CN117531047A - 一种负载干细胞的改良型水凝胶制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种负载干细胞的改良型水凝胶制剂，它是以纤维蛋白原、凝血酶为基本成胶材料，掺入具有促进细胞增殖的生物活性玻璃和高分子材料，并负载干细胞制成的水凝胶。本发明以纤维蛋白原和凝血酶为基本成胶材料形成水凝胶，为干细胞提供适宜的三维生长和增殖环境，实现干细胞在骨关节部位的长效留存；通过掺入能够促进细胞增殖的生物活性玻璃和高分子材料，促进细胞增殖，且高分子材料具有抗炎和润滑关节的效果。相较于现有水凝胶，本发明水凝胶具有更稳定的优势。本发明负载干细胞的改良型水凝胶制剂具有促进关节软骨缺损修复作用本发明还公开了负载干细胞的改良型水凝胶制剂在制备治疗关节软骨损伤的药物或组织工程产品的应用。

Description

一种负载干细胞的改良型水凝胶制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体属于生物医用材料领域，涉及一种负载干细胞的改良型水凝胶制剂及其制备方法与应用。

背景技术

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的退行性关节疾病，以进行性软骨退化、软骨下骨重塑、骨髓损害、半月板损害和滑膜炎为特征，其引发的关节功能障碍和关节疼痛严重影响患者的健康和生活质量。近年来，剧烈运动造成的软骨损伤以及机体衰老产生的软骨退变的发病率逐年上升。此外，软骨基质中的胶原蛋白半衰期很长，即便只是发生轻微损伤，它的恢复也是非常缓慢的。关节软骨缺乏自我修复的能力，一旦受损，随着时间的推移会逐渐恶化。造成软骨很难自我修复的原因很多，但主要归结于关节软骨组织的无血管结构和低细胞密度，一方面营养物质很难通过血管到达受损部位，另一方面参与修复的细胞增殖能力差、细胞活力及数量也不足；此外，关节腔的炎性微环境会引起软骨细胞的生长分裂停止乃至诱导软骨细胞退行性死亡。因此，如何减少炎症和增加修复细胞数量和活力是治疗软骨缺损亟需解决的两个关键问题。

就目前而言，OA是无法治愈的疾病，临床常用的治疗手段分为保守治疗和外科手术两大类，包括：①口服非甾体抗炎药；②关节腔注射药物：玻璃酸钠溶液、肾上腺皮质激素；③手术治疗：自体软骨细胞植入、微骨折、关节清理、全膝关节置换等。但是现有治疗药物只是缓解症状、减少进行性破坏，不能起到预防和再生的作用，而且长期服用抗炎类药物会危害胃肠道以及心血管系统，注射激素类药物次数过多会增加对软骨的损害，手术治疗也是治标不治本，因此亟需寻找一种新的治疗方式。

水凝胶作为一种含水量高的高分子网络材料，被广泛应用于各种组织修复中，如伤口敷料、软骨修复、骨缺损填充材料等。其中，以天然高分子材料(如明胶、壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠)制成的水凝胶具有更为突出的生物相容性。但是，大多数以高分子材料为成胶材料的水凝胶制备复杂且需要使用有毒的交联剂；此外，大多数以高分子材料为成胶材料的水凝胶无法为细胞的生长和分化提供粘附位点，无法实现细胞的体外培养。

透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)广泛分布在结缔组织、上皮和神经组织中，也是一种天然存在于关节腔中的线性多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D葡糖胺的二糖单元组成。作为一种长链有机大分子，透明质酸具有保湿、润滑、抗炎及粘弹性特征，其本身具有良好的生物相容性和非免疫原性，并且可以在透明质酸酶或者活性氧物质存在条件下实现降解。透明质酸作为细胞外基质重要组成成份，在众多生物学过程中起着重要作用，包括伤口愈合、血管生成、激活细胞黏附信号通路、细胞骨架重排、细胞的迁移、增殖和分化等。此外，透明质酸还能与间充质干细胞表面的CD44受体相互作用，具有促进其成软骨分化的效应。因此，透明质酸被认为是软骨组织修复的理想生物材料，已有大量的透明质酸注射液获批上市且销量可观。但是其疗效一直具有争议，作为黏性补充剂，透明质酸注射液只能起到辅助作用，治标不治本。

干细胞具有自我更新和多能分化的潜能，干细胞疗法作为再生医学的一大分支，不仅用于修复组织，还应用于软骨和骨骼的组织工程。大量的动物实验已证明干细胞治疗可减少滑膜增厚、抑制软骨破坏、降低关节腔内IL-β、TNF-α和MMP-1的表达。目前，Cartistem(可特立)作为全球首个/唯一国家级批准的间充质干细胞治疗骨性关节炎的药物，于2012年由韩国FDA批准，占据了很大的市场。进一步地，从2013-2019年的临床调研数据来看，关节腔注射干细胞具有安全性和有效性，其改善疼痛的效果显著，能有效降低关节炎症程度并改善软骨质量；此外，较高剂量的细胞注射以及多次注射的疗效更好。干细胞治疗OA的机制包括但不局限于以下3个方面：1.分化为软骨细胞，促进软骨再生；2.具有免疫调节活性--抗炎作用：降低关节腔内IL-β、TNF-α和MMP-1的表达；3.营养和旁分泌作用：分泌VEGF、HGF、EGF、PDGF等；

但是，直接注射干细胞存在一定的局限性：①直接注射细胞容易在关节腔扩散，不易在靶区富集，很难保留在软骨缺损部位；②关节腔内炎症性破坏微环境显著损伤细胞，抑制治疗效果；有文献报道，关节注射细胞存活率低，仅有不到5％的细胞在注射部位持续存在，而且有大量实验数据证明了细胞水凝胶组的疗效显著高于直接注射细胞。因此有必要制备水凝胶，充当机械屏障，维持细胞活力和数量；以及通过改变炎症环境来保护细胞，来实现细胞的高效传递和长期生存，进而减少注射次数和剂量。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种能支持细胞粘附、增殖且能够抗炎的、具有更高稳定性的治疗关节软骨损伤的改良型细胞水凝胶制剂，利用生物相容性良好的纤维蛋白原和凝血酶交联制备可用于软骨组织缺损修复的可注射水凝胶，一方面，以纤维蛋白原和凝血酶为基本成胶材料形成水凝胶，为干细胞提供适宜的三维生长和增殖环境，实现干细胞在骨关节部位的长效留存；另一方面，通过掺入能够促进细胞增殖的功能性材料：生物活性玻璃和高分子材料，促进细胞增殖且高分子材料具有抗炎和润滑关节的效果。本发明负载干细胞的改良型水凝胶制剂在治疗关节软骨损伤如骨关节炎方面展现出明显的优势。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种负载干细胞的改良型水凝胶制剂，它是以纤维蛋白原、凝血酶为基本成胶材料，掺入具有促进细胞增殖的生物活性玻璃和高分子材料，并负载干细胞制成的水凝胶。

所述的负载干细胞的改良型水凝胶制剂是由以下方法制得的：采用PBS缓冲液分别配制生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、高分子材料溶液、纤维蛋白原溶液，并使用纤维蛋白原溶液重悬干细胞，得到干细胞混悬液，将生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、高分子材料溶液加入干细胞混悬液中，混合均匀，在25～40℃恒温环境中静置，得到的负载干细胞的改良型水凝胶。

本发明的另一个目的是提供一种所述的负载干细胞的改良型水凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)、配制生物活性玻璃(BG)溶液：生物活性玻璃进行灭菌处理，在无菌环境下，使用PBS缓冲液溶解配制成生物活性玻璃溶液；

配制凝血酶溶液：在无菌环境下，使用PBS缓冲液溶解凝血酶，得到凝血酶溶液；

配制高分子材料溶液：使用PBS缓冲液溶解高分子材料，高压灭菌，得到高分子材料溶液；

配制纤维蛋白原溶液：在无菌环境下，使用PBS缓冲液溶解纤维蛋白原，并加入抑肽酶溶液和氨甲环酸溶液，得到纤维蛋白原溶液；

步骤(2)、混合干细胞：在无菌环境下，使用纤维蛋白原溶液重悬干细胞，得到干细胞混悬液；

步骤(3)、制备负载干细胞的改良型水凝胶：在无菌环境下，将生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、高分子材料溶液加入干细胞混悬液中，混合均匀，在25～40℃恒温环境中静置，得到负载干细胞的改良型水凝胶。

步骤(1)中，所述的灭菌处理为：生物活性玻璃的经紫外灯照射30min。

所述的生物活性玻璃溶液的浓度为2～24mg/mL，优选为8～24mg/mL，最优选为16mg/mL。

生物活性玻璃是一种由SiO₂、P₂O₅和CaO等成分组成的硅酸盐玻璃，具有制备简单、化学组分均匀、含有大量孔隙结构、高比表面积、离子释放速率高、生物友好性等优势。生物活性玻璃不仅能够通过释放离子达到抗炎的效果，还能够提供钙离子促进成胶。

所述的凝血酶溶液的浓度为100～300U/mL，优选为200U/mL。

所述的高分子材料选自透明质酸(HA)、硫酸软骨素、海藻酸钠、壳聚糖、纤维素、明胶、胶原中的一种或两种以上的混合物。

所述的高压灭菌为在温度121℃、约103.4kPa下高压灭菌30min。

所述的高分子材料溶液的浓度为4～12mg/mL，具体可以为4、8、12mg/mL。

所述的抑肽酶溶液的浓度为7500U/mL，采用PBS缓冲液配制；所述的氨甲环酸溶液的浓度为10mg/mL的氨甲环酸溶液，采用PBS缓冲液配制。

所述的纤维蛋白原溶液中纤维蛋白原的浓度为10～30mg/mL，优选为15mg/mL，抑肽酶的浓度为400～900U/mL，优选为750U/mL，氨甲环酸的浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL。

步骤(2)中，使用10～1000μL纤维蛋白原溶液重悬1×10⁶～4×10⁶个干细胞，得到干细胞混悬液。

优选的，使用1000μL纤维蛋白原溶液重悬4×10⁶个干细胞，得到干细胞混悬液。

所述的干细胞包括骨髓间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、牙髓间充质干细胞或皮肤间充质干细胞。

所述的干细胞为原代～第六代的间充质干细胞。

步骤(3)中，所述的生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、高分子材料溶液和干细胞混悬液的体积比为1:1:2:1～1:1:2:20，优选为1:1:2:4。

一般的，在无菌环境下，将生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、高分子材料溶液加入干细胞混悬液中，混合均匀，在25～40℃恒温环境中静置3～10min，得到负载干细胞的改良型水凝胶。

本发明具有促进关节软骨缺损修复作用的负载干细胞的改良型水凝胶制剂，在使用水凝胶作为细胞支架的基础上，加入生物活性玻璃提供钙离子以提高水凝胶的稳定性，同时起到抗炎、促进细胞增殖以及修复组织的作用；加入高分子材料起到促进细胞增殖和软骨修复的作用，从而实现对关节软骨缺损更加高效、持久的治疗。

本发明的另一个目的是提供所述的负载干细胞的改良型水凝胶制剂在制备治疗关节软骨损伤的药物或组织工程产品的应用。

所述的关节软骨损伤包括但不限于创伤性关节炎、类风湿性关节炎、通风性关节炎、微骨折、半月板置换术所致的关节软骨损伤。

所述的负载干细胞的改良型水凝胶在修复骨关节炎关节软骨损伤中的应用，包括：将负载干细胞的改良型水凝胶填充在软骨缺损处后缝合伤口。

本发明的有益效果：

(1)、本发明水凝胶具有促进干细胞生长与增殖的功能。本发明水凝胶的原材料为纤维蛋白原和凝血酶，生物相容性好，可为细胞提供粘附位点，为细胞的生长和增殖提供适宜的微环境。相较于干细胞的二维培养，水凝胶为干细胞生长提供了一个三维的类细胞外基质环境，可以有效避免二维培养所产生的细胞接触抑制现象，从而促进干细胞的增殖。此外，生物活性玻璃和高分子材料(如透明质酸)都能够促进细胞的增殖。

(2)、本发明生物活性玻璃能够提供钙离子，具有促进水凝胶成胶的作用。相较于现有水凝胶，本发明水凝胶具有更稳定的优势。

(3)、本发明水凝胶中掺杂生物活性玻璃具有抗炎的作用。生物活性玻璃释放的离子能够调节巨噬细胞的极化，调节免疫微环境，进而促进软骨缺损修复的进程。同时，将生物活性玻璃掺入水凝胶中可以避免离子的爆炸性释放，导致pH突然升高引起的组织疼痛问题。

(4)、本发明制备水凝胶的原料成本低、操作简单，可以现配现用。

(5)、本发明可注射的水凝胶可用于软骨缺损的修复治疗，能够将干细胞粘附在软骨缺损部位，可适应缺损部位不规则形貌，从而持久地发挥功能。

附图说明

图1为不同BG浓度水凝胶浸出液促细胞增殖情况的结果。

图2为不同BG浓度水凝胶体外稳定性的结果。

图3为不同HA浓度水凝胶中干细胞的增殖情况的结果。

图4为二维培养与三维培养条件下干细胞增殖情况的结果。

图5为改良型水凝胶抗炎的结果。

图6为改良型水凝胶中干细胞的三维分布情况的结果。

图7为不同治疗组在第4、8周的软骨缺损大小对比图。

图8为不同治疗组在第8周关节评分统计图；其中，Degree of defect repair：缺陷修复面积；Intergration to border zone：与周围软骨整合程度；Macroscopicappearance：大体外观；Overall repair assessment：整体修复评估。

图9为不同治疗组经8周治疗后，关节的H&E、番红固绿和COL II染色结果。

具体实施方式

本发明设计并成功制备了负载干细胞的改良型水凝胶制剂，该水凝胶以纤维蛋白原与凝血酶作为成胶基质材料，并加入生物活性玻璃以提高水凝胶的稳定性，同时起到抗炎、促进细胞增殖以及修复组织的作用；加入透明质酸起到促进细胞增殖和软骨修复的作用，从而实现对关节软骨缺损更加高效、持久的治疗。本发明以水凝胶作为生物支架，其模拟了三维的细胞外基质生长环境，能够支持干细胞的生长、增殖与分化，实现了对关节软骨缺损的修复。

在本发明的一个实施例中，选用了SD大鼠作为主要模型以评估细胞组合物的促关节软骨修复效果。在模型构建过程中，采用了无菌环钻在大腿股骨沟钻均一的孔以构建全层软骨损伤模型。

下面结合附图与具体实施方案对本发明进一步说明，具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为本领域常规条件。

PBS缓冲液的pH为7.2～7.4。

实施例1

制备不同生物活性玻璃浓度的负载干细胞的改良型水凝胶制剂，包括以下步骤：

步骤(1)、在无菌条件下，分别准确称取8mg、16mg、24mg生物活性玻璃(规格：5g；品牌：3Achem)，紫外灯下照射30min，在无菌环境下，使用1mL PBS缓冲液溶解生物活性玻璃，得到浓度分别为8mg/mL、16mg/mL、24mg/mL的生物活性玻璃溶液；

步骤(2)、在无菌条件下，准确称取效价200U的凝血酶粉末(规格：2ku；品牌：源叶)，使用1mL PBS缓冲液溶解凝血酶，得到浓度为200U/mL的凝血酶溶液；

步骤(3)、在无菌条件下，准确称取4mg透明质酸，使用1mL PBS缓冲液溶解透明质酸，121℃高压(约103.4kPa)灭菌30min，得到浓度为4mg/mL的透明质酸溶液；

步骤(4)、在无菌条件下，准确称取15mg纤维蛋白原(规格：1g；品牌：源叶)，使用980μL PBS缓冲液溶解纤维蛋白原，并加入10μL浓度为7500U/mL的抑肽酶溶液(货号：A105534；品牌：阿拉丁，溶剂为PBS)及10μL浓度为10mg/mL的氨甲环酸溶液(货号：A111900；品牌：阿拉丁，溶剂为PBS)，得到浓度为15mg/mL的纤维蛋白原溶液；

步骤(5)、使用1mL步骤(4)制得的纤维蛋白原溶液重悬4×10⁶个人脐带间充质干细胞(MSCs)，得到人脐带间充质干细胞悬浮液；

步骤(6)、在无菌环境下，将生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、透明质酸溶液、人脐带间充质干细胞悬浮液按照体积比1:1:2:4混合均匀使MSCs的终浓度为2×10⁶个/mL，在37℃恒温环境中静置5min，得到稳定的负载干细胞的水凝胶，分别记为FTHB1(生物活性玻璃浓度为1mg/mL)、FTHB2(生物活性玻璃浓度为2mg/mL)、FTHB3(生物活性玻璃浓度为3mg/mL)。

通过CCK-8法评估不同BG浓度水凝胶浸出液的促进干细胞增殖情况，具体实验步骤如下：首先，以DMEM/F12培养基为浸出介质，按照水凝胶和浸出介质的体积比为1:1，37℃下浸出24h，得到浸出液，往浸出液中补充10％FBS，用于MSCs细胞增殖的相关实验。然后，将人脐带血间充质干细胞培养后消化下来，使用含10％FBS的DMEM/F12完全培养基重悬人脐带血间充质干细胞，以3×10³个/孔接种在96孔板中培养24h。3个实验组：分别使用水凝胶FTHB1、FTHB2、FTHB3浸出液进行培养，对照组(即FTHB0)：采用DMEM/F12完全培养基进行培养。在培养第0和第3天时，采用CCK-8法按照说明书进行定量检测吸光度值(吸光度值越高，细胞相对数量越高)。图1为体外环境下，不同生物活性玻璃(BG)浓度水凝胶浸出液的促进干细胞增殖情况的结果。实验结果表明：BG浓度为1～3mg/mL时，均可以促进干细胞增殖效果，尤其是BG浓度为2mg/mL时，干细胞增殖明显高于BG浓度为0mg/mL时，说明BG具有促进细胞增殖的作用。

首先，取水凝胶样本(FTHB1、FTHB2、FTHB3)，加入适量PBS缓冲液，置于37℃恒温孵育一段时间，并且记录重量。水凝胶刚制备完成充分溶胀后的原始重量记为W₀，降解过程中剩余的重量记为Wn，每个实验组设3个平行样品，计算留存率L，将各组水凝胶的留存率曲线进行对比分析。图2为体外环境下、不同BG浓度水凝胶稳定性考察结果，表明BG浓度越高，水凝胶在体外的稳定时间越长，说明BG能促进水凝胶的稳定。

L＝(Wn/W₀)×100％

实施例2

制备不同透明质酸浓度的负载干细胞的改良型水凝胶制剂，包括以下步骤：

步骤(1)、在无菌条件下，准确称取16mg生物活性玻璃，紫外灯下照射30min，在无菌环境下，使用1mL PBS缓冲液溶解生物活性玻璃，得到浓度为16mg/mL的生物活性玻璃溶液；

步骤(2)、在无菌条件下，准确称取效价200U的凝血酶粉末，使用1mL PBS缓冲液溶解凝血酶，得到浓度为200U/mL的凝血酶溶液；

步骤(3)、在无菌条件下，分别准确称取4、8、12mg透明质酸，使用1mL PBS缓冲液溶解透明质酸，121℃高压(约103.4kPa)灭菌30min，得到浓度分别为4、8、12mg/mL的透明质酸溶液；

步骤(4)、在无菌条件下，准确称取15mg纤维蛋白原，使用980μL PBS缓冲液溶解纤维蛋白原，并加入10μL浓度为7500U/mL的抑肽酶溶液及10μL浓度为10mg/mL的氨甲环酸溶液，得到浓度为15mg/mL的纤维蛋白原溶液；

步骤(5)、使用1mL纤维蛋白原溶液重悬4×10⁶个人脐带间充质干细胞，得到人脐带间充质干细胞混悬液；

步骤(6)、在无菌环境下，将生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、透明质酸溶液、人脐带间充质干细胞混悬液按照体积比1:1:2:4混合均匀使MSCs终浓度为2×10⁶个/mL，在37℃恒温环境中静置5min，得到稳定的负载干细胞的水凝胶。

通过CCK-8法评估不同HA浓度水凝胶中干细胞的增殖情况，具体实验步骤如下：首先，将本实施例配制的生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、透明质酸溶液(浓度分别为4、8、12mg/mL)和人脐带间充质干细胞混悬液按照体积比1:1:2:4混合均匀，在37℃、5％CO₂培养箱中静置成胶，水凝胶样品分别记为FTBH1、FTBH2、FTBH3；同时，将生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、PBS缓冲液和人脐带间充质干细胞混悬液按照体积比1:1:2:4混合均匀，在37℃、5％CO₂培养箱中静置成胶，记为FTBH0。将水凝胶样品FTBH0、FTBH1、FTBH2、FTBH3置于37℃、5％CO₂培养箱中，按照说明书，采用CCK-8法定量检测培养第0、1、3、5和7天时的吸光度值。图3为体外环境下，不同HA浓度水凝胶中干细胞的增殖情况的结果，表明，在HA浓度1～3mg/mL范围内，干细胞增殖结果与水凝胶中HA浓度成正比，说明HA具有促进细胞增殖的作用。

设置两种培养模式，比较37℃下二维培养模式和三维培养模式下干细胞的增殖情况，三维培养模式用水凝胶培养细胞，二维培养模式用孔板培养细胞。具体实验步骤如下：首先，人脐带间充质干细胞消化，二维培养模式：将人脐带间充质干细胞直接接种在48孔板中，采用DMEM/F12完全培养基培养，三维培养模式：先将人脐带间充质干细胞与水凝胶前体溶液(本实施例配制的16mg/mL生物活性玻璃溶液、200U/mL凝血酶溶液、12mg/mL透明质酸溶液、步骤(5)人脐带间充质干细胞混悬液按照体积比1:1:2:4混合均匀)预混，再置于48孔板中成胶，成胶后采用DMEM/F12完全培养基培养，调整两种培养模式中细胞密度约为1×10³个/孔。采用CCK-8法，按照说明书定量检测在培养第0、1、3、5和7天时的吸光度值。图4为二维培养与三维培养条件下干细胞增殖情况的结果，随着培养时间增加，三维培养模式下干细胞的增殖情况明显优于二维培养。

通过qPCR评估不同处理下，RAW细胞中几种抗炎和促炎细胞因子的基因表达情况。具体实验步骤如下：以DMEM培养基为浸出介质，按照水凝胶FTBH3和浸出介质的体积比为1:1，37℃下处理24h，制备浸出液，往收浸出液补充10％的FBS，用于RAW细胞抗炎的相关实验。将RAW细胞以1×10⁶个/孔的细胞密度接种于含10％ FBS的DMEM培养基的6孔板中，37℃培养24h，实验组：将RAW细胞与水凝胶浸出液共培养，对照组：将RAW细胞与含10％FBS的DMEM培养基共培养，共培养48小时后，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤RAW细胞，采用传统的Trizol法提取细胞中的RNA。使用逆转录试剂盒合成cDNA，以GAPDH为内参基因，按照试剂盒说明书使用罗氏荧光定量仪进行实时定量分析，数据进一步归一化为GAPDH的表达，并相对于对照组样本相应的基因表达进行定量，标准化为1。图5为体外环境下、改良型水凝胶抗炎的结果，结果表明改良型水凝胶浸出液能够下调促炎因子TNF-α、IL-1β和上调抗炎因子ARG、IL-10的表达。

人脐带血间充质干细胞培养，消化，使用步骤(5)纤维蛋白原溶液重悬细胞，得到人脐带血间充质干细胞混悬液，将16mg/mL生物活性玻璃溶液、200U/mL凝血酶溶液、12mg/mL透明质酸溶液和人脐带血间充质干细胞混悬液按照体积比1:1:2:4混合均匀，在37℃、5％CO₂培养箱中静置成胶。在37℃下培养第0、1、3、5和7天时，按照试剂盒说明书，用钙黄绿素对干细胞进行染色，采用荧光显微镜进行图片拍摄，观察不同时间点改良型水凝胶中细胞形态以评估细胞的三维分布情况，结果见图6，表明：在第0天时，细胞呈圆形，分布在水凝胶中，随着共培养时间的延长，第1天时细胞逐渐伸展出伪足，表明干细胞发生粘附行为。在培养3天以后，干细胞形态呈现长梭状，表明水凝胶为细胞的粘附和增殖提供了良好的微环境。

实施例3

一种负载干细胞的改良型水凝胶制剂，是由以下方法制备得到的，包括以下步骤：

步骤(1)、在无菌条件下，准确称取8mg生物活性玻璃，紫外灯下照射30min，在无菌环境下，使用1mL PBS缓冲液溶解生物活性玻璃，得到浓度为8mg/mL的生物活性玻璃溶液；

步骤(2)、在无菌条件下，准确称取效价200U凝血酶粉末，使用1mL PBS缓冲液溶解凝血酶，得到浓度为200U/mL的凝血酶溶液；

步骤(3)、在无菌条件下，准确称取8mg透明质酸，使用1mL PBS缓冲液溶解透明质酸，121℃高压(约103.4kPa)灭菌30min，得到浓度为8mg/mL的透明质酸溶液；

步骤(4)、在无菌条件下，准确称取15mg纤维蛋白原，使用980μL PBS缓冲液溶解纤维蛋白原，并加入10μL浓度为7500U/mL的抑肽酶溶液及10μL浓度为10mg/mL的氨甲环酸溶液，得到浓度为15mg/mL的纤维蛋白原溶液；

步骤(5)、使用1mL纤维蛋白原溶液重悬4×10⁶个人脐带间充质干细胞得到人脐带间充质干细胞悬浮液；

步骤(6)、在无菌环境下，将生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、透明质酸溶液、人脐带间充质干细胞悬浮液按照体积比1:1:2:4混合均匀使MSCs终浓度为2×10⁶个/mL，在37℃恒温环境中静置5min，得到稳定的负载干细胞的水凝胶。

对比例1

一种改良型水凝胶制剂，是由以下方法制备得到的，包括以下步骤：

步骤(1)、在无菌条件下，准确称取16mg生物活性玻璃，紫外灯下照射30min，在无菌环境下，使用1mL PBS缓冲液溶解生物活性玻璃，得到浓度为16mg/mL的生物活性玻璃溶液；

步骤(2)、在无菌条件下，准确称取效价200U的凝血酶粉末，使用1mL PBS缓冲液溶解凝血酶，得到浓度为200U/mL的凝血酶溶液；

步骤(3)、在无菌条件下，分别准确称取12mg透明质酸，使用1mL PBS缓冲液溶解透明质酸，121℃高压(约103.4kPa)灭菌30min，得到浓度分别为12mg/mL的透明质酸溶液；

步骤(4)、在无菌条件下，准确称取15mg纤维蛋白原，使用980μL PBS缓冲液溶解纤维蛋白原，并加入10μL浓度为7500U/mL的抑肽酶溶液及10μL浓度为10mg/mL的氨甲环酸溶液，得到浓度为15mg/mL的纤维蛋白原溶液；

步骤(5)、在无菌环境下，将生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、透明质酸溶液、纤维蛋白原溶液按照体积比1:1:2:4混合均匀，在37℃恒温环境中静置5min，得到水凝胶制剂。

应用实施例1

1、选取SD大鼠(体重300～350g)为实验对象，饲养一段时间后，开展大鼠膝关节软骨缺损修复实验，观察改良型水凝胶制剂对骨关节炎大鼠软骨缺损的治疗效果。术前禁食8h，禁水2h，分为4组。腹腔注射10％水合氯醛(0.5g/kg)麻醉大鼠，将大鼠以仰卧位固定于手术台上，腿部刮毛，75％乙醇擦拭至术区无污染物，碘伏擦拭术区；取膝关节外侧髌旁入路，纵行切开皮肤约1.5cm，逐层切开皮下组织、关节囊，将髌骨向内侧脱位，显露股骨滑车；于股骨远端踝间凹处用直径为1.5mm的钻头制备一个直径1.5mm、深度1mm的环形软骨缺损，确保基底无骨髓血渗出，并用生理盐水清洗碎屑；进行不同处理治疗，空白对照组(Blank)：不对缺损做任何治疗处理；细胞组(Cell)：将人脐带血间充质干细胞(密度为2×10⁶个/mL，PBS缓冲液混悬)直接填充到软骨缺损处，用量约为2μL；水凝胶组(Hydrogel)：将对比例1制得的水凝胶填充到缺损处，用量约为2μL；细胞凝胶组(Cell+Hydrogel)：将实施例2制得的FTBH₃水凝胶填充到缺损处，用量约为2μL；将皮下软组织及皮肤依次缝合。术后每天用碘伏对伤口进行消毒，并连续注射抗生素3天预防感染，分笼饲养。

2、分别于治疗的第4和第8周随机处死大鼠，取关节组织进行宏观观察、关节评分、H&E染色、番红固绿染色、COLII染色。

图7为不同治疗组在第4、8周的软骨缺损大小对比图。结果表明，术后4周，空白对照组大鼠的软骨缺损处几乎无修复组织；细胞组大鼠软骨缺损处发生纤维组织样部分修复；水凝胶组大鼠损伤区域依旧明显但有所减小，周围可观察到凹凸不平的组织生长；细胞凝胶组大鼠可见软骨缺损处被修复组织填充，表面较平整。术后8周，空白对照组大鼠软骨缺损仍清晰可见，但缺损边缘变得圆整；细胞组大鼠软骨缺损基本填充完全，但损伤与周围正常组织界限较明显，且表面欠平整且无透明软骨样光泽；水凝胶组大鼠损伤区域基本填充完整，且表面平整；细胞凝胶组大鼠可见软骨缺损被透明软骨样组织修复，表面平整富有光泽。

按照国际软骨修复协会(ICRS)评分标准对软骨修复情况进行评价，图8为不同治疗组在第8周的关节评分统计图。结果表明，细胞水凝胶组大鼠的关节评分高于空白对照组、细胞组、水凝胶组，表明负载干细胞的改良型水凝胶具有显著的软骨修复效果。

不同治疗组大鼠经8周治疗后，关节的H&E、番红固绿和COL II染色结果见图9。与上述结果趋势一致，空白对照组大鼠软骨缺损处仍存在明显的缺陷，仅发现少量透明软骨形成；细胞组和水凝胶组大鼠软骨缺损处均有新生软骨的填充，与周围正常组织融合较好，但是表面不平整；而细胞凝胶组大鼠软骨损伤部位填充完整，新生的软骨组织表面光滑平整，与周围组织的整合度较好，修复效果最佳。

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，公开了本发明改良型水凝胶制剂的实施例和附图，而并非对实施方式的限定。本领域内的科研人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可行的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种负载干细胞的改良型水凝胶制剂，其特征在于：它是以纤维蛋白原、凝血酶为基本成胶材料，掺入具有促进细胞增殖的生物活性玻璃和高分子材料，并负载干细胞制成的水凝胶。

2.根据权利要求1所述的负载干细胞的改良型水凝胶制剂，其特征在于：所述的负载干细胞的改良型水凝胶制剂是由以下方法制得的：采用PBS缓冲液分别配制生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、高分子材料溶液、纤维蛋白原溶液，并使用纤维蛋白原溶液重悬干细胞，得到干细胞混悬液，将生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、高分子材料溶液加入干细胞混悬液中，混合均匀，在25～40℃恒温环境中静置得到的负载干细胞的改良型水凝胶。

3.一种权利要求1所述的负载干细胞的改良型水凝胶制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤(1)、配制生物活性玻璃溶液：生物活性玻璃进行灭菌处理，在无菌环境下，使用PBS缓冲液溶解配制成生物活性玻璃溶液；

配制凝血酶溶液：在无菌环境下，使用PBS缓冲液溶解凝血酶，得到凝血酶溶液；

配制高分子材料溶液：使用PBS缓冲液溶解高分子材料，高压灭菌，得到高分子材料溶液；

配制纤维蛋白原溶液：在无菌环境下，使用PBS缓冲液溶解纤维蛋白原，并加入抑肽酶溶液和氨甲环酸溶液，得到纤维蛋白原溶液；

步骤(2)、混合干细胞：在无菌环境下，使用纤维蛋白原溶液重悬干细胞，得到干细胞混悬液；

步骤(3)、制备负载干细胞的改良型水凝胶：在无菌环境下，将生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、高分子材料溶液加入干细胞混悬液中，混合均匀，在25～40℃恒温环境中静置，得到负载干细胞的改良型水凝胶。

4.根据权利要求3所述的负载干细胞的改良型水凝胶制剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的生物活性玻璃溶液的浓度为2～24mg/mL；所述的凝血酶溶液的浓度为100～300U/mL；所述的纤维蛋白原溶液中纤维蛋白原的浓度为10～30mg/mL，抑肽酶的浓度为400～900U/mL，氨甲环酸的浓度为0.5～2mg/mL。

5.根据权利要求4所述的负载干细胞的改良型水凝胶制剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的生物活性玻璃溶液的浓度为8～24mg/mL，优选为16mg/mL；所述的凝血酶溶液的浓度为200U/mL；所述的纤维蛋白原溶液中纤维蛋白原的浓度为15mg/mL，抑肽酶的浓度为750U/mL，氨甲环酸的浓度为1mg/mL。

6.根据权利要求3所述的负载干细胞的改良型水凝胶制剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的高分子材料溶液的浓度为4～12mg/mL；

所述的高分子材料选自透明质酸、硫酸软骨素、海藻酸钠、壳聚糖、纤维素、明胶、胶原中的一种或两种以上的混合物。

7.根据权利要求3所述的负载干细胞的改良型水凝胶制剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，步骤(2)中，使用10～1000μL纤维蛋白原溶液重悬1×10⁶～4×10⁶个干细胞，得到干细胞混悬液；优选使用1000μL纤维蛋白原溶液重悬4×10⁶个干细胞，得到干细胞混悬液。

8.根据权利要求3所述的负载干细胞的改良型水凝胶制剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的生物活性玻璃溶液、凝血酶溶液、高分子材料溶液和干细胞混悬液的体积比为1:1:2:1～1:1:2:20，优选为1:1:2:4。

9.权利要求1所述的负载干细胞的改良型水凝胶制剂在制备治疗关节软骨损伤的药物或组织工程产品的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的关节软骨损伤包括创伤性关节炎、类风湿性关节炎、通风性关节炎、微骨折、半月板置换术所致的关节软骨损伤。