull.2003；60:131–42；Van der StaayFJ et al.,Behav.Brain Res.2011；220:215–29；Mutlu O et al.,Pharmacol.Biochem.Behav.2011；99:557–65)。
为了确定测试的化合物是否起到认知增强剂的作用，通过广泛使用的测试，诸如新物体认知测试(Dere E et al.,Neurosci.Biobehav.Rev.2007；31:673–704；Boess FGet al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.2007；321:716–25)；被动或抑制性回避任务(Sarter M etal.,Psychopharmacology(Berl)1992；107:144–59)；Morris水迷宫(D’Hooge R et al.,Brain Res.Rev.2001；36:60–90)；和T迷宫交替任务(Boess FG et al.,Neuropharmacology 2004；47:1081–92；Spowart-Manning L et al.,Behav.BrainRes.2004；151:37–46)，测试了它们恢复正常认知行为的能力。
作为评估新型POP抑制剂的代表性实例，描述了每个行为测试所遵循的方案，以及在物体认知测试和被动回避测试中获得的结果。
新物体认知任务
新物体认知(NOR)任务基于啮齿动物探索新物体的自然偏好(Ennaceur A etal.,Behav.Brain Res.1988；31:47–59)。这是相关的非奖励测试，用于研究视觉学习和记忆缺陷。简而言之，NOR任务过程包括三个试验：习惯化、训练和保留。在没有物体存在的情况下，将每只动物习惯于40-cm直径的圆形竞技场10分钟(习惯化阶段)。第二天，将动物放置在圆形竞技场中进行训练试验10分钟，并将两个相同的物体放置在对称位置。该步骤进行连续两天。在第三天，将物体中的一个用不同的物体取代。训练试验中未使用的物体用作保留试验中的新物体。然后允许动物自由探索10分钟，并记录探索每个物体所花费的时间。预计动物花费更多时间探索新物体，这是完整认知记忆的标志。如下计算鉴别指数：探索新物体所花费的时间减去探索旧物体所花费的时间，除以探索两个物体的总时间，再乘以100。较高的鉴别指数被认为反映了更大的记忆保留。
通过口服途径施用的化合物
该实验使用8-9周龄的雄性C57/Bl6小鼠进行(n＝7-9只动物/组)。将化合物用在盐水(0.9％NaCl)中的5％的吐温的混合物溶解，以获得0.5mg/mL的溶液强度。
测试分为三个部分：习惯化、训练和测试。在第一天，动物习惯于竞技场(圆形，直径40cm)10分钟。在接下来的两天里，动物被允许自由探索放置在竞技场中的两个相同物体10分钟。在测试阶段(第四天)中，将物体中的一个用新的物体取代。在这个阶段之前，在测试之前的35分钟，按os(po)用研究化合物(盐水中的5％吐温5mg/kg)或媒介物(盐水中的5％吐温/>1mL/100g体重)一起施用给动物。为了诱导认知缺陷，在试验之前的20分钟以在盐水中0.2mg/kg剂量皮下施用地佐环平(MK-801)给阴性对照组或药物测试组。基线对照组用生理盐水注射。
在施用之后，允许每只小鼠自由探索物体10分钟。鉴别指数(DI)被定义为用于评估的参数：
使用放置在竞技场上方1.5m的网络摄像头记录实验。使用Panlab SMART 2.0软件分析小鼠的行进距离作为在圆形竞技场的区域中花费的时间百分比。
通过腹膜内途径施用的化合物
该实验使用8-9周龄的雄性C57/Bl6小鼠进行(n＝7-9只动物/组)。将化合物用在盐水(0.9％NaCl)中的5％的吐温的混合物溶解，以获得0.5mg/mL的溶液强度。
测试分为三个部分：习惯化、训练和测试。在第一天，动物习惯于竞技场(圆形，直径40cm)10分钟。在接下来的两天里，动物被允许自由探索放置在竞技场中的两个相同物体10分钟。在测试阶段(第四天)中，将物体中的一个用新的物体取代。在这个阶段之前，在测试之前的35分钟，用在研究化合物(在盐水中的5％吐温5mg/kg)或媒介物(盐水中的5％吐温/>1mL/每100g体重)腹腔内施用至动物。为了诱导认知缺陷，在试验之前的20分钟以盐水中以0.2mg/kg剂量皮下施用地佐环平(MK-801)给阴性对照组或药物试验组。基线对照组用盐水注射。
在施用之后，允许每只小鼠自由探索物体10分钟。鉴别指数(DI)被定义为用于评估的参数：
/>
使用放置在竞技场上方1.5m的网络摄像头记录实验。使用Panlab SMART 2.0软件分析小鼠的行进距离作为在圆形竞技场的区域中花费的时间的百分比。
当施用实施例1的化合物和比较实施例3的化合物时获得的结果提供在下表中。
表8：NOR任务测试
表8的数据如图5a(腹膜内施用)和图5b(口服施用)所示。在所述图中，棒代表n只动物的平均数±s.e.m.。对认知缺陷的基础(基础MK 801)条件的*P<0.05，**P<0.01，****P<0.001(单因素方差分析检验，然后是邓尼特事后检验)。
如上所示，实施例1的化合物在其通过口服途径施用时优于比较实施例3，使其特别适合于口服施用。
选择性图谱(结合于5-HT1A)
实验使用来自Cerep/Eurofins的Safety板进行。化合物在100μM(在1％的DSMO中)的浓度下测试。
化合物的结合被计算为对每个目标特异性的放射性标记配体的结合的抑制百分比。
结果表示为在测试化合物存在的情况下获得的对照特异性结合的抑制百分比。
显示抑制高于50％的结果被认为是代表测试化合物的显著效果。
表9：结合于5-HT1A受体
化合物 对照特异性结合的％抑制 SD
实施例1 -6.3 1.2
比较实施例3 64.6 5.6
表9的数据如图6所示。

Claims (15)

1.一种式(I)的化合物
(其中星号表示手性中心)，其立体异构体及其盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其具有式(Ia)：
其立体异构体及其盐。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：
·(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(R)-1-((2S,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(S)-1-((2R,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(R)-1-((2R,4R)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(R)-1-((2S,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(S)-1-((2R,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈
·(R)-1-((2R,4S)-1-(4-(苄氧基)-3,5-二氟苯甲酰基)-4-氟吡咯烷-2-羰基)吡咯烷-2-腈，
及其盐。
4.一种制备根据权利要求1至3中任一项所述的式(I)的化合物的方法，其包括
a)使式(IX)的化合物与式(XI)的化合物反应：
以产生式(XII)的化合物：
b)水解所述式(XII)的化合物以产生所述式(XIV)的化合物：
并且
c)使所述式(XIV)的化合物经受能够将羧基转化为腈基的条件，以产生所述式(I)的化合物：
其中步骤b)和c)可以单独进行或者一步反应进行。
5.一种制备根据权利要求1至3中任一项所述的式(I)的化合物、其立体异构体及其盐的方法，其包括使式(IX)的化合物与式(IV)的化合物反应：
6.一种药物组合物，其包括至少一种根据权利要求1至3中任一项所述的式(I)的化合物、其立体异构体及其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的式(I)的化合物，其作为药物使用。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的式(I)的化合物，其在治疗和/或预防认知障碍中使用。
9.根据权利要求8所述使用的化合物，其中所述认知障碍是与选自下列的疾病相关的认知障碍：精神分裂症、重度抑郁症、双相情感障碍、REM睡眠行为障碍、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、帕金森病、路易体病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底变性或肌萎缩侧索硬化症。
10.一种治疗或预防哺乳动物中认知障碍的方法，其中向需要所述治疗的患者施用治疗量的根据权利要求1至3中任一项所述的化合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述认知障碍是与选自下列的疾病相关的认知障碍：精神分裂症、重度抑郁症、双相情感障碍、REM睡眠行为障碍、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、帕金森病、路易体病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底变性或肌萎缩性侧索硬化。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的方法，其中所述治疗量的化合物被口服施用至所述患者。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的式(I)的化合物用于制造药物的用途。
14.根据权利要求1至3中任一项所述的式(I)的化合物用于制造用于所述治疗和/或预防认知障碍的药物的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述认知障碍是与选自下列的疾病相关的认知障碍：精神分裂症、重度抑郁症、双相情感障碍、REM睡眠行为障碍、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、帕金森病、路易体病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底变性或肌萎缩侧索硬化。
CN202180047448.7A 2020-07-07 2021-07-06 1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲酰基)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]吡咯烷-2-腈 Pending CN117545738A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20382606.0 2020-07-07
EP20382606 2020-07-07
PCT/EP2021/068577 WO2022008477A1 (en) 2020-07-07 2021-07-06 1-[1-(4-benzyloxy-3,5-difluoro-benzoyl)-4-fluoro-pyrrolidine-2-carbonyl]-pyrrolidine-2-carbonitrile

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117545738A true CN117545738A (zh) 2024-02-09

Family

ID=71607883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180047448.7A Pending CN117545738A (zh) 2020-07-07 2021-07-06 1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲酰基)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]吡咯烷-2-腈

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20230250058A1 (zh)
EP (1) EP4178945A1 (zh)
JP (1) JP2023533932A (zh)
KR (1) KR20230035604A (zh)
CN (1) CN117545738A (zh)
AU (1) AU2021303440A1 (zh)
BR (1) BR112023000335A2 (zh)
CA (1) CA3185064A1 (zh)
IL (1) IL299035A (zh)
MX (1) MX2023000261A (zh)
TW (1) TW202216689A (zh)
WO (1) WO2022008477A1 (zh)
ZA (1) ZA202213708B (zh)

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6159938A (en) 1994-11-21 2000-12-12 Cortech, Inc. Serine protease inhibitors comprising α-keto heterocycles
DE19603510A1 (de) 1996-02-01 1997-08-07 Knoell Hans Forschung Ev Die Verwendung von Terrecyclolsäure A und Terrecyclolsäure A-Derivate als neue Inhibitoren der humanen Prolyl-Oligopeptidase
FI20011466A0 (fi) 2001-07-04 2001-07-04 Orion Corp Prolyylioligopeptidaasia inhiboivaa aktiivisuutta omaavia yhdisteitä, niiden valmistusmenetelmiä ja käyttö
FI20030014A0 (fi) 2003-01-03 2003-01-03 Orion Corp Prolyylioligopeptidaasia inhiboivaa aktiivisuutta omaavia yhdisteitä
FI20031018A0 (fi) 2003-07-04 2003-07-04 Orion Corp Parannus aivovammasta toipumiseen
WO2005027934A1 (ja) 2003-09-24 2005-03-31 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha プロリルオリゴペプチダーゼ阻害剤
US7667044B2 (en) 2003-11-03 2010-02-23 Probiodrug Ag Compounds for the treatment of neurological disorders
ES2302473B1 (es) 2006-12-22 2009-06-12 Universidad De Barcelona Agente terapeutico para el tratamiento del desorden afectivo bipolar en mamiferos.
EP2730571A1 (en) 2012-11-12 2014-05-14 Universitat De Barcelona 1-[1-(benzoyl)-pyrrolidine-2-carbonyl]-pyrrolidine-2-carbonitrile derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
MX2023000261A (es) 2023-04-13
US20230250058A1 (en) 2023-08-10
JP2023533932A (ja) 2023-08-07
BR112023000335A2 (pt) 2023-01-31
IL299035A (en) 2023-02-01
AU2021303440A1 (en) 2023-02-02
KR20230035604A (ko) 2023-03-14
ZA202213708B (en) 2024-04-24
EP4178945A1 (en) 2023-05-17
WO2022008477A1 (en) 2022-01-13
TW202216689A (zh) 2022-05-01
CA3185064A1 (en) 2022-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10611727B2 (en) 1-[1-(benzoyl)-pyrrolidine-2-carbonyl]-pyrrolidine-2-carbonitrile derivatives
US10975066B2 (en) Bis-heteroaryl derivatives as modulators of protein aggregation
TWI579269B (zh) 作爲ａｌｘ受體激動劑之經氟化橋聯之螺［２．４］庚烷衍生物
KR20000016700A (ko) 뎁시 펩티드 및 이를 유효 성분으로 하는 의약
US20230174582A1 (en) Vipr2 antagonist peptide
JP5801206B2 (ja) アルツハイマー病の治療のための化合物および方法
CN117545738A (zh) 1-[1-(4-苄氧基-3,5-二氟-苯甲酰基)-4-氟-吡咯烷-2-羰基]吡咯烷-2-腈
JP4169597B2 (ja) 神経変性疾患の処置のためのトリペプチド及びトリペプチド誘導体
WO2016172219A1 (en) Methods and compositions for inhibition of toll-like receptors (tlrs)-mediated inflammation
WO2011144714A1 (en) Kissorphin peptides for use in the treatment of alzheimer&#39;s disease, creutzfeldt- jakob disease or diabetes mellitus
AU2016356876B2 (en) Gelatinase inhibitors and use thereof
US20120157394A1 (en) Selective caspase inhibitors and uses thereof
AU2018314833B2 (en) Novel compounds activating the NRF2 pathway
US20060036073A1 (en) Neurotrophic and neuroprotective peptides
WO2008083543A1 (fr) Composés modifiés hétérocycliques contenant de l&#39;azote et leurs utilisations

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination