CN117538518A - 一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法 - Google Patents

一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117538518A
CN117538518A CN202311461396.5A CN202311461396A CN117538518A CN 117538518 A CN117538518 A CN 117538518A CN 202311461396 A CN202311461396 A CN 202311461396A CN 117538518 A CN117538518 A CN 117538518A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
aptamer
mycotoxin
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311461396.5A
Other languages
English (en)
Inventor
相欣然
陆佳冉
文千予
张乐妍
鞠晨
姜湘雲
陶梦荧
李婷
王其传
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huaian Chaimihe Agriculture Technology Co ltd
Jiangsu Hengxin Youhua Biotechnology Co ltd
Huaiyin Normal University
Original Assignee
Huaian Chaimihe Agriculture Technology Co ltd
Jiangsu Hengxin Youhua Biotechnology Co ltd
Huaiyin Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huaian Chaimihe Agriculture Technology Co ltd, Jiangsu Hengxin Youhua Biotechnology Co ltd, Huaiyin Normal University filed Critical Huaian Chaimihe Agriculture Technology Co ltd
Priority to CN202311515939.7A priority Critical patent/CN117548159A/zh
Priority to CN202311461396.5A priority patent/CN117538518A/zh
Publication of CN117538518A publication Critical patent/CN117538518A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/588—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with semiconductor nanocrystal label, e.g. quantum dots
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法，本发明成功构建了一种功能性DNA引导的过渡态CRISPR/Cas12a微流控生物传感器FTMB。FTMB中的信号转导CRISPR/Cas12a策略利用具有特异性识别功能的DNA序列和激活剂来形成触发开关，同时通过调节crRNA和激活剂的组成比例，构建了过渡态CRISPR/Cas12a系统，以实现对低浓度目标真菌毒素的高响应。另一方面，FTMB的信号增强有效地集成了量子点的信号输出和光子晶体的荧光增强效应。

Description

一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法。
背景技术
真菌毒素被认为是引起食源性疾病的最重要原因之一，已受到全球的长期关注。其中，黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏马菌素B1(FB1)、T-2真菌毒素(T-2)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是最常见的毒素。随着公众健康意识的提高，一些组织已经设定了食品中真菌毒素的最大残留限量(MRLS)，以避免高风险行为。然而，大多数真菌毒素都是微量存在的，这对食品安全构成了严重挑战。此外，多种真菌毒素共存于同一食品中的协同或拮抗作用增加了对人类的毒性。面对物流全球化的发展趋势，高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS)等传统真菌毒素分析方法由于成本高、程序耗时、对专业技能的要求，在实际应用中受到限制。因此，迫切需要建立一种灵敏、快速、准确的多种真菌毒素高通量检测方法来满足当前的新需求。
到目前为止，已经报道了一些生物传感器用于真菌毒素的原位检测。特异性分子识别元件主要是抗体和适配体，与抗体相比，适配体具有合成容易、成本低、热稳定性好的优点，使其成为构建生物传感器的理想识别元件。通过指数富集配体的系统进化，已经筛选出多种真菌毒素适配体。由于适配体稳定的信号输出和可编程性，将适配体转化为荧光信号在生物传感器中具有更广泛的应用前景。然而，它主要用于真菌毒素的竞争免疫测定，因此，输出荧光强度与分析物浓度呈负相关，或通过二次信号处理呈正相关，这牺牲了检测精度。
CRISPR/Cas系统使真菌毒素和荧光信号之间建立直接的线性正相关成为可能。CRISPR-Cas系统可以通过设计特定的引导RNA链来实现与匹配的RNA或DNA的结合，成为基于这一特征的理想分子检测工具。CRISPR/Cas12a系统基于Cas12a酶，当功能性DNA遇到目标分析物时，Cas12a不加区分地切割周围的单链DNA(ssDNA)探针。此外，Cas12a对crRNA靶DNA错配的内在耐受性较低，需要高度互补性，传感器在捕获目标分子时不受界面空间的限制，显著提高了识别效率。但是固相界面上的免疫识别受到比表面积、靶分子与界面之间缓慢扩散过程以及靶分子与固相界面非特异性相互作用的限制，Cas12a酶的非特异性侧支切割活性限制了其在多靶点检测系统中的应用。因此，为了扩展CRISPR/Cas12a系统的吞吐量检测策略，将其与多路复用微流控芯片相结合是一种可行的解决方案。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：Cas12a酶的非特异性侧支切割活性限制了其在多靶点检测系统中的应用，导致CRISPR/Cas12a系统的检测通量小；同时CRISPR/Cas12a系统中与分子识别事件相关的标签的信号强度低，导致检测灵敏度较低。
本发明为了实现对真菌毒素的高通量超灵敏检测，构建了一种功能性DNA引导的过渡态CRISPR/Cas12a微流控生物传感器(FTMB)，FTMB中的信号转导CRISPR/Cas12a策略利用具有特异性识别功能的DNA序列和激活剂来形成触发开关，同时通过调节crRNA和激活剂的组成比例，构建了过渡态CRISPR/Cas12a系统，以实现对低浓度目标真菌毒素的高响应。另一方面，FTMB的信号增强有效地集成了量子点(QDs)的信号输出和光子晶体(PC)的荧光增强效应。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明的第一个技术方案是：
一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，所述的真菌毒素检测系统用于检测黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏马菌素B1(FB1)、T-2真菌毒素(T-2)或者脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)中的任意一种或几种组合；
所述的检测系统中包括针对各个真菌毒素的以下物质：
4)适配体-1、激活子、适配体-2构成的复合物；
5)crRNA；
6)探针；
其中，针对AFB1，crRNA的序列为：SEQ ID NO：1，适配体-1的序列为：SEQ ID NO：
2，激活剂的序列为：SEQ ID NO：3，适配体-2的序列为：SEQ ID NO：4；
针对OTA，crRNA的序列为：SEQ ID NO：5，适配体-1的序列为：SEQ ID NO：6，激活剂的序列为：SEQ ID NO：7，适配体-2的序列为：SEQ ID NO：8；
针对ZEN，crRNA的序列为：SEQ ID NO：9，适配体-1的序列为：SEQ ID NO：10，激活剂的序列为：SEQ ID NO：11，适配体-2的序列为：SEQ ID NO：12；
针对FB1，crRNA的序列为：SEQ ID NO：13，适配体-1的序列为：SEQ ID NO：14，激活剂的序列为：SEQ ID NO：15，适配体-2的序列为：SEQ ID NO：16；
针对T-2，crRNA的序列为：SEQ ID NO：17，适配体-1的序列为：SEQ ID NO：18，激活剂的序列为：SEQ ID NO：19，适配体-2的序列为：SEQ ID NO：20；
针对DON，crRNA的序列为：SEQ ID NO：21，适配体-1的序列为：SEQ ID NO：22，激活剂的序列为：SEQ ID NO：23，适配体-2的序列为：SEQ ID NO：24。
优选的，探针两端分别被淬灭基团和荧光基团连接。
优选的，探针序列如SEQ ID NO:26所示。
优选的，探针连接于量子点的表面；所述的量子点是CdSe/ZnS量子点。
优选的，所述的探针的制备方法是：
S1：称取EDC和NHS溶于PB缓冲液中，加入量子点，活化、离心、洗涤、重悬，得到悬浊液；
S2：在所述悬浊液中加入ssDNA报告分子，在超声条件下梯度混合至最终浓度，得到混合液；
S3：在所述混合液中加入额外EDC，孵育、离心后收集产物，即为QD探针。
优选的，所述EDC和NHS的浓度为1-5mg/ml；所述活化的时间为10-50min；所述洗涤和重悬的溶液为PBS缓冲液；所述梯度混合的梯度浓度为150-250nM，所述最终浓度为0.5-1.5μM；所述额外EDC的浓度为10-30mg/mL；所述孵育的时间为1-3h。
优选的，所述的复合体是由适配体-1、激活剂、适配体-2的摩尔比1-5：1：1-5所构成，优选2:1:2。
优选的，所述的复合体的制备方法是每种真菌毒素的适配体-1、激活剂和适配体-2混合，将混合物加热，然后自然冷却至室温得到。
优选的，所述的检测系统中还包括Cas12a酶。
本发明的第二个技术方案是：
一种检测真菌毒素的方法，包括如下步骤：
步骤1，将针对各个真菌毒素的复合物的溶液、crRNA溶液、探针溶液、Cas12a酶的溶液分散于超纯水中，冻干后得到微球；
步骤2，微球与标准品溶液或样品溶液进行反应，并记录探针释放的荧光强度；
步骤3，根据标准品溶液获得标准曲线，并计算出样品溶液中的真菌毒素的浓度。
步骤1中，复合物的溶液的浓度是4-20 nM，crRNA溶液的浓度是0.5-5μM，探针溶液的浓度是0.5-5μM，Cas12a酶的溶液的浓度是1-20μM；各个溶液的体积比依次是1.5:0.5-5:0.5-5:0.5-4。
所述的步骤2中，荧光强度还通过聚苯乙烯(PS)微球进行信号放大，所述的聚苯乙烯(PS)微球的直径范围是250-550nm。
本发明的第三个技术方案是：
一种微流控芯片，包括：
加样口，位于上层；
至少一个反应室，位于中间层，所述的反应室通过流动通道与加样口连通；反应室中预置有检测试剂，所述的检测试剂基于荧光对待测物的含量进行响应；
透光的下层，并且在下层与反应室之间还设有信号放大层；
在反应室的底部还设有排气通道，排气通道直径小于反应室的直径，当样品溶液进样压力小于阈值时，样品溶液受到毛细管力作用不能从排气通道中排出，且当样品溶液进校压力大于阈值时，样品溶液可排出。
排气通道的出口端位于上层。
所述的信号放大层是由羧基改性PS微球构成，通过配制成悬浮液后滴入底层表面并静置成膜而得到。
静置成膜的条件：温度为30-60℃，时间为10-15h。
所述的反应室的数量为多个，构成反应室阵列。
所述的检测试剂是上述的冻干后得到微球。
本发明的第四个技术方案是：
上述的微流控芯片的检测方法，包括如下步骤：
步骤a，将样品溶液从加样口加入，并通过流动通道进入至反应室中，并与检测试剂进行反应，并产生荧光；
步骤b，荧光通过信号放大层进行放大后，从下层中采集荧光，并根据光强度对样品溶液中的目标物质的浓度进行测定；
步骤c，检测结束后，对加样口进行加压，使反应体系排出。
所述的步骤a中，当样品溶液加入后，继续加入矿物油沿密封反应室。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明中，基于真菌毒素适配体的DNA引导的过渡态CRISPR/Cas12a系统用于信号转导，CRISPR/Cas12a系统的通用量子点用PC增强，用于信号增强，使真菌毒素识别事件能够正相关转换为荧光信号。在此基础上，将压力驱动的八通道微流控芯片与它们进一步集成，实现了对六种真菌毒素的同时超灵敏和定量检测。这种功能性DNA引导的过渡态CRISPR/Cas12a微流体生物传感器(命名为FTMB)的高信号转导和增强特性使其能够在复杂的生物背景中更准确地检测真菌毒素。
(2)增强了与分子识别事件相关的标签的信号强度，使得灵敏度提高。本发明通过荧光共振能量转移(FRET)技术中，采用量子点(QDs)作为FRET供体；并且，基于光子晶体(PC)的荧光增强技术用于进一步提高检测灵敏度。光子晶体通过胶体晶体周期性有序排列形成的光子带，提高了发射的荧光光子的收集效率，以反射与光子晶体衍射波长重叠的荧光。PC布拉格反射效应的可调节性使其能够匹配来自不同标记材料波段的荧光。
(3)CRISPR/Cas12a系统通用量子点的构建和匹配光子带隙的PC膜产生了45.6倍的显著信号增强。FTMB表现出宽的分析范围、低检测限、短检测周期、高特异性、良好的精密度，以及令人满意的实际样品分析能力，为临床诊断和食品安全领域中多种小分子的快速检测提供一种新的可靠的解决方案。
附图说明
图1：本发明的原理图。
图2：CRISPR/Cas12a信号转导和PCs信号增强机制的可行性验证过程。(A)聚丙烯酰胺凝胶电泳；(B)由对应于六种真菌毒素的触发开关激活的CRISPR/Cas12a系统的实时荧光曲线；(C)适配体和激活剂的不同比例对锁定效果的影响；(D)不同浓度的报告分子对猝灭量子点荧光的评估；(E)由PS微球组成的PC的TEM；(F)载有量子点和FAM的PDMS和PC的荧光图像；(G)不同粒径的PC对量子点和FAM的增强因子。
图3：用于真菌毒素检测的过渡态CRISPR/Cas12a系统的建立。(A)Cas12a酶：(1)不同形式之间的转化，(2)不同的反应状态(闭合、过渡和开放状态)，(3)不同crRNA对切割效率的影响；(B)活化复合物浓度对Cas12a酶反式切割活性的影响；(C)激活剂、crRNA比例对Cas12a酶反式切割活性的影响；(D)活化剂浓度对Cas12a酶反式切割活性的影响；(E)CRISPR/Cas12a系统在与靶上和靶外真菌毒素孵育时的三种状态的性能。
图4：CRISPR/Cas12a系统在为六种真菌毒素设计的三种状态下的裂解动力学。
图5：压力驱动微流控芯片的组成和整个操作过程，(A)芯片的结构层组成；(B)芯片中流体测试的初始和最终状态(添加红色染料的样品溶液)；(C)样品在芯片中流动的全过程。
图6：QD探针浓度的优化。
图7：crRNA浓度的优化。
图8：触发开关浓度的优化。
图9：FTMB的性能分析。(A)六种真菌毒素在不同浓度下的标准曲线及其相应的荧光图像；(B)单一和多种真菌毒素的特异性评估。
图10：芯片中样品溶液的流动过程剖面图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，FTMB的程序由四个部分组成：(1)通过微流控芯片的分形分支八通道自动分配样品；(2)激活剂和功能性DNA的程序化分离，视为触发开关，以响应目标真菌毒素的诱导；(3)通过活化的Cas12a酶的侧支切割活性，由含有报告基因的BHQ1猝灭的量子点控制荧光的释放；(4)在具有PC的反应室中进行信号增强和记录。
本发明的检测系统的工作原理：(A)功能性DNA引导的过渡态CRISPR/Cas12a系统对目标真菌毒素的信号转导和识别增强：目标真菌素诱导相应触发开关的分离；将功能性DNA与靶真菌毒素结合，释放CRISPR/Cas12a系统的激活剂；释放的激活剂与crRNA结合，促进CRISPR/Cas12a系统向激活状态的过渡；用具有猝灭基团BHQ1的报告分子作为CRISPR/Cas12a系统的探针对CdSe/ZnS量子点的表面进行修饰；激活的CRISPR/Cas12a系统剪切量子点表面的报告分子以恢复荧光；反应室下方的PC增强荧光信号，荧光信号最终被收集和读取。(B)压力驱动八通道微流控芯片的操作流程：样品溶液通过手动注射器进入芯片，并均匀分布；矿物油密封反应室，避免交叉污染；CRISPR/Cas12a系统在室温下反应，生成的荧光信号被智能手机收集；通过智能手机拍摄的图片分析颜色模型，得到六种真菌毒素的浓度。
在以下的实施例中所进行检测的真菌毒素包括AFB1、OTA、ZEN、FB1、T-2和DON，另外还采用羧基PEG修饰的CdSe/ZnS量子点(发射波长为525nm)，以及尺寸为250 nm、350 nm、450 nm和550 nm的PS微球。
触发开关的设计和准备：根据六种毒素(AFB1、OTA、ZEN、FB1、T-2和DON)，设计了修饰适配体、Cas12a-guide RNA(crRNA)和激活剂的相应序列如表1所示。
表1核酸序列
为了确保所有种类的激活剂都被完全锁定，每种真菌毒素的适配体-1、激活剂和适配体-2混合摩尔比例设置为2:1:2，将混合物在90℃下加热10分钟，然后自然冷却至室温，得到触发开关，在4-20 nM范围内优化得到真菌毒素的触发开关的最终浓度。
CRISPR/Cas12a系统中QD探针的合成：
QD探针是通过EDC和NHS介导的酰胺化反应制备的。具体如下：将1.5mg EDC和NHS溶解在1.0mL PB缓冲液中，并加入3mg CdSe/ZnS量子点，并在室温下在垂直混合器中反应30分钟，以激活QDs上的羧基，活化后将溶液转移到1.5mL EP管中，并以12000rpm离心5分钟，用PBS缓冲液洗涤活化的QD 3次，以去除未反应的EDC和NHS，然后重新悬浮在PBS缓冲溶液中，然后加入具有猝灭基团的ssDNA报告分子，并超声混合，以200 nM的梯度将其最终浓度混合至1μM。随后，向活化反应提供浓度为20mg/mL的额外EDC以加速偶联效率，并继续孵育2小时。通过离心(6000rpm，5min)去除残留的ssDNA报告分子后，收集产物，即为QD探针，测试收集产物的猝灭效率。
CRISPR/Cas12a系统的构建：
为每种真菌毒素制备25μL体积的CRISPR/Cas12a溶液。成分包括1.5μL LbaCas12a酶(5μM)、2.5μL crRNA(1μM)，每种真菌毒素1.5μL触发开关溶液(10nM)、2.5μL QD探针或FAM标记探针(2μM)和、5μL NEBuffer2.1和10μL超纯水。根据上述系统，用1000ng/mL浓度的目标真菌毒素溶液和FAM标记的探针测试了CRISPR/Cas12a系统的可行性，通过凝胶电泳和实时荧光曲线分析反应结果。通过冷冻干燥技术将CRISPR/Cas12a系统集成到芯片中，在上述制备的25μLCRISPR/Cas12a系统中加入2μL 20％(V/V)海藻糖溶液作为保护剂。将针对不同真菌毒素的CRISPR/Cas12a溶液滴入液氮中，并快速冷冻成微球。
制备微流控芯片：
本研究中使用的微流控芯片由三层组成：流动通道的上层、带有反应室阵列的中间层和带有PC膜和PDMS层的底层。考虑到流道高度的限制，分别采用不同的工艺制备了三层结构，上层的模具是通过软光刻制备的，中间和底部的PDMS层是使用金属模具制造的。通过溶剂蒸发法制备反应室底部的PC膜：将不同尺寸的羧基改性PS微球高速和低速离心以提高其分散性，然后用超纯水以1:4(v/v)的比例稀释，然后通过移液管枪将10μL PS微球垂直滴到底层反应室的中心，将含有PS微球的底层在40℃下放置12小时，以使水蒸发。将用于不同真菌毒素检测、阴性和阳性对照的CRISPR/Cas12a系统微球添加到反应室中进行冷冻干燥，三个PDMS层通过氧等离子体处理，然后依次结合，将制备的微流控芯片用蓝色薄膜包裹，并放置在-20℃下供进一步使用。为了测试PC对探针荧光的增强作用，使用2μL的1 ng/mL AFB1来激活与AFB1对应的CRISPR/Cas12a系统。
芯片的工作原理：
芯片中流体的正常工作主要取决于外部驱动力和八个反应室中空气压缩引起的反向驱动力的一致性，排气通道设计在每个反应室的下端，以确保流体能够顺利分配到8个反应室中。图10显示了具有相应流动通道和排气通道的单个反应室的横截面图，流体通过上部流动通道进入反应室，使反应室内的气体被压缩，在压缩气体的阻力作用下，流体将首先在腔室顶部形成一个柱，然后通过增加体积来加载，由于排气通道的存在，可以稳定地排除腔室中的气体，以保持低水平的压力强度。当腔室中的气体压力达到排气通道的阈值时，气体将通过底部排气通道从芯片中排出，由于排气通道尺寸的毛细管效应和PDMS的疏水性，液体在接受更大的压力之前不会进入排气通道。当所有样品溶液进入反应室时，随后加入的矿物油沿着上部通道密封反应室。需要注意的是，如果排气通道设计在芯片顶部，溶液将直接突破毛细管阻力，从排气通道流到芯片外部，而不会进入反应室。在微观尺度上，重力可以忽略，流体主要受到下方反应室气体压力的影响，流体首先在反应室上方形成柱，防止反应室中的气体通过排气通道排出。以上的反应室直径、毛细管径以及反应液的加入压力可以根据反应液的表面张力等参数进行确定。
读取输出信号：
在触发开关可行性分析中，使用琼脂糖凝胶电泳和qPCR仪器(反应条件为37℃)分析触发开关对CRISPR/Cas12a系统的调节，使用荧光分光光度计研究了适配体和激活剂的最佳比例以及报告子的浓度对猝灭量子点荧光的影响。为了读取芯片上的信号，我们在智能手机中开发了一个简单的读取设备和相应的应用程序，读取设备由一个λ＝380nm的蓝色LED和一个通过3D打印获得的带有智能手机支架的黑盒组成，该设备的主要功能是为FTMB提供黑暗环境和激励光源。荧光强度也可以通过其他的光学检测器进行采集，本专利中不作限定。
数据分析：
读取拍摄图像的RGB中的绿色通道值。提取图像的绿色通道信号值(G)，通过方差分析的单向分析和Tukey的多重比较来分析这些值。
为了定量真菌毒素，通过梯度稀释的标准溶液构建标准曲线。通过将1 mg真菌毒素(AFB1、OTA、ZEN、FB1、T-2和DON)溶解在1 mL乙腈中制备真菌毒素储备溶液，并在-20℃下储存在琥珀色玻璃瓶中。通过在乙腈-水溶液(0.1，v/v)中稀释储备溶液来制备AFB1、OTA、ZEN、FB1、T-2和DON的十倍标准溶液。为了确保所选浓度覆盖真菌毒素的最大残留限量范围，标准溶液的稀释度为0、1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2、1.0×10-1、1、10和50 ng/mL，绘制了荧光信号与真菌毒素浓度之间的标准曲线。每种真菌毒素的LOD由3倍标准偏差计算，该标准偏差是从空白或未添加任何真菌毒素(n＝20)的样品中获得的，除以每种真菌毒素在标准曲线上的绝对斜率。FTMB对不同真菌毒素的特异性通过检测浓度为50μg/L的AFB1、OTA、ZEN、FB1和T-2来评估，使用PBS缓冲液作为阴性对照。所有实验一式三份进行，通过FTMB和HPLC检测真实样品。在研磨三种样品后，将AFB1、OTA、ZEN、FB1、T-2和DON的标准溶液分别添加到玉米、花生和小麦样品粉末中，在室温下干燥上述样品6小时后，加入10mL甲醇-水混合物(6:4，v/v)。然后，将加标样品在摇床上振荡2小时，并以8000rpm离心10分钟，最后，用0.22μM注射器过滤器过滤获得上清液，随后用Tris缓冲液将所得上清液稀释至0.05、1和5 ng/mL，得到玉米、花生和小麦样品，储存在4℃下进行后续操作测试。
在检测系统的构建中，目标真菌毒素的识别是关键因素。作为触发开关，功能性DNA必须满足两个条件：锁定激活剂和识别目标分子，因此我们在先前报道的适配体的基础上精心设计了功能性DNA，该适配体可以在不影响识别位点的情况下完全锁定激活剂。本发明证实了复合物在室温下是稳定的，并且它们会与靶标结合，导致构象变化，从而释放激活剂。因此，真菌毒素识别事件被成功转导，并触发Cas12a酶的启动进行级联反应，活化的Cas12a酶会快速剪切量子点表面修饰的报告分子(NH2-TTATT-BHQ1)，使猝灭基团BHQ1远离发射区，恢复量子点的荧光，受活化的Cas12a酶的量和切割效率的限制，量子点的荧光回收效率与释放的活化剂密切相关。PC被构建在反应室的底部，以实现荧光信号的增强，这有助于降低检测阈值水平并扩大动态检测范围。
触发开关的可行性验证：
为了验证触发开关对六种不同真菌毒素的实用性，将功能性DNA引导的CRISPR/Cas12a系统分别应用于ssDNA(19nt)和FAM标记的探针(FAM-TATT-BHQ1)的降解。如图2的A区域所示，ssDNA在没有相应激活剂的反应系统中保持完整(泳道1-2)。当使用触发开关时，CRISPR/Cas12a的切割活性仍然受到限制(泳道3-8)。然而，它可以在靶真菌毒素(100ng/mL)存在的情况下被触发，因此ssDNA被切割成随机的短片段(泳道9-14)。这种降解现象表明，六种功能DNA可以作为触发开关启动随后的级联反应。另一方面，基于功能DNA的触发开关也在CRISPR/Cas12a荧光检测系统中进行了测试，实时荧光曲线显示，在没有触发开关或目标真菌毒素的情况下，荧光信号几乎不积累，而在有触发开关和目标真菌素的情况下荧光信号迅速增加(图2的B)。根据荧光强度值，适配体和激活剂的最佳比例为2:1(图2的C)。这些结果表明，功能性DNA作为触发开关可以识别目标真菌毒素。
CRISPR/Cas12a系统的量子点：
为了进一步提高FTMB的检测灵敏度和抗干扰能力，选择量子点作为供体材料构建CRISPR/Cas12a系统的探针。与FAM标记的探针相比，量子点的窄发射光谱和高量子产率有助于高度匹配PC的光子带隙。考虑到绿带是最常见的检测输出信号，选择了绿色发射波长为520 nm的量子点，在FRET的基础上，将报告分子修饰在量子点表面，实现荧光猝灭，进一步检测报告基因的浓度以获得最佳的猝灭效率。如图2的D所示(右上角显示了量子点的TEM)，猝灭效率随着报告基因浓度的增加而增加，直到在6nmol下实现完全猝灭。
PC的荧光增强效应：
构建了具有不同粒径聚苯乙烯(PS)微球的PC，以研究与量子点匹配的最佳光子带隙。PS微球溶液在疏水性聚二甲基硅氧烷(PDMS)表面蒸发，自组装成紧密堆积、高度有序的周期性纳米结构(图2的E)。图2的F显示，由不同尺寸(直径为250nm、350nm、450nm和550nm)的PS微球组成的四种PC增强了量子点和FAM的荧光，量子点的发射光谱范围和PC中不同光子带隙的存在决定了不同的信号增强效果，量子点的窄发射波长范围能够更好地增强荧光信号。根据定量测量，由250nm PS微球组成的PC对量子点的增强因子达到45.6，远高于由250nm、350nm、450nm和550nm PS微球构成的PC对FAM的增强因子(图2的G)。这些结果表明，由250nm PS微球构建的PC是CRISPR/Cas12a系统中QDs信号放大的理想选择。
过渡态CRISPR/Cas12a系统的设计：
使用少量激活剂可以很容易地改变具有不同形式的Cas12a酶(即失活、中间体和活化)的动态平衡系统，以激活更多的Cas12a酶(图3的A(1))。然而，只有当激活剂浓度超过一定阈值时，CRISPR/Cas12a系统的切割效率才会显著提高。在闭合状态下，Cas12a酶需要大量的激活剂来启动切割活性。在开放状态下，大多数Cas12a酶通过与过量的crRNA/激活剂复合物结合而被完全激活，并且较高的初始背景荧光使得很难区分额外激活的信号变化。因此，CRISPR/Cas12a系统最敏感的状态是过渡状态，即使少量的激活剂也可以容易地激活Cas12a酶(图3的A(2))，以诱导强烈的切割活性。从图3的A(3)中观察到，在相同浓度的激活剂下，对应于不同crRNA的Cas12a酶的侧支切割活性不同，这归因于CRISPR/Cas12a系统的裂解效率是由多个组分的性质共同驱动的，因此组分的结构和比例对CRISPR/Cas12a系统性能有显著影响。
为了确定过渡状态，首先评估了活化复合物(活化剂/crRNA)对Cas12a酶的影响。对于固定浓度的Cas12a酶，活化复合物的浓度逐渐增加到4nM以上(将活化剂与crRNA的比例保持在1:1)，Cas12a的侧支切割活性显著增加(图3的B)。通过绘制激活曲线的一阶导数，将分子开关分为三种状态(即闭合状态、过渡状态和断开状态，如图3的B所示)。分别用低浓度(<3nM)和高浓度(>8nM)的活化复合物形成闭合状态和打开状态。用中等浓度的活化复合物制备过渡态，并对活化复合物浓度的变化保持高响应，其中顶点为5.32nM。此外，当激活剂与crRNA的比例在所有三种状态下都降低时，只有过渡状态的Cas12a酶的反式切割活性发生了显著变化(图3的C)。
为了建立过渡状态，我们进一步调整了激活剂的数量，同时保持crRNA的数量不变(图3的D)。最佳过渡状态被定义为一阶导数激活图上的顶点(图3的D)，这种确定的过渡状态表明其响应性进一步提高，Cas12a酶的切割速率最高，而CRISPR/Cas12a系统的闭合和打开状态未能产生任何可区分的信号(图3的E)，比率调节的Cas12a酶不仅在与靶上真菌毒素孵育时表现出显著的侧支切割活性，而且在与脱靶真菌毒素一起孵育时保持低的背景活性。在过渡态CRISPR/Cas12a系统中，三种状态的酶的比浓度比计算为：5nM(失活状态Cas12a):100nM(中间状态Cas12b):195nM(激活状态Cas12c)。过渡态CRISPR/Cas12a系统对所有六种真菌毒素实现了更快的激活动力学(图4)，与其他状态下制备的分子开关相比，过渡态CRISPR/Cas12a系统能够快速激活Cas12a酶，低浓度的靶标可以在室温下孵育40分钟内被识别。
压力驱动微流控芯片的流体测试：
微流控芯片上的流体控制是高通量真菌毒素检测的重要保证。使用一种红色染料溶液，上面有25μL矿物油，用于流体测试，受自然分形树系统的启发，流道设计确保了入口施加的压力均匀分布在反应室中，以引导液体分流，这种分配模式不受注射过程中压力变化的影响，并确保了100％的分配效率。图5为压力驱动微流控芯片的组成和整个操作过程，图5(A)为芯片的结构层组成：底层为信号增强层，分布在带有PC的八个空心孔中；中间层是具有穿过顶部和底部的八个反应室和从底部延伸的排气通道的反应层；顶层是一个具有分形分支微通道网络的流动通道层，可以均匀分布样品溶液；图5(B)为芯片中流体测试的初始和最终状态(添加红色染料的样品溶液)：芯片可以在可变的外部压力下驱动样品的均匀分布；图5(C)为样品在芯片中流动的全过程：液体在外部压力的作用下进入芯片的流道；流体压缩反应室和流道中的空气，空气通过排气通道缓慢排出，从而将每个反应室的压力调节为一致；在流体完全进入反应室后，矿物油立即进入以密封流动通道和反应室；反应室中的CRISPR/Cas12a系统开始工作，并且如果存在目标真菌毒素则释放荧光。
从图5中可以看出，红色液体均匀分布在左右八个反应室中，并被随后的矿物油隔离，以避免交叉污染，芯片底部的排气通道利用毛细管效应形成截止阀，排出反应室中的空气，但不排出液体。为了确保结果的准确性，右侧的两个反应室被用作阴性和阳性对照，另外六个反应室用于检测六种不同的真菌毒素，此外具有不同分形维数和分支级别的芯片可以进一步扩展到更高吞吐量的检测方案。
FTMB操作步骤：
FTMB中微流控芯片的分形微通道实现了每个反应室的压力一致性。因此，注射操作只需要从入口通过注射器将样品(200μL)缓慢注射到芯片中，直到液体分散到每个反应室，样品分配完成后，立即向芯片中注入20μL矿物油，在反应溶液上形成薄膜进行密封，以防止污染和溶剂蒸发，然后在芯片表面覆盖一层蓝色塑料膜，以密封所有的孔，在室温下持续孵育40分钟，在黑暗环境中用智能手机收集芯片上每个反应室在380nm便携式激光(300mW)照射下的荧光。
FTMB中关键参数的优化。
作为CRISPR/Cas12a系统的底物，通常需要量子点来支持整个反应过程。从图6可以看出，荧光强度通常随着量子点浓度的增加而在一定范围内增加，直到达到最大值，通过综合考虑荧光强度和试剂剂量，选择了300nM的量子点。在此基础上，对crRNA和触发开关的浓度进行了优化，在110nM下测定Cas12a酶的浓度，如图7所示，荧光强度随着crRNA浓度的增加而增加，考虑到crRNA与激活剂对Cas12a酶的不同结合能力，六种真菌毒素的最佳crRNA浓度分别为150nM(ZEN)、175nM(FB1、DON)和200nM(AFB1、OTA、T-2)。类似地，通过研究不同浓度触发开关下荧光强度的变化来确定触发开关的最佳剂量。触发开关与处于过渡状态的目标真菌毒素的结合效率受其序列的影响，触发开关的浓度选择为300 nM(FB1)、350nM(OTA、ZEN、DON)和400 nM(AFB1、T-2)(图8)。
多种真菌毒素的定量标准曲线和检测限：
在最佳实验条件下，构建了六种真菌毒素检测的FTMB标准曲线。如图9的A所示，分析不同真菌毒素浓度对应的荧光图像，将获得的数据用于拟合标准曲线，微流控芯片中传感位点的亮度随着真菌毒素浓度的增加而增加。FTMB的信号转导机制不需要来自靶类似物的竞争来通过减少用信号标记修饰的识别分子的数量来实现定量，因此荧光强度与目标真菌毒素的浓度呈正相关，有利于提高检测灵敏度。AFB1、OTA、ZEN、FB1、T-2和DON的标准回归曲线由Michaelis-Menten方程获得(图9的A)。在0.949至0.989的范围内的相关系数R2值在测量范围内显示出优异的相关系数。根据标准曲线，AFB1、OTA、ZEN、FB1、T-2和DON的检测限(LOD)分别为2.3、3.9、2.6、1.4、1.7和1.5 fg·mL-1。
FTMB的特异性：
为了进一步评估FTMB对单一和多重检测的特异性，测量了对单个AFB1、OTA、ZEN、FB1、T-2、DON及其混合物的荧光反应(图9的B)。对于单次检测，每个检测单元对应的目标真菌毒素可以触发反应室内的CRISPR/Cas12a系统，恢复量子点的荧光。从图9(B)左下角可以看出检测单元对非靶标真菌毒素没有反应，信号值与阴性对照相似。从图9(B)中芯片上八个腔室的荧光图像和相应的归一化荧光值可以看出，对于多重检测，当针对多种真菌毒素的不同组合(2种、3种、4种和5种真菌毒素混合物)进行测试时，FMTB也提供了准确的结果。然而，在一些需要制备半抗原的竞争性免疫测定中，某些真菌毒素(如AFB1)的自发荧光会干扰结果的判读，在这方面FTMB没有受到影响，因为它通过触发级联反应发射荧光。这些结果表明，FTMB系统的非竞争性检测方法能够准确、特异地检测出单重或者多重目标毒素。
真实样本中真菌毒素的检测：
为了准确评估真菌毒素检测在FTMB中的功效，将AFB1、OTA、ZEN、FB1、T-2和DON的标准溶液掺入上文提前制备的玉米、花生和小麦样品中进行回收实验。如表2-表7所示，AFB1、OTA、ZEN、FB1、T-2和DON的回收率分别为86.60％-116.40％、92.08％-108.26％、91.00％-102.35％、91.20％-103.60％、90.80％-114.85％和94.62％-115.96％，此外，测试结果的RSD处于0.58％-5.67％之间，表明该FTMB系统在真实样品的真菌毒素检测中具有较高的精度。更重要的是，所有结果都与高效液相色谱法保持高度一致(88.76％-109.99％)，以上所有结果表明，该策略在真实样本中进行真菌毒素监测的可靠性。
表2使用FTMB检测AFB1的回收率结果以及FTMB和HPLC之间的一致性
表3使用FTMB检测OTA的回收率结果以及FTMB和HPLC之间的一致性
表4使用FTMB检测ZEN的回收率结果以及FTMB和HPLC之间的一致性
表5使用FTMB检测FB1的回收率结果以及FTMB和HPLC之间的一致性
表6使用FTMB检测T-2的回收率结果以及FTMB和HPLC之间的一致性
表7使用FTMB检测DON的回收率结果以及FTMB和HPLC之间的一致性
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (10)

1.一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述的真菌毒素检测系统用于检测黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏马菌素B1(FB1)、T-2真菌毒素(T-2)或者脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)中的任意一种或几种组合；
所述的检测系统中包括针对各个真菌毒素的以下物质：
1)适配体-1、激活子、适配体-2构成的复合物；
2)crRNA；
3)探针；
其中，针对AFB1，crRNA的序列为：SEQ ID NO：1，适配体-1的序列为：SEQ ID NO：2，激活剂的序列为：SEQ ID NO：3，适配体-2的序列为：SEQ ID NO：4；
针对OTA，crRNA的序列为：SEQ ID NO：5，适配体-1的序列为：SEQ ID NO：6，激活剂的序列为：SEQ ID NO：7，适配体-2的序列为：SEQ ID NO：8；
针对ZEN，crRNA的序列为：SEQ ID NO：9，适配体-1的序列为：SEQ ID NO：10，激活剂的序列为：SEQ ID NO：11，适配体-2的序列为：SEQ ID NO：12；
针对FB1，crRNA的序列为：SEQ ID NO：13，适配体-1的序列为：SEQ ID NO：14，激活剂的序列为：SEQ ID NO：15，适配体-2的序列为：SEQ ID NO：16；
针对T-2，crRNA的序列为：SEQ ID NO：17，适配体-1的序列为：SEQ ID NO：18，激活剂的序列为：SEQ ID NO：19，适配体-2的序列为：SEQ ID NO：20；
针对DON，crRNA的序列为：SEQ ID NO：21，适配体-1的序列为：SEQ ID NO：22，激活剂的序列为：SEQ ID NO：23，适配体-2的序列为：SEQ ID NO：24。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述探针两端分别被淬灭基团和荧光基团连接；所述探针序列如SEQ ID NO:26所示。
3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述探针连接于量子点的表面；所述的量子点是CdSe/ZnS量子点。
4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述的探针的制备方法是：
S1：称取EDC和NHS溶于PB缓冲液中，加入量子点，活化、离心、洗涤、重悬，得到悬浊液；
S2：在所述悬浊液中加入ssDNA报告分子，在超声条件下梯度混合至最终浓度，得到混合液；
S3：在所述混合液中加入额外EDC，孵育、离心后收集产物，即为QD探针。
5.根据权利要求4所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述EDC和NHS的浓度为1-5mg/ml；所述活化的时间为10-50min；所述洗涤和重悬的溶液为PBS缓冲液；所述梯度混合的梯度浓度为150-250nM，所述最终浓度为0.5-1.5μM；所述额外EDC的浓度为10-30mg/mL；所述孵育的时间为1-3h。
6.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述的复合体是由适配体-1、激活剂、适配体-2的摩尔比1-5：1：1-5所构成，优选2:1:2；所述的复合体的制备方法是每种真菌毒素的适配体-1、激活剂和适配体-2混合，将混合物加热，然后自然冷却至室温得到；所述的检测系统中还包括Cas12a酶。
7.一种基于权利要求1所述的检测系统的检测真菌毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将针对各个真菌毒素的复合物的溶液、crRNA溶液、探针溶液、Cas12a酶的溶液分散于超纯水中，冻干后得到微球；
步骤2，微球与标准品溶液或样品溶液进行反应，并记录探针释放的荧光强度；
步骤3，根据标准品溶液获得标准曲线，并计算出样品溶液中的真菌毒素的浓度。
8.根据权利要求7所述的检测真菌毒素的方法，其特征在于，步骤1中，复合物的溶液的浓度是4-20nM，crRNA溶液的浓度是0.5-5μM，探针溶液的浓度是0.5-5μM，Cas12a酶的溶液的浓度是1-20μM；各个溶液的体积比依次是1.5:0.5-5:0.5-5:0.5-4。
9.根据权利要求7所述的检测真菌毒素的方法，其特征在于，所述的步骤2中，荧光强度还通过聚苯乙烯(PS)微球进行信号放大。
10.根据权利要求9所述的检测真菌毒素的方法，其特征在于，所述的聚苯乙烯(PS)微球的直径范围是250-550nm。
CN202311461396.5A 2023-11-03 2023-11-03 一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法 Pending CN117538518A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311515939.7A CN117548159A (zh) 2023-11-03 2023-11-03 一种基于光子晶体信号增强的压力驱动多通道微流控芯片及其检测方法
CN202311461396.5A CN117538518A (zh) 2023-11-03 2023-11-03 一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311461396.5A CN117538518A (zh) 2023-11-03 2023-11-03 一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311515939.7A Division CN117548159A (zh) 2023-11-03 2023-11-03 一种基于光子晶体信号增强的压力驱动多通道微流控芯片及其检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117538518A true CN117538518A (zh) 2024-02-09

Family

ID=89783334

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311461396.5A Pending CN117538518A (zh) 2023-11-03 2023-11-03 一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法
CN202311515939.7A Pending CN117548159A (zh) 2023-11-03 2023-11-03 一种基于光子晶体信号增强的压力驱动多通道微流控芯片及其检测方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311515939.7A Pending CN117548159A (zh) 2023-11-03 2023-11-03 一种基于光子晶体信号增强的压力驱动多通道微流控芯片及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN117538518A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117548159A (zh) * 2023-11-03 2024-02-13 淮阴师范学院 一种基于光子晶体信号增强的压力驱动多通道微流控芯片及其检测方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104458684A (zh) * 2014-11-25 2015-03-25 浙江农林大学 基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法
CN106147749A (zh) * 2016-06-27 2016-11-23 江门职业技术学院 荧光微球组装成光子晶体、及其制备方法和应用
CN107271668A (zh) * 2017-06-12 2017-10-20 国家粮食局科学研究院 一种多信号检测真菌毒素的方法及试剂盒
CN109444102A (zh) * 2018-12-18 2019-03-08 济南大学 一种检测赭曲霉毒素a的荧光生物传感器及其制备方法和应用
CN109991290A (zh) * 2019-03-22 2019-07-09 河南大学 以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的构建方法
CN113466305A (zh) * 2021-07-23 2021-10-01 江苏大学 一种基于自增强发光材料和亚甲基蓝的双信号同时获取的比率适配体传感器的构建方法
CN116438303A (zh) * 2020-03-19 2023-07-14 J·大卫格莱斯顿研究所-根据J·大卫格莱斯顿遗嘱的遗嘱信托 SARS-CoV-2病毒的快速可现场部署检测

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109929749B (zh) * 2019-03-27 2021-07-27 深圳市尚维高科有限公司 自驱动微流控芯片及其使用方法
CN110988331B (zh) * 2019-11-22 2024-02-23 四川微康朴澜医疗科技有限责任公司 一种基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法和微流控芯片
CN113649095B (zh) * 2021-09-13 2022-04-08 大连理工大学 一种用于核酸检测的高度集成式微流控芯片及使用方法
CN116196990A (zh) * 2022-12-28 2023-06-02 武汉大学 用于核酸检测的微流控芯片及便携式荧光检测系统
CN117538518A (zh) * 2023-11-03 2024-02-09 淮阴师范学院 一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104458684A (zh) * 2014-11-25 2015-03-25 浙江农林大学 基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法
CN106147749A (zh) * 2016-06-27 2016-11-23 江门职业技术学院 荧光微球组装成光子晶体、及其制备方法和应用
CN107271668A (zh) * 2017-06-12 2017-10-20 国家粮食局科学研究院 一种多信号检测真菌毒素的方法及试剂盒
CN109444102A (zh) * 2018-12-18 2019-03-08 济南大学 一种检测赭曲霉毒素a的荧光生物传感器及其制备方法和应用
CN109991290A (zh) * 2019-03-22 2019-07-09 河南大学 以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的构建方法
CN116438303A (zh) * 2020-03-19 2023-07-14 J·大卫格莱斯顿研究所-根据J·大卫格莱斯顿遗嘱的遗嘱信托 SARS-CoV-2病毒的快速可现场部署检测
CN113466305A (zh) * 2021-07-23 2021-10-01 江苏大学 一种基于自增强发光材料和亚甲基蓝的双信号同时获取的比率适配体传感器的构建方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DA LIU等: "Using time-shared scanning optical tweezers assisted two-photon fluorescence imaging to establish a versatile CRISPR/Cas12a-mediated biosensor", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 227, 1 May 2023 (2023-05-01), pages 2 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117548159A (zh) * 2023-11-03 2024-02-13 淮阴师范学院 一种基于光子晶体信号增强的压力驱动多通道微流控芯片及其检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN117548159A (zh) 2024-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Application of multiplexed aptasensors in food contaminants detection
Sena-Torralba et al. Toward next generation lateral flow assays: Integration of nanomaterials
Hu et al. AIEgens enabled ultrasensitive point-of-care test for multiple targets of food safety: Aflatoxin B1 and cyclopiazonic acid as an example
Wang et al. Development of nucleic acid aptamer-based lateral flow assays: A robust platform for cost-effective point-of-care diagnosis
Zhang et al. Immunoassay technology: Research progress in microcystin-LR detection in water samples
Fu et al. Fluorescence‐based quantitative platform for ultrasensitive food allergen detection: From immunoassays to DNA sensors
Goryacheva et al. Nanosized labels for rapid immunotests
US6399302B1 (en) Signal generating oligonucleotide-based biosensor
Dos Santos et al. Recent developments in lanthanide-to-quantum dot FRET using time-gated fluorescence detection and photon upconversion
JP5400297B2 (ja) 蛍光ナノシリカ粒子、ナノ蛍光材料、それを用いたバイオチップ及びそのアッセイ法
Si et al. Inner filter effect-based homogeneous immunoassay for rapid detection of imidacloprid residue in environmental and food samples
Li et al. Recent advances in immunoassays and biosensors for mycotoxins detection in feedstuffs and foods
KR101232499B1 (ko) 마이코톡신을 확인하는 장치 및 방법
US20220011315A1 (en) Non-enzymatic glow assays
JP5588454B2 (ja) 分析物検出アッセイ
Gómez-Hens et al. Long-wavelength fluorophores: new trends in their analytical use
CN103874924B (zh) 通过一次的试样注入就能够依次改变反应条件的膜传感器
US8029985B2 (en) Amplified bioassay
US9274056B2 (en) Use of non-chelated fluorochromes in rapid test systems
Sharma et al. Nanomaterials in fluorescence-based biosensors: Defining key roles
KR20030040208A (ko) 개선된 형광 폴리머-ｑｔｌ 바이오센싱 방법
Castro et al. Multiplexed detection using quantum dots as photoluminescent sensing elements or optical labels
Zhang et al. Biotoxin sensing in food and environment via microchip
Zhang et al. Label-free quantifications of multiplexed mycotoxins by G-quadruplex based on photonic barcodes
CN117538518A (zh) 一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination