CN117534609A - 一种水溶性aie荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水溶性AIE荧光探针，结构式如下式(Ⅰ)所示，式中，R1与R2独立地选自碳数为1～6的烷基醇；X选自水溶性阴离子，M选自水溶性阳离子。本发明公开的荧光探针，具有AIE特性，可实现快速高效对细胞质膜进行染色，且无需清洗；该荧光探针具有良好的水溶性，细胞毒性小，可用于活体细胞荧光成像中；该荧光探针的荧光颜色为橙红色，且Stokes位移较大，抗自体荧光干扰能力强。

Description

一种水溶性AIE荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光探针的技术领域，尤其涉及一种水溶性AIE荧光探针及其制备方法和在活体细胞荧光成像领域中的应用。
背景技术
细胞膜参与各种细胞过程和生物功能，如细胞信号传导、细胞粘附、内吞、胞吐和物质的选择性渗透等；因此，细胞膜对细胞来说不可或缺，而通过对细胞膜进行观察还可以得出与细胞状态和疾病相关的许多信息。众所周知，利用荧光探针对细胞膜进行标记和示踪的成像技术是研究细胞膜结构和功能的重要手段，具有重要的实际价值。
作为一种强大的非创伤性成像技术，荧光生物成像技术取得了长足的进步。作为其中主要使用的一类荧光生色团，有机小分子荧光生色团化合物也获得了很大的发展，如目前已商业化的细胞膜染色探针染料(如DiI、DiO等)。
而目前商业化的细胞膜荧光染色探针在应用过程中存在的普遍共性问题，包括：1)基本都需要较长的染色时间以及繁琐的染色后清洗操作；长时间的染色不仅费时，更经常会导致细胞组分的非特异性发光；而且频繁的后清洗洗脱过程不仅繁琐，而且容易改变细胞的周围环境并在清洗过程中造成细胞的丢失，更不能满足对生物过程进行连续监测的要求。事实上，细胞染色时间长以及繁琐的后道清洗操作一直是细胞荧光成像领域长期未解的技术难题。2)由于π-π堆积和其它非辐射衰变渠道的存在，传统的NIR荧光生色团在高浓度或聚集状态下只能发出较弱的荧光，或者完全不发光，上述这种荧光猝灭的主要原因跟聚集体的形成有关，故常被称为聚集导致荧光猝灭(aggregation-caused quenching,ACQ)。这种现象在生物成像和分析中非常常见，并且已经成为了影响实际应用的一个主要障碍：由于其发光中心的高疏水性，有机分子在生物介质中会自发地聚集在一起，表现为荧光染料淬灭常数高，进而导致染料在细胞内会快速内化，导致成像时间窗非常狭窄。
2001年，唐本忠课题组发现了一个奇特的现象：一些噻咯分子在溶液中几乎不发光，而在聚集状态或固体薄膜下发光大大增强。因为此发光增强是由聚集所导致的，故被形象地将称为聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)。
事实上，具有聚集诱导发光(AIE)性质的发光体系会避免常见荧光分子在高浓度条件下的荧光淬灭，同时处于聚集态的荧光分子也会降低细胞毒性，抗生物体内酶解的性质得到提高。因此，具有AIE性质的荧光探针更适于应用在荧光生物成像领域。
水溶性AIEgen(具有AIE性质的分子)，特别是能够应用于荧光生物成像领域的抗生物自体荧光的水溶性AIEgen多年来一直是人们追求的目标，这是因为目前商用化的各类细胞荧光探针材料基本上还是要溶解在DMSO、DMF或乙醇等有机溶剂中，存在具有潜在的细胞毒性、易导致膜融合等问题，但应用于荧光生物成像领域的抗生物自体荧光的水溶性AIEgen荧光探针的探索道路依然极具挑战性，加上活体细胞膜的选择透过性特点，要开发快速实现跨膜的水溶性AIEgen荧光探针分子的开发更具有挑战性。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种荧光探针，具有AIE特性，可实现快速高效对细胞质膜进行染色，且无需清洗；该荧光探针具有良好的水溶性，细胞毒性小，可用于活体细胞荧光成像中；该荧光探针的荧光颜色为橙红色，且Stokes位移较大，抗自体荧光干扰能力强。
具体技术方案如下：
一种水溶性AIE荧光探针，结构式如下式(Ⅰ)所示：
式中，R1与R2独立地选自碳数为1～6的烷基醇；X选自水溶性阴离子，M选自水溶性阳离子。
优选的：
R1＝R2；
X选自卤素阴离子。
M选自碱金属阳离子。
进一步优选：
R1＝R2，选自CH2OH、CH2CH2OH、CH2CH2CH2OH中的一种或多种；
X选自F-、Cl-、Br-中的一种或多种；
M选自Na+和/或K+。
本发明制备的水溶性AIE荧光探针的发射波长为590～610nm。
本发明还公开了所述的水溶性AIE荧光探针的制备方法，包括：
(1)以N,N-二烷基醇胺和对氟苯甲醛为原料，经亲核取代反应制备得到中间产物A；
(2)将4-甲基吡啶、2-卤代乙基磺酸盐与有机溶剂A混合，加热至回流温度下进行烷基化反应，制备得到中间产物B；
(3)惰性气氛下，将中间产物A、中间产物B与有机溶剂B混合，加热至回流温度下进行亲核加成反应，得到所述的水溶性AIE荧光探针。
步骤(1)中：
所述N,N-二烷基醇胺选自二乙醇胺、二乙醇胺、N,N-二(3-羟基丙基)胺、N,N-二(4-羟基丁基)胺、N,N-二(5-羟基戊基)胺、N,N-二(6-羟基己基)胺中的一种或多种；
所述亲核取代反应在催化剂作用下进行，催化剂选自三氯化铝、三氯化铁、四氯化钛中的一种或多种；
亲核取代反应的温度为110～160℃，优选为110～130℃。
优选的，N,N-二烷基醇胺和对氟苯甲醛的摩尔比为1～8：1，进一步优选为3～6：1，更优选为4.5:1。
优选的，以N,N-二烷基醇胺和对氟苯甲醛的总质量计，加入的催化剂的用量为1～10wt％。
步骤(2)中：
所述2-卤代乙基磺酸盐选自2-溴乙基磺酸钠、2-溴乙基磺酸钠、2-氯乙基磺酸钠中的一种或多种；
所述有机溶剂A选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、甲醇、乙醇中的一种或多种；
4-甲基吡啶与2-卤代乙基磺酸盐的摩尔比为1～20：1；优选为5～15：1，更优选为11.2：1。
具体的回流温度根据采用的有机溶剂A的种类进行适应性调整。
步骤(3)中：
中间产物A与中间产物B的摩尔比为1.0～1.2：1，优选为1.1：1；
所述有机溶剂B选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、甲醇、乙醇中的一种或多种；
所述亲核加成反应在催化剂作用下进行，催化剂选自哌啶、吡啶、叔丁醇钾中的一种或多种。
以中间产物B的质量计，加入的催化剂的用量为1～3wt％。
具体的回流温度根据采用的有机溶剂B的种类进行适应性调整。
所述惰性气氛采用本领域常见的气氛，如氮气、氩气、氦气等。
优选的，步骤(3)中，经亲核加成反应后的产物还需进行沉析、洗涤处理。
沉析操作，是指将目标粗产物溶解后，滴入其不良溶剂中沉淀，纯化产物，获得目标粗产物的手段为常规实验手段即可，如萃取后旋转蒸发仪上通过旋转蒸发除去有机溶剂得到。优选的，所述不良溶剂选自无水乙醚。
洗涤操作，通过不良有机溶剂如无水乙醚的洗涤以进一步除去沉析过程中黏附在目标产物上的杂质。
本发明对制备的水溶性AIE荧光探针进行了光物理性质、AIE性质、细胞毒性等实验研究，研究发现：
本发明制备的荧光探针水溶性好、细胞毒性低，且为具有AIE性质的发(橙)红色荧光的化合物。
本发明还公开了所述的水溶性AIE荧光探针在活体细胞荧光成像领域中的应用，尤其是在细胞质膜靶向荧光成像中的应用。
经试验发现，本发明公开的水溶性AIE荧光探针可实现快速高效对细胞质膜进行染色，并且还可克服活体细胞膜的选择透过性，顺利透过细胞膜进入细胞内，对细胞质和细胞核染色，观察细胞整体形貌，并且可能有在核仁染色方面的应用潜力。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1)本发明制备的荧光探针具有AIE性质，可作为细胞膜荧光染色探针应用于细胞荧光成像中，能够避免常规有机发光染料的聚集荧光淬灭(ACQ)现象；
2)本发明制备的荧光探针为发橙红色的荧光分子，而生物自体荧光多为蓝绿光，将本发明的水溶性荧光探针应用于细胞荧光成像领域中，抗自体荧光干扰能力强；
3)本发明制备的荧光探针为离子型荧光染料，水溶性好；且细胞毒性实验显示其细胞毒性低，具有良好的生物兼容性，因此可应用于活体细胞荧光成像领域。
4)最重要的是，本发明制备的荧光探针作为细胞膜荧光染色探针能够对细胞膜快速均匀染色，3分钟内即可对细胞膜完成染色，且无需后清洗操作，实现细胞质膜靶向荧光成像。
附图说明
图1为实施例1制备产物的核磁氢谱；
图2为实施例1制备产物的核磁碳谱；
图3为将实施例1制备的产物溶于水后测得的紫外可见吸收光谱；
图4为将实施例1制备的产物溶于水后测得的光致发光光谱；
图5为不同THF含量的混合溶液的荧光光谱(PL)强度随发射波长的变化曲线；
图6为不同THF含量的混合溶液的相对PL强度(I/I0)随THF体积分数的变化曲线；
图7为不同甘油含量的混合溶液的荧光光谱(PL)强度随发射波长的变化曲线；
图8为不同甘油含量的混合溶液的相对PL强度(I/I0)随甘油体积分数的变化曲线；
图9为实施例1制备的产物的细胞毒性试验结果；
图10为采用200μM的水溶性AIE荧光探针溶液进行染色后，HeLa细胞的荧光(PL)图像、明场(DIC)图像和叠加(Merge)图像；
图11为采用800μM的水溶性AIE荧光探针溶液进行染色后，HeLa细胞的PL、DIC和Merge图像。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方法进一步进行说明，在这里需要说明的是，此处所描述的具体实施方法只是为了说明和解释本发明，并不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
(1)将二乙醇胺(40.7g，387.1mmol)、对氟苯甲醛(10.7g，86.2mmol)和磁子放入250mL烧瓶中，然后加入无水氯化铝(0.61g，4.57mmol)。在120℃下反应42h后，加入50mL水稀释。然后用10％盐酸中和混合物，并在60℃下用乙酸乙酯萃取4次，合并有机相并真空干燥。用乙酸乙酯/正己烷(2/1，v/v)洗脱，柱色谱法纯化粗产物。真空干燥后得到灰白色固体，即化合物3(6.25g)，产率30.4％，反应式如下式(1)。
化合物3的核磁氢谱数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ/ppm:
9.67(1H),7.70(2H),6.73(2H),3.93(4H),3.70(6H).
(2)首先在250mL烧瓶中加入4-甲基吡啶(16mL，161.8mmol)、2-溴乙磺酸钠(3.07g，14.5mmol)和磁子，然后加入50mL乙醇作为溶剂，在回流温度下反应5h，待白色固体完全消失后停止加热，减压蒸馏除去溶剂后得到粗产物。用乙醚洗涤3次后得到白色固体，即化合物6(2.0g)，产率49.3％，反应式如上式(2)。
(3)在250mL烧瓶中加入化合物6(0.437g,2.17mmol)和化合物3(0.5g，2.39mmol)，然后加入50mL甲醇作为溶剂，再加入0.2mL哌啶，在回流温度下加热反应8h。得到产物9为红色针状结晶，即4-(4-(N,N-二羟乙基胺)苯乙烯基)-N-(2-磺酸根乙基)吡啶溴化铵盐(0.348g)，产率34.0％，反应式如上式(3)。
产物9的核磁氢谱与碳谱分别如图1和2所示，具体数据如下：
1H NMR(500MHz,DMSO):δ/ppm:8.73(2H),7.98(2H),7.90(1H),7.56(2H),7.14(1H),6.80(2H),4.81(2H),4.66(2H),3.58,(4H),3.52(4H),3.33(2H).
13C NMR(126MHz,DMSO):δ/ppm:153.61,150.22,144.13,141.80,130.27,122.06,121.59,116.79,111.58,58.08,56.39,53.08,50.58,48.58,39.48.
实施例2
制备工艺与实施例1基本相同，区别在于：
步骤(1)中，将亲核取代的反应温度替换为130℃，反应时间替换为70h；
步骤(3)中，将亲核加成反应的时间替换为12h。
本实施例制备的产物的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(500MHz,DMSO):δ/ppm:8.73(2H),7.98(2H),7.90(1H),7.56(2H),7.14(1H),6.80(2H),4.81(2H),4.66(2H),3.58,(4H),3.52(4H),3.33(2H).
性能测试：
1、光谱测试：
将实施例1制备的产物溶于水中，配置成浓度为10-5mol/L的待测溶液，将待测溶液转移到紫外光谱仪(Shimadzu UV-1800紫外-可见吸收光谱仪)的样品架上进行光谱测试，测得的紫外可见吸收光谱如图3所示。
观察图3可以发现，本实施例制备的水溶性AIE荧光探针在水中最高能量的吸收峰的波长为468nm。
取上述配制的待测样品转移到荧光光谱仪(Shimadzu RF-5301PC光致发光光谱仪)的样品架上，选择在激发波长为468nm时进行光谱测试，经归一化后得到的光致发光光谱图如图4所示，图中还给出本实施例制备的水溶性AIE荧光探针在固体状态下经归一化后得到的光致发光光谱图。
观察图4可以发现，本实施例制备的水溶性AIE荧光探针在水中最大发射波长为594nm，荧光颜色为橙红色，而生物自体荧光多为蓝绿光，因此，本实施例制备的水溶性AIE荧光探针的抗自体荧光干扰能力强；相对于紫外最大吸收波长(468nm)，Stokes位移较大，有利于生物检测与荧光成像。
2、发光性质测试
2.1将实施例1制备的产物与不同体积分数的四氢呋喃(THF)与水组成的混合溶液共混，配制浓度为10-5mol/L的THF/H2O混合溶液，其中THF体积含量分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、99％；分别测试上述混合溶液的荧光光谱(PL)强度随发射波长的变化情况，具体如图5所示(图5中不同曲线对应的THF含量由下至上依次增加)；再以最大发射波长处(594nm)，测试混合溶液的相对PL强度(I/I0)随THF体积分数的变化情况，具体如图6所示。
观察图5可以发现，实施例1制备的水溶性AIE荧光探针在不同THF体积分数配制的THF/H2O混合溶液中，最大发射波长均为594nm。
结合图5与图6的变化可知，随着THF含量的增加，实施例1制备的水溶性AIE荧光探针的PL强度不断增加，而当THF含量升高至80％及以上时，荧光发射强度急剧增高，当THF体积含量达到99％时，荧光强度为初始的6倍左右，分析其原因可能是因为化合物发生聚集，从溶剂体系中析出导致，从而证明实施例1制备的产物具有典型AIE分子的特征，具有聚集诱导发光性质。
2.2将实施例1制备的产物与不同体积分数的甘油与水组成的混合溶液共混，配制浓度为10-5mol/L的甘油/水混合溶液，其中甘油体积含量分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80％；分别测试上述混合溶液的PL强度随发射波长的变化情况，具体如图7所示(图7中不同曲线对应的甘油含量由下至上依次增加)；再以最大发射波长处(594nm)，测试混合溶液的相对PL强度(I/I0)随甘油体积分数的变化情况，具体如图8所示。
观察图7可以发现，实施例1制备的水溶性AIE荧光探针在体积分数的甘油/水混合溶液中，最大发射波长均为594nm。
结合图7与图8的变化可知，随着甘油含量的增加，实施例1制备的水溶性AIE荧光探针的PL强度不断增加，当甘油含量升高至60％以上时，荧光发射强度急剧增高，而当甘油体积含量为80％时，水溶性AIE荧光探针的荧光强度约为纯水中的30倍，分析其原因可能是由于体系粘度急剧增大，水溶性AIE荧光探针在甘油溶剂体系中运动受限，从而表现出典型的聚集诱导发光(AIE)特征，具有聚集诱导发光性质。
3、细胞毒性测试
将培养基中的HeLa细胞移入96孔板中培养一天，待细胞生长到适当满度后，用PBS缓冲液清洗培养基。将实施例1制备得到的水溶性AIE荧光探针与含1vol％双抗和10vol％FBS的DMEM培养基配置成浓度梯度为200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM的溶液。
在孔板中加入含有不同浓度水溶性AIE荧光探针的培养基，设置空白对照组，培养24小时后用PBS缓冲液清洗干净培养基，然后加入CCK-8，再次培养2小时，用酶标仪检测细胞活性，得出细胞毒性实验结果如图9所示。
由图9所示的细胞毒性检测结果可知，当水溶性AIE荧光探针的浓度逐渐上升时，共同培养的HeLa细胞活性有所下降；当浓度达到1000μM时，整体的细胞活性仍然保持在80％以上，说明本发明制备的水溶性AIE荧光探针的分子细胞毒性较小，有应用于活细胞染色方面的潜力。
应用例
将HeLa细胞与实施例1制备的水溶性AIE荧光探针共同培育来染色HeLa细胞，然后使用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞的荧光图像来进一步研究。具体操作步骤如下：
1)将HeLa细胞在37℃、含1vol％双抗和10vol％FBS的DMEM培养基中培养，湿度为5％。每隔一天更换一次培养基。
2)将细胞传代至共聚焦培养皿中培养24h后，用PBS缓冲液洗去培养基，加入不同浓度的水溶性AIE荧光探针溶液(溶剂为PBS缓冲液)进行染色。
3)待染色3min后，在激光共聚焦显微镜下观察。
使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察细胞的荧光图像(激发波长：561nm，发射波段：578～700nm，标尺：10μm)。
图10为采用200μM的水溶性AIE荧光探针溶液进行染色后，HeLa细胞的荧光图像(PL)、明场图像(DIC)和叠加图像(Merge)。
图10显示在578～700nm的光谱窗口中，可以在细胞膜周围记录亮红色的发射光，此外，在实验过程中，水溶性AIE荧光探针在细胞质膜附近聚集发光的速率很快，在3分钟的染色时间内已经实现在细胞膜上聚集并且发出较强的红色荧光，将细胞膜周围点亮。通过以上细胞染色实验结果可知：实施例1制备的AIE荧光探针(4-(4-(N,N-二羟乙基胺)苯乙烯基)-N-(2-磺酸根乙基)吡啶溴化铵盐)是活体细胞荧光成像的良好荧光剂，具有快速高效对细胞质膜进行染色的能力。
图11为采用800μM的水溶性AIE荧光探针溶液进行染色后，HeLa细胞的荧光图像(PL)、明场图像(DIC)和叠加图像(Merge)。
图11显示在578～700nm的光谱窗口中，当提高浓度后，水溶性AIE荧光探针溶液在3min内不但点亮了细胞膜，而且还点亮了整个细胞，核仁处也显现了较强的红色荧光。这说明本发明制备的水溶性AIE荧光探针不但能够快速染色细胞膜还可以快速通过细胞膜。
通过以上细胞染色实验结果可知：本发明制备的水溶性AIE荧光探针是活体细胞荧光成像的良好荧光剂，具有快速高效对细胞质膜进行染色的能力，同时能够使活体细胞膜的选择透过性不对它发生作用，进而实现快速跨膜过程，在探索开发荧光生物成像领域中的抗生物自体荧光的水溶性AIEgen荧光探针具有重要价值。
以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，以上应用了具体实例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。本发明所属技术领域的技术人员依据本发明的构思，还可以做出若干简单推演、变形、替换或结合。这些推演、变形、替换或结合方案也落入本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种水溶性AIE荧光探针，其特征在于，结构式如下式(Ⅰ)所示：
式中，R1与R2独立地选自碳数为1～6的烷基醇；X选自水溶性阴离子，M选自水溶性阳离子。
2.根据权利要求1所述的水溶性AIE荧光探针，其特征在于：
R1＝R2；
X选自卤素阴离子；
M选自碱金属阳离子。
3.根据权利要求1所述的水溶性AIE荧光探针，其特征在于：
R1＝R2，选自CH2OH、CH2CH2OH、CH2CH2CH2OH中的一种或多种；
X选自F-、Cl-、Br-中的一种或多种；
M选自Na+和/或K+。
4.根据权利要求1所述的水溶性AIE荧光探针，其特征在于，所述水溶性AIE荧光探针的发射波长为590～610nm。
5.一种根据权利要求1～4任一项所述的水溶性AIE荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：
(1)以N,N-二烷基醇胺和对氟苯甲醛为原料，经亲核取代反应制备得到中间产物A；
(2)将4-甲基吡啶、2-卤代乙基磺酸盐与有机溶剂A混合，加热至回流温度下进行烷基化反应，制备得到中间产物B；
(3)惰性气氛下，将中间产物A、中间产物B与有机溶剂B混合，加热至回流温度下进行亲核加成反应，得到所述的水溶性AIE荧光探针。
6.根据权利要求5所示的水溶性AIE荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中：
所述N,N-二烷基醇胺选自二乙醇胺、N,N-二(3-羟基丙基)胺、N,N-二(4-羟基丁基)胺、N,N-二(5-羟基戊基)胺、N,N-二(6-羟基己基)胺中的一种或多种；
所述亲核取代反应在催化剂作用下进行，催化剂选自三氯化铝、三氯化铁、四氯化钛中的一种或多种；
N,N-二烷基醇胺和对氟苯甲醛的摩尔比为1～8：1，亲核取代反应的温度为110～160℃。
7.根据权利要求5所示的水溶性AIE荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中：
所述2-卤代乙基磺酸盐选自2-溴乙基磺酸钠和/或2-氯乙基磺酸钠；
所述有机溶剂A选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、甲醇、乙醇中的一种或多种；
4-甲基吡啶与2-卤代乙基磺酸盐的摩尔比为1～20：1。
8.根据权利要求5所示的水溶性AIE荧光探针的制备方法方法，其特征在于，步骤(3)中：
中间产物A与中间产物B的摩尔比为1.0～1.2：1；
所述有机溶剂B选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、甲醇、乙醇中的一种或多种；
所述亲核加成反应在催化剂作用下进行，催化剂选自哌啶、叔丁醇钾、吡啶中的一种或多种。
9.一种根据权利要求1～4任一项所述的水溶性AIE荧光探针在活体细胞荧光成像领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的水溶性AIE荧光探针在活体细胞荧光成像领域中的应用，其特征在于，所述水溶性AIE荧光探针在细胞质膜靶向荧光成像中的应用。
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