CN117545467A - 含有核酸的纳米颗粒 - Google Patents

Abstract

本文公开了包含磷脂、载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、甾醇、阳离子脂质或可电离的阳离子脂质和核酸的纳米颗粒，以及包含此类纳米颗粒的组合物和用于制备此类纳米颗粒的方法。纳米颗粒可以用作药物，例如通过刺激或抑制先天免疫应答来治疗疾病。

Description

含有核酸的纳米颗粒

发明领域

本发明涉及核酸治疗剂领域，并且提供了用于在靶位点处细胞内递送核酸的新颖的和创造性的纳米颗粒。本发明进一步涉及使用纳米颗粒的治疗方法，例如，通过刺激或抑制先天免疫应答来治疗疾病。本发明进一步涉及使用纳米颗粒将核酸引入细胞中的体内、体外或离体方法。

背景技术

核酸治疗剂(Nucleic acid therapeutics，NAT)诸如小反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)以及其他类型是具有调节基因表达潜力的革命性的新一类药物。近年来，已经批准了数种用于体内应用的基于核酸的药物产品，包含ASO、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-siRNA缀合物、含有siRNA或mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)和许多含有质粒DNA(pDNA)的病毒载体。此外，还有数个NAT处于后期临床试验。此外，已经批准了数种基因工程离体细胞疗法药物产品。

肠胃外施用之后核酸的治疗应用是挑战性的。尽管核酸类型在尺寸和物理化学性质上有所不同，但它们的共同特征包括它们的大的大分子尺寸和负电荷。因此，在全身施用时，由于肾脏过滤和核酸酶降解，核酸迅速从循环中被清除。此外，NAT在细胞内起作用，但不能轻易穿过细胞膜。最后，外源性核酸的施用引起免疫应答。虽然这可以是有利的(例如，对于疫苗开发)，但通常这导致核酸的快速清除和副作用。

为了克服这些挑战，所有的核酸治疗剂都依赖于化学修饰和/或基于纳米技术的递送系统。所有批准的NAT都依赖于化学修饰和/或纳米技术平台以促进其细胞内递送，并随后在肠胃外施用后诱导治疗作用：

1)ASO被高度化学修饰以增加其稳定性，降低免疫刺激作用并增加其功效。它们通过皮下施用至靶肝细胞或通过鞘内施用至中枢神经系统中的靶细胞。

2)GalNAc-siRNA缀合物与ASO类似地进行修饰并皮下施用。GalNAc部分确保肝细胞中脱唾液酸糖蛋白受体介导的摄取。

3)脂质纳米颗粒(LNP)直径为～50-100nm并且可以全身地、皮内地或肌内地施用。全身施用之后，LNP在肝细胞中高效积累，为基因沉默(siRNA)或蛋白质产生(mRNA)提供机会。皮内或肌内施用后，LNP被免疫细胞诸如抗原呈递细胞吸收，这可以用于疫苗目的。LNP是目前mRNA治疗剂的黄金标准，并且也可能成为用于体内基因编辑应用的标准递送平台。LNP含有与超敏反应和或过敏反应相关联的合成聚乙二醇(PEG)缀合的脂质。

4)病毒递送系统诸如腺病毒、慢病毒或腺相关病毒(AAV)载体是递送DNA的有效载体。病毒载体的特征在于其有限的有效载荷(payload)能力和免疫原性。然而，在免疫特权组织(immune-privileged tissue)诸如眼中，病毒载体构成目前用于NAT的黄金标准。病毒载体广泛地用于离体治疗剂(例如，CART)或经静脉内施用至肝脏中的靶细胞、玻璃体内(intravitreally)/视网膜下(subretinally)施用至视网膜中的靶细胞或肌内施用以用于疫苗目的。

除了基于病毒载体或LNP-mRNA的疫苗外，大多数已批准的核酸治疗剂是针对免疫疗法以外的其他适应症开发的。因此，将治疗性核酸递送到髓样隔室仍然是一个挑战。此外，核酸分子的化学修饰或病毒递送固有地具有免疫系统的不希望活化的风险，导致NAT的降解或清除。

例如，携带核酸的纳米颗粒已经描述于诸如WO2009127060A1中，其描述了与非阳离子脂质和核酸组合的阳离子脂质的用途。阳离子脂质中和核酸，允许形成可以用于在受试者中非靶向递送核酸的纳米颗粒。这些纳米颗粒的缺点是它们不能靶向髓样隔室。

其他系统，例如在WO2019103998A2中，描述了能够靶向髓样隔室的纳米生物制剂(nanobiologics)，该纳米生物制剂包含磷脂和ApoA1和小分子药物。这些纳米生物制剂的缺点在于，由于它们的疏水性核心，它们不允许掺入极性结构诸如核酸(例如DNA和RNA)。

因此，需要一种用于将治疗性核酸递送至髓样隔室的改进的递送系统。

发明内容

本发明人首先开发了允许将核酸货物递送至髓样隔室的纳米颗粒。更具体地，本发明人已经开发了稳定的、基于脂质的纳米级制剂(直径约10-200nm)，其包含载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、磷脂、甾醇、阳离子或可电离的阳离子脂质和核酸(诸如siRNA或mRNA)。不希望受任何理论的束缚，本发明人认为纳米颗粒的核心包含与(可电离的)阳离子脂质相互作用的核酸的组装体，其中该核心被包装并掩埋在包含载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、磷脂和甾醇的外保护表面或脂质壳内，该外保护表面或脂质壳起到表面屏障的作用。

将核酸适当且稳定地掺入到本发明的纳米颗粒中，而不需要合成的(非天然的)亲水性聚合物或此类聚合物的(脂质)缀合物，例如聚乙二醇(PEG)。

此外，本发明的纳米颗粒也不会不可控制地聚集和/或聚结(coalesce)，即使在此类合成的(非天然的)亲水性聚合物或此类聚合物的(脂质)缀合物不存在时。

此外，由于在纳米颗粒的外表面存在载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物，本发明的纳米颗粒具有针对髓样细胞和与免疫系统相关联的其他细胞的靶向能力。

此外，本文教导的纳米颗粒是稳定的，具有低毒性或无毒，具有高核酸滞留和高核酸活性。

本发明人已经进一步开发用于成功将核酸掺入基于载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物的纳米颗粒中的受控配制方法。

因此，本发明的第一方面提供了纳米颗粒，其包含：

核心，其由表面层包围，其中：

核心包含核酸和阳离子或可电离的阳离子脂质；和

表面层包含：

磷脂，

甾醇，和

载脂蛋白或载脂蛋白模拟物或其组合。

本发明进一步涉及包含根据本发明的纳米颗粒和生理学上可接受的载体的组合物。

本发明进一步涉及根据本发明的纳米颗粒或组合物用作药物。

本发明进一步涉及根据本发明的纳米颗粒或组合物用于通过刺激或抑制先天免疫应答来治疗疾病。

本发明进一步涉及用于产生纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：

a)在5.0或更低的pH下，将有机溶剂中的脂质组分与水性缓冲液中的核酸快速混合以产生脂质纳米颗粒，其中脂质组分包含磷脂、甾醇、阳离子脂质或可电离的阳离子脂质，以及任选的填料材料，优选甘油三酯；和

b)在6.0和8.0之间的pH下将脂质纳米颗粒(如根据a)所制备的)与载脂蛋白、载脂蛋白模拟物或其组合快速混合以产生纳米颗粒。

本发明进一步涉及用于将核酸引入细胞的体外或离体方法，该方法包括使根据本发明的纳米颗粒或组合物与细胞接触。

本发明进一步涉及通过根据本发明的方法可获得的或通过根据本发明的方法获得的根据本发明的纳米颗粒。

本发明进一步涉及用于将核酸引入细胞中的体内方法，该方法包括使根据本发明的纳米颗粒或组合物与细胞接触。

本发明进一步涉及根据本发明的纳米颗粒或组合物用于将核酸体内递送至受试者。

本发明进一步涉及用于体内递送核酸的方法，该方法包括向受试者施用根据本发明的纳米颗粒或组合物。

本发明进一步涉及用于通过刺激或抑制先天免疫应答来治疗有此需要的受试者中的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的纳米颗粒或组合物。

附图说明

图1：根据本发明某些实施方案的用于核酸递送的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)平台技术的示意性概述。不希望受任何理论的束缚，认为此类RNA-aNP由与(可电离的)阳离子脂质复合的含有任选的填料材料(例如甘油三酯)和核酸(例如RNA)的疏水核心构成。疏水核心被含有磷脂和甾醇的表面层或屏障(可能是单层)封闭和隔离。脂质纳米颗粒的表面还包含载脂蛋白，用于结构完整性、防止聚集、提供颗粒稳定性、提供天然隐形、和/或促进与免疫细胞的相互作用。

图2：根据本发明的某些实施方案的示例性方法的示意性概述，该方法用于产生如本文所述的含有核酸诸如RNA的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)。

图3：根据本发明某些实施方案的载脂蛋白纳米颗粒(aNP)中的siRNA滞留和没有载脂蛋白的对比实施例纳米颗粒(NP)的不稳定性。(A)根据图2(白色条)中描述的产生程序制备含有siRNA的代表性aNP(siRNA-aNP)18和34。此外，通过省略程序的第二步来制备对比NP，由此将载脂蛋白A1掺入制剂中(黑色条)。使用配制后一天的Ribogreen测定法来确定RNA滞留。(B)没有掺入载脂蛋白A1的对比实施例siRNA-NP制剂18的代表性图像。(C)对比实施例siRNA-NP制剂18的代表性低温透射电子显微图(比例尺50nm)。

图4：根据本发明某些实施方案的含有siRNA的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)(siRNA-aNP)的脂质组成影响它们的物理化学性质，并且可以被优化以获得具有最佳特性的siRNA-aNP。(A)配制一天后，根据以下确定文库的个体siRNA-aNP制剂的物理化学性质：使用动态光散射(DLS)评估的(i)颗粒尺寸(z-平均)和(ii)颗粒尺寸分散度，(iii)使用RiboGreen测定法的siRNA滞留，(iv)使用比色蛋白质定量测定法的载脂蛋白A1(apo-A1)，和使用标准比色定量测定法的(v)胆固醇和(vi)磷脂回收。显示了其中采用1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)或1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)的两种制剂类型的数据。(B)在产生后一天，根据使用动态光散射(DLS)的(i)颗粒尺寸(数均)和(ii)颗粒尺寸分散度的文库的个体siRNA-aNP制剂分析，其由制剂的甘油三酯含量显示。(C)在产生后一天，根据使用动态光散射(DLS)的颗粒尺寸(数均)和(ii)颗粒尺寸分散度的文库的个体siRNA-aNP制剂分析，其由制剂的N/P比率显示。N/P比率是所采用的可电离的阳离子材料的带正电荷的胺(N＝氮)基团与带负电荷的核酸磷酸盐(P)基团的比率。

图5：代表性低温透射电子显微图，其显示根据本发明某些实施方案的含有siRNA的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)(siRNA-aNP)的脂质组成可用于影响这些aNP的形态和尺寸。使用FEI TITAN 300kV使所有文库的个体siRNA-aNP制剂经受低温电子透射电子显微术，以确定颗粒尺寸、形态和制剂同质性(比例尺50nm)。

图6：根据本发明的某些实施方案的含有萤火虫萤光素酶siRNA的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)(siRNA-aNP)在体外诱导强效的报告基因表达敲低(knockdown)。(A)将用pmirGLO质粒(Promega)转染用于稳定的双报告萤光素酶表达(萤火虫和Renilla萤光素酶)的鼠RAW264.7巨噬细胞暴露于含有萤火虫萤光素酶(Fluc)siRNA的文库的个体siRNA-aNP制剂中48小时。根据制造商的方案(双Glo萤光素酶测定系统，Promega)进行发光分析。对含有非特异性siRNA的对照siRNA-aNP制剂的数据进行校正。(B)根据文库的个体siRNA-aNP制剂的磷脂类型和甘油三酯含量显示的萤火虫萤光素酶表达敲低数据。(C)根据文库的个体siRNA-aNP制剂的磷脂类型和N/P比率显示的萤火虫萤光素酶表达敲低数据。N/P比率是可电离的阳离子材料的带正电荷的胺(N＝氮)基团与带负电荷的核酸磷酸盐(P)基团的使用比率。

图7：根据本发明的某些实施方案的含有放射性标记的siRNA的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)(siRNA-aNP)在小鼠中静脉内施用后定位于造血组织(包含脾和骨髓)。(A)小鼠中静脉内施用后siRNA-aNP的生物分布。向C57BL/6小鼠(每种制剂n＝6)静脉内注射本发明的siRNA-aNP制剂或含有锆89-放射性标记的非特异性siRNA的对比实施例LNP制剂^#，剂量为2mg/kg siRNA。注射后24小时，处死小鼠，并收集器官用于通过γ计数进行定量分析。数据以每克组织注射剂量％(％ID/g)的平均值±标准差表示，并通过双因素方差分析(two-wayANOVA)和Tukey事后检验(Tukey’s post test)进行分析。*指示p值<0.05，****指示p值<0.0001。(B)生物分布结果显示为骨髓与肝脏每克组织的注射剂量％(％ID/g)的比率。^#Lnp-siRNA对比实施例由DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和PEG-DMG(50:38.5:10:1.5mol％)，和所包含的siRNA构成。

图8：根据本发明的某些实施方案的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)可以包封mRNA以产生稳定的制剂并在体外诱导基因表达。(A)含有萤火虫萤光素酶信使RNA(mRNA)的aNP的制剂使用图2中描述的方法制备。使用动态光散射(DLS)对根据本发明某些实施方案的mRNA-aNP制剂和LNP-mRNA对比实施例制剂^#的颗粒尺寸和颗粒尺寸分散度进行表征。使用Ribogreen测定评估mRNA截留效率。(B)代表性mRNA-aNP低温透射电子显微图(比例尺50nm)。(C)使人HEK293细胞暴露于含有萤火虫mRNA的aNP和对比实施例LNP中24小时。报告基因表达(左)通过发光确定，细胞存活(右)通过MTT测定法确定，表明mRNA-aNP在体外诱导剂量依赖性萤火虫萤光素酶表达而不诱导毒性。(D)使鼠RAW264.7巨噬细胞暴露于含有萤火虫mRNA的aNP中24小时。通过发光确定基因表达，表明mRNA-aNP在巨噬细胞培养物中诱导剂量依赖性萤火虫萤光素酶表达。(E).使原代鼠骨髓衍生的巨噬细胞暴露于含有萤火虫mRNA的aNP中24小时。通过发光确定基因表达，表明mRNA-aNP在原代细胞中诱导剂量依赖性萤火虫萤光素酶表达。^#LnP-mRNA对比实施例由DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和PEG-DMG(50:38.5:10:1.5mol％)，和所包含的mRNA构成。

图9：可以用于复合RNA(或其他核酸)的单价可电离的阳离子材料的分子结构，其用于掺入根据本发明的某些实施方案的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)。图9中提及的实施例1-15是实施例9的子实施例1-15。

图10：根据本发明的某些实施方案的含有siRNA的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)(siRNA-aNP)可以用各种可电离的阳离子材料制备，以产生稳定的制剂。图9中描述的含有磷脂、胆固醇、可电离的阳离子材料的siRNA-aNP制剂(可电离的阳离子脂质5、16、17和19分别是实施例10、13、9和8的分子，如图9所示)，甘油三酯，载脂蛋白A1和siRNA。使用图2中描述的程序产生siRNA-aNP制剂。配制一天后，文库的个体siRNA-aNP制剂和LNP-siRNA对比实施例制剂^#针对以下进行分析：使用动态光散射(DLS)的(A)颗粒尺寸和(B)颗粒尺寸分散度，以及(C)使用Ribogreen测定的siRNA滞留。^#Lnp-siRNA对比实施例由DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和PEG-DMG(50:38.5:10:1.5mol％)，和所包含的mRNA构成。

图11：表1：72个siRNAaNP制剂的文库的示例性制剂。

发明详述

如本文所用，单数形式“一种”、“一个”、“所述”和“该”包含单数和复数指示物，除非上下文另有明确规定。

如本文所用，术语“包括”与“包含”、“含有”同义，并且是包容性的或开放式的，并且不排除额外的、未叙述的成员、元素或方法步骤。该术语还涵盖在专利术语中具有公认含义的术语“由…构成”、“由…组成”，以及“基本上由…组成”。

由端点叙述的数值范围包含所有整数，并且在适当的情况下，包含在相应范围内的分数，以及所叙述的端点。这适用于数值范围，无论它们是否由表达“从…至…”或表达“…和…之间”或另一种表达引入。本文叙述的任何数值范围旨在包含其中包含的所有子范围。

如本文所用，术语“约”在涉及可测量的值诸如参数、量和持续时间等时，意指涵盖指定值的变化和从指定值的变化，例如指定值的或从指定值的+/-10％或更少，优选+/-5％或更少，更优选+/-1％或更少，并且还更优选+/-0.1％或更少，只要此类变化适合于在所公开的发明中执行。应当理解，修饰语“约”所指的值本身也被具体地并且优选地公开。

此外，除非特别说明，说明书和权利要求中的术语第一、第二和第三等用于区分相似的元素，而不一定用于描述按顺序的或按时间的次序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或示出的其他顺序操作。

尽管术语“一个或更多个”或“至少一个”，例如一组成员中的一个或更多个成员或至少一个成员本身是清楚的，但通过进一步举例的方式，除其他外，该术语涵盖提及所述成员中的任何一个，或所述成员中的任何两个或更多个，例如诸如所述成员中的任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7个等，直到所有所述成员。在另一个实例中，“一个或更多个”或“至少一个”可以指1、2、3、4、5、6、7或更多个。

如本文所用，当在两个或更多个项目的列表中使用术语“和/或”时，意味着可以单独采用所列项目中的任何一个，或者可以采用所列项目中的两个或更多个的任何组合。例如，如果列表被描述为包含组A、B和/或C，则该列表可以包含单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合或者A、B和C组合。

本文包含对本发明的背景的讨论以解释本发明的上下文。这不应被视为承认所提及的任何材料在任何权利要求的优先权日之前在任何国家是公开的、已知的或是公知常识的一部分。

在本公开整篇中，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过识别引文(identifying citation)被引用。本说明书中引用的所有文件通过引用其整体并入本文。特别地，本文特别引用的此类文件的教导或节段通过引用并入。

除非另有定义，在本发明公开中使用的所有术语，包含技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导的方式，包含术语定义以更好地理解本发明的教导。除非另有定义，否则当结合本发明的具体方面或本发明的具体实施方案来定义特定术语时，此类内涵或含义意味着适用于整个说明书，即也适用于本发明的其他方面或实施方案的上下文中。

在以下段落中，更详细地定义本发明的不同方面或实施方案。如此定义的每个方面或实施方案可以与任何其他方面或实施例组合，除非清楚地相反指示。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他特征组合。

在整个说明书中提及“一个实施方案”、“实施方案”是指结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施方案中。因此，在贯穿此说明书的各处中出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定是全部指同一实施方案，而是可以指同一实施方案。此外，在一个或更多个实施方案中，特定特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合，这对于本领域技术人员来说从本公开中是显而易见的。此外，如本领域技术人员所理解的，虽然本文所描述的一些实施例包含一些特征，但不包含其他实施方案所包含的其他特征，但是不同实施方案的特征的组合意图在本发明的范围内，并且形成不同的实施方案。例如，在所附权利要求中，可以以任何组合使用所要求保护的实施方案中的任何一个。

类似地，应当理解，在本发明的示例性实施方案的描述中，本发明的各种特征有时在单个实施方案、附图或其描述中组合在一起，以用于简化本公开并帮助理解各创造性方面中的一个或更多个的目的。

术语“体外”在本领域中是充分理解的，并且特别地可以是指使用已经从其自然条件中分离的生物体的组分进行的实验或测量。

如本文所用，术语“离体”在本领域中是充分理解的，并且特别地可以是指在对自然条件的最小化改变的外部环境中在来自生物体的组织中或组织上进行的实验或测量。

术语“核酸”、“核酸分子”和“多核苷酸”是本领域充分理解的。通过进一步指导的方式，该术语通常是指基本上由核苷单元构成的任何长度的聚合物(优选线性聚合物)。核苷单元通常包含杂环碱基和糖基团。杂环碱基尤其可以包含嘌呤和嘧啶碱基，例如广泛存在于天然存在的核酸中的腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)、其他天然存在的碱基(例如黄嘌呤、肌苷、次黄嘌呤)以及化学或生物化学修饰的(例如甲基化的)非天然或衍生的碱基。示例性的修饰核碱基包括但不限于5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包含2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。特别地，5-甲基胞嘧啶取代已显示增加核酸双链体稳定性。糖基团可以特别的包含戊糖(呋喃戊糖(pentofuranose))基团，诸如优选地天然存在的核酸中常见的核糖和/或2-脱氧核糖，或阿拉伯糖、2-脱氧阿拉伯糖、苏糖或己糖糖基团，以及修饰或取代的糖基团(例如但不限于2’-O-烷基化的，例如2’-O-甲基化的或2’-O乙基化的糖，诸如核糖；2’-O-烷氧基烷基化的，例如2’-O-甲氧基乙基化的糖，诸如核糖；或2’-O,4’-C-亚烷基连接的，例如2’-O,4’-C-亚甲基连接的或2’-O,4-C-亚乙基连接的糖，诸如核糖；2-氟-阿拉伯糖等)。核苷单元可以通过大量已知的核苷间键中的任何一种彼此连接，尤其包含在天然存在的核酸中常见的磷酸二酯键，以及进一步修饰的基于磷酸酯或膦酸酯的键，诸如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、烷基硫代磷酸酯诸如甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯诸如甲基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯、磷酸三酯诸如烷基磷酸三酯、氨基磷酸酯、哌嗪磷酸酯、吗啉酸酯(phosphoromorpholidate)、桥接氨基磷酸酯、桥接亚甲基膦酸酯、桥接硫代磷酸酯；以及进一步硅氧烷、碳酸酯、氨基磺酸酯、烷氧羰基、乙酰氨基酸酯(acetamidate)、氨基甲酸酯诸如3’-N-氨基甲酸酯、吗啉代、硼烷(borano)、硫醚、3’-硫缩醛和砜核苷间键。优选地，核苷间键可以是基于磷酸酯的键，包括修饰的基于磷酸酯的键，例如更优选磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键或其组合。术语“核酸”还涵盖任何其他含有核酸碱基的聚合物，诸如核酸模拟物，包括但不限于肽核酸(PNA)、具有磷酸酯基团的肽核酸(PHONA)、锁核酸(LNA)、吗啉代磷酸二酰胺-主链核酸(PMO)、环己烯核酸(CeNA)、三环-DNA(tcDNA)和具有含有烷基接头或氨基接头的主链部分的核酸(参见，例如，Kurreck 2003(Eur J Biochem270:1628–1644))。本文中使用的“烷基”特别涵盖低级烃部分，例如C₁-C₄线性或支化的、饱和或不饱和的烃，诸如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和异丙基。

本文所指的核酸可以包含天然存在的核苷、修饰的核苷或其混合物。修饰的核苷可以包含修饰的杂环碱基、修饰的糖部分、修饰的核苷间键或其组合。术语“核酸”进一步优选地包含DNA、RNA和DNA/RNA杂合分子，具体包含hnRNA、前mRNA、mRNA、cDNA、基因组DNA、扩增产物、寡核苷酸和合成的(例如化学合成的)DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。核酸可以是天然存在的，例如存在于自然界中或从自然界分离的，可以是重组的，即通过重组DNA技术产生的，和/或可以部分或完全化学或生物化学合成的。“核酸”可以是双链、部分双链或单链。在单链的情况下，核酸可以是正义链或反义链。此外，核酸可以是环状的或线性的。

在某些实施方案中，该术语可以旨在包含DNA分子和RNA分子，以及锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、吗啉代或肽核酸(PNA)。核酸(分子)可以是任何核酸(分子)，例如其可以是单链或双链。

可以互换使用的术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”在本领域中是充分理解的，并且特别地可以指需要诊断、预后或疗法的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。该术语可以例如指动物，优选温血动物，更优选脊椎动物，甚至更优选哺乳动物，还更优选灵长类，并且可以具体包含人患者和非人哺乳动物和灵长类。优选的患者是人受试者，包含两种性别及其所有年龄类别。哺乳动物受试者包含人、家畜、农场动物和动物园动物、运动动物或宠物动物诸如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛和熊等。如本文所定义的，受试者可以是活的或死亡的。样品可以从死后的(即死亡后)受试者采集，和/或样品可以从活着的受试者采集。优选地，受试者是人。

术语“治疗”或“处理”在本领域中是充分理解的，并且可以特别地涵盖对已经发展的疾病或状况的治疗性治疗，以及预防性或预防的措施，其中目的是预防或减少不希望的痛苦发生的机会，例如预防疾病或病症的发生、发展和进展。有益的或需要的临床结果可以包括但不限于一种或更多种症状或一种或更多种生物标志物的减轻、疾病程度的缩减、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓和疾病状态的改善或缓和等。“治疗”也可以指与不接受治疗的预期生存期相比延长生存期。

当用于本文时，术语“纳米颗粒”特别是指小颗粒，例如直径在约10nm至约200nm范围内的小颗粒，其可以用于将有效载荷递送至靶标，例如受试者中的器官或细胞。

当用于本文时，当涉及靶向细胞(诸如靶细胞，例如但不限于髓样细胞)或靶向组织或器官时，术语“靶向”应理解引入预期的细胞、器官或组织附近，或富集到预期的细胞、器官或组织附近。这暗示当靶向预期的细胞、器官或组织时，平均更多的纳米颗粒在预期的细胞、器官或组织附近，如基于颗粒的随机或自然分布所预期的。本文中附近是指定位于，使得纳米颗粒可以与细胞(或组织或器官)相互作用以递送其有效载荷(核酸)。

术语“髓样细胞”在本领域中是充分理解的，并且可以特别指衍生自巨核细胞、粒细胞、单核细胞、红细胞的共同祖细胞的血细胞。髓样细胞是免疫系统的主要细胞隔室，包含单核细胞、树突状细胞、组织巨噬细胞和粒细胞。当在本文中使用时，术语髓样隔室是指生物体中髓样细胞的全体。

术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指式C_nH_2n+1的烃基，其中n是大于或等于1的数。烷基基团可以是线性或支化的，并且可以如本文所述被取代。通常，本发明的烷基基团包含1至18个碳原子，优选1至17个碳原子，优选1至15个碳原子，优选1至6个碳原子，，优选1至5个碳原子，，优选1至4个碳原子，更优选1至3个碳原子，还更优选1至2个碳原子。当本文在碳原子之后使用下标时，该下标是指所指定的基团可以含有的碳原子的数目。例如，作为基团或基团的一部分，术语“C_1-6烷基”是指式-C_nH_2n+1的烃基基团，其中n为范围为1至6的数。因此，例如，“C_1-6烷基”包含具有1至6个碳原子的所有线性或支化烷基基团，并且因此包含甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基及其异构体(例如正丁基、异丁基和叔丁基)；戊基及其异构体、己基及其异构体。例如，“C_1-5烷基”包含所有包含所有具有1至5个碳原子的线性或支化烷基基团，并且因此包含甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基及其异构体(例如正丁基、异丁基和叔丁基)；戊基及其异构体。例如，“C_1-4烷基”包含所有具有1至4个碳原子的线性或支化烷基基团，并且因此包含甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基及其异构体(例如正丁基、异丁基和叔丁基)。例如，“C_1-3烷基”包含所有具有1至3个碳原子的线性或支化烷基基团，并且因此包含甲基、乙基、正丙基、异丙基。

当后缀“ene”与烷基(alkyl)基团结合使用时，即“亚烷基(alkylene)”，这意为指如本文所定义的具有两个单键作为与其他基团的连接点的烷基基团。本文所用的术语“C_1-6亚烷基”，其本身或作为另一取代基的一部分，是指二价的C_1-6烷基，即具有两个单键用于连接两个其他基团。亚烷基基团可以是线性或支化，并且可以如本文所述被取代。亚烷基基团的非限制性实例包括亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂-CH₂-)、甲基亚甲基(-CH(CH₃)-)、1-甲基-亚乙基((-CH(CH₃)-CH₂-)、n-丙烯(-CH₂-CH₂-CH₂-)、2-甲基丙烯(-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-)、3-甲基丙烯(-CH₂-CH₂-CH(CH₃)-)、n-丁烯(-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-)、2-甲基丁烯(-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-CH₂-)、4-甲基丁烯(-CH₂-CH₂-CH₂-CH(CH₃)-)、戊烯及其链状异构体、己烯及其链状异构体。

作为基团或基团的一部分，术语“烯基(alkenyl)”是指不饱和烃基基团，其可以是线性的或支化，包含一个或更多个碳-碳双键。当本文在碳原子之后使用下标时，该下标是指所指定基团可以含有的碳原子的数目。例如，术语“C_2-6烯基”是指不饱和烃基基团，其可以是线性的或支化，包含一个或更多个碳-碳双键并且包含2至6个碳原子。例如，C_2-4烯基包含所有具有2至4个碳原子的线性或支化烯基基团。C_2-6烯基基团的实例是乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-戊烯基及其异构体、2-己烯基及其异构体、2,4-戊二烯基等。

作为基团或基团的一部分，术语“芳基”是指具有单环(即苯基)或稠合在一起的多个芳环(例如萘基)或共价连接的多不饱和芳烃基基团，通常含有6至24个碳原子，优选6至12个原子；优选6至10，其中至少一个环是芳族的。合适的芳基的实例包含C_6-10芳基，更优选C_6-8芳基。C_6-12芳基的非限制性实例包括苯基；联苯基；联苯基；或1-或2-萘基(naphthanelyl)；1-、2-、3-、4-、5-或6-四氢萘(tetralinyl)(也称为1,2,3,4-四氢化萘)；1-、2-、3-、、4-、5-、、6-、、7-或8-甘菊基(azulenyl)，4-、5-、6-或7-茚基，4-或5-茚满基，5-、6-、7-或8-四氢萘基(tetrahydronaphthyl)；1,2,3,4-四氢萘基；和1,4-二氢萘基(dihydronaphthyl)；1-、2-、3-、4-或5-芘基。当后缀“ene”与芳基结合使用时；即亚芳基(arylene)，这意为指如本文所定义的具有两个单键作为与其他基团的连接点的芳基基团。合适的“C_6-12亚芳基”基团包含1,4-亚苯基、1,2-亚苯基、1,3-亚苯基、亚联苯基(biphenylylene)、亚萘基、亚茚基和1-、2-、5-或6-亚四氢化萘(tetralinylene)等。当芳基基团中的至少一个碳原子被杂原子替换时，所得到的环在本文中称为杂芳基环。杂原子可以选自由O、N、P和S组成的组；优选为O或N。

作为基团或基团的一部分，术语“亚烷基-芳基”是指其中至少一个氢原子被至少一个如本文所定义的芳基替换的如本文所定义的亚烷基。亚烷基-芳基基团通常含有7至25个碳原子。亚烷基-芳基基团的非限制性实例包含苄基、苯乙基、二苄基甲基、甲基苯基甲基和3-(2-萘基)-丁基等。作为基团或基团的一部分，术语“亚芳基-烷基”是指其中至少一个氢原子被至少一个如本文所定义的烷基替换的如本文所定义的亚芳基。亚芳基-烷基基团通常含有7至25个碳原子。

酯、酰胺、羧酸和醇基团定义如下，其中Rp代表氢原子或环状、线性或支化烷基或亚烷基基团。在含有超过一个Rp元素的组中，可以独立选择这些元素。此文件中所示的酯(官能)基团或部分应理解为根据式：-C(O)-O-的基团。此文件中所示的酰胺(官能)基团或部分应理解为根据式：-NRp-C(O)-的基团。此文件中所示的羧酸(官能)基团或部分应理解为根据式：-C(O)OH的部分或基团。此文件中所示的醇(或羟基)官能基团或部分应理解为根据式：-OH的基团。

本发明构成了适用于将NAT递送至髓样细胞隔室的纳米颗粒平台技术。本文所描述的纳米颗粒是由载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物稳定化的(磷)脂基纳米颗粒，该载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物通过防止降解和快速清除来保护循环中的NAT有效载荷。同时，纳米颗粒通过限制与血液中组分的不需要的相互作用，减少NAT的免疫刺激相关的副作用。此外，本发明能够高效核酸治疗剂递送到淋巴器官(诸如骨髓和脾脏)中的髓样细胞隔室，以用于有效的免疫疗法。

如本文所描述的纳米颗粒是脂质基的纳米尺寸制剂(直径～10-200nm，例如在某些实施方案中～30-200nm)，其具有疏水性核心以及覆盖外表面的载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物。在不受理论束缚的情况下，本发明人认为纳米颗粒的核心包含与(可电离的)阳离子脂质相互作用的核酸的组装体，其中此核心被包装并掩埋在包含载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、磷脂和甾醇的外保护表面或脂质壳内，该外保护表面或脂质壳起到表面层或屏障的作用。载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物可以使用疏水和/或带电(离子)相互作用与外保护表面的其他组分相互作用。外保护表面可能还包含一些未与核酸组分复合的(可电离的)阳离子脂质。图1提供了本发明的纳米颗粒的印象的示意性概述。载脂蛋白是螺旋蛋白，由于其两亲性特征，其对脂质层具有固有的亲和力。有几类载脂蛋白，并且所有都可以用作纳米颗粒制剂的结构组分。载脂蛋白整合通过提供结构稳定性来影响纳米颗粒的物理化学性质和贮存期限。此外，载脂蛋白的存在调节纳米颗粒的生物行为。例如，载脂蛋白A1经由B类1型清除剂(scavenger receptor)受体(SRB1)和ATP结合盒转运蛋白(transporter)ABCA1与细胞相互作用。这增加了纳米颗粒与淋巴器官中髓样细胞的相互作用。

由于它们的两亲性特征，纳米颗粒制剂中的磷脂在疏水核心和水性溶剂之间的界面处积累，有效地形成脂质单层膜，或表面层或屏障。对于生物用途，使用单一或多个磷脂类型，因为它们固有的生物相容性和净中性电荷。任选地，可以添加摩尔百分比(～1-95mol％；相对于所采用磷脂的总量)的带电荷脂质诸如1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)或1,2-二油酰-Sn-甘油-3-磷酸酯(18PA)，以给予整个制剂特定的带电荷特征。

将如本文所教导的纳米颗粒工程化为与天然亲水的核酸复合，因此需要辅助分子以将核酸吸引到疏水的纳米颗粒核心中。为此目的，采用阳离子疏水分子。阳离子基团可以经由离子相互作用与磷酸糖主链中的阴离子磷酸酯基团复合。辅助分子的疏水部分在亲水性核酸分子周围形成壳。阳离子辅助分子可以是永久带电的或可电离的。它们包含商业上可获得的或内部合成的多种分子，但它们需要遵守两个普遍标准：1)带正电荷的基团，以能够与带负电荷的磷酸糖主链复合。2)疏水部分以形成疏水壳并能够在纳米颗粒核心中整合。纳米颗粒制剂中阳离子材料的含量的范围可以为1:1至25:1的阳离子对阴离子比率。此比率(通常称为N/P(氮/磷酸酯)比率)是基于(可电离的)阳离子脂质(通常基于氮)中的正电荷数比核酸有效载荷(通常为磷酸酯)中的负电荷数。因此，N/P比率是阳离子或可电离的脂质组分中阳离子和/或可电离的基团的累积摩尔量(N)与核酸组分中磷酸酯基团的累积摩尔量(P)之间的比率。在具体实施方案中，如本文所教导的纳米颗粒的N/P比率为1至25、1至20、1至15、1至12、1至9、1至6或1至3。例如，如本文所教导的纳米颗粒的N/P比率可以为3、6、9或12。

除了核酸和阳离子辅助分子之外，额外的疏水分子(例如填料材料(即填料或填料分子))可以包含在纳米颗粒制剂的核心中。它们的主要应用是改变纳米颗粒物理化学性质和/或提高稳定性。

预期含有治疗性核酸的纳米颗粒精确调节髓样细胞隔室中的基因表达，并且从而调节免疫应答。如本文所教导的纳米颗粒平台技术的主要优势在于在不改变aNP制剂的生物行为和相互作用的情况下交换核酸有效载荷的可能性。含有治疗性核酸的纳米颗粒从而可以作为免疫疗法实施，其促进免疫应答以治疗例如癌症或传染性疾病，或抑制免疫应答以治疗例如自身免疫性疾病或在器官移植期间。

因此，在第一方面，本发明涉及纳米颗粒，其包含以下、基本由以下组成或由以下组成：

载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物；

磷脂；

甾醇；

阳离子脂质、可电离的阳离子脂质或其组合；

核酸；和

可选地，填料材料。

在不受理论束缚的情况下，本发明人认为本文所描述的纳米颗粒具有主要包含载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、磷脂和甾醇的外层以及包含阳离子或可电离的阳离子脂质和货物(即核酸)的核心。更具体地，如本说明书其他地方所描述，如本文所教导的纳米颗粒的核心包含与(可电离的)阳离子脂质相互作用的核酸的组装体，其中本发明的纳米颗粒的此核心被脂质壳包围，该脂质壳包含载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、磷脂和甾醇、基本由或由载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、磷脂和甾醇组成。

纳米颗粒可以用于将货物递送至其预期目的地，例如细胞、组织或器官。优选地，核酸货物在靶细胞、组织或器官中进行细胞内递送。

在具体的实施方案中，核酸位于纳米颗粒内(即在其内部)。换句话说，在具体实施方案中，核酸不位于纳米颗粒的外表面处和/或不暴露于纳米颗粒的周围。

在具体的实施方案中，载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物位于纳米颗粒的外表面处和/或暴露于纳米颗粒的周围。

在具体的实施方案中，本发明涉及包含被表面层包围的核心的纳米颗粒，其中：

核心包含核酸和阳离子或可电离的阳离子脂质、基本上由或由核酸和阳离子或可电离的阳离子脂质组成；和

表面层包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：

磷脂，

甾醇，和

载脂蛋白或载脂蛋白模拟物或其组合。

发现通过使用载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物，例如ApoA1，纳米颗粒可以在体外、离体和在体内成功地靶向髓样隔室。这具有的优点在于，免疫祖细胞可以成为药物的靶标，以刺激或抑制先天免疫应答。有几种治疗应用，其中此类使用被认为是有益的，例如但不限于癌症、心血管疾病、自身免疫性病症和异种移植排斥。

因为本文所描述的纳米颗粒具有与HDL颗粒相同的外观，所以纳米颗粒不会引发可以导致纳米颗粒在到达其预期靶标(例如髓样隔室)之前被免疫系统过早降解或清除的免疫应答。

本发明基于这样的认识，即基于载脂蛋白的纳米颗粒或基于载脂蛋白模拟物的纳米颗粒可以成功地被修饰以容纳核酸。这可以通过以下特征的组合实现：

-使用阳离子或可电离的阳离子脂质以中和核酸以允许其装载在纳米颗粒的疏水核心中；

-定义纳米颗粒的结构组分和/或它们的相对量的范围，例如载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、甾醇、磷脂、阳离子或可电离的阳离子脂质和任选的填料材料(例如甘油三酯)的量。

本发明的纳米颗粒不同于本领域中描述的任何纳米颗粒。

在具体实施方案中，本发明的纳米颗粒毒性低或是无毒的。

在具体的实施方案中，本发明的纳米颗粒的核心不被脂质双层包围，例如存在于具有包围水性核心的脂质双层的囊泡样或脂质体颗粒中。

在具体的实施方案中，本发明的纳米颗粒不包含合成的(非天然的)亲水性聚合物或此类聚合物的(脂质)缀合物，例如最明显的聚乙二醇(PEG)。因此，此类纳米颗粒不会引发不需要的免疫应答，特别是在重复施用时。

在具体的实施方案中，此发明的纳米颗粒的有效载荷(即核酸)不受颗粒外部(表面)处的离子相互作用的束缚。核酸与颗粒外部表面的结合是不需要的，因为核酸暴露于紧接的周围环境中可能使颗粒更具毒性以及导致核酸有效载荷的快速(生物)降解。

在具体的实施方案中，本发明的纳米颗粒基本上或完全可生物降解。在具体实施方案中，本发明的纳米颗粒由天然或生物相容的构建块形成。例如，本发明的纳米颗粒基本上由或由C、H、N、O、S和P原子，以及额外的抗衡阳离子和/或阴离子组成。在具体的实施方案中，本发明的纳米颗粒不包含无机物和/或金属(例如固体Au或Ag)。无机物和/或金属不是或较少是生物可降解的，并且对于体内使用很大程度上是不相容的。在进一步的具体实施方案中，本发明的纳米颗粒的核心不包含无机物和/或金属(例如固体Au或Ag)。

纳米颗粒的核心可以是固体，并且在核心中不具有或携带显著的水性空隙(void)或储库(reservoir)。在具体实施方案中，纳米颗粒的核心是非水性的。

本发明人进一步开发了成功地将核酸掺入基于载脂蛋白和/或的载脂蛋白模拟物的纳米颗粒中的方法，因为不能简单地将个别的组分混合以获得本文所描述的纳米颗粒。发现进行两步反应是必要的，其中在第一步中，形成含有核酸的纳米颗粒，并且在接下来的第二步中，使载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物包含在纳米颗粒中。优选地，第一步在低pH下进行，并且第二步在生理pH下进行。该发现首次允许将核酸包含在基于载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物的纳米颗粒中，从而允许将所述核酸递送至髓样隔室。

当用于本文时，纳米颗粒是指小颗粒，例如直径在约10nm至约200nm范围内的小颗粒，其可以用于将有效载荷递送至靶标，例如受试者中的器官或细胞。

当用于本文时，受试者可以是人或非人动物，例如哺乳动物，优选人。

填料材料

本文所描述的纳米颗粒可以进一步包含填料材料(本文也称为“填料”或“填料分子”)，例如但不限于脂质诸如甘油三酯。因此，在一个实施方案中，纳米颗粒进一步包含选自三酰甘油酯(triacylglyceride)(也简称为甘油三酯)和胆固醇酰基酯(也称为胆甾醇酯(cholesteryl ester))或其组合的填料，优选其中三酰甘油酯是三辛酸甘油酯和/或其中胆固醇酰基酯是胆甾醇辛酸酯和/或胆甾醇油酸酯。胆甾醇乙酸酯也可以用作填料材料。可以应用的其他填料材料是甘油二酯或甘油三酯或衍生自C1-C18羧酸，优选C6-C18脂肪酸的其他酯，其中这些羧酸和脂肪酸可以是饱和的或不饱和的。优选地，填料是衍生自C6-C18脂肪酸的甘油三酯。

本文所描述的纳米颗粒可以形成纳米盘或纳米球，即不同形状的颗粒。纳米颗粒的形状可以取决于填料材料的存在与否。填料可以是例如甘油三酯，其与有效载荷(核酸)和阳离子或可电离的阳离子脂质一起包含在颗粒的核心中。应当理解，包含更多的填料可能会使纳米颗粒变得更大，直到颗粒变得不稳定的一定程度。在不受理论束缚的情况下，包含填料材料可以有助于使纳米颗粒稳定化，或者它可以使对有效载荷的包含稳定化，或者它可以调节或增强核酸的递送。

核酸

许多不同类型的RNA、DNA或合成寡核苷酸已被用作核酸治疗剂。本发明不限于特定类型的核酸，因为本发明预期与可以使用纳米颗粒中的阳离子或可电离的阳离子脂质装载的任何类型的核酸共同起作用。因此，在一个实施方案中，核酸是RNA或DNA或核酸类似物。

在优选的实施方案中，RNA是微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi-相互作用RNA(piRNA)、小核RNA(snoRNA)、转移RNA(tRNA)，tRNA衍生的小RNA(tsRNA)、小调节RNA(srRNA)、信使RNA(mRNA)、修饰的mRNA、核糖体RNA(rRNA)、长非编码RNA(lncRNA)或引导RNA(gRNA)或其组合和/或其修饰。

在具体实施方案中，反义寡核苷酸是单链DNA或RNA。

在优选的实施方案中，DNA是单链或双链DNA。

在优选的实施方案中，反义寡核苷酸是由含有磷酸二酯主链或2’核糖的修饰的核苷酸或核苷类似物组成的单链DNA或RNA，优选其中核苷酸或核苷类似物选自锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、吗啉代或肽核酸(PNA)。

在本发明的一个实施方案中，核酸是缀合的，并且将核酸缀合物掺入本发明的纳米颗粒中。核酸缀合物包含与例如磷脂或与甾醇(诸如胆固醇)或与疏水烷基链的脂质缀合物。核酸缀合物还包含与低聚物或聚合物的缀合物。优选地，这些低聚物或聚合物具有疏水性。

在本发明的实施方案中，核酸照此或“原样(as is)”掺入本发明的纳米颗粒内，这意味着核酸没有被缀合。据推测，此实施方案的纳米颗粒以优选的生物相容方式表现。

载脂蛋白

本文所用术语“载脂蛋白”是指与脂质一起形成脂蛋白(即脂质和蛋白质的组装体)的蛋白质。该术语涵盖野生型载脂蛋白(例如特别是人野生型载脂蛋白)，及其生物活性片段，载脂蛋白的生物活性变体或其生物活性片段，包含生物活性突变体(例如天然存在的突变体或非天然存在的突变体)载脂蛋白或其生物活性片段。载脂蛋白的典型功能是运输血液中的脂质和脂溶性物质。本发明描述了载脂蛋白，包括但不限于ApoA1、ApoA1-Milano、ApoA2、ApoA4、ApoA5、ApoB48、ApoB100、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoC-IV、ApoD、ApoE、ApoF、ApoH、ApoL和APOM。

本说明书中所用的涉及肽、多肽或蛋白质的术语“片段”通常表示肽、多肽或蛋白质的部分，例如通常是肽、多肽和蛋白质的N-和/或C-末端截短形式。优选地，片段可以包含所述肽、多肽或蛋白质的氨基酸序列长度的至少约30％，例如至少约50％或至少约70％，优选至少约80％，例如至少约85％，更优选至少约90％，并且还更优选至少约95％或甚至约99％。

术语蛋白质、多肽、肽或核酸的“变体”通常是指蛋白质、多肽或肽的氨基酸序列或核酸的核苷酸序列与蛋白质、多肽、肽或核酸的序列基本相同(即很大程度上但不是完全相同)，例如至少约80％相同或至少约85％相同，例如优选至少约90％相同，例如至少91％相同、92％相同，更优选至少约93％相同，例如至少94％相同，甚至更优选至少约95％相同，例如至少96％相同，还更优选至少约97％相同，例如至少98％相同，并且最优选与所叙述的蛋白质、多肽、肽或核酸的序列至少99％相同。优选地，当在序列对齐中查询所叙述的蛋白质、多肽、肽或核酸的全序列时，变体可以显示与所叙述的蛋白质、多肽、肽或核酸的此类同一性程度(即，总序列同一性)。可以使用本身已知的用于进行序列对齐和序列同一性确定的合适算法来确定序列同一性。示例性但非限制性的算法包含那些基于由Altschul etal.1990(J Mol Biol 215:403-10)最初描述的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)，例如Tatusova and Madden 1999(FEMS Microbiol Lett 174:247-250)描述的“BLAST 2序列”算法，例如使用公开的默认设置或其他合适的设置(诸如，例如对于BLASTN算法：空位开放成本＝5，空位扩展成本＝2，错配惩罚＝-2，匹配奖励＝1，空位x_衰减(gapx_dropoff)＝50，期望值＝10.0，字长(word size)＝28；或者对于BLASTP算法：矩阵＝Blosum62(Henikoff et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.,89:10915-10919)，空位开放成本，空位扩展成本＝1，期望值＝10.0，字长＝3)。

确定特定氨基酸序列和查询多肽的氨基酸序列之间的同一性百分比的示例程序需要使用合适的算法参数使用Blast 2序列(Bl2seq)算法对齐两个氨基酸序列，该算法可在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)作为网络应用程序或独立可执行程序(BLAST版本2.2.31+)获得。

蛋白质、多肽或肽的变体可以包含相对于(即，相比于)对应蛋白质或多肽的一个或更多个氨基酸添加、缺失或取代。

术语“生物活性的”可以与诸如“功能活性的”或“功能性的”术语互换，表示片段和/或变体至少部分保留各自或相应的肽、多肽或蛋白质的生物活性或预期的功能性。提及肽、多肽或蛋白质的“活性”通常可以涵盖肽、多肽或蛋白质的生物活性的任何一个或更多个方面，诸如但不限于其例如在细胞、组织、器官或生物体内的生物化学活性、酶活性、信号传导活性、相互作用活性、配体活性和/或结构活性的任何一个或更多个方面。

优选地，与对应的肽、多肽或蛋白质相比，功能活性片段或变体诸如突变体可以保留至少约20％，例如至少约25％，或至少30％，或至少约40％，或者至少约50％，例如至少60％，更优选至少约70％，例如至少80％，还更优选至少约85％，还更优选至少约90％，并且最优选至少约95％或甚至约100％的预期生物活性或功能。在某些实施方案中，与对应的肽、多肽或蛋白质相比，功能活性片段或变体甚至可以表现出更高的生物活性或功能性，例如与相应的肽、多肽或蛋白质相比，可以表现出至少约100％，或至少约150％，或至少约200％，或至少约300％，或至少约400％，或至少约500％的预期生物活性或功能性。以例举的方式，当给定的肽、多肽或蛋白质的活性可以在具有定量输出的测定(例如酶测定或信号传导测定或产生可定量信号的结合测定)中容易地测量时，肽、多肽或蛋白质的功能活性片段或变体可以产生为相应肽、多肽或蛋白质产生的信号的至少约20％，或至少约25％，或至少30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少60％，更优选至少约70％，或至少80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约100％，或至少约150％，或至少约200％，或至少约300％，或至少约400％，或至少约500％的信号。

以例举但不限制的方式，载脂蛋白的生物活性片段或变体将至少部分地保留相应的天然或野生型载脂蛋白的生物活性的一个或更多个方面。例如，提及载脂蛋白的生物活性可以特别指示与纳米颗粒表面层的组分(例如磷脂和甾醇)相互作用的能力，稳定化如本文所教导的纳米颗粒的能力和/或靶向髓样隔室(诸如靶向髓样细胞)的能力。

当用于本文时，术语载脂蛋白可以进一步指载脂蛋白模拟物。载脂蛋白模拟物是模拟载脂蛋白特性的短肽，例如至多50个氨基酸，如18-聚体或36-聚体。ApoA1模拟肽的实例通常称为“18A”，其是具有氨基酸序列：DWLKAFYDKVAEKLKEAF(SEQ ID NO:1)的肽，其具有未官能化的N-末端和C-末端。另一报道的、更方便并且也更活性的模拟的是ApoA1模拟肽“2F”，其为Ac-DWLKAFYDKVAEKLKEAF-NH2(SEQ ID NO:2)，即具有乙酰胺加帽的(capped)N-末端和酰胺C-末端的ApoA1模拟肽18A。在Leman,L.J.et al.,J.Med.Chem.2014,57,2169-2196(10.1021/jm4005847)中，特别是在表2和表3中描述了ApoA1肽模拟物的进一步实例。其他ApoA1肽模拟物，诸如二聚体、三聚体和四聚体肽，在Zhou et al.,J.Am.Chem.Soc.2013,135,13414-13424(dx.doi.org/10.1021/ja404714a)中说明。优选的ApoA1肽模拟物是18A、2F和4F，以及这些肽的任何多聚体。更优选的是2F和该肽的任何二聚体或三聚体。

载脂蛋白是结合脂质以形成脂蛋白的蛋白质。它们在血液、脑脊液和淋巴液中运输脂质和脂溶性维生素。脂蛋白的脂质组分不溶于水。然而，由于它们的两亲性性质，载脂蛋白和其他两亲性分子诸如磷脂可以包围脂质，产生本身水溶性的脂蛋白颗粒，并且因此可以通过水基循环(即血液、细胞外液、淋巴)携带。除了稳定化脂蛋白结构和溶解脂质组分外，载脂蛋白与脂蛋白受体和脂质转运蛋白相互作用，从而参与脂蛋白的摄取和清除。它们还充当参与脂蛋白代谢的特定酶的酶辅因子。

载脂蛋白A1是在人中由APOA1基因编码的蛋白质。在具体实施方案中，载脂蛋白A1是人载脂蛋白A1。通过进一步的指导，人载脂蛋白A1前体被注释在UniProt登录号P02647.1(www.uniprot.org)下。作为HDL颗粒的主要组分，它在脂质代谢中具有特定的作用。该蛋白质作为HDL颗粒的组分，通过接受来自细胞(包括动脉壁内的巨噬细胞，其从氧化的LDL颗粒中摄入的脂肪而变得超负荷)内的脂肪使脂肪分子流出，用于运输(在细胞外的水中)到其他地方，包括回到LDL颗粒或肝脏以进行排泄。

可以预期，任何载脂蛋白都可以用于纳米颗粒中。因此，在实施方案中，载脂蛋白选自ApoA1、ApoA1-Milano、ApoA2、ApoA4、ApoA5、ApoB48、ApoB100、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoC-IV、ApoD、ApoE、ApoF、ApoH、ApoL和ApoM，优选地选自ApoA1、ApoA2、ApoA4、ApoA5、ApoB100、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoC-IV和ApoE，更优选地选自ApoA1、ApoA4、ApoA5、ApoB100、ApoC-III和ApoE，甚至更优选地选自ApoA1、ApoB100和ApoE。在尤其优选的实施方案中，载脂蛋白是ApoA1，因为它允许纳米颗粒非常有效地靶向髓样隔室。在替代的优选实施方案中，载脂蛋白是ApoE，因为它允许纳米颗粒靶向树突状细胞。

在具体实施方案中，载脂蛋白是野生型载脂蛋白或其片段，优选全长野生型载脂蛋白。

在具体实施方案中，载脂蛋白是载脂蛋白的变体或其片段，或载脂蛋白的突变体或其片段。

可以通过本领域已知的方法产生和纯化载脂蛋白，例如从大肠杆菌细菌或从其他生物体表达重组蛋白，然后进行分离(足够)纯形式的载脂蛋白(例如ApoA1)所需的步骤。也可以通过应用本领域已知的一系列纯化方法(诸如Chapman MJ,Goldstein S,Lagrange D,Laplaud PM.Adensity gradient ultracentrifugal procedure for the isolation ofthe major lipoprotein classes from human serum.J Lipid Res.1981Feb；22(2):339-58.PMID:6787159中所描述的)从血液中分离载脂蛋白。可以根据本领域已知的肽合成方案和缀合方法合成载脂蛋白肽模拟物。

本发明人发现，使用纳米颗粒中的载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物在靶位点处递送核酸具有数种优势。首先，载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物通过在制备和储存期间防止聚集使纳米颗粒稳定。为了使纳米颗粒保持在稳定的乳液中，纳米颗粒不聚集或融合是必要的，聚集或融合可以导致颗粒沉淀。载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物有助于使颗粒稳定并防止聚集。此外，载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物确保纳米颗粒的体内稳定性。因为载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物天然存在于血流中循环的脂质颗粒(诸如LDL和HDL)上，所以它们不会被免疫系统识别为非自身，从而确保天然隐形，而不是通过化学修饰或其他非天然方法来提高稳定性。最后，载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物的使用促进了所需的与免疫细胞的相互作用，例如在髓样隔室中递送核酸货物。

因此，在一个实施方案中，纳米颗粒中的载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物用于：

-在制备和储存时防止聚集；

-提高体内稳定性；

-提供天然隐形；和/或

-促进与免疫细胞的相互作用。

阳离子脂质和可电离的阳离子脂质

当用于本文时，术语可电离的阳离子脂质是指在生理pH(例如在pH 7至7.5，优选在pH 7.3至7.5，诸如在-pH 7.4)具有中性电荷并且在较低pH(例如在pH 1至5，优选在pH 1至4，诸如在pH 4)被质子化或带正电荷的脂质。应当理解，可电离的阳离子脂质是特别有用的，因为它们可以在低pH被质子化，从而促进与亲水性核酸的结合。通过随后提高pH，脂质可以变为(部分)中性，进一步促进包含在疏水环境诸如纳米颗粒的疏水核心中。替代地，不受理论束缚，由于包含磷脂甾醇和载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物的纳米颗粒的表面层的作用，和/或由于纳米颗粒内的非水性环境，即使周围水性溶液的pH已提高至生理pH诸如约7.4，可电离的脂质也可以在纳米颗粒内保持带正电荷。此外，可电离的阳离子脂质理论上促进靶细胞中核酸的内质体逃逸，其中由于低pH，可电离的阳离子脂质将被质子化。

可电离的阳离子脂质的非限制性实例为DLin-DMA(2-[2,2-双(十八烷基-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊环(dioxolan)-4-基]-N，N-二甲基乙胺)、DLin-KC2-DMA(2-[2,2-双[(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯基]-1,3-二氧戊环(dioxolan)-4-基]-N,N-二甲基乙胺)和如以下的式1所表示的DLin-MC3-DMA([(6Z,9Z,28Z,31Z)-四十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基]4-(二甲基氨基)丁酸酯)(DLin-MC3-DMA([(6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl]4-(dimethylamino)butanoate))：

式1

实际上，可以采用宽范围的可电离的阳离子脂质(包含类脂质)用于制备此发明的纳米颗粒，因为文献中已经开发和报道了各种系列的可电离的阳离子脂质。进一步的非限制性实例包含分子cKK-E12、C12-200、L319、Acuitas-A9、Moderna-L5、TT3和ssPalmE(例如Witzigmann et al.,Advanced Drug Delivery Reviews 159(2020)344–363；doi.org/10.1016/j.addr.2020.06.026中所描述的)。

可电离的脂质可以进一步为可电离的甘油三酯。非限制性实例为由式2表示的化合物：

式2

可电离的脂质可以进一步为胆固醇酯(cholesterol ester)(也称为胆甾醇酯(cholesteryl ester))。非限制性实例由式3表示：

式3

当用于本文时，术语阳离子脂质是指在生理pH(例如pH 7.4)带正电荷的脂质。阳离子脂质的非限制性实例为DOTMA(1,2-二-O-十八烷基-3-三甲基铵丙烷)、DOGS(2,5-双(3-氨基丙基氨基)-N-[2-[二(十七烷基)氨基]-2-氧代乙基]戊酰胺)、DOSPA(2-[3-[4-(3-氨基丙基氨基)丁基氨基]丙基氨基甲酰基氨基]乙基-[2,3-双[[(Z)-十八烷-9-烯酰基]氧基]-二甲基铵)和DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷)。其他实例包含任何可电离的阳离子脂质分子，其中叔胺部分已经例如通过烷基化诸如通过甲基化(-Me)、乙基化(-Et)、苄基化(-Bn)或乙氧基化(-CH₂CH₂-OH)被转变为季铵部分。所得的季铵分子具有永久的正(阳离子)电荷，并且因此也携带抗衡阴离子诸如氯离子。

在实施方案中，仅使用可电离的阳离子脂质来制备本发明的纳米颗粒。因此，在实施方案中，如本文所教导的纳米颗粒不包含阳离子脂质。

在实施方案中，仅使用阳离子脂质来制备本发明的纳米颗粒。因此，在实施方案中，如本文所教导的纳米颗粒不包含可电离的阳离子脂质。

在实施方案中，使用可电离的阳离子脂质和阳离子脂质的组合来制备本发明的纳米颗粒。

当在本文使用时，术语“有效载荷”通常是指包含在颗粒中并在靶位点递送的物质。当提及本发明的纳米颗粒时，术语“有效载荷”是指核酸，优选与阳离子和/或可电离的阳离子脂质组合的核酸。

术语“脂质”在本领域中是公知的，并且如本文所使用的，可以特别地被认为涵盖脂质，即天然存在的疏水性生物分子诸如，例如脂肪酸、脂肪酸的单甘油酯、二甘油酯或三甘油酯、甾醇(衍生物)或磷脂，以及脂质样生物分子。注意，本文所描述的阳离子脂质或可电离的阳离子脂质(或类脂质)通常不是该术语最狭义解释范围内的脂质，即天然存在的疏水性生物分子诸如，例如脂肪酸、单甘油酯脂肪酸、二甘油酯脂肪酸或三甘油酯脂肪酸、甾醇(衍生物)或磷脂，而是类似于脂质生物分子的脂质样生物分子，即它们优选含有生物相容的基团(诸如，例如酯或酰胺)，和/或使用天然存在的构建块(例如脂肪酸、甘油、胆固醇)构建。在实施方案中，阳离子或可电离的阳离子脂质选自长链醇的可电离的阳离子酯、甘油二酯的可电离的阳离子酯或甾醇的可电离的阳离子酯，或其组合。

长链醇的可电离的阳离子酯可以例如是具有羧基基团的叔胺的酯，具有羧基基团的叔胺例如具有式(CH₃)₂N(CH₂)_nCOOH的化合物，其中n是1或更大的整数，例如n是1至12；例如3-二甲基氨基-丙酸或4-二甲基氨基丁-酸或5-二甲基氨基-戊酸。酯是由长链醇形成的。长链醇优选为长度为8个或更多个(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)碳原子的具有线性或分支链的伯醇或仲醇。

甘油二酯的可电离的阳离子酯为优选为与具有羧基基团的叔胺在1或2位处偶联的二酰基甘油(即甘油二酯)，具有羧基基团的叔胺例如具有式(CH₃)₂N(CH₂)_nCOOH的化合物，其中n是1或更大的整数，例如n是1至12；例如3-二甲基氨基-丙酸或4-二甲基氨基-丁酸或5-二甲基氨基-戊酸。二酰基甘油可以包含中链或长链饱和或不饱和脂肪酸或其衍生物或修饰。

甾醇的可电离的阳离子酯优选是与具有羧基基团的叔胺在羟基基团处偶联的甾醇酯，具有羧基基团的叔胺诸如具有式(CH₃)₂N(CH₂)_nCOOH的化合物，其中n是1或更大的整数，例如n是1至12；例如3-二甲基氨基-丙酸或4-二甲基氨基-丁酸或5-二甲基氨基-戊酸。甾醇可以是胆固醇、豆甾醇或β-谷甾醇。

在上文中，羧基化合物以式(CH₃)₂N(CH₂)_nCOOH表示，其中n是1或更大的整数。作为此化合物的代替，可以采用具有式NH₂-(C＝NH)-NH-(CH₂)_nCOOH的替代化合物，其中n是1或更大的整数，例如n是1至12。。该羧基化合物包含胍基团而不是叔胺基。

为了制备本发明的纳米颗粒，可电离的阳离子脂质可以例如选自根据式(I)至(V)的分子。

/>

式(I)代表甘油三酯，其中可电离的阳离子基团(ICG)包含在1位。

式(II)代表与式(I)所代表的相同类型的甘油三酯，尽管该分子在天然存在的构型中是立体特异性定义的，即如其在磷脂中一样：ICG基团与磷脂中的磷酸基团在相同位置。

式(III)代表甘油三酯，其中可电离的阳离子基团(ICG)包含在2-位。

式(IV)表示二酯(或三酯)，其中可电离的阳离子基团(ICG)经由酰胺官能团连接。

式(V)代表胆甾醇酯，其中可电离的阳离子基团(ICG)经由酯官能团连接。

对于式(I)至(V)中的任一个，可电离的阳离子基团(ICG)经由波形键连接到分子的其余部分，其中ICG可以代表叔胺(ICG类型A，或ICG-A)，或其可以代表胍(ICG类型B，或ICG-B)。

在式(I)至(IV)中，对于每个位置，R₁可以独立地选择，并且其表示线性或支化C1-C19烷基、线性或支化C1-C19烯基、芳基、亚芳基-烷基或亚烷基-芳基，其中所述烷基或烯基基团任选地含有5个独立地选自O和N的杂原子。优选地，根据式(I)至(IV)中的任一个的特定分子内的每个R₁基团是相同的R₁基团。优选地，R₁基团是线性或支化C5-C19烷基基团，或线性或支化C5-C19烯基基团。当R₁为烯基基团时，该基团优选仅具有一个单双键。更优选地，R₁基团是线性或支化C9-C17烷基基团或线性或支化C5-C17烯基基团。优选R₁是线性C5-C15烷基基团或线性C17-C19烯基。衍生自R₁的羧酸，即R₁-COOH，优选是天然存在的脂肪酸分子诸如癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、油酸或亚油酸。优选的是C10-C16饱和脂肪酸以及油酸(C18，不饱和)。

整数p是离散数，不是平均值；p可以是0至11。优选地，p是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9。更优选地，p是1、2、3或4。

式(IV)中的R₂基团可以选自氢、甲基、乙基和-CH₂-O-C(O)-R_1a基团(其中R_1a具有与上述定义的R₁相同的含义)。优选地，R₂是氢、甲基或-CH₂-O-C(O)-R₁基团。更优选地，R₂是甲基。

式(IV)中的R₃基团可以选自氢、芳基、亚芳基-烷基、亚烷基-芳基或线性C1-C6烷基基团。优选R₃为氢或甲基。更优选地，R₃是氢。

ICG-A中对于每个位置的R_x基团可以独立地选自甲基、乙基、丙基和亚乙基-羟基(-CH₂＝CH₂-OH)基团中，优选其为甲基。优选地，ICG-A中的两个R_x基团是相同的基团，并且它们优选是甲基。

ICG-B中对于每个位置的R_y基团可以独立地选自氢、线性或支化C1-C18烷基、芳基、亚芳基-烷基或亚烷基-芳基基团，其中所述烷基基团任选地含有多达5个独立地选自O和N的杂原子。优选地，R_y基团选自氢和线性C1-C6烷基基团。甚至更优选地，R_y基团是氢。优选地，ICG-B中的所有四个R_y基团是相同的基团，并且它们优选是氢。

从式(I)至(V)中，优选式(I)、(II)和(IV)。更优选的是式(I)和(II)。

从ICG ICG-A和ICG-B中，优选ICG-A，即优选叔胺可电离的阳离子脂质。

根据式(I)至(V)中任一个的可电离的阳离子脂质分子具有高于250道尔顿、优选高于350道尔顿、更优选高于450道尔顿的分子量。其具有低于3000道尔顿、优选低于1800道尔顿、更优选低于1200道尔顿的分子量。

由式(I)至(V)代表的分子可以以各种异构形式诸如旋转异构体、互变异构体、立体异构体或位置异构体存在，并且所有这些都包含在本发明的范围内。

根据式(I)至(V)中任一个的可电离的阳离子脂质优选是单一化合物，即不是化合物的混合物。因此，式(I)至(V)的可电离的阳离子脂质的纯度优选为50％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，最优选95％或更高。在可电离的阳离子脂质是化合物的混合物的情况这，这优选地仅是由于分子中存在不明确的立体中心。一个实例是在外消旋来源的可电离的阳离子脂质中使用支化烷基链。其他实例是甘油三酯，其中甘油实体中三个羟基基团上的取代模式不是立体特异性定义的。

根据式(I)至(V)中的任一个的可电离的阳离子脂质可以通过本领域已知的合成方法制备。在本申请的实施例部分，尤其是实施例9中，呈现了可电离的阳离子脂质的各种非限制性合成。

(可电离的)阳离子脂质优选可以从溶液中加工。因此，(可电离的)阳离子脂质优选在极性范围的溶剂中是可溶的。因此，(可电离的)阳离子脂质优选可溶于辛酸甘油酯、乙醇或异丙醇中，更优选可溶于所有这三种溶剂中。溶解度可以通过以下来检查，将约20mg(可电离的)阳离子脂质在约1克三辛酸甘油酯、乙醇或异丙醇中搅拌，并评估是否所有材料自发溶解以产生浓度为约2w/w％的澄清/透明溶液。可以在约20℃(室温)或约37℃进行测试。优选地，(可电离的)阳离子脂质在室温下是可溶的。

(可电离的)阳离子脂质优选是无毒的，或者其本身或当与核酸结合或共同测试时，或者在本发明的纳米颗粒中测定时，可以具有有限的和低的毒性。毒性细胞测试可以通过本领域已知的方法执行诸如，例如通过细胞存活MTT测定，或通过类似或相当的测试。

进一步的方面提供了根据上面更详细说明的式(I)至(V)中任一个的可电离的阳离子脂质分子。进一步的方面提供了根据式(I)至(V)中任一个的可电离的阳离子脂质分子在制备纳米颗粒(例如含核酸的纳米颗粒)中的用途，例如其中可电离的阳离子脂质分子用于与核酸复合。

甾醇

当用于本文时，术语甾醇是指通过用其他化学基团取代一些氢原子或修饰环中的键而衍生自甾醇(2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-醇)的化合物。甾醇和相关化合物在真核生物的生理学中起着重要作用。例如，胆固醇形成动物细胞膜的一部分，其影响细胞膜的流动性并在发育信号传导中充当第二信使。当在本文使用时，甾醇可以例如是指选自胆固醇、链甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、麦角甾醇、藿烷类(hopanoid)、羟甾类(hydroxysteroid)、植物甾醇(phytosterol)、甾类、氢化胆固醇、菜油甾醇(campesterol)、动物甾醇(zoosterol)或其组合的甾醇。在纳米颗粒中，甾醇维持或调节膜流动性(即在纳米颗粒的磷脂表面(单)层屏障中)。在实施方案中，甾醇选自胆固醇、豆甾醇或β-谷甾醇或其组合。在实施方案中，甾醇是胆固醇、麦角甾醇、藿烷类、羟甾类、植物甾醇、甾类、动物甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇。在优选的实施方案中，甾醇是或包含胆固醇。

磷脂

磷脂(Phospholipid)，也称为磷脂(phosphatide)，是一类脂质，其分子具有由甘油分子连接的含有磷酸酯基团的亲水头部和由脂肪酸衍生的两个疏水尾部。

如果磷脂是海洋磷脂(marine phospholipid)，则磷脂通常具有作为磷脂分子的一部分整合的omega-3脂肪酸EPA和DHA。简单的有机分子诸如胆碱、乙醇胺或丝氨酸可以用于修饰磷酸酯基团。

磷脂是所有细胞膜的关键组分。由于它们的两亲性特征，它们可以形成脂质双层。在真核生物中，细胞膜还含有另一类脂质，即散布在磷脂中的甾醇(特别是胆固醇)。该组合提供了与抗破裂的机械强度相结合的二维流动性。

因此，在实施方案中，磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油或其组合。

磷脂中的酰基基团可以分别为中链或长链脂肪酸。在实施方案中，磷脂中的至少一个、优选两个酰基基团是长链脂肪酸，优选其中所述长链脂肪酸选自C14、C16和C18链，即选自肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸和油酸，或其组合。

在特别优选的实施方案中，磷脂是中性磷脂，这意味着其在生理pH是两性离子的(其具有净中性电荷)。因此，在优选的实施方案中，磷脂是磷脂酰胆碱(PC)或磷脂酰乙醇胺(PE)。

因此，可以使用的磷脂的非限制性实例是二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二月桂酰磷脂酰丝氨酸(DLPS)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其组合。

溶血磷脂(Lyso-phospholipid)是其中一个酰基基团通过水解被除去，留下醇基基团的磷脂。因此，这些分子具有一个而不是两个脂肪酸链。这些磷脂也可以用于例如调节如本文所教导的纳米颗粒的外层的形状、功能和流动性。可以采用1-肉豆蔻酰-2-羟基-sn-甘油磷酰胆碱(MHPC)、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PHPC)和1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SHPC)或其混合物作为溶血磷脂。

在实施方案中，用于制备本发明的纳米颗粒的所有磷脂都具有天然来源，这意味着它们存在于任何种类的天然环境诸如，例如在某些细胞膜中。因此，这些磷脂是生物相容的和可生物降解的。天然来源的磷脂可以从天然源(大豆、牛奶、油菜籽、鸡蛋、向日葵等)中分离和纯化，但它们也可以通过(半)合成方法制备和纯化。

纳米颗粒特征

本发明实施方案的纳米颗粒包含核酸、阳离子和/或可电离的阳离子脂质、磷脂、甾醇、载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物和任选的填料材料，基本上由或由核酸、阳离子和/或可电离的阳离子脂质、磷脂、甾醇、载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物和任选的填料材料组成，其中：

载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物的量范围为0.1至90重量％；和/或

核酸的量范围为0.01至90重量％；和/或

磷脂的量范围为0.1至95重量％；和/或

甾醇的量范围为0.1至95重量％；和/或

阳离子和/或可电离的阳离子脂质的量范围为0.1至95重量％，和

任选存在的填料材料的量范围为0至95重量％，其中这些重量百分比是基于载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、核酸、磷脂、甾醇以及阳离子和/或可电离的阳离子脂质加上任选的填料材料的合并量，即这五种或六种组分相加达到纳米颗粒重量的100％。

在实施方案中，载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物的量范围为0.2至50重量％，例如3至20重量％或4至20重量％，更优选0.5至30重量％，更优选1至20wt％。

在实施方案中，核酸的量范围为0.02至30重量％，更优选0.05至20重量％，更优选0.1至15重量％，例如0.5至5重量％。

在实施方案中，磷脂的量范围为0.2至60重量％，更优选为1至50重量％，例如10至50重量％，更优选为3至40重量％，例如10至40wt％。

在实施方案中，甾醇的量范围为0.2至90重量％，更优选为0.5至70重量％，例如2至65重量％，更优选为1至50重量％、例如2至45重量％、10至45重量％或10至20重量％。

在实施方案中，阳离子和/或可电离的阳离子脂质的量范围为0.2至90重量％，更优选0.5至80重量％，更优选1至70重量％，例如5至60重量％、8至60重量％、9至60重量％、10至60重量％、15至25重量％或20至60重量％。

在实施方案中，任选的填料或填料分子的量范围为0至90重量％，更优选0至80重量％，更优选0至70重量％，例如0至65重量％。

在具体实施方案中，任选的填料或填料分子的量范围为20至80重量％，更优选30至70重量％，甚至更优选30至65重量％，例如40至65重量％、45至55重量％或30至60重量％。

在具体实施方案中，如本文所教导的纳米颗粒不包含填料或填料分子。

如上所示的这些重量百分比是基于载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、核酸、磷脂、甾醇和阳离子和/或可电离的阳离子脂质以及任选的填料材料的合并量，即这五种或六种组分相加达到这些陈述的上下文中的纳米颗粒重量的100％。

发现由在这些范围内的载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、磷脂、甾醇和阳离子和/或可电离的阳离子脂质构建的纳米颗粒是稳定的，并且可以成功地掺入核酸。

纳米颗粒的外层由磷脂、载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物以及甾醇构成。在优选的实施方案中，载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物与磷脂基于重量的比率为2:1至1:10，因为这允许组装稳定的纳米颗粒。因此，在实施方案中，所采用的载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物与磷脂基于重量的比率为2:1至1:10，更优选为1:1至1:5，甚至更优选为1:1.5至1:4。

在实施方案中，纳米颗粒中组分的相对量与用于制备纳米颗粒的他们的比率有关。

在配制和任选地纯化本发明的纳米颗粒之后，可以评估各种纳米颗粒组分的滞留(或回收或截留)。这可以通过本领域已知的方法来完成。例如，RNA滞留可以使用Ribogreen测定法来确定，而载脂蛋白A1(Apo-A1)回收可以使用比色蛋白质定量测定法来评估。胆固醇和磷脂的回收可以使用标准比色定量测定法来确定。本发明的纳米颗粒的各种组分的回收是高的。

在实施方案中，纳米颗粒中组分的相对量与在配制和任选纯化后纳米颗粒中组分的确定掺入水平有关。

在实施方案中，在纳米颗粒中的核酸(例如siRNA或mRNA)滞留优选为1％或更高，优选为5％或更高，更优选为20％或者更高，例如40％或者更高、甚至更优选为50％或更高，例如60％或更高、70％或更高或80％或更高。

在实施方案中，纳米颗粒中的甾醇(例如胆固醇)回收为1％或更高，优选10％或更高，更优选30％或更高，例如40％或更高、甚至更优选50％或更高，例如60％或更高、70％或更高、80％或更高或85％或更高。

在实施方案中，纳米颗粒中的磷脂回收为1％或更高，优选10％或更高，更优选30％或更高，例如40％或更高，甚至更优选50％或更高，例如60％或更高、70％或更高或80％或更高。

在实施方案中，纳米颗粒中载脂蛋白(例如Apo-A1)和/或载脂蛋白模拟物的回收为1％或更高，优选为5％或更高，更优选为10％或更高，甚至更优选20％或更高，例如30％或更高或35％或更高。

在实施方案中，载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物的量范围为0.05至2.0mol％，例如0.10至2.0mol％或0.08至0.5mol％；和/或磷脂的量范围为5至90mol％，例如15至90mol％或8.0至50mol％；和/或甾醇的量范围为2.5至65mol％，例如2.5至50mol％或4至65mol％；和/或阳离子或可电离的阳离子脂质的量范围为5.0至80mol％，例如8.0至80mol％或5至65mol％，其中摩尔百分比仅基于纳米颗粒中载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、磷脂、甾醇和阳离子和/或可电离的阳离子脂质的合并量。发现由在这些范围内的载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、磷脂、甾醇和阳离子和/或可电离的阳离子脂质构建的纳米颗粒是稳定的，并且可以成功地掺入核酸。

纳米颗粒的外层由磷脂、载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物和甾醇构成。为了组装稳定的纳米颗粒，优选载脂蛋白与磷脂的比率(基于摩尔重量百分比)为1:25与1:400之间。因此，在实施方案中，基于摩尔重量百分比的载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物与磷脂的比率为1:25与1:400之间，更优选1:50与1:200之间，甚至更优选1:75与1:150之间。

发现根据本发明的纳米颗粒具有相对明确和恒定的尺寸。换句话说，根据本发明的纳米颗粒在尺寸上是均匀的。平均尺寸可能很大程度上取决于核心组分，即核酸的量和类型、阳离子和/或可电离的阳离子脂质的量以及填料的量。应当理解，填料是任选的，并且通过包含增加量的填料可能可以增加颗粒尺寸。在实施方案中，根据本发明的纳米颗粒具有约10至约200nm，约20至约200nm，或约30至约200纳米，优选约30至约100纳米的平均尺寸，优选其中平均尺寸是指颗粒直径。

在具体实施方案中，尺寸是z-平均尺寸或数均尺寸。

本发明的纳米颗粒的尺寸可以通过本领域已知的方法来评估。例如，可以采用动态光散射(DLS)来测量纳米颗粒的直径。低温TEM测量也可以用于此目的。这两种技术也可以用于评估所制备的纳米颗粒制剂的直径分布(或分散度)。

在具体的实施方案中，如本文所教导的纳米颗粒的组内的颗粒尺寸分散度为0和0.5之间，优选0和0.4之间，更优选0与0.3之间并且最优选0与0.2之间。

本发明的纳米颗粒的形状和性质可以通过例如低温TEM测量来评估。颗粒的形状可以是球形或近似球形。颗粒的形状也可以是椭圆状或甚至蠕虫状。颗粒也可以是盘状的。优选地，颗粒的形状是球形的、近似球形的和/或稍微椭圆形的。优选地，颗粒的形状不是盘状。优选地，颗粒本质上表现为固体，即在颗粒内观察不到明显的或大的内部水性隔室。低温TEM观察到的颗粒不必是完全均匀的，即电子密度可以在颗粒内变化。优选地，本发明的颗粒具有相似的尺寸和形状，即在尺寸和形状上没有大的分布。如本文所定义的纳米颗粒包含疏水核心和亲水表面，因此可以溶解在水或水性溶液诸如盐溶液或缓冲液中。由本发明所定义的纳米颗粒的成分所导致的固有性质导致纳米颗粒在悬浮液中稳定数月，例如至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少4个月、至少6个月，至少8个月，至少10个月或至少12个月。合适的水性缓冲液是本领域已知的，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris缓冲盐水(TBS)。合适的盐溶液是已知的，并且非限制性实例包含NaCl或KCl的水性溶液。当意图将纳米颗粒施用于受试者时，应将纳米颗粒悬浮于用于此目的的生理上可接受的载体中。例如，如果纳米颗粒意图用于静脉内递送，则生理上可接受的载体通常是与血液等渗的流体。例如，可以使用浓度为0.9％w/v的氯化钠溶液、5％w/v的右旋糖溶液、林格氏溶液、林格氏乳酸盐或林格氏醋酸盐，但其他合适的载体是已知的。

因此，在一个方面，本发明涉及包含根据本发明的纳米颗粒和生理上可接受的载体的组合物。在实施方案中，组合物是药物组合物。应当理解，组合物可以进一步包含额外的组分，例如但不限于制药学药物或生物制药学药物。这可能是对于核酸(包含在纳米颗粒中)和药物的组合疗法的有吸引力的选择。药物可以是小化合物、抗体或抗原结合片段、进一步的纳米颗粒，但不限于此。

用途

本文所描述的纳米颗粒的目的是将核酸递送至细胞或将核酸疗法递送至受试者。核酸可以是例如编码要在细胞中表达的感兴趣的肽或蛋白质的mRNA，或者可以包含短核酸诸如旨在干扰基因表达(例如基因沉默)的siRNA、shRNA，或者其可以包含CRISPR-Cas或相关系统(例如gRNA)的组分以诱导细胞基因组中的突变。因此，通常核酸(纳米颗粒的有效载荷)的作用模式是在细胞质或细胞核中。因此，纳米颗粒优选具有至少以下特性：1)它允许靶向预期的靶细胞，和2)它允许递送其中可以维持其作用的有效载荷(因此在大多数情况下在靶细胞的细胞质或细胞核中)。

本发明的进一步的方面涉及用作药物的根据本发明的纳米颗粒或根据本发明的组合物。

应当理解，包含纳米颗粒的核酸疗法可以施用于有此需要的受试者。取决于靶细胞或组织，施用可以是肠胃外的，例如静脉内、肌肉内或皮下。施用可以进一步是口服、舌下、局部、直肠、鼻(吸入)或阴道。此外，靶组织或细胞的靶向由载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物的适当选择来确定。在实施方案中，根据本发明的纳米颗粒或组合物的用途包括将核酸递送至髓样隔室或脾。这可以例如通过静脉内胃肠外施用来实现。优选地，载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物是髓样隔室靶向的载脂蛋白诸如ApoA1。

本发明人已经发现，如本文所教导的纳米颗粒能够有效地将核酸治疗剂递送到淋巴器官中的髓样细胞隔室，例如但不限于骨髓和脾脏，以进行有效的免疫疗法。实际上，本发明人已经发现，在系统注射后，本发明的纳米颗粒可以靶向与免疫细胞的存在相关联的组织(脾、骨髓)。

进一步的方面提供了用于免疫疗法的如本文所教导的纳米颗粒，或如本文教导的组合物。

在一个方面，本发明涉及用于通过刺激或抑制先天免疫应答来治疗疾病的根据本发明的纳米颗粒或根据本发明的组合物，优选其中所述疾病是从刺激或抑制受试者中的先天免疫应答中受益的疾病，例如特征为缺陷型先天免疫应答的疾病，更优选其中要治疗的所述疾病是癌症，心血管疾病、自身免疫性病症或异种移植排斥。因此，根据本发明的纳米颗粒可以用于治疗任何与免疫系统有关的疾病诸如任何免疫病症，或用于治疗调节免疫应答被认为是可行的治疗选择的任何疾病或病症。

在进一步的方面，本发明涉及用于体内递送核酸的方法，该方法包括将根据本发明的纳米颗粒或根据本发明的组合物施用于受试者。

在进一步的方面，本发明涉及通过刺激或抑制先天免疫应答来治疗有此需要的受试者种的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的纳米颗粒或根据本发明的组合物。在具体的实施方案中，疾病或病症是以缺陷型先天免疫应答为特征的疾病或病症。在实施方案中，疾病或病症选自癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病或异种移植排斥。

通过靶向髓样隔室，核酸疗法可以成功地递送至不同血细胞类型的祖细胞，而不是存在于血液和组织中的已经分化的细胞诸如T细胞和巨噬细胞。在这样做时，取决于所需的结果，可以通过核酸疗法调节(例如刺激或抑制)先天免疫应答。例如，在自身免疫性病症、心血管疾病或异种移植排斥(预防)中，需要抑制自身免疫应答，而在癌症中，需要刺激对靶癌症细胞的免疫应答。

纳米颗粒制剂–aNP的制备

本发明提供了具有核酸的基于载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物的纳米颗粒(在本文中，本发明的这些颗粒有时称为aNP)。到目前为止，不可能将核酸包含在此类纳米颗粒中，因为此类颗粒的核心是疏水性的，因此由于其亲水性特点而不适合掺入核酸。尽管已经描述了将可电离的阳离子脂质与核酸一起使用作为用于细胞内递送核酸的工具，但将可电离的阳离子脂质和核酸与其他脂质组分简单组合不会导致形成本文所述的脂质纳米颗粒。例如，将核酸(例如siRNA或mRNA)与脂质体制剂混合将产生使核酸暴露于其水性周围环境中的颗粒，使核酸易于快速降解。此外，这些颗粒是不稳定的并且显示出大的不明确的聚集体(aggregate)的形成。在另一个实例中，将载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物简单加入脂质体制剂中不会产生具有确定和所需特征的纳米颗粒制剂。

令人惊讶的是，在不使用PEG、PEG-缀合物或另一种合成聚合物类型稳定剂材料的情况下，本发明人发现了受控的配制程序，该程序生成稳定和/或无毒的aNP，且其具有清楚定义的尺寸和形状，具有包封和屏蔽的核酸有效载荷，具有所用组分的适当回收，并且具有当暴露于(各种)细胞系时为活性的核酸有效载荷。此外，可以采用宽范围的组合物(例如具有不同类型和/或水平的载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、磷脂、甾醇、阳离子和/或可电离的阳离子脂质、核酸和任选的填料)以生成这些aNP。

因此，本发明还围绕这样的实现，即通过使用两步配制程序可以将核酸掺入到纳米颗粒中。

因此，在一个方面，本发明涉及用于产生纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：

a)将有机溶剂中的脂质组分与水性缓冲液中的核酸混合，优选快速混合，以产生脂质纳米颗粒，其中脂质组分包含磷脂、甾醇、阳离子脂质或可电离的阳离子脂质，以及任选的填料材料(例如甘油三酯)，其中水性缓冲液具有5.0或更低的pH；和

b)在6.0和8.0之间的pH下将脂质纳米颗粒(根据a)制备)与载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物混合，优选快速混合，以产生本发明的纳米颗粒。

有机溶剂可以是醇诸如乙醇、异丙醇、甲醇、乙腈、二甲基亚砜(DMSO)、氯仿或其组合。优选的有机溶剂是可与水混溶的和无毒的，例如乙醇和DMSO，或其组合。

例如，有机溶剂可以是96％至100％的乙醇，优选100％的乙醇。

快速混合在本领域中是已知的，并且已经例如描述于Hirota etal.BIOTECHNIQUES VOL.27,NO.2,p286-289；Jeffs et al.,Pharm Res 22,362–372(2005)；Kulkarni et al.,ACS Nano 2018,12,5,4787–4795

步骤a)中的水性缓冲液具有低pH以确保可电离的阳离子脂质带正电荷，从而允许核酸/阳离子脂质复合物结合并包含在颗粒中。例如，缓冲液可以具有5.0或更低的pH，例如4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5或更低。水性缓冲液可以是不破坏核酸的任何缓冲液。示例性的缓冲剂是pH4.0的乙酸钠。然后将纳米颗粒置于pH约6至8，优选7至8更优选约7.4的水性缓冲液中。例如，这可以通过在指定pH范围中的水性缓冲液透析来实现。适用于此步骤的水性缓冲液的非限制性实例是pH7.4的155mM PBS，但是应当理解，可以使用不破坏核酸的任何缓冲液。

在步骤b)中，将pH为6至8之间，优选pH为7至8之间的水性缓冲液中的纳米颗粒与载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物在pH为6至8之间，优选pH为7至8之间的水性缓冲液中快速混合，以获得根据本发明的纳米颗粒。

如本文所教导的上述两步配制程序产生具有广泛的所需和有益特征(稳定性、低毒性或无毒性、高核酸滞留、核酸活性等)的集的aNP。然而，所描述的配制方法是非限制性的，因为其他程序也可以产生具有有益特征的aNP。

本发明进一步的方面涉及可以通过包括以下步骤的方法获得的或通过包括以下步骤的方法获得的纳米颗粒：

a)将有机溶剂中的脂质组分与水性缓冲液中的核酸混合，优选快速混合，以产生脂质纳米颗粒，其中脂质组分包含磷脂、甾醇、阳离子脂质或可电离的阳离子脂质，以及任选的填料材料(例如甘油三酯)，其中水性缓冲液具有5.0或更低的pH；和

b)在6.0和8.0之间的pH下将脂质纳米颗粒(根据a)制备)与载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物混合，优选快速混合，以产生本发明的纳米颗粒。

本发明的进一步方面

应当理解，根据本发明的纳米颗粒能够在靶细胞或组织中递送核酸。靶细胞或组织可以在受试者中，或者可以是体外或离体的。因此，在一个方面，本发明涉及用于在细胞中引入核酸的体内、体外或离体方法，该方法包括使根据本发明的纳米颗粒或根据本发明的组合物与细胞接触。在具体的实施方案中，细胞是髓样隔室的细胞或髓样细胞。

本申请还提供如以下陈述中所阐述的方面和实施方案：

陈述1.纳米颗粒，其包含：

-载脂蛋白；

-磷脂；

-甾醇；

-阳离子或可电离的阳离子脂质；和

-核酸。

陈述2.根据陈述1的纳米颗粒，其中该纳米颗粒进一步包含选自三酰甘油和胆固醇酰基酯或其组合的填料，优选其中该三酰甘油是三辛酸甘油酯和/或其中该胆固醇酰基酯是胆固醇辛酸酯和/或胆固醇油酸酯。

陈述3.根据前述陈述中任一项的纳米颗粒，其中该核酸是RNA、DNA或核酸类似物，

优选其中该RNA是微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi-相互作用RNA(piRNA)、小核RNA(snoRNA)、转移RNA(tRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNAs)、小调节RNA(srRNA)、信使RNA(mRNA)、修饰的mRNA、核糖体RNA(rRNA)、长非编码RNA(lncRNA)或引导RNA(gRNA)或其组合和/或其修饰；或

优选其中该DNA是单链或双链DNA；或

优选其中该反义寡核苷酸是由核苷酸或核苷类似物组成的单链DNA或RNA，该核苷酸或核苷类似物含有磷酸二酯主链或2’核糖的修饰，更优选地，其中该核苷酸或核苷类似物选自锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、吗啉代或肽核酸(PNA)。

陈述4.根据前述陈述中任一项的纳米颗粒，其中该载脂蛋白选自ApoA1、ApoA2、ApoA4、ApoA5、ApoB48、ApoB100、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoC-IV、ApoD、ApoE、ApoF、ApoH、ApoL和ApoM，

优选地选自ApoA1、ApoA2、ApoA4、ApoA5、ApoB100、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoC-IV和ApoE，

更优选选自ApoA1、ApoA4、ApoA5、ApoB100、ApoC-III和poE，

最优选选自ApoA1、ApoB100和ApoE。

陈述5.根据陈述1至5中任一项的纳米颗粒，其中该纳米颗粒中的载脂蛋白用于：

-在制备和储存时防止聚集；

-提高体内稳定性；

-提供天然隐形；和/或

-促进与免疫细胞的相互作用。

陈述6.根据前述陈述中任一项的纳米颗粒，其中该阳离子或可电离的阳离子脂质选自长链醇的可电离的阳离子酯、甘油二酯的可电离的阳离子酯或甾醇的可电离的阳离子酯或其组合。

陈述7.根据前述陈述中任一项的纳米颗粒，其中该甾醇选自胆固醇、豆甾醇或β-谷甾醇或其组合。

陈述8.根据前述陈述中任一项的纳米颗粒，其中：

该磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油或其组合，优选其中磷脂中的酰基基团中的至少一个、更优选两个是长链脂肪酸，甚至更优选其中所述长链脂肪酸选自肉豆蔻脑酸、棕榈油酸和油酸或其组合。

陈述9.根据前述陈述中任一项的纳米颗粒，其中：

载脂蛋白的量范围为0.10至2.0mol％；和/或

磷脂的量范围为15至90mol％；和/或

甾醇的量范围为2.5-50mol％；和/或

阳离子或可电离的阳离子脂质的量范围为8.0至80mol％，其中该摩尔百分比仅基于该纳米颗粒中载脂蛋白、磷脂、甾醇和阳离子或可电离的阳离子脂质的合并量。

陈述10.根据前述陈述中任一项的纳米颗粒，其中载脂蛋白与磷脂的基于摩尔重量百分比的比率为1:25和1:400之间，更优选为1:50和1:200之间，甚至更优选为1:75和1:150之间。

陈述11.根据前述陈述中任一项的纳米颗粒，其具有30至100nm的平均尺寸。

陈述12.组合物，其包含根据陈述1至11中任一项的纳米颗粒和生理上可接受的载体，优选其中该组合物为药物组合物。

陈述13.根据陈述1至11中任一项的纳米颗粒或根据陈述12的组合物，其用作药物。

陈述14.根据陈述13使用的纳米颗粒或组合物，该用途包括将核酸递送至髓样隔室或脾。

陈述15.根据陈述1至11中任一项的纳米颗粒或根据陈述12的组合物，其用于通过刺激或抑制先天免疫应答来治疗疾病，优选其中所述疾病为癌症、心血管疾病、自身免疫性病症或异种移植排斥。

陈述16.用于产生纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：

a)将有机溶剂中的脂质组分与水性缓冲液中的核酸快速混合以产生脂质纳米颗粒，其中脂质组分包含磷脂、甾醇、甘油三酯(任选地)和阳离子脂质或可电离的阳离子脂质以及核酸，其中水性缓冲液具有5.0或更低的pH；和

b)在6.0和8.0之间的pH下，将脂质纳米颗粒与载脂蛋白混合，优选快速混合以产生纳米颗粒。

陈述17.用于将核酸引入细胞的体内、体外或离体方法，该方法包括使根据陈述1至11中任一项的纳米颗粒或根据陈述12的组合物与细胞接触。

陈述18.用于体内递送核酸的方法，该方法包括向受试者施用根据陈述1至11中任一项的纳米颗粒或根据陈述12的组合物。

陈述19.用于通过刺激或抑制先天免疫应答来治疗有此需要的受试者中的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据陈述1至11的纳米颗粒或根据陈述12的组合物。

陈述20.根据陈述19的方法，其中该疾病选自癌症、心血管疾病、自身免疫性病症或异种移植排斥。

虽然已经结合本发明的特定实施方案描述了本发明，但是很明显，根据前面的描述，许多替换、修改和变化对于本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，在如下所附权利要求的精神和广泛范围内，其旨在包括所有此类替换、修改和变化。

本文公开的本发明的方面和实施方案进一步由以下非限制性实施例支持。

实施例

实施例1.配制和表征的一般说明

纳米颗粒制剂基于离子和疏水相互作用自组装。组分在它们对应的有机溶剂(脂质和其他结构组分)或水性缓冲液(核酸有效载荷)中以所需浓度制备。然后将溶液经由快速混合技术(涵盖微流体混合或T型接合混合)聚集在一起。

过量的水性缓冲液对于形成过程是必需的。当用于本文时，过量的水性缓冲液是指(水性缓冲液):(有机溶剂)的比率(基于体积)为至少2:1或更高，例如2.2:1、2.5:1、2.8:1或3:1或更高。

在初始混合后，将小部分有机溶剂去除，例如使用透析或离心过滤去除。这些步骤产生脂质纳米颗粒，在下一步骤中，经由快速混合技术(诸如，例如滴注法)向这些脂质纳米颗粒添加载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物。在载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物的添加和加工后，残留的蛋白质需要通过透析或离心过去除。最后，样品被浓缩至所需浓度(参见图2)。

因此，核酸纳米颗粒aNP包含：

(a)核酸；

(b)(可电离)阳离子分子；

(c)载脂蛋白；

(d)磷脂；

(d)甾醇；和

(e)任选的甘油三酯或其衍生物。

在配制aNP之后，确定纳米颗粒制剂的物理化学性质。这些性质可以取决于制剂的具体组成而变化。经由动态光散射(DLS)和电子显微镜(例如低温TEM)确定纳米颗粒的尺寸和分散度。电子显微镜还用于评估纳米颗粒的形态。此外，用本领域已知的各种商业上可获得的测定法来确定输入材料组分(诸如核酸、载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、磷脂和胆固醇)的回收。通过确定制剂在4℃的缓冲液中储存延长的时间段(1个月)后的物理化学特征来评价贮存期限。已对大量核酸纳米颗粒制剂(约150种)的物理化学特性和贮存期限进行了表征。研究了特定制剂在生理条件下的重现性和稳定性。

测试了组分的以下摩尔百分比范围，并且发现生成的aNP是稳定的，其中摩尔百分比仅基于载脂蛋白(Apo-A1)、磷脂、甾醇(胆固醇)和阳离子或可电离阳离子脂质的总量，因此排除了填料、核酸和任选的其他组分：

载脂蛋白Apo-A1的量的范围为0.08至2.0mol％，诸如0.10至2.0mol％；和/或

磷脂的量的范围为5至90mol％，诸如15至90mol％；和/或

甾醇的量的范围为2.5-65mol％，诸如2.5-50mol％；和/或

阳离子或可电离阳离子脂质的量的范围为5.0至80mol％，例如8.0至80mol％。

在这些范围之外，纳米颗粒可能不稳定。此外，填料材料如甘油三酯可以以0至95mol％的范围添加，其中摩尔百分比仅基于载脂蛋白、磷脂、甾醇和阳离子或可电离阳离子脂质的总量。

实施例2.用于产生本文所述的含有核酸如RNA的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)的 说明性方法(图2)。

在第一步中，将磷脂、甾醇如胆固醇、可电离阳离子脂质和任选的填料材料(例如甘油三酯)溶解在可与水混溶的有机溶剂如96％至100％乙醇(例如2.33mL)中，并将该溶液与保持在较低pH并含有核酸的水性溶液(例如25mM乙酸钠7mL，pH 4)(以特定的流速和比率)快速混合。对于混合，使用T型接合混合装置，例如以28mL/min进行混合。也可以采用其他基于微流体的混合方法，例如在具有交错人字形结构的芯片中混合。所得的脂质纳米颗粒在生理pH下透析(例如在4℃透析过夜，2x，155mM PBS，pH 7.4)，接下来在第二步中，在生理pH下与载脂蛋白如载脂蛋白A1快速混合，以获得根据本发明的纳米颗粒(aNP)。载脂蛋白A1可以存在于155mM PBS(pH 4)中。替代地，在第二混合步骤中可以使用载脂蛋白的肽模拟物。对于混合，可以使用T型接合混合装置，例如以13.3mL/min进行混合。混合后，可以将获得的核酸纳米生物剂温育1小时。任选地，可以对纳米颗粒进行过滤和浓缩(例如，0.2μm过滤，然后100kDa离心过滤)。本发明的aNP也可以用其他方法加工。

实施例3.载脂蛋白纳米颗粒(aNP)中的siRNA滞留和不含载脂蛋白的对比实施例 纳米颗粒(NP)的不稳定性(图3)。

根据实施例2的产生程序(图2)来制备两种代表性的含有siRNA的aNP(siRNA-aNP)(aNP 18和34，其制剂如表1所示(图11))。siRNA-aNP制剂18和34是根据本发明某些实施方案的制剂，并且包含不同量的磷脂(即1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)或1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC))、胆固醇、可电离阳离子脂质(即Dlin-MC3-DMA)、甘油三酯、载脂蛋白A1(ApoA1)和siRNA。

此外，通过省略将载脂蛋白A1加入制剂的程序的第二步来制备对比NP。在配制NP一天后，使用RiboGreen测定法(ThermoFisher–R11490)确定RNA滞留。

只有根据本发明的aNP令人信服地捕获siRNA有效载荷(图3A)。不含载脂蛋白的对比实施例NP不保留或几乎不保留siRNA(图3A)。

图3B显示了没有加入载脂蛋白A1的对比实施例siRNA-NP制剂18的代表性图像，显示混浊溶液中有大的不明确的沉淀物/聚集体，表明不能形成稳定(透明)的制剂。

图3C显示对比实施例siRNA-NP制剂18的代表性低温透射电子显微图，显示大的不明确的聚集体(比例尺50nm)。

总之，这些数据表明，对于含有核酸的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)的形成和稳定性来说，载脂蛋白是关键和必需的结构组分。

ApoA1纯化

用pET20b-apoA1质粒转化的ClearColi细胞的小规模培养在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中开始。第二天，将20mL的小规模培养在1升2YT培养基中稀释以开始大规模培养。培养物在37℃和150rpm下生长，直至OD600为0.6至0.8，然后加入终浓度为0.1mM的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以诱导表达。将诱导的培养物在20℃和150rpm下温育过夜。使诱导的细菌培养物粒化，并通过将这些粒重悬在每克粒5mL BugBuster蛋白提取试剂(Novagen)中来化学裂解细胞。将Benzonase核酸酶(Merck Millipore)加入到重悬于BugBuster中的细胞中，然后将细胞悬浮液于室温振荡温育。细胞裂解物始终被保持在冰上。裂解后，将细胞裂解物离心以使不溶的细胞碎片粒化，并使上清液流过含有固定的镍离子的IMAC柱。用8倍柱体积的缓冲液A(20mM Tris，500mM NaCl，10mM咪唑，pH 7.9)清洗该柱，然后用8倍柱体积的缓冲液A50(20mM Tris，500mM NaCl，50mM咪唑，pH 7.9)清洗。为了洗脱apoA1，将8倍柱体积的缓冲液A500(20mM Tris，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.9)应用于该柱。纯化步骤的所有级分被收集并用SDS-PAGE分析。使用Amicon超离心过滤器(Amicon)将含有纯化的apoA1的级分的缓冲液更换为PBS。为了储存apoA1，将等分试样在液氮中快速冷冻并储存于-70℃。

实施例4.含有siRNA的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)(siRNA-aNP)的脂质组成影响 它们的物理化学性质并且可以被优化以获得具有最佳特征的siRNA-aNP(图4)。

建立了72种siRNA-aNP制剂的文库并分析物理化学参数。siRNA-aNP制剂含有8-52mol％的磷脂(即1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)或1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC))、4-62mol％的胆固醇、5-62mol％的可电离阳离子脂质(即Dlin-MC3-DMA)、0-76mol％甘油三酯、0.08-0.5mol％的载脂蛋白A1(如实施例3所述制备)和0.03-0.18％的非特异性(Integrated DNAtechnologies–51-01-14-03)或萤火虫萤光素酶(Integrated DNA technologies–定制序列)siRNA。制剂1、3、6、7、8、9、10、11、12、14、18、19、20、21、22、23、24、29、31、32、33、34、35、39、42、43、44、45、46、47、48、50、54、55、56、59、60、67、68、71和72在表1(图11)中示出。

使用实施例2中所述的程序产生siRNA-aNP制剂。

配制一天后，根据以下各项来确定文库的单个siRNA-aNP制剂的物理化学性质：使用动态光散射(DLS)评估的(i)颗粒尺寸(z-平均)和(ii)颗粒尺寸分散度，(iii)使用RiboGreen测定法的siRNA滞留，(iv)使用比色蛋白质定量测定法的载脂蛋白A1(apo-A1)，以及使用标准比色定量测定法的(v)胆固醇和(vi)磷脂回收(图4A)。图4A中显示了两种配方类型的数据，其中采用1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)或1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)作为磷脂。图4A中的结果显示，通过改变组成来优化aNP以产生有效包封siRNA的约100nm的稳定均匀的制剂。图4A中的结果还显示载脂蛋白A1、胆固醇和磷脂被有效地加入到制剂中

产生后一天，根据以下各项进一步分析文库的单个siRNA-aNP制剂：使用动态光散射(DLS)的(i)颗粒尺寸(数均)和(ii)颗粒尺寸分散度，通过制剂的甘油三酯含量展示。图4B中的结果显示加入甘油三酯作为填料分子导致siRNA-aNP尺寸和均匀性增加。

产生后一天，还根据以下各项进一步分析文库的单个siRNA-aNP制剂：使用动态光散射(DLS)的(i)颗粒尺寸(数均)和(ii)颗粒尺寸分散度，通过制剂的N/P比展示。N/P比是如本说明书中其他地方所描述的所采用的可电离阳离子材料的可带正电荷的胺(N＝氮)基团与核酸组分中带负电荷的核酸磷酸盐(P)基团的比率。图4C中的结果表明，siRNA-aNP以各种N/P比产生，而不影响颗粒尺寸或分散度。

实施例5.代表性低温透射电子显微图，显示含有siRNA的载脂蛋白脂质纳米颗粒 (aNP)(siRNA-aNP)的脂质组成可用于影响这些aNP的形态和尺寸(图5)。

使所有文库的单个siRNA-aNP制剂经历使用FEI TITAN 300kV的低温电子透射电子显微术以确定颗粒尺寸、形态和制剂均匀性(比例尺50nm)。

从含有72种siRNA-aNP的文库的所有单个制剂中获取低温透射电子显微术(低温TEM)图像。72种siRNA-aNP的制剂如实施例4所描述。结果表明，制剂具有球形外观，并且其形态、内部结构、尺寸和均匀性取决于制剂组成。例如，当具有少量胆固醇和甘油三酯的制剂如制剂1看起来具有含多个同心环的内部结构时，具有大量胆固醇和甘油三酯的制剂如制剂72看起来具有被表面屏障包围的电子致密核心。在检查图像时，可以看出颗粒包含(不同的)表面屏障层，可能但不一定是单层，并且可能包含磷脂、胆固醇和载脂蛋白。不希望受任何理论的束缚，本发明人相信该层通过可电离阳离子脂质来屏蔽和保护埋在核心中的siRNA。

实施例6.含有萤火虫萤光素酶siRNA的载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)(siRNA-aNP) 在体外诱导强效的报告基因表达敲低(图6)。

通过测量鼠RAW264.7巨噬细胞中的萤火虫萤光素酶敲低来确定siRNA-aNP文库的72种单个制剂的功能作用。更具体地，将鼠RAW254.7巨噬细胞用pmirGLO质粒(Promega,E1330)转染以进行稳定的双报告基因萤光素酶表达(萤火虫和海肾萤光素酶)，并随后暴露于文库的含有萤火虫萤光素酶(Fluc)siRNA的单个siRNA-aNP制剂达48小时。根据制造商方案(Dual-Glo Luciferase Assay System,Promega,E2920)进行发光测定。对含有非特异性siRNA的对照siRNA-aNP制剂的数据进行校正。72种siRNA-aNP的制剂如实施例4中所描述。

结果显示，取决于制剂组成，与非特异性siRNA-aNP相比，萤火虫萤光素酶siRNA-aNP诱导强效的基因沉默。图6A显示了一些代表性制剂，这些代表性制剂导致40％或更多、甚至高达100％的沉默。图6B中的结果显示，不管制剂的磷脂类型如何，向制剂中加入甘油三酯可以影响其功能效果。图6C中的结果显示，不管制剂的磷脂类型如何，将N/P比从3增加到9看起来改善了功能效果。

实施例7.在小鼠静脉内施用后，含有放射性标记的siRNA的载脂蛋白脂质纳米颗 粒(aNP)(siRNA-aNP)位于造血组织，包括脾和骨髓(图7)。

siRNA-aNP制剂3、39、14、55、22和72都是根据本发明某些实施方案的制剂并包含不同量的磷脂(即1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)或1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC))、胆固醇、可电离阳离子脂质(即Dlin-MC3-DMA)、甘油三酯、载脂蛋白A1(如实施例3所述制备)和siRNA。siRNA-aNP的制剂如表1所描述(图11)。

图7A显示了在小鼠中静脉内施用后siRNA-aNP的生物分布。C57BL/6小鼠(每种制剂n＝6)静脉内注射本发明的示例性siRNA-aNP制剂或含有锆89-放射性标记的非特异性siRNA的对比实施例LNP制剂^#，剂量为2mg/kg的剂量。LNP对照制剂包含PEG化脂质。注射后24小时，处死小鼠，收集器官用于通过γ计数进行定量分析。数据表示为每克组织注射剂量％(％ID/g)的平均值±SD表示，并通过双因素方差分析(two-way ANOVA)和Tukey事后检验(Tukey’s post test)进行分析。*指示p值<0.05，****指示p值<0.0001。

图7B显示了表现为每克组织注射剂量％(％ID/g)的骨髓肝脏比的生物分布结果。^#LNP-siRNA对比实施例包含Dlin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和PEG-DMG(50:38.5:10:1.5mol％)，以及所包含的siRNA。

总之，数据显示，根据本发明某些实施方案的含有siRNA作为有效载荷的aNP能够在全身性注射后靶向与免疫细胞存在相关的组织。此外，siRNA-aNP的组成可用于引导靶向和随后的生物分布。

实施例8.载脂蛋白脂质纳米颗粒(aNP)可以包封mRNA以产生稳定的制剂并在体外 诱导基因表达(图8)。

使用实施例2中所描述的方法制备含有萤火虫萤光素酶信使RNA(mRNA；TrilinkBiotechnologies–L7602)的aNP制剂。本发明的mRNA-aNP制剂和LNP-mRNA对比实施例制剂^#使用动态光散射(DLS)针对它们的颗粒尺寸和颗粒尺寸分散度进行表征(图8A，左图)。使用Ribogreen测定评价mRNA截留效率(图8A，右图)。

图8B显示了代表性mRNA-aNP(根据本发明某些实施方案)低温透射电子显微图(比例尺50nm)。

将人HEK293细胞暴露于含有萤火虫mRNA的aNP和对比实施例LNP达24小时。通过发光确定报告基因表达(图8C，左图)，并通过MTT测定(Promega–G3582)确定细胞活力(图8C，右图)，表明mRNA-aNP在体外诱导剂量依赖性萤火虫萤光素酶表达，而不会诱导毒性。

将鼠RAW264.7巨噬细胞暴露于含有萤火虫mRNA的aNP达24小时。通过发光确定基因表达，表明mRNA-aNP在巨噬细胞培养物中诱导剂量依赖性萤火虫萤光素酶表达(图8D)。

将原代鼠骨髓来源的巨噬细胞暴露于含有萤火虫mRNA的aNP达24小时。通过发光确定基因表达，表明mRNA-aNP在原代细胞中诱导剂量依赖性萤火虫萤光素酶表达(图8E)。^#LNP-mRNA对比实施例包含Dlin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和PEG-DMG(50:38.5:10:1.5mol％)，以及所包含的siRNA。

实施例9.根据式(I)至(V)的可电离阳离子脂质的合成(如图9所描述)。

起始化合物、试剂、溶剂、氘化溶剂和(纯化)材料购自商业来源(如Merck、ABCR、Cambridge Isotopes Laboratories等)。NMR分析在Bruker 400MHz光谱仪上进行。MALDI-TOF-MS分析在Bruker Autoflex光谱仪上进行。HPLC-MS在配备有ESI离子阱MS检测器以及PDA检测器的LCQ Fleet(Thermo Scientific)上进行，应用C18反相柱(Kinetex 5μm颗粒,2.1mm(内径)×50mm,Phenomenex)，并使用从5％乙腈和95％水至95％乙腈和5％水(二者均含有0.1％甲酸)的梯度洗脱液，流速为0.2mL/min。

针对式(II)(ICG-A型)的实施例：1,2-甘油可电离阳离子脂质

方案A：根据具有ICG-A型的式(II)的可电离阳离子脂质的合成路线。DPTS＝4-(二甲基氨基)-吡啶鎓4-甲磺酸盐；DIC＝N,N′-二异丙基-碳二亚胺；DCM＝二氯甲烷；RT＝室温；DIPEA＝二异丙基乙胺；Pd/C＝在碳上的钯；THF＝四氢呋喃；HAc＝乙酸；H2(g)＝氢气。

中间体1：(S)-4-((苄氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环

该化合物是根据文献程序(Lee,Jong-Dae等人，Organic Letters(2007),9(2),323-326)经由对(S)-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)甲醇的苄基保护而获得的。产量：16.8g(88％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

中间体2：(R)-3-((苄氧基)丙烷-1,2-二醇

该化合物是根据文献程序(Lee,Jong-Dae等人，Organic Letters(2007),9(2),323-326)经由使用乙酸和水对(S)-4-((苄氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环中的二醇基团脱保护而得到的。产量：9.45g(76％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

中间体3：(S)-3-(苄氧基)丙烷-1,2-二醇二(十二酸)酯

该化合物是经由(R)-3-((苄氧基)丙烷-1,2-二醇(3g；16.5mmol)与十二酸(6.92g；34.6mmol；2.1moleqs)在DCM(23mL)中的偶联获得的，使用DPTS(0.4g；1.36mmol；约0.1moleqs)和DIC(5.2g；41.3mmol；2.5moleqs)作为偶联试剂。反应混合物于室温搅拌24小时，然后将反应混合物在硅藻土塞上过滤。粗混合物经由硅胶柱色谱法纯化，使用1/9EtOAc/庚烷作为洗脱液。产量：8.21g(91％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.43–7.27(m,5H,Ar-H),5.37–5.06(m,1H,手性OCH₂CHCH₂O),4.67–4.43(m,2H,OCH₂-Bn),4.43–4.08(m,2H,CHCH₂OCO),3.67–3.31(m,2H,CHCH₂OCH₂),2.29(dt,J＝16.9,7.5Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.59(dq,J＝10.6,7.1Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.26(d,J＝4.2Hz,32H,CH₃(CH₂)₈CH₂),0.88(t,J＝6.8Hz,6H,CH₃CH₂)。

中间体4：(S)-3-(苄氧基)丙烷-1,2-二醇二(十一酸)酯。

(R)-3-((苄氧基)丙烷-1,2-二醇与十一酸之间的反应以与中间体3相似的方式进行。产率：478mg(90％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.54–7.26(m,5H,Ar-H),5.33–5.12(m,1H,手性OCH₂CHCH₂O),4.66–4.44(m,2H,OCH₂-Bn),4.35-4.19(m,2H,CHCH₂OCO),3.59(d,J＝5.3Hz,2H,CHCH₂OCH₂),2.30(dt,J＝17.0,7.5Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.74–1.49(m,4H,CH₂CH₂COO),1.50–1.08(m,28H,CH₃(CH₂)₇CH₂),0.88(t,J＝6.8Hz,6H,CH₃CH₂)。

中间体5：(S)-3-(苄氧基)丙烷-1,2-二醇二癸酸酯

(R)-3-((苄氧基)丙烷-1,2-二醇与癸酸之间的反应以与对中间体3所做的相似方式进行。产量：505mg(93％)。1H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.42–7.27(m,5H,Ar-H),5.24(dtd,J＝6.4,5.2,3.7Hz,1H,手性OCH₂CHCH₂O),4.65–4.44(m,2H,OCH₂-Bn),4.35-4.19(m,2H,CHCH₂OCO),3.59(dd,J＝5.2,1.2Hz,2H,CHCH₂OCH₂),2.30(dt,J＝16.9,7.5Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.74–1.51(m,4H,CH₂CH₂COO),1.51–1.08(m,24H,CH₃(CH₂)₆CH₂),1.08–0.67(m,6H,CH₃CH₂)。

子实施例1：(R)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二(十二酸)酯

步骤1，构造块1：(S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二(十二酸)酯

该化合物经由(S)-3-(苄氧基)丙烷-1,2-二醇二(十二酸)酯(中间体3；8.21g；15mmol)在THF(50mL)和乙酸(0.5mL)中使用氢气球和作为催化剂的Pd/C(250mg；Degussa型)来脱苄基而获得。反应混合物于室温搅拌24小时，然后将反应混合物在硅藻土塞上过滤并蒸发至干。粗混合物溶解在氯仿中并用脱矿物质水清洗，然后用饱和NaCl溶液(水性)清洗。获得油，该油缓慢变成固体。产量：7.1g(100％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.09(p,J＝5.0Hz,1H,手性OCH₂CHCH₂O),4.48–4.19(m,2H,CHCH₂OCO),3.73(t,J＝4.0Hz,2H,CHCH₂OH),2.33(dt,J＝9.0,7.5Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.61(h,J＝5.2,3.1Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.28(d,J＝14.7Hz,32H,CH₃(CH₂)₈CH₂),1.04–0.66(m,6H,CH₃CH₂)。

步骤2：(R)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二(十二酸)酯

该化合物经由(S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二(十二酸)酯(构造块1；0.1g；0,22mmol)与4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(55mg；0.33mmol；1.5moleqs)在DCM(1mL)中的偶联获得，使用DIPEA(74mg；0.58mmol；2.6moleqs)、DPTS(6.4mg；0.1moleqs)和DIC(41.4mg；0.33mmol；1.5moleqs)作为偶联试剂。反应混合物于室温搅拌24小时，然后将反应混合物在硅藻土塞上过滤，滤液用DCM稀释，并随后用0.1M HCl(水性)、0.1M NaOH(水性)和饱和NaCl(水性)清洗。有机层用Na₂SO₄干燥。粗混合物在乙腈中搅拌并过滤。滤液蒸发至干以得到油，该油在4℃缓慢变成固体。产量：90mg(80％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.27(tt,J＝6.0,4.3Hz,1H,OCH₂CHCH₂O),4.30-4.15(4H,CHCH₂OCO),2.44–2.25(m,8H,CH₂CH₂COO and NCH₂),2.21(s,6H,N(CH₃)₂),1.78(p,J＝7.4Hz,2H,NCH₂CH₂CH₂COO),1.70–1.51(m,4H,CH₂CH₂COO),1.40–1.08(m,32H,CH₃(CH₂)₈CH₂),1.08–0.69(m,6H,CH₃CH₂)。

MALDI-TOF-MS(CHCA基质，正反射器模式)：m/z(M+H)⁺＝570.48。计算值：C₃₃H₆₃NO₆(精确质量569.47；分子量569.87)。

子实施例2：(R)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二(十一酸)酯

步骤1，构造块2：(S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二(十一酸)酯

(S)-3-(苄氧基)丙烷-1,2-二醇二(十一酸)酯(中间体4)的加氢反应以与制备构造块1所做的相似的方式进行，产量：405mg(80％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.09(p,J＝5.1Hz,1H,手性OCH₂CHCH₂O),4.42–4.20(m,2H,CHCH₂OCO),3.94–3.52(m,2H,CHCH₂OH),2.33(dt,J＝9.1,7.5Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.76–1.53(m,4H,CH₂CH₂COO),1.28(d,J＝14.9Hz,28H,CH₃(CH₂)₇CH₂),0.88(t,J＝6.8Hz,6H,CH₃CH₂)。

步骤2：(R)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二(十一酸)酯

(S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二(十一酸)酯(构造块2)与4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐之间的反应以与对子实施例1(步骤2)的制备所做的相似的方式进行。产量：96mg(87％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.27(tt,J＝6.0,4.3Hz,1H,OCH₂CHCH₂O),4.30-4.15m,4H,CHCH₂OCO),2.55–2.25(m,8H,C₁₀尾部的(CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂COO、(CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂COO和CH₂CH₂COO),2.21(s,6H,N(CH₃)₂),1.78(p,J＝7.4Hz,2H,NCH₂CH₂CH₂COO),1.61(td,J＝7.3,6.8,3.1Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.28(d,J＝14.1Hz,28H,CH₃(CH₂)₇CH₂),1.06–0.67(m,6H,CH₃CH₂)。

MALDI-TOF-MS(CHCA基质，正反射器模式)：m/z(M+H)⁺＝542.45,(M+Na)⁺＝564.43。计算值：C₃₁H₅₉NO₆(精确质量541.43；分子量541.81)。

子实施例3：(R)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二癸酸酯

步骤1，构造块3：(S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二癸酸酯

(S)-3-(苄氧基)丙烷-1,2-二醇二癸酸酯(中间体5)的加氢反应以与对制备构造块1所做的相似的方式进行。产量：412mg(100％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.09(p,J＝5.0Hz,1H,手性OCH₂CHCH₂O),4.46–4.20(m,2H,CHCH₂OCO),3.74(t,J＝5.6Hz,2H,CHCH₂OH),2.33(dt,J＝9.1,7.5Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.78–1.54(m,4H,CH₂CH₂COO),1.28(d,J＝8.8Hz,24H,CH₃(CH₂)₆CH₂),1.09–0.51(m,6H,CH₃CH₂)。

步骤2：(R)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二癸酸酯

(S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二癸酸酯(构造块3)与4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐之间的反应以与对子实施例1(步骤2)所做的相似的方式进行，区别在于不使用DIPEA。产量：110mg(80％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.27(tt,J＝6.0,4.3Hz,1H,OCH₂CHCH₂O),4.30-4.15m,4H,CHCH₂OCO),2.48–2.23(m,8H,(CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂COO,(CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂COO and CH₂CH₂COOof the C₉ tails),2.21(s,6H,N(CH₃)₂),1.78(p,J＝7.4Hz,2H,NCH₂CH₂CH₂COO),1.61(ddt,J＝11.7,7.8,4.7Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.40–1.12(m,24H,CH₃(CH₂)₆CH₂),1.02–0.73(m,6H,CH₃CH₂)。

MALDI-TOF-MS(CHCA基质，正反射器模式)：m/z(M+H)⁺＝514.43。计算值：C₂₉H₅₅NO₆(精确质量513.40；分子量513.76)。

子实施例4：(R)-3-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二(十二酸)酯

(S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二(十二酸)酯(构造块1)与3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐之间的反应以与对子实施例1(步骤2)的制备所做的相似的方式进行。产量：83mg(68％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.27(tt,J＝6.0,4.3Hz,1H,OCH₂CHCH₂O),4.40-4.16(m,4H,CHCH₂OCO),2.68-2.55(m,2H,(CH₃)₂NCH₂CH₂COO),2.55-2.43(m,2H,(CH₃)₂NCH₂CH₂COO),2.31(td,J＝7.5,3.7Hz,4H,CH₂CH₂COO of the C₁₁ tails),2.23(s,6H,N(CH₃)₂),1.62(qt,J＝7.0,3.4Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.27(d,J＝9.9Hz,32H,CH₃(CH₂)₈CH₂),1.09–0.64(m,6H,CH₃CH₂)。

MALDI-TOF-MS(CHCA基质，正反射器模式)：m/z(M+H)⁺＝556.48,(M+Na)⁺＝578.44。计算值：C₃₂H₆₁NO₆(精确质量555.45；分子量555.84)。

子实施例5：(R)-3-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二(十一酸)酯

(S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二(十一酸)酯(构造块2)与3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐之间的反应以与对子实施例1(步骤2)的制备所做的相似的方式进行。产量：108mg(82％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.27(tt,J＝6.0,4.3Hz,1H,OCH₂CHCH₂O),4.31–4.04(m,4H,CHCH₂OCO),2.74–2.56(m,2H,(CH₃)₂NCH₂CH₂COO),2.56–2.42(m,2H,(CH₃)₂NCH₂CH₂COO),2.31(ddd,J＝9.1,5.6,2.4Hz,4H,C₁₀尾部的CH₂CH₂COO),2.25(d,J＝1.2Hz,6H,N(CH₃)₂),1.62(tt,J＝7.3,3.6Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.51–1.07(m,28H,CH₃(CH₂)₇CH₂),1.07–0.66(m,6H,CH₃CH₂)。

MALDI-TOF-MS(CHCA基质，正反射器模式)：m/z(M+H)⁺＝528.45。计算值：C₃₀H₅₇NO₆(精确质量527.42；分子量527.79)。

子实施例6：(R)-3-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二癸酸酯

((S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二癸酸酯(构造块3)与3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐之间的反应以与对子实施例1(步骤2)的制备所做的相似的方式进行，区别在于不使用DIPEA。产量：131mg(80％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.42–5.06(m,1H,OCH₂CHCH₂O),4.51–4.17(m,4H,CHCH₂OCO),2.75-2.53(m,4H,(CH₃)₂NCH₂CH₂COO,(CH₃)₂NCH₂CH₂COO),2.48–2.03(m,10H,N(CH₃)₂),CH₂CH₂COO of the C₉tail),1.61(td,J＝7.3,3.5Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.39–1.18(m,24H,CH₃(CH₂)₆CH₂),0.88(t,J＝6.8Hz,6H,CH₃CH₂)。

MALDI-TOF-MS(CHCA基质，正反射器模式)：m/z(M+H)⁺＝500.42。计算值：C₂₈H₅₃NO₆(精确质量499.39；分子量499.73)。

子实施例7：(R)-3-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二硬脂酸酯

构造块4，即(S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二硬脂酸酯购自Merck(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油；CAS10567-21-2)。构造块4与3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐之间的反应以与对子实施例1(步骤2)的制备所做的相似的方式进行，区别在于不使用DIPEA。此外，该反应在40℃而不是室温搅拌。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.27(tt,J＝6.0,4.2Hz,1H,OCH₂CHCH₂O),4.30-4.16(m,4H,CHCH₂OCO),2.60(dd,J＝7.4,6.0Hz,2H,(CH₃)₂NCH₂CH₂COO),2.49(dd,J＝7.5,6.2Hz,2H,(CH₃)₂NCH₂CH₂COO),2.31(td,J＝7.6,3.7Hz,4H,CH₂CH₂COO of the C₁₈ tails),2.23(s,6H,N(CH₃)₂),1.70–1.51(m,4H,CH₂CH₂COO),1.26(s,56H,CH₃(CH₂)₁₄CH₂),0.88(t,J＝6.8Hz,6H,CH₃CH₂)。

针对式(I)(ICG-A型)的实施例：1,2-甘油可电离阳离子脂质

子实施例8： -3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二油酸酯

构造块5，即(S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二油酸酯购自ABCR。其为外消旋化合物(CAS2442-61-7)。构造块5与4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐之间的反应以与对子实施例1(步骤2)的制备所做的相似的方式进行。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.35(td,J＝7.2,6.1,4.2Hz,4H,CH＝CH),5.25(ddd,J＝10.2,5.8,4.3Hz,1H,OCH₂CHCH₂O),4.30-4.14(m,2H,CHCH₂OCO),2.43–2.28(m,8H,(CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂COO,(CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂COO,CH₂CH₂COO of oleic tails),2.26(s,6H,N(CH₃)₂),2.11–1.92(m,8H,CH₂CH＝CHCH₂),1.81(p,J＝7.4Hz,2H,NCH₂CH₂CH₂COO),1.62(q,J＝7.2Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.42–1.19(m,40H,CH₃(CH₂)₆CH₂CH＝CH(CH₂)₄CH₂COO),0.95–0.82(m,6H,CH₃CH₂)。

子实施例9：(R)-3-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二油酸酯

构造块5，即(S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二油酸酯购自ABCR。其为外消旋化合物(Cas[2442-61-7])。构造块5与3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐之间的反应以与对子实施例1(步骤2)的制备所做相似的方式进行，区别在于不使用DIPEA。产量：120mg(33％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.46–5.19(m,5H,CH＝CH,OCH₂CHCH₂O),4.31-4.15(m,4H,CHCH₂OCO),2.62(td,J＝7.1,3.8Hz,2H,(CH₃)₂NCH₂CH₂COO),2.50(td,J＝7.2,2.6Hz,2H,(CH₃)₂NCH₂CH₂COO),2.31(dd,J＝9.1,6.1Hz,4H,油酸尾部的CH₂CH₂COO),2.24(s,6H,N(CH₃)₂),2.02(dq,J＝12.8,6.7Hz,8H,CH₂CH＝CHCH₂),1.60(q,J＝7.2Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.52–1.18(m,40H,CH₃(CH₂)₆CH₂CH＝CH(CH₂)₄CH₂COO),0.99–0.77(m,6H,CH₃CH₂)。

HPLC-MS:(M+H+)＝720。计算值：C₄₄H₈₁NO₆(精确质量；719.61分子量720.13)。

针对式(III)(ICG-A型)的实施例：1,3-甘油可电离阳离子脂质

子实施例10：2-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)丙烷-1,3-二醇二(十二酸)酯

步骤1：2-氧代丙烷-1,3-二醇二(十二酸)酯

该化合物是经由1,3-二羟基丙烷-2-酮(0.5g；5.6mmol)与十二酸(2.28g；11.4mmol；2.05moleqs)在DCM(50mL)中的偶联而获得的，使用DIPEA(2.32mL；13.3mmol；2.4moleqs)、DMAP(67mg；0.56mmol；0.2moleqs)和EDC.HCl(2.65克,13.8mmol,2.4moleqs)作为偶联试剂。通过进行萃取/清洗步骤、然后进行硅胶柱色谱来进行后处理。产量：2.27g(90％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.75(s,4H,OCCH₂OCO),2.42(t,J＝7.5Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.67(q,J＝7.4Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.50–1.07(m,32H,CH₃(CH₂)₈CH₂),1.07–0.64(m,6H,CH₃CH₂)。

步骤2：2-羟基丙烷-1,3-二醇二(十二酸)酯

该化合物经由在THF(45mL)和水(3mL)中用硼氢化钠(229mg；7.9mmol；2.4moleqs)还原2-氧代丙烷-1,3-二醇二(十二酸)酯(1.54g；3.37mmol)而获得。硼氢化钠加入到酮在THF/水中的冷却溶液中(0℃冰浴)。反应混合物搅拌2小时，然后通过加入乙酸(1mL)淬灭反应。反应混合物用氯仿(50mL)稀释并用饱和Na₂CO₃溶液和饱和NaCl溶液清洗。有机层用Na₂SO₄干燥。然后，粗产物经由硅胶柱色谱纯化，使用在氯仿中的2％丙酮作为洗脱液。获得产物的纯级分(440mg；28％产量)，以及不纯级分。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.31–4.01(m,5H,OCH₂CH(OH)CH₂O),2.42(d,J＝4.8Hz,1H,OH),2.35(t,J＝7.6Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.74–1.58(m,4H,CH₂CH₂COO),1.27(d,J＝12.5Hz,32H,CH₃(CH₂)₈CH₂),0.88(t,J＝6.8Hz,6H,CH₃CH₂)。

步骤3：2-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)丙烷-1,3-二醇二(十二酸)酯

2-羟基丙烷-1,3-二醇二(十二酸)酯与3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐之间的反应以与对子实施例1(步骤2)的制备所做的相似的方式进行。产量：165mg(68％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.28(tt,J＝5.8,4.4Hz,1H,OCH₂CHCH₂O),4.30-4.16(m,4H,CHCH₂OCO),2.61(td,J＝7.1,1.1Hz,2H,(CH₃)₂NCH₂CH₂COO),2.50(ddd,J＝7.9,6.9,1.1Hz,2H,(CH₃)₂NCH₂CH₂COO),2.31(t,J＝7.6Hz,4H,C₁₁尾部的CH₂CH₂COO),2.23(s,6H,N(CH₃)₂),1.62(q,J＝7.1Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.27(d,J＝8.7Hz,32H,CH₃(CH₂)₈CH₂),0.99–0.71(m,6H,CH₃CH₂)。

MALDI-TOF-MS(CHCA基质，正反射器模式)：m/z(M+H)⁺＝556.46。计算值：C₃₂H₆₁NO₆(精确质量555.45；分子量555.84)。

针对式(II)(ICG-B型)的实施例：1,2甘油可电离阳离子脂质

子实施例11：(R)-3-((5-胍基戊酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二(十二酸)酯

步骤1：(Z)-5-(2,3-双(叔丁氧羰基)胍基)戊酸

(E)-(((叔丁氧基羰基)亚氨基)(1H-吡咯-1-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(0.5g；4.25mmol)与5-氨基戊酸(1.45g；4.68mmol；1.1moleqs)之间的反应于室温在吡啶(10mL)中进行达48小时。反应混合物悬浮液变为澄清溶液。混合物蒸发至干，残余物溶解于1M NaOH(25mL)中并用EtOAc(50mL)清洗。使用浓HCl溶液将水层酸化至pH为3。水层用EtOAc萃取两次，收集的有机层首先用饱和NaCl溶液清洗，然后用Na₂SO₄干燥。蒸发溶剂得到白色固体(1.22g)。该粗产物通过将其在加入几滴乙酸(约0.2v/v％)的1/3EtOAc/庚烷的混合物中搅拌来进一步纯化。1H-NMR谱与期望结构一致。

1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.35(t,J＝5.3Hz,1H),3.73–3.15(m,2H,NCH₂CH₂),2.40(t,J＝7.0Hz,2H,CH₂CH₂COOH),1.83–1.57(m,4H.NCH₂CH₂CH₂CH₂COOH),1.50(d,J＝2.3Hz,18H,CH₃ Boc)。

HPLC-MS:m/z(M+H)⁺＝359.92。计算值：C₁₆H₂₉N₃O₆(精确质量359.21；分子量359.42)。

步骤2：(R,E)-6-((叔丁氧基羰基)氨基)-2,2-二甲基-4,12-二氧代-3,13-二氧杂-5,7-二氮杂十六-5-烯-15,16-二醇二(十二酸)酯

(Z)-5-(2,3-双(叔丁氧基羰基)胍基)戊酸(0.43g；1.2mmol；1.1moleqs)与(S)-3-羟基丙烷-1,2-二醇二(十二酸)酯(构造块1；0.5g；1.1mmol)之间的反应在DCM(4mL)中使用DIC(0.15g；1.2mmol；1.1moleqs)和DPTS(32mg；0.11mmol；0.1moleqs)作为试剂来进行。混合物于室温搅拌72小时。混合物用DCM(25mL)稀释，随后用1M NaOH(25mL)和饱和NaCl(水性)溶液清洗。溶液用Na₂SO₄干燥。粗产物通过硅胶柱色谱纯化，用EtOAc/庚烷(1/3)作为洗脱液。产量：0.471g(54％)。1H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ11.50(s,1H,NH),8.32(t,J＝5.2Hz,1H,NH),5.26(tt,J＝6.0,4.3Hz,1H,OCH₂CHCH₂O),4.30-4.14(m,4H,CHCH₂OCO),3.43(td,J＝6.9,5.2Hz,2H,NCH₂(CH₂)₂CH₂COO),2.59–2.20(m,C6H,C₁₁尾部的CH₂CH₂COO,NCH₂(CH₂)₂CH₂COO),1.84–1.56(m,8H,NCH₂CH₂CH₂CH₂COOH,CH₂CH₂COO),1.50(d,J＝3.9Hz,18H,CH₃ Boc),1.27(d,J＝9.2Hz,32H,CH₃(CH₂)₈CH₂),1.11–0.64(m,8H,CH₃)。

步骤3：(R)-3-((5-胍基戊酰基)氧基)丙烷-1,2-二醇二(十二酸)酯

(R,E)-6-((叔丁氧基羰基)氨基)-2,2-二甲基-4,12-二氧代-3,13-二氧杂-5,7-二氮杂十六-5-烯-15,16-二醇二(十二酸)酯(0.471g；0.6mmol)于室温用TFA在DCM中脱保护达24小时。反应混合物蒸发并与DCM共同蒸发数次以除去过量的TFA。产物在氯仿中稀释，先用0.05M NaOH溶液(25mL)清洗，然后用饱和NaCl(水性)溶液清洗。用Na₂SO₄干燥有机层，浓缩溶液以得到产物。产量：0.35g(100％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.27(td,J＝6.1,3.0Hz,1H,OCH₂CHCH₂O),4.49–4.00(m,4H,CHCH₂OCO),3.21(q,J＝6.8,6.1Hz,2H,NCH₂(CH₂)₂CH₂COO),2.57–2.26(m,6H,CH₂CH₂COOof the C₁₁ tails,NCH₂(CH₂)₂CH₂COO),1.88–1.48(m,8H,NCH₂CH₂CH₂CH₂COO,CH₂CH₂COO),1.27(d,J＝9.0Hz,32H,CH₃(CH₂)₈CH₂),0.88(t,J＝6.7Hz,6H,CH₃)。

MALDI-TOF-MS(CHCA基质，正反射器模式)：m/z(M+H)⁺＝598.46。计算的：C₃₃H₆₃N₃O(精确质量597.47；分子量597.88)。

针对式(IV)(ICG-A型)的实施例：衍生自丝氨醇的类型的可电离阳离子脂质

子实施例12：2-(4-(二甲基氨基)丁酰胺基)-2-甲基丙烷-1,3-二醇二(十二酸)酯

步骤1：(1,3-二羟基-2-甲基丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯

2-氨基-2-甲基丙烷-1,3-二醇(5g；48mmol)与BOC-酸酐(8g；96mmol；2moleqs)在甲醇(120mL)和THF(30mL)的混合物中反应。BOC-酸酐溶液逐滴添加到在冰浴(0℃)中冷却的反应混合物中。反应混合物于室温搅拌24小时，然后浓缩。将残余物溶解于EtOAc中，用脱矿物质水清洗三次，并用Na₂SO₄干燥。粗产物从EtOAc中重结晶。产量：3.5g(36％)。1H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.98(s,1H,NH),3.78-3.62(m,4H,OCOCH₂CCH₂OCO),3.52(s,2H,OH),1.44(s,9H,CH₃ Boc),1.17(s,3H,NCCH₃)。

步骤2：2-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基丙烷-1,3-二醇二(十二酸)酯

(1,3-二羟基-2-甲基丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.5g；2.43mmol)与十二酸(1.02g；5.15.1mmol；2.1moleqs)在DCM(4mL)中偶联，使用DPTS(70mg；0.24mmol；0.1moleqs)和DIC(0.77g；41.2mmol；6.1moleqs)作为试剂。于室温搅拌反应混合物24小时后，将其在硅藻土塞上过滤。滤液用DCM(25mL)稀释，然后用0.1M HCl(25mL)、0.1M NaOH(25mL)和饱和NaCl(水性)溶液(25mL)清洗。溶液用Na₂SO₄干燥。经由硅胶柱色谱进一步纯化，使用EtOAc/Hept 1/20作为洗脱液。产量：1.13g(82％)。1H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.73(s,1H,NH),4.42–3.96(m,4H,OCOCH₂CCH₂OCO),2.33(t,J＝7.5Hz,4H,C₁₁尾部的CH₂CH₂COO),1.62(p,J＝7.7Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.52(s,9H,CH₃Boc),1.36(s,3H,NCCH₃),1.33–1.09(m,32H,CH₃(CH₂)₈CH₂),0.88(t,J＝6.7Hz,6H,CH₃)。

步骤3：2-氨基-2-甲基丙烷-1,3-二醇二(十二酸)酯

(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基丙烷-1,3-二醇二(十二酸)酯(1.13g；1.98mmol)在TFA(2mL)和DCM(4mL)中于室温搅拌24小时。蒸发溶剂，粗产物残余物(白色固体)重新溶解在氯仿中，随后有机溶液用1.0M NaOH(25mL)和饱和NaCl(水性)溶液清洗。在Na₂SO₄中干燥后，分离产物。产量：0.853g(91％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ3.94(q,J＝10.9Hz,4H,OCOCH₂CCH₂OCO),2.33(t,J＝7.6Hz,4H,C₁₁尾部的CH₂CH₂COO),1.63(q,J＝7.2Hz,4H,CH₂CH₂COO),1.27(d,J＝11.9Hz,32H,CH₃(CH₂)₈CH₂),1.12(s,3H,NCCH₃),0.88(t,J＝6.7Hz,6H,CH₃)。

MALDI-TOF-MS(CHCA基质，正反射模式):m/z(M+H)⁺＝470.43,(M+Na)⁺＝492.41。计算值：C₂₈H₅₅NO₄(精确质量469.41；分子量469.75)。

步骤4：2-(4-(二甲基氨基)丁酰胺基)-2-甲基丙烷-1,3-二醇二(十二酸)酯

2-氨基-2-甲基丙烷-1,3-二醇二(十二酸)酯(0.32g；0.68mmol)在DCM(2mL)中与4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(0.17g；1.02mmol；1.5moleqs)偶联，使用DPTS(20mg；0.24mmol；0.07moleqs)和DIC(0.127g；1.01mmol；1.5moleqs)作为试剂。反应混合物于室温搅拌24小时，然后在硅藻土塞上过滤。滤液用DCM(25mL)稀释，用0.1M HCl(25mL)、0.1MNaOH(25mL)、饱和NaCl(水性)(25ml)清洗，最后用Na₂SO₄干燥。粗产物经由硅胶柱色谱纯化，使用2％MeOH/氯仿至10％MeOH/氯仿的梯度洗脱液。产量：294mg(75％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.86(s,1H,NH),4.50–4.09(m,4H,OCOCH₂CCH₂OCO),2.40(t,J＝6.6Hz,2H.CH₂N(CH₃)₂),2.36–2.16(m,10H,NCOCH₂,OCOCH₂ and CH₂N(CH₃)₂),1.79(q,J＝6.8Hz,2H,CH₂CH₂N(CH₃)₂),1.75–1.54(m,4H,CH₂CH₂COO),1.39(s,3H,NCCH₃),1.27(d,J＝9.1Hz,32H,CH₃(CH₂)₈CH₂),1.12–0.52(m,6H,CH₃)。

MALDI-TOF-MS(CHCA基质，正反射模式)：m/z(M+H)⁺＝583.47,(M+Na)⁺＝605.46。计算的：C₃₄H₆₆N₂O₅(精确质量58 2.50；分子量58 2.91)。

针对式(V)(ICG-A型)的实施例：胆甾醇基可电离阳离子脂质

方案B：根据具有ICG-A型的式(V)的胆甾醇基可电离阳离子脂质的合成路线。DPTS＝4-(二甲基氨基)-吡啶鎓4-甲苯磺酸盐；DIC＝N,N′-二异丙基碳二亚胺；DCM＝二氯甲烷。

子实施例13：(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚- 2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基4-(二甲基 氨基)丁酸酯

胆固醇(0.30g；0.77mmol)与4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(0.195g；1.16mmol；1.5moleqs)在DCM(2mL)中使用DPTS(21.7mg；0.077mmol；0.1moleqs)和DIC(0.15g；1.16mmol；1.5moleqs)作为试剂进行反应。反应混合物于室温搅拌24小时，然后在硅藻土塞上过滤。滤液用DCM(25mL)稀释，用0.1M NaOH(25mL)和饱和NaCl(水性)(25mL)清洗，最后用Na₂SO₄干燥。于0℃，将粗混合物从氯仿(1.5ml)中沉淀到乙腈(50mL)中。过滤收集产物沉淀，用冷乙腈清洗并在40℃干燥。产量：165mg(42％)。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.37(d,J＝5.0Hz,1H,C＝CHCH₂),4.71–4.49(m,1H,CH₂CHCOO),2.37–2.25(m,6H,CH₂N(CH₃)₂,CH＝CCH₂CHCOO,CH₂COO),2.22(s,6H,CH₂N(CH₃)₂),2.08–1.91(m,2H,),1.91–1.71(m,5H),1.57–1.41(m,6H),1.34(d,J＝8.2Hz,3H),1.26(d,J＝10.9Hz,1H),1.22–1.05(m,7H),1.02(s,5H),0.99–0.94(m,2H),0.91(d,J＝6.5Hz,3H),0.86(dd,J＝6.6,1.8Hz,6H),0.68(s,3H)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

HPLC-MS:m/z(M+H)⁺＝500.42。计算值：C₃₃H₅₇NO₂(精确质量499.44；分子量499.82)。

子实施例14：(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚- 2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基3-(二甲基 氨基)丙酸酯

如实施例13中所描述的相似程序用于将胆固醇(0.097g；0.25mmol)偶联至3-(二甲基-氨基)丙酸盐酸盐(0.058g；0.375mmol；1.5moleqs)。产量：76mg(63％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.37(d,J＝4.9Hz,1H),4.62(t,J＝5.9Hz,1H),2.67–2.56(m,2H),2.51–2.41(m,2H),2.32(d,J＝7.5Hz,2H),2.24(s,6H),2.05–1.91(m,2H),1.84(tt,J＝9.5,4.2Hz,3H),1.66–1.42(m,9H),1.42–1.23(m,4H),1.23–1.04(m,7H),1.02(s,4H),0.96(dd,J＝11.3,5.3Hz,2H),0.91(d,J＝6.5Hz,3H),0.86(dd,J＝6.6,1.8Hz,6H),0.68(s,3H)。

HPLC-MS:m/z(M+H)⁺＝486.33。计算值：C₃₂H₅₅NO₂(精确质量485.42；分子量485.80)。

子实施例15：(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚- 2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基二甲基甘 氨酸酯

如实施例13中所描述的相似程序用于将胆固醇(0.193g；0.5mmol)偶联至二甲基甘氨酸盐酸盐(0.077g；0.750.75mmol；1.5moleqs)。产量：147mg(63％)。¹H-NMR谱与期望结构一致。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.38(d,J＝5.1Hz,1H),4.78–4.61(m,1H),3.14(s,2H),2.35(s,8H),2.08–1.92(m,2H),1.92–1.75(m,3H),1.72–1.41(m,10H),1.30(dd,J＝31.8,9.6Hz,4H),1.23–1.04(m,7H),1.02(s,4H),0.99–0.94(m,2H),0.91(d,J＝6.5Hz,3H),0.86(dd,J＝6.6,1.8Hz,6H),0.68(s,3H)。

HPLC-MS:m/z(M+H)⁺＝472.17。计算值：C₃₁H₅₃NO₂(精确质量471.41；分子量471.77)。

实施例10.可以用各种可电离阳离子材料制备含有siRNA的载脂蛋白脂质纳米颗 粒(aNP)(siRNA-aNP)以产生稳定的制剂(图10)。

使用实施例2中所描述的程序来制备含有磷脂、胆固醇、选自如图9所描述的可电离阳离子物质、甘油三酯、载脂蛋白A1和siRNA的siRNA-aNP制剂。配制一天后，对文库的单个siRNA-aNP制剂和LNP-siRNA对比实施例制剂^#进行以下分析：使用动态光散射(DLS)的(A)颗粒尺寸和(B)颗粒尺寸分散度，和(C)使用Ribogreen测定法的siRNA滞留。^#LNP-siRNA对比实施例包含Dlin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和PEG-DMG(50:38.5:10:1.5mol％)，与所包含的siRNA。

此外，测试了可电离阳离子材料17和19的非优化siRNA-aNP制剂，并在用pmirGLO质粒(Promega)转染以进行稳定的双报告萤光素酶表达(萤火虫和海肾萤光素酶)的鼠RAW264.7巨噬细胞中显示出中等(约50％)沉默能力。

序列表

<110> 比奥-特里普公司

<120> 含有核酸的纳米颗粒

<130> BTB-001-PCT

<150> EP21180786.2

<151> 2021-06-22

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ApoA1模拟物肽18A

<400> 1

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu

1 5 10 15

Ala Phe

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ApoA1模拟物肽2F

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(1)

<223> 乙酰胺加帽

<220>

<221> SITE

<222> (18)..(18)

<223> 酰胺-基团

<400> 2

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu

1 5 10 15

Ala Phe

Claims (40)

1.纳米颗粒，其包含由表面层包围的核心，其中：

所述核心包含核酸和阳离子脂质或可电离的阳离子脂质；并且

所述表面层包含：

磷脂，

甾醇，和

载脂蛋白或载脂蛋白模拟物或其组合。

2.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述载脂蛋白、载脂蛋白模拟物或其组合位于所述表面层的外表面上。

3.根据权利要求1或2的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒核心进一步包含填料，优选选自三酰甘油和胆固醇酰基酯或其组合的填料。

4.根据权利要求3的纳米颗粒，其中所述三酰甘油是三辛酸甘油酯和/或其中所述胆固醇酰基酯是胆甾醇辛酸酯和/或胆甾醇油酸酯。

5.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述核酸是RNA、DNA或核酸类似物。

6.根据权利要求5的纳米颗粒，其中所述RNA是微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi-相互作用RNA(piRNA)、小核RNA(snoRNA)、转移RNA(tRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)、小调节RNA(srRNA)、信使RNA(mRNA)、修饰的mRNA、核糖体RNA(rRNA)、长非编码RNA(lncRNA)或引导RNA(gRNA)或其组合和/或其修饰。

7.根据权利要求5的纳米颗粒，其中所述DNA是单链或双链DNA。

8.根据权利要求1至5中任一项的纳米颗粒，其中所述核酸是反义寡核苷酸并且所述反义寡核苷酸是由核苷酸或核苷类似物组成的单链DNA或RNA，所述核苷酸或核苷类似物含有磷酸二酯主链或2’核糖的修饰。

9.根据权利要求8的纳米颗粒，其中所述核苷酸或核苷类似物选自锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、吗啉代或肽核酸(PNA)。

10.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述载脂蛋白选自ApoA1、ApoA1-Milano、ApoA2、ApoA4、ApoA5、ApoB48、ApoB100、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoC-IV、ApoD、ApoE、ApoF、ApoH、ApoL、ApoM及其组合。

11.根据权利要求10的纳米颗粒，其中所述载脂蛋白选自ApoA1、ApoA2、ApoA4、ApoA5、ApoB100、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoC-IV、ApoE及其组合。

12.根据权利要求10的纳米颗粒，其中所述载脂蛋白选自ApoA1、ApoA4、ApoA5、ApoB100、ApoC-III、ApoE及其组合。

13.根据权利要求10的纳米颗粒，其中所述载脂蛋白选自ApoA1、ApoB100、ApoE及其组合。

14.根据权利要求1至13中任一项的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒中的所述载脂蛋白用于：

-在制备和储存时防止聚集；

-提高体内稳定性；

-提供天然隐形；和/或

-促进与免疫细胞的相互作用。

15.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述阳离子脂质或可电离的阳离子脂质选自长链醇的可电离的阳离子酯、甘油二酯的可电离的阳离子酯或甾醇的可电离的阳离子酯或其组合。

16.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述可电离的阳离子脂质是根据式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)中任一项的分子

其中ICG是其中波浪线指示与式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)的化合物的连接点；

p是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的整数；

每个R₁独立地选自由线性或支化C1-C19烷基、线性或支化C1-C19烯基、芳基、亚芳基-烷基和亚烷基-芳基基团组成的组，其中所述烷基或烯基基团任选地含有多达5个独立地选自O和N的杂原子；

R₂选自由氢、甲基、乙基和-CH₂-O-C(O)-R_1a组成的组；

R₃选自由氢、芳基、亚芳基-烷基、亚烷基-芳基和线性C1-C6烷基基团组成的组；

R_1a选自由线性或支化C1-C19烷基、线性或支化C1-C19烯基、芳基、亚芳基-烷基和亚烷基-芳基基团组成的组，其中所述烷基或烯基基团任选含有多达5个独立选自O和N的杂原子；

每个R_x独立地选自由甲基、乙基、丙基和-CH₂-CH₂-OH组成的组；

每个R_y基团独立地选自由氢、线性或支化C1-C18烷基、芳基、亚芳基-烷基或亚烷基-芳基基团组成的组，其中所述烷基基团任选地含有多达5个独立地选自O和N的杂原子；

或其旋转异构体、互变异构体、立体异构体或位置异构体。

17.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述甾醇选自胆固醇、链甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、麦角甾醇、藿烷类、羟基类甾醇、植物甾醇、类甾醇、氢化胆固醇、菜油甾醇或动物甾醇或其组合。

18.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中：

所述磷脂选自磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油或其组合。

19.根据权利要求18的纳米颗粒，其中所述磷脂中的酰基基团中的至少一个、更优选两者是长链脂肪酸。

20.根据权利要求19所述的纳米颗粒，其中所述长链脂肪酸选自肉豆蔻脑酸、棕榈油酸和油酸或其组合。

21.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述磷脂选自由以下组成的组：二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二月桂酰磷脂酰丝氨酸(DLPS)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其组合。

22.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中：

载脂蛋白的量范围为0.08至2.0mol％，例如0.10至2.0mol％；和/或

磷脂的量范围为5至90mol％，例如15至90mol％；和/或

甾醇的量范围为2.5-65mol％，例如2.5-50mol％；和/或

阳离子脂质或可电离的阳离子脂质的量范围为5.0至80mol％，例如8.0至80mol％，其中所述摩尔百分比仅基于所述纳米颗粒中所述载脂蛋白、磷脂、甾醇和阳离子脂质或可电离的阳离子脂质的合并量。

23.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中

载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物的量范围为0.1至90重量％；

核酸的量范围为0.01至90重量％；

磷脂的量范围为0.1至95重量％；

甾醇的量范围为0.1至95重量％；和/或

阳离子脂质和/或可电离的阳离子脂质的量范围为0.1至95重量％，

其中这些重量百分比是基于所述载脂蛋白和/或载脂蛋白模拟物、所述核酸、所述磷脂、所述甾醇和所述阳离子和/或可电离的阳离子脂质的合并量。

24.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中基于摩尔重量的所述载脂蛋白与磷脂的比率为1:25和1:400之间，更优选为1:50和1:200之间，甚至更优选为1:75和1:150之间。

25.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中基于重量的所述载脂蛋白与磷脂的比率为2:1至1:10，更优选为1:1至1:5，甚至更优选为1:1.5至1:4。

26.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其具有10至100nm，诸如30至100nm的平均尺寸。

27.组合物，其包含根据权利要求1至26中任一项的纳米颗粒和生理上可接受的载体。

28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

29.根据权利要求1至26中任一项的纳米颗粒，或根据权利要求27或28的组合物，其用作药物。

30.根据权利要求29使用的纳米颗粒或组合物，所述用途包括将核酸递送至髓样隔室或脾。

31.根据权利要求1至26中任一项的纳米颗粒，或根据权利要求27或28的组合物，其用于通过刺激或抑制先天免疫应答来治疗疾病。

32.根据权利要求31使用的纳米颗粒或组合物，其中所述疾病是癌症、心血管疾病、自身免疫性病症或异种移植排斥。

33.用于生产纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：

a)将有机溶剂中的脂质组分与水性缓冲液中的核酸快速混合以产生脂质纳米颗粒，其中所述脂质组分包含磷脂、甾醇、阳离子脂质或可电离的阳离子脂质，其中所述水性缓冲液具有5.0或更低的pH；和

b)在6.0和8.0之间的pH将所述脂质纳米颗粒与载脂蛋白、载脂蛋白模拟物或其组合快速混合以产生所述纳米颗粒。

34.根据权利要求1至26中任一项的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒通过权利要求33的方法可获得或通过权利要求33的方法获得。

35.用于将核酸引入细胞的体外或离体方法，所述方法包括使根据权利要求1-26中任一项的纳米颗粒或根据权利要求27或28的组合物与细胞接触。

36.用于将核酸引入细胞的体外方法，所述方法包括使根据权利要求1至26中任一项的纳米颗粒或根据权利要求27或28的组合物与细胞接触。

37.根据权利要求1至26中任一项的纳米颗粒或根据权利要求27或28的组合物，其用于向受试者在体内递送核酸。

38.用于体内递送核酸的方法，所述方法包括将向受试者施用根据权利要求1至26中任一项的纳米颗粒或根据权利要求27或28的组合物。

39.用于通过刺激或抑制先天免疫应答来治疗有此需要的受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至26的纳米颗粒或根据权利要求27或28的组合物。

40.根据权利要求39的方法，其中所述疾病选自癌症、心血管疾病、自身免疫性病症或异种移植排斥。