CN117535349A - 一种调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因klf6的应用 - Google Patents

一种调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因klf6的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因KLF6的应用。利用山羊KLF6基因干扰序列、过表达序列和对照序列，通过转染肌内和皮下前体脂肪细胞及诱导分化，从细胞形态学和分子生物学水平确定过表达和抑制KLF6基因表达对肌内和皮下前体脂肪细胞分化及脂滴积聚的影响。结果表明，山羊KLF6基因通过影响分化标志基因和脂滴积聚标志基因的表达，从而在山羊前体脂肪细胞分化过程中起到正调控作用；过表达山羊KLF6基因，使前体脂肪细胞分化及脂滴积聚得到促进，并且山羊KLF6基因经RNA干扰后前体脂肪细胞分化及脂滴积聚得到抑制。本发明可应用于调控前体脂肪细胞分化的靶标基因检测及改善羊肉品质。

Description

一种调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因KLF6的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及山羊KLF6基因作为调控前体脂肪细胞分化的靶标基因的应用。
背景技术
基因是一种资源，基因工程研究的基本任务是开发人们需要的基因产物，这样的基因统称为目的基因。获得目的基因的途径很多，主要是通过构建基因组文库或cDNA文库，从中筛选出需要的基因。广泛使用PCR技术直接从某生物基因组中扩增出目的基因。对于较小的目的基因也可用人工化学合成。已获得的目的基因大致可分为三大类：第一类是与医药相关的基因；第二类是抗病虫害和恶劣生境的基因；第三类是编码具有营养价值的蛋白或多肽的基因。
基因工程技术具体指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术)；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化。基因工程利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸(基因)进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物表型。一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的内容有：(1)外源目的基因的分离、克隆以及目的基因的结构与功能研究；(2)适合转移、表达载体的构建或目的基因的表达调控结构重组；(3)外源基因的导入；(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选；(5)外源基因表达产物的生理功能的核实；(6)转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析；(7)生态与进化安全保障机制的建立；(8)消费安全评价。在研究基因功能过程中，利用分子生物学实验全面准确的阐明基因的作用机制，例如构建基因的过表达和干扰载体并且导入宿主细胞中进行表达，从而能帮助人们在体外模拟基因对于个体生理机能的作用，并为动物实验提供科学依据。
肌内脂肪(IMF)含量对山羊肉质及羊肉风味有很重要的影响，具有丰富肌内脂肪的羊肉产品逐渐受到消费市场青睐。前体脂肪细胞是脂肪细胞的一种，由多能干细胞(MSC)或胚胎干细胞(ESC)分化而来。前体脂肪细胞体积小、呈梭形，并且间质少、胞浆内不含脂滴，但具有向胞浆内聚集脂滴的能力，在体内和体外都可以分裂增殖。前体脂肪细胞通过在胞浆内聚集脂滴而分化为成熟的脂肪细胞，并且前体脂肪细胞分化是脂肪细胞脂质蓄积的过程，是影响动物脂肪沉积的途径之一，此生物学过程涉及诸多激素分泌和基因表达的相互调控，例如CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)，及固醇调节元件结合蛋白异形体1(SREBP1)、脂蛋白脂酶(LPL)等。因此，明确山羊脂肪细胞分化的分子机制意义重大。
KLFs是一类在真核生物体内广泛分布的锌指蛋白，其功能复杂多样。目前共发现KLFs家族成员有18个，成员间存在直接或间接相互作用，在不同的生物过程中都发挥重要调控功能。已有研究证明KLFs家族有多个成员参与脂肪分化，并发挥重要的作用。KLF6是KLFs家族中的重要一员，最早从小鼠和人的肝脏星形间叶细胞和胎盘中获得，KLF6具有典型的锌指(C2H2)结构域，其锌指结构域由3个锌指残基构成。KLF6作为转录因子，可能通过结合基因的启动子来调控靶基因的表达。近年在小鼠上的研究表明：(1)KLF6参与到前体脂肪细胞分化及脂质代谢过程中；(2)在3T3-L1细胞的研究中KLF6可能通过抑制DLK1来促进脂肪细胞分化；(3)KLF6增加了PPARγ的活性，而敲除KLF6基因则PPARγ活性受到抑制(其中PPARγ是参与脂肪细胞分化过程的重要的核受体类转录因子)。
有研究经生物信息学分析发现：山羊KLF6蛋白潜在的磷酸化位点共53个，其中酪氨酸(Tyr)、丝氨酸(Ser)及苏氨酸(Thr)磷酸化位点的个数分别为5、37及11，有20个O-糖基化位点，分别为8个苏氨酸糖(Thr)基化位点和12个丝氨酸(Ser)糖基化位点，存在1个N-糖基化位点；同时分析发现山羊KLF6蛋白无信号肽及跨膜结构域，其主要功能位于细胞核(95.7％)，其次是液泡(4.3％)，二级结构预测结果显示其可能由总氨基酸的19.18％(61个氨基酸)形成α-螺旋、12.26％(39个氨基酸)形成延伸链及68.55％(218个氨基酸)形成无规则卷曲。该研究还根据KLF6基因在分化前后的山羊皮下脂肪细胞分化中的表达水平及结合在3T3-L1中的研究结果，推测KLF6基因促进山羊皮下脂肪细胞分化(王江林,王永,孟庆勇等.山羊KLF6的分子克隆及其时空表达特征分析.华北农学报,2021,36(02):226-232.)。另外有研究表明KLF6基因在牦牛肺脏中高表达(朱江江,林亚秋,左璐璐等.牦牛KLF5、KLF6、KLF7基因的克隆表达及其与肌内脂肪含量的相关性分析[J].畜牧兽医学报,2017,48(03):416-424.)，该研究同时指出KLF6基因的表达与IMF含量无相关性。
发明内容
本发明目的在于提供一种调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因KLF6的应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
确定KLF6基因为一个调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，包括以下步骤：
以山羊KLF6基因为目的基因，在山羊前体脂肪细胞中分别对目的基因进行过表达及RNA干扰。
优选的，所述方法具体包括以下步骤：将山羊肌内前体脂肪细胞或山羊皮下前体脂肪细胞经细胞培养后作为宿主细胞，分别将山羊KLF6基因过表达载体、山羊KLF6基因干扰载体转染宿主细胞及进行诱导分化，然后利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测KLF6基因和分化标志基因与脂滴积聚标志基因的表达情况，并利用油红O染色和Bodipy染色在形态学上观察脂肪细胞分化及半定量脂滴表达情况，同时利用试剂盒测定脂肪细胞甘油三酯(TG)含量。
优选的，所述细胞培养具体包括以下步骤：
(1)复苏
将冻存的山羊肌内前体脂肪细胞或山羊皮下前体脂肪细胞接种于含有双抗及胎牛血清的DEME/F12培养基中，然后在37℃培养24-48h；
(2)传代
待细胞生长至80％-90％时用胰酶消化细胞，然后转接至新鲜培养基(例如，含10％胎牛血清的DEME/F12培养基)中继续进行培养；
(3)铺板
采用某次传代后的细胞，且待细胞生长至80％-90％时将细胞接种至细胞孔板(例如6、12或24孔板)中，待孔内细胞生长至80％-90％时即可用于转染。
优选的，所述转染宿主细胞及进行诱导分化具体包括以下步骤：将山羊KLF6基因过表达载体和山羊KLF6基因干扰载体以及相应的对照载体分别采用转染试剂配制预混液，混匀后于22-25℃孵育15-20min；使用孵育后的预混液并于37℃处理孔内细胞16-24h，然后使用油酸继续处理孔内细胞48-60h。
优选的，所述山羊肌内前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体或山羊KLF6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下脂滴积聚标志基因中的一种或多种：DGAT1、DGAT2、ADFP、TIP47、AGPAT6、GPAM、HSL、ATGL(例如，DGAT1、ADFP、GPAM、TIP47和ATGL)；所述山羊肌内前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体或山羊KLF6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下分化标志基因中的一种或多种：AP2、CEBPα、PPARγ、DLK1、SREBP1、LPL、CEBPβ、FASN、GLUT4、ACC(例如，AP2、PPARγ、FASN、ACC、LPL和GLUT4)。
优选的，所述山羊皮下前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体或山羊KLF6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下脂滴积聚标志基因中的一种或多种：DGAT1、DGAT2、ADFP、TIP47、AGPAT6、GPAM、HSL、ATGL(例如，DGAT1、GPAM、ATGL、AGPAT6和ADFP)；所述山羊皮下前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体或山羊KLF6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下分化标志基因中的一种或多种：AP2、CEBPα、PPARγ、DLK1、SREBP1、LPL、CEBPβ、FASN、ACC(例如，AP2、PPARγ、LPL、FASN、DLK1、SREBP1和ACC)。
山羊KLF6基因实时荧光定量PCR试剂(包括qPCR引物等)在检测用于调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因中的应用，即所述靶标基因为山羊KLF6基因。
山羊KLF6基因过表达载体和/或山羊KLF6基因干扰载体(即过表达山羊KLF6基因和/或抑制山羊KLF6基因表达)在调控山羊前体脂肪细胞分化中的应用，所述前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体转染后在诱导分化中表现为分化及脂滴积聚受到抑制。
优选的，所述前体脂肪细胞为山羊肌内前体脂肪细胞或山羊皮下前体脂肪细胞。
山羊KLF6基因过表达载体和/或山羊KLF6基因干扰载体(即过表达山羊KLF6基因和/或抑制山羊KLF6基因表达)在改善山羊羊肉品质中的应用。
本发明的有益效果体现在：
本发明通过分子生物学和细胞形态学实验，发现在山羊前体脂肪细胞中过表达KLF6基因时促进山羊前体脂肪细胞的分化以及脂滴的积聚，而干扰KLF6基因时抑制山羊前体脂肪细胞的分化和脂滴的积聚，明确山羊KLF6基因为一个新的调控前体脂肪细胞分化的靶标基因(山羊KLF6基因通过影响分化标志基因和脂滴积聚标志基因的表达，从而在山羊前体脂肪细胞分化过程中起到正调控作用)。本发明可应用于调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因检测及改善羊肉品质。
附图说明
图1为诱导分化肌内细胞后NC组与si组明场下的细胞分化及细胞内油红O染色情况(A)、NC组与si组KLF6基因相对表达量(B)。
图2为诱导分化肌内细胞后NC组与OE组明场下的细胞分化及bodipy染色细胞内荧光表达情况(A)、NC组与OE组KLF6基因相对表达量(B)。
图3为诱导分化肌内细胞后NC组与si组的OD值(A)、NC组与si组油红O染色观察细胞内脂滴积聚情况(B)、NC组与si组甘油三酯含量(C)。
图4为诱导分化肌内细胞后NC组与OE组的OD值(A)、NC组与OE组油红O染色观察细胞内脂滴积聚情况(B)、NC组与OE组甘油三酯含量(C)。
图5为肌内细胞中干扰KLF6基因后脂滴积聚标志基因的mRNA表达水平。
图6为肌内细胞中过表达KLF6基因后脂滴积聚标志基因的mRNA表达水平。
图7为肌内细胞中干扰KLF6基因后分化标志基因的mRNA表达水平。
图8为肌内细胞中过表达KLF6基因后分化标志基因的mRNA表达水平。
图9为诱导分化皮下细胞后NC组与si组明场下的细胞分化及细胞内油红O染色情况(A)、NC组与si组KLF6基因相对表达量(B)。
图10为诱导分化皮下细胞后NC组与OE组明场下的细胞分化及bodipy染色细胞内荧光表达情况(A)、NC组与OE组KLF6基因相对表达量(B)。
图11为诱导分化皮下细胞后NC组与si组的OD值(A)、NC组与si组油红O染色观察细胞内脂滴积聚情况(B)、NC组与si组甘油三酯含量(C)。
图12为诱导分化皮下细胞后NC组与OE组的OD值(A)、NC组与OE组油红O染色观察细胞内脂滴积聚情况(B)、NC组与OE组甘油三酯含量(C)。
图13为皮下细胞中干扰KLF6基因后脂滴积聚标志基因的mRNA表达水平(A)和分化标志基因的mRNA表达水平(B)。
图14为皮下细胞中过表达KLF6基因后脂滴积聚标志基因的mRNA表达水平(A)和分化标志基因的mRNA表达水平(B)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
本发明在细胞实验的基础上，运用形态学观察和分子生物学实验对KLF6基因在山羊前体脂肪细胞分化过程中的调控机制进行研究，以期验证山羊KLF6基因能作为一个新的影响前体脂肪细胞分化的靶标基因。
1.试验材料
1.1试验样品的采集
本试验中所用的山羊肌内前体脂肪细胞来自于实验室前期冻存的7日龄简州大耳羊公羊羔羊的肌内前体脂肪细胞(原代细胞)。该批冻存细胞由实验室于2021年2月自四川省简阳市(四川省简阳大哥大牧业有限公司)采集的山羊(简州大耳羊)背最长肌中分离获得(何长晟,王永,许晴等.KLF2对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响[J].畜牧兽医学报,2020,51(01):64-73.)。
本试验中所用的山羊皮下前体脂肪细胞来自于实验室前期冻存的7日龄简州大耳羊公羊羔羊的皮下前体脂肪细胞(原代细胞)。该批冻存细胞由实验室于2021年2月自四川省简阳市(四川省简阳大哥大牧业有限公司)采集的山羊(简州大耳羊)皮下脂肪组织中分离获得。具体流程如下：
(1)试验羊带回实验室后，颈动脉放血，用新洁而灭清洗2-3次，再用75％酒精擦拭消毒。(2)在无菌细胞培养间取其皮下脂肪组织，用3-5倍双抗的PBS清洗3次后在超净工作台对其进行分离修剪。(3)将剪碎的组织分装到50mL离心管中，分别加入2倍体积的Ⅰ型胶原酶，置于37℃水浴锅中消化1.5h(每隔5min震荡1次)。(4)加入等体积的完全培养液终止消化，用无菌纱布将消化后的组织过滤到烧杯中，以除去未消化完的较大的组织。(5)然后再分别过400筛网(38μm)和200目筛网(75μm)，将滤液分装到离心管中，2000r/min离心5min，弃上清。(6)加入红细胞裂解液将沉淀吹散，静置5min，2000r/min离心5min，弃上清，用完全培养基重悬沉淀。(7)取适量的细胞重悬液分装到25cm2培养瓶中，加入适量完全培养基混匀，放至细胞培养箱中培养。(8)培养2h后，将细胞培养液移至新的培养瓶中，在原培养瓶中加入新的5mL完全培养基继续培养，此时即获得山羊原代皮下前体脂肪细胞。
1.2主要试剂
反转录试剂盒(Revert AidFirst Strandc DNASynthesis Kit)购自ThermoFisher Scientific；胎牛血清、双抗(青霉素和链霉素)和胰酶购自Gibco；DEME/F12培养基购自Hyclone；油酸购自Sigma；动物RNA提取试剂Trizol购自TaKaRa；实时荧光定量PCR试剂购自TaKaRa。
2.试验方法
2.1山羊前体脂肪细胞培养、转染及诱导分化
(1)重组质粒制备
山羊KLF6基因干扰(siRNA)载体、山羊KLF6基因过表达(oeRNA)载体和对照(Negative control)载体均由广州吉赛生物科技有限公司构建并合成。
通过检测siRNA不同的两种干扰载体siRNA-KLF6-1和siRNA-KLF6-2的干扰效率，并且由于siRNA-KLF6-1的干扰效率更显著且稳定，所以选择了siRNA-KLF6-1用于后续试验步骤。
(2)处理流程
37℃水浴解冻实验室冻存的山羊肌内前体脂肪细胞和山羊皮下前体脂肪细胞，将这两种前体脂肪细胞(F0)分别接种于培养瓶中的含有双抗及10mL·L-1胎牛血清的DEME/F12培养基，并在37℃二氧化碳培养箱中培养24-36h；
待细胞长至80％左右时进行细胞传代，传代前先用PBS清洗2-3次，随后加入1mL胰酶消化60-90s，再加入含10％胎牛血清的DEME/F12培养基将消化下来的细胞收集在离心管中，离心后重新将细胞接种在含新鲜培养基(含10％胎牛血清的DEME/F12培养基)的细胞培养皿中，并于37℃二氧化碳培养箱进行细胞培养；若继续传代，则重复以上操作即可。
待通过传代培养至F3代细胞，且细胞已生长至80％时，即可将细胞接种至12孔板中，每孔细胞生长至80％时进行转染及诱导分化。
转染及诱导分化的具体流程如下：将山羊KLF6基因过表达组(记为OE-KLF6，简称OE组)的重组质粒(即以上合成的山羊KLF6基因过表达载体)、山羊KLF6基因干扰组(记为siRNA-KLF6，简称si组)的重组质粒(即以上合成的山羊KLF6基因干扰载体)和对照组(Negative Control，即NC组)的重组质粒分别按转染试剂的说明书配制预混液(即重组质粒1μg、转染试剂4μL及无血清培养基200mL，轻微震荡混匀)，室温孵育15min。将孵育好的预混液均匀滴加到孔中，并置于37℃二氧化碳培养箱培养，18h后再加入50μmol/L油酸，并置于37℃二氧化碳培养箱中60h(以诱导孔中细胞分化)。
2.2油红O染色和Bodipy染色
用于染色的细胞接种于24孔板，处理方式同2.1。
油红O染色：室温下用10mL·L-1甲醛固定诱导60h后的细胞30min，在固定细胞前后各用PBS(pH7.2-7.4)清洗；利用适量油红O工作液染色30min，PBS洗去油红O工作液，使用显微镜观察脂滴情况并拍照，拍照结束后每孔加入1mL异丙醇溶解油红O，混合均匀后迅速放于酶标仪中检测吸光度(OD490nm)。
Bodipy染色：10mL·L-1甲醛固定诱导60h后的细胞30min，在固定细胞前后各用PBS(pH7.2-7.4)清洗；向1mL PBS中加入1μL Bodipy染料配制成Bodipy工作液，每孔加入Bodipy工作液200μL，避光染色20min，荧光显微镜下观察并拍照。
2.3检测KLF6基因过表达和干扰效率及脂肪细胞分化标志基因和脂滴积聚标志基因的表达
收集12孔板中诱导60h后的细胞，利用TRizol提取所收集的细胞的RNA后反转录，将得到的cDNA置于-20℃冰箱保存。
以cDNA作为模板，利用qPCR检测结果分析山羊KLF6基因过表达和干扰情况以及脂肪细胞分化标志基因及脂滴积聚标志基因的表达差异，qPCR检测以UXT基因作为内参基因。引物信息见表1。
表1.引物序列及扩增参数
2.4甘油三酯的测定
用于检测的细胞接种于6孔板，处理方式同2.1。
用PBS清洗诱导60h后的细胞2次；每个孔加入200μL裂解液，将裂解后的液体全部吸入到1.5mL离心管中；按照甘油三酯含量测定试剂盒说明书进行操作，细胞裂解后取10μL与190μL工作液在96孔板中混匀，随后在550nm处测定其吸光度。余下的裂解上清用BCA试剂盒测定蛋白浓度，以每毫克蛋白浓度校正样本甘油三酯的含量。
2.5数据统计与分析
采用2-△△Ct法对Ct值进行处理，用SPSS软件中的One-way ANOVA对处理后的Ct值数据进行显著性分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，使用Graph Pad Prism5.0绘图。
3.试验结果
3.1肌内细胞形态学层面
首先油红O和bodipy染色结果显示，过表达山羊KLF6基因后促进脂滴的积聚(图2A、图4B)，干扰山羊KLF6基因后，抑制了脂滴的积聚(图1A、图3B)；其次半定量OD值的检测结果表明，过表达山羊KLF6基因后的OD值水平极显著高于对照组(P<0.01，图4A)，干扰山羊KLF6基因后的OD值水平极显著低于对照组(P<0.01，图3A)；最后甘油三酯含量的检测结果表明，过表达山羊KLF6基因后的甘油三酯(TG)水平显著高于对照组(P<0.05，图4C)，干扰山羊KLF6基因后的甘油三酯(TG)水平显著低于对照组(P<0.05，图3C)；油红O染色、半定量实验和甘油三酯含量的检测结果初步揭示了过表达和干扰KLF6基因后对脂滴积聚的影响。
3.2肌内细胞分子生物学层面
通过过表达山羊KLF6基因(P<0.01，图2B)和干扰山羊KLF6基因(P<0.01，图1B)，一方面分别促进和抑制了肌内前体脂肪细胞中的脂滴积聚，另一方面过表达山羊KLF6基因后脂滴积聚标志基因DGAT1、ADFP极显著上调(P<0.01，图6)，GPAM显著上调(P<0.05，图6)，分化标志基因AP2、PPARγ极显著上调(P<0.01，图8)，FASN显著上调(P<0.05，图8)；干扰山羊KLF6基因后脂滴积聚标志基因ADFP、GPAM极显著下调(P<0.01，图5)，TIP47显著下调(P<0.05，图5)，ATGL极显著上调(P<0.01，图5)，分化标志基因AP2、PPARγ、ACC极显著下调(P<0.01，图7)，LPL显著下调(P<0.05，图7)，GLUT4极显著上调(P<0.01，图7)。这些结果从分子水平揭示了过表达和干扰KLF6基因后对肌内前体脂肪细胞分化的影响机制。
3.3皮下细胞形态学层面
首先油红O和bodipy染色结果显示，过表达山羊KLF6基因后促进脂滴的积聚(图10A、图12B)，干扰山羊KLF6基因后抑制了脂滴的积聚(图9A、图11B)；其次半定量OD值的检测结果表明，过表达山羊KLF6基因后的OD值水平极显著高于对照组(P<0.01，图12A)，干扰山羊KLF6基因后的OD值极显著低于对照组(P<0.01，图11A)；最后甘油三酯含量的检测结果表明，过表达山羊KLF6基因后的甘油三酯(TG)水平显著高于对照组(P<0.05，图12C)，干扰山羊KLF6基因后的甘油三酯(TG)水平显著低于对照组(P<0.05，图11C)；油红O染色、半定量实验和甘油三酯含量的检测结果初步揭示了过表达和干扰KLF6基因后对脂滴积聚的影响。
3.4皮下细胞分子生物学层面
通过过表达山羊KLF6基因(P<0.01，图10B)和干扰山羊KLF6基因(P<0.01，图9B)，一方面分别促进和抑制了皮下前体脂肪细胞中的脂滴积聚，另一方面过表达山羊KLF6基因后脂滴积聚标志基因DGAT1、GPAM、ATGL极显著上调(P<0.01，图14A)，AGPAT6显著上调(P<0.05，图14A)，分化标志基因AP2、PPARγ、LPL、FASN极显著上调(P<0.01，图14B)，DLK1显著下调(P<0.05，图14B)；干扰山羊KLF6基因后脂滴积聚标志基因ADFP、GPAM显著下调(P<0.05，图13A)，分化标志基因AP2、PPARγ极显著下调(P<0.01，图13B)，SREBP1、FASN、ACC显著下调(P<0.05，图13B)，DLK1极显著上调(P<0.01，图13B)。这些结果从分子水平揭示了过表达和干扰KLF6基因后对皮下前体脂肪细胞分化的影响机制。
以上结果中，分子生物学实验的结果解释了细胞形态学的结果。并且结果表明：在肌内和皮下前体脂肪细胞中过表达和干扰山羊KLF6基因会分别促进和抑制前体脂肪细胞的分化，并且从细胞形态学实验和分子生物学实验证明了作用机制，确定了山羊KLF6基因为一个新的调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因。
4.应用
分子生物学实验中：山羊KLF6基因作为一个新的调控前体脂肪细胞分化的靶标基因，通过进行实时荧光定量PCR检测，采用2-△△Ct法对Ct值进行处理，用SPSS软件中的One-way ANOVA对处理后的Ct值数据进行显著性分析，同时结合形态学染色和甘油三酯的测定，即可确定待研究的目的基因是否是通过调控山羊KLF6基因来影响脂肪细胞分化。
基因工程实验中：有研究发现山羊KLF6基因在皮下脂肪细胞分化60h的表达水平极显著高于前体脂肪细胞的表达水平，并推测KLF6基因促进山羊脂肪细胞分化(王江林,王永,孟庆勇等.山羊KLF6的分子克隆及其时空表达特征分析[J].华北农学报,2021,36(02):226-232.)。本发明中不仅在山羊肌内前体脂肪细胞和皮下前体脂肪细胞中进行了离体实验验证，确定山羊KLF6基因是一个促进脂肪分化的基因(该结果与现有的研究报道一致)，而且可以通过将过表达或干扰KLF6基因的载体通过转基因技术转入到培养的细胞(同样适用于动物体)中，过表达山羊KLF6基因后表现为促进前脂肪细胞的分化和脂质的聚集，干扰山羊KLF6基因后表现为抑制脂肪细胞的分化和脂质的聚集。根据此实验理论和技术可以得到肌内脂肪含量高且皮下脂肪含量少的羊肉产品，从而改善羊肉品质。
总之，本发明利用细胞培养技术、实时荧光定量PCR技术、油红O和Bodipy染色技术以及甘油三酯检测技术等，揭示了山羊KLF6基因在前体脂肪细胞分化中的调控机制，确定了山羊KLF6基因为一个新的调控前体脂肪细胞分化的靶标基因，并且在分子生物学和动物个体水平均展现出重要应用价值。

Claims (10)

1.确定KLF6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：
以山羊KLF6基因为目的基因，在山羊前体脂肪细胞中分别对目的基因进行过表达及RNA干扰。
2.根据权利要求1所述确定KLF6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：将山羊肌内前体脂肪细胞或山羊皮下前体脂肪细胞经细胞培养后作为宿主细胞，分别将山羊KLF6基因过表达载体、山羊KLF6基因干扰载体转染宿主细胞及进行诱导分化，然后检测KLF6基因和分化标志基因与脂滴积聚标志基因的表达情况，并在形态学上观察细胞分化及脂滴表达情况，同时测定细胞甘油三酯含量。
3.根据权利要求2所述确定KLF6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：所述细胞培养具体包括以下步骤：
(1)复苏
将冻存的山羊肌内前体脂肪细胞或山羊皮下前体脂肪细胞接种于含有双抗及胎牛血清的培养基中，然后在37℃培养24-48h；
(2)传代
待细胞生长至80％-90％时用胰酶消化细胞，然后转接至新鲜培养基中并于37℃进行培养；
(3)铺板
采用某次传代后的细胞，且待细胞生长至80％-90％时将细胞接种至细胞孔板中，待孔内细胞生长至80％-90％时即可用于转染。
4.根据权利要求2所述确定KLF6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：所述转染宿主细胞及进行诱导分化具体包括以下步骤：将山羊KLF6基因过表达载体和山羊KLF6基因干扰载体以及相应的对照载体分别采用转染试剂配制预混液后于22-25℃孵育15-20min；使用孵育后的预混液并于37℃处理孔内细胞16-24h，然后使用油酸于37℃处理孔内细胞48-60h。
5.根据权利要求2所述确定KLF6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：所述山羊肌内前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体或山羊KLF6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下脂滴积聚标志基因中的一种或多种：DGAT1、DGAT2、ADFP、TIP47、AGPAT6、GPAM、HSL、ATGL；所述山羊肌内前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体或山羊KLF6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下分化标志基因中的一种或多种：AP2、CEBPα、PPARγ、DLK1、SREBP1、LPL、CEBPβ、FASN、GLUT4、ACC 。
6.根据权利要求2所述确定KLF6基因为调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因的方法，其特征在于：所述山羊皮下前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体或山羊KLF6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下脂滴积聚标志基因中的一种或多种：DGAT1、DGAT2、ADFP、TIP47、AGPAT6、GPAM、HSL、ATGL；所述山羊皮下前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体或山羊KLF6基因过表达载体转染及进行诱导分化后，检测以下分化标志基因中的一种或多种：AP2、CEBPα、PPARγ、DLK1、SREBP1、LPL、CEBPβ、FASN、ACC。
7.山羊KLF6基因实时荧光定量PCR试剂在检测用于调控山羊前体脂肪细胞分化的靶标基因中的应用。
8.山羊KLF6基因过表达载体和/或山羊KLF6基因干扰载体在调控山羊前体脂肪细胞分化中的应用，其特征在于：所述前体脂肪细胞经山羊KLF6基因干扰载体转染后在诱导分化中表现为分化及脂滴积聚受到抑制。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述前体脂肪细胞为山羊肌内前体脂肪细胞或山羊皮下前体脂肪细胞。
10.山羊KLF6基因过表达载体和/或山羊KLF6基因干扰载体在改善山羊羊肉品质中的应用。
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