CN117529503A - 结合ox40和/或pd-l1的抗体和双特异性结合蛋白 - Google Patents

结合ox40和/或pd-l1的抗体和双特异性结合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明提供了新的识别TNF受体超家族成员OX40的抗体，新的识别程序性细胞死亡配体1(PD‑L1)的抗体，以及使用这些抗体制造的双特异性OX40/PD‑L1结合蛋白，诸如FIT‑Ig结合蛋白。所述抗体和双特异性结合蛋白对于疾病诸如肿瘤的治疗是有用的。

Description

结合OX40和/或PD-L1的抗体和双特异性结合蛋白
技术领域
本公开内容涉及能够识别肿瘤坏死因子受体OX40(CD134)的抗体，以及包含至少一个OX40结合结构域和至少一个PD-L1结合结构域的相关双特异性结合蛋白，诸如双特异性OX40/PD-L1结合蛋白(例如Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)结合蛋白)。本公开内容还涉及能够识别PD-L1的抗体，以及包含至少一个PD-L1结合结构域和至少一个OX40结合结构域的相关的双特异性结合蛋白，诸如双特异性OX40/PD-L1结合蛋白(例如FIT-Ig结合蛋白)。本文公开的抗体和双特异性结合蛋白对于疾病治疗可能是有用的，例如，在癌症免疫治疗中。本公开进一步涉及编码所述抗体或双特异性结合蛋白的核酸，以及生产所述抗体或双特异性结合蛋白的方法。
背景技术
肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNFR)是一大类功能多样的受体，能够介导一系列的免疫细胞功能(Mayes PA,2018)。TNFR超家族的许多成员是共刺激受体，其可以表达在一些免疫细胞类型上，包括T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞以及抗原呈递细胞(APC)，并被证明可以诱导免疫细胞功能、增殖和存活(Watts T.H.,2005)。
OX40(CD134)是TNFR超家族的成员，属于表征为4个半胱氨酸富集结构域(cysteine-rich domain，CRD)的I型跨膜糖蛋白，主要表达于活化的CD4和CD8 T细胞和Foxp3+CD4+调节性T细胞(Treg)上，而其配体OX40L(CD252)则表达于活化的APC，例如树突状细胞(DC)、B细胞和巨噬细胞(Weinberg AD，2011)。在被TCR-MHC/肽相互作用活化后，OX40L形成同源三聚体并与三个OX40受体结合，产生受体交联(Watts,2005；Jane Willoughby,2017)。OX40的高阶超聚集(super-clustering)被认为是介导下游信号传导的必要条件。聚集的OX40受体将TNF受体相关因子(TRAF)招募到OX40的细胞内域。TRAF2和3激活PI3K/PKB、核因子κB1(NF-κB1)和NFAT途径，这些途径决定了T细胞的分裂、存活和细胞因子的产生(Croft,2010；Kawamata,1998；Song,2008)。因此，OX40的下游信号有可能增强增殖、抑制凋亡和诱导T细胞产生更多的细胞因子反应，所有这些功能性结果都赋予OX40激动性抗体在免疫疗法中的引发能力。
激动性抗OX40抗体介导抗肿瘤疗效的机制已经在各种小鼠肿瘤模型中被广泛研究。大多数激动性抗OX40 mAb采用人IgG1同型，以实现强力FcγR结合以触发效应T细胞上的共刺激信号通路，从而支持通过OX40活化T细胞亚群的存活和扩增和建立CD8 T细胞应答的T细胞记忆(Brendan D Curti,2013；Glisson,2020)。其他数据表明，OX40共刺激经由下游信号传导抑制FoxP3的表达和Treg的诱导(Zhang X,2018)。由于OX40在浸润的Treg上高度表达，OX40抗体诱导抗肿瘤反应依赖于通过抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的Fc介导的效应子功能耗竭肿瘤内Treg细胞(Aspeslagh，2016；Smyth，2014)。然而，肿瘤内Treg的耗竭可以改善肿瘤微环境(TME)中CD8+效应T细胞对Treg的浸润的比值，这在几个小鼠模型中被证明为增强了抗肿瘤免疫应答并改善了生存率(Jacquemin,2015；Bulliard,2014)。由于其良好的抗肿瘤功效，临床开发中的大多数激动性OX40抗体是IgG1同型的，以获得理想的抗肿瘤功效(Choi,2020；Brendan D Curti,2013；Glisson,2020)。使用OX40靶向药物的临床试验已经说明了其当作为单一疗法或与免疫检查阻断剂(ICB)联合使用时的安全性。尽管OX40靶向治疗在临床前小鼠模型中表现出令人印象深刻的结果，但根据初步的临床数据，其作为人类的单一疗法的疗效不太明显(Glisson,2020；Carolina,2020；Martin Gutierrez,2020)。然而，根据最近发表的1/2a期研究，OX40与抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA4联合刺激并没有产生明显的疗效改善(MartinGutierrez,2020)。患者对激动性抗OX40抗体的低反应可能有两个原因。首先，当受到TME中可用的浸润性FcγR的限制时(Willoughby，2017)，或在存在高浓度的内源性IgG竞争FcγR结合时(Christian Gieffers，2013)，一些肿瘤中的FcγR依赖性聚集会更低效。其次，正如最近的一项临床研究发现的那样，在抗OX40 IgG1抗体治疗后，OX40+CD4+记忆T细胞的比例减少，可能是由于OX40+细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)(Glisson,2020)。因此，需要新一代的抗OX40激动剂，无论FcγR的有限可用性如何，都可以介导有效的超聚集，同时保持低效应功能。
PD-L1(CD274)是一种40kDa的I型跨膜蛋白，PD-1/PD-L1信号通路在免疫耐受和肿瘤免疫逃避中起着重要作用。PD-L1在许多人类肿瘤组织中表达(如肺癌、胃癌、乳腺癌和肠癌)。阻断PD-1/PD-L1抑制性信号通路可激活被遏制的T细胞来攻击癌细胞。大多数抗PD-L1mAb通过促进肿瘤抗原特异性T细胞的增殖，在体内和患者体内都能抑制肿瘤的生长(Julie,2012；Brahmer,2012)。
双特异性抗体是一类具有针对两种不同抗原/表位的双重亲和力的工程化抗体。已经报道和开发了各种形式的双特异性抗体，包括如WO2015/103072中公开的FIT-IG(Fabs-In-Tandem ImmunoGlobulin)。
发明概述
本公开提供了以高亲和力与OX40结合的新抗体和与PD-L1结合的新抗体。本公开还提供了同时结合PD-L1和OX40的双特异性Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)。本公开的抗体和双特异性结合蛋白可以阻断肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的PD-L1抑制性信号，以重新激活肿瘤浸润的细胞毒性(针对肿瘤)T细胞。
本公开的双特异性抗体包括两个抗原结合区，具有双重机制，首先，通过其PD-L1结合区，双特异性抗体剂与表达PD-L1的肿瘤细胞或APC结合，而通过其OX40结合区，双特异性抗体可以结合OX40和介导超聚集，从而以条件性PD-L1依赖方式激活T细胞。其次，本公开的双特异性抗体阻断人PD-L1与人PD-1的结合，以防止PD-L1介导的通过PD-1的免疫逃避。因此，本公开的双特异性抗体通过与OX40的结合激活T细胞，同时通过PD-1/PD-L1的相互作用防止T细胞衰竭，反过来引起效应、记忆T细胞激活和增殖被增强，以推动抗肿瘤疗效。此外，本公开的双特异性抗体在Fc区引入了LALA突变，以减弱对OX40阳性T细胞的ADCC和ADCP。
本公开的PD-L1/OX40双特异性抗体通过诱导高阶OX40聚集和通过由PD-L1交联触发足够的OX40信号，从而克服了抗OX40单药疗法的局限性。肿瘤细胞上的PD-L1和T细胞上的OX40同时结合，导致T细胞上的OX40的PD-L1依赖性激活，连同PD-1/PD-L1抑制性信号传导的抑制，这可能导致有效诱导抗肿瘤免疫。因此，OX40/PD-L1双特异性抗体在治疗癌症方面具有实用性。
附图说明
图1显示了抗OX40抗体的表位鉴定。图1a显示了HuEM1007-044-16(顶部)、OX40-Tabl(中间)、OX40-Tab2(底部)与OX40细胞外段全长(CRD1-4，圆形)和截短的OX40变体ΔCRD1(缺少CRD1，方形)、ΔCRD1-2(缺少CRD1和CRD2，三角形)、ΔCRD1-3(缺少CRD1、CRD2和CRD3，菱形)的结合。图1b显示了OX40-Tab2与OX40胞外段全长(CRD1-4，圆形)、mCRD1(CRD1-4，且其中的CRD1结构域被小鼠CRD1取代，方形)、mCRD2(CRD1-4，且其中的CRD2结构域被小鼠CRD2取代，三角形)，mCRD3(CRD1-4，且其中的CRD3结构域被小鼠CRD3取代，倒三角形)，和mCRD4(CRD1-4，且其中的CRD4结构域被小鼠CRD4取代，菱形)。
图2显示了抗OX40抗体HuEM1007-044-16(黑色)诱导T效应细胞选择性增殖(相对于Treg细胞)。不相关的人IgG(灰色)用作阴性对照。
图3显示了CHO-PD-L1与连续稀释的抗体FIT1014-20a(菱形)和HuEM0005-86-64(正方形)的结合，连同不相关的人IgG(三角形)作为阴性对照，通过FACS检测。
图4显示了FACS检测的结合转染了人OX40的CHO细胞的亲和力结果，涉及连续稀释的抗体FIT1014-20a(菱形)和其亲本OX40抗体HuEM1007-44-16(方形)。不相关的人类IgG(三角形)被用来作为阴性对照。
图5表明了在基于细胞的受体阻断试验中，双特异性FIT1014-20a(方形)和亲本PD-L1抗体(三角形)以及作为阴性对照的不相关的人IgG(倒三角)对PD-1/PD-L1结合的阻断。
图6显示了双特异性FIT1014-20a(方形)和亲本PD-L1抗体(三角形)以及作为阴性对照的不相关人IgG(倒三角形)对PD-L1介导的抑制性信号的阻断。
图7(顶部)显示了双特异性FIT1014-20a(方形)，分别包含相同的PD-L1和OX40结合域的两个亲本抗体的组合(倒三角)，以及作为阴性对照的不相关的人IgG(菱形)对OX40下游信号的激活。在一个对照试验中(底部)，通过FIT1014-20a或两个亲本抗体的组合，不表达PD-L1的CHO细胞显示出缺乏激活。
图8显示了从经与FIT1014-20a(方形)、亲本抗体组合(倒三角)或不相关的人IgG(菱形)孵育后的CHO-PD-L1-OS8细胞和人原代T细胞的共培养系统中产生的IL2(顶部，培养后72小时)和IFN-γ(底部，培养后48小时)。
图9显示了T细胞激活的评估，通过与FIT1014-20a(深色)和亲本抗体组合(灰色)孵育3天后从混合淋巴细胞反应(MLR)测定中观察到的IL2水平。
图10显示了T细胞激活的评估，通过与FIT1014-20a(方形)，亲本抗体组合(倒三角)或作为阴性对照的不相关的人IgG(菱形)孵育96小时后从金黄色葡萄球菌肠毒素(SEB)测定中观察到的IL2水平。
图11显示了FIT1014-20a(圆形)的补体依赖性细胞毒性测定，且抗HLA-1为阳性对照(三角形)，不相关的人IgG为阴性对照(方形)。
图12显示了FIT1014-20a(黑色实心)、HuEM1007-044-16-hIgG1(灰色实心)、HuEM1007-044-16(斜条纹)、OX40-Tab2(横条纹)和无关hIgG(棋盘)对CHO-OX40的吞噬作用。
图13显示了在用FIT1014-20a(三角形)、亲本PD-L1 mAb HuEM0005-86-64(方形)、阿替利珠单抗Atezolizumab(方形)和作为阴性对照的溶媒(圆形)治疗的携带MC38-hPD-L1肿瘤细胞的人源化OX40和PD-L1 B6小鼠之中的抗肿瘤疗效评估。
图14显示了在用溶媒对照(圆形)、参照PD-L1抗体阿替利珠单抗(方形)和FIT1014-20a(三角形)治疗的人PD-1/PD-L1/OX40基因敲入小鼠中建立的CT26-hPD-L1同系肿瘤(syngeneic tumor)的肿瘤体积概况。箭头指示了指定药剂的施用。
发明详述
本公开涉及抗OX40抗体、抗PD-L1抗体、其抗原结合部分以及与OX40和PD-L1和靶标二者结合的多价、双特异性结合蛋白，诸如FIT-Ig。本公开的各个方面涉及抗OX40及其抗原结合片段、抗PD-L1抗体及其抗原结合片段、与人OX40和人PD-L1结合的FIT-Ig结合蛋白、其药物组合物、以及用于制备此类抗体、抗原结合片段和结合蛋白的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明还包括使用本发明的抗体、抗原结合片段和双特异性结合蛋白检测人OX40、人PD-L1或两者的方法；在体外或体内调节人OX40和/或人PD-L1活性的方法；诱导和/或增强针对外来抗原(例如肿瘤)的适应性免疫反应的方法；治疗疾病，尤其是癌症的方法，也都包含在本公开的范围之内。
定义
除非本文另有定义，否则本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外在定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的其他形式的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，否则诸如“元件”或“组成”等术语涵盖包含一个单元的元件和组成、以及包含一个以上子单元的元件和组成。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区域和结构域的氨基酸位置根据Kabat编号系统编号，所述编号系统描述在Kabat等Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中且在本文中被称为"根据Kabat编号"。具体地，Kabat等Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)描述的Kabat编号系统(参见第647-660页)用于kappa和lambda同种型的轻链恒定结构域CL，而Kabat EU索引编号系统(见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链区、CH2和CH3，在本案中通过提及"根据Kabat EU索引编号"进一步阐明)。
术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是一种蛋白质或多肽，就其起源或衍生来源而言，其与天然状态下伴随其的天然相关组分分离，基本上不含来自同一物种的其他蛋白质，由来自不同物种的细胞表达，或在自然界中不存在。化学合成的或在不同于其天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽，可以是与其天然相关组分“分离”的。还可以使用本领域公知的蛋白质纯化技术，通过分离，使蛋白质基本上不含天然相关组分。
术语“特异性的结合”或“特异性地结合”，当涉及抗体、结合蛋白、或肽与第二个化学物质的相互作用时，表示该相互作用依赖于第二个化学物质上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，但非通常的蛋白质。如果抗体对于表位“A”是特异性的，在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的，未标记的A)的分子的存在，将降低与抗体结合的标记的A的量。与本公开内容一致，特异性结合蛋白以10nM或更低的KD与相应的抗原结合，例如，1nM或更低。术语"KD"是指平衡解离常数(平衡结合常数的倒数)，在此根据本领域提供的定义来使用。抗体或结合蛋白与相应抗原结合的KD值可以通过公知的方法确定，包括但不限于荧光滴定法、竞争ELISA、量热法，如等温滴定量热法(ITC)、流式细胞仪滴定分析(FACS滴定法)、生物层干涉法(Bio-LayerInterferometry，BLI)和表面等离子体共振(BIAcore)。
术语“抗体”宽泛地指，由四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子、或保留了Ig分子的必要表位结合特征的其任何抗原结合片段、突变体、变体或衍生物。这样的突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。以下讨论了非限制性的实施方案。
在全长抗体中，每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成超可变区，称为互补决定区(CDR)，间插更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4，从氨基端排列至羧基端。VH结构域的第一、第二和第三个CDR通常记为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；同样，VL结构域的第一、第二和第三个CDR通常记为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，其可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，即，CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域，例如在IgM和IgE抗体的Fc区的情况下。IgG、IgA和IgD抗体的Fc区包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。相反，IgM和IgE抗体的Fc区缺乏铰链区，但是包含CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域。Fc部分中具有氨基酸残基替换以改变抗体效应子功能的变体Fc区是本领域已知的(参见，例如，Winter等，美国专利号5,648,260和5,624,821)。抗体的Fc部分可以介导一种或多种效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除速率。在一些情况下，这些效应子功能对于治疗性抗体是理想的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至是有害的，这取决于治疗目的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，分别通过与FcγR和补体C1q的结合来介导ADCC和CDC。在另一个实施方案中，在抗体的恒定区例如抗体的Fc区中替换至少一个氨基酸残基，从而改变抗体的效应子功能。免疫球蛋白的两条相同重链的二聚化通过CH3结构域的二聚化来介导，并且通过将CH1恒定结构域连接至Fc恒定结构域(例如CH2和CH3)的铰链区中的二硫键来稳定。IgG的抗炎活性依赖于IgG Fc片段的N-连接聚糖的唾液酸化。已经确定了抗炎活性的精确聚糖要求，从而可以产生合适的IgG1 Fc片段，由此产生具有极大增强效力的完全重组的唾液酸化IgG1 Fc(参见，Anthony等，Science，320：373-376(2008))。
术语抗体的“抗原结合部分”和“抗原结合片段”或“功能性片段”可互换使用，并且是指抗体的一个或多个片段，所述片段保留特异性地结合抗原(即，与衍生所述部分或片段的全长抗体结合相同的抗原(例如，OX40，PD-L1))的能力。已经表明，可以通过全长抗体的片段来执行抗体的抗原结合功能。这样的抗体实施方案还可以是双特异性的、双重特异的、或多特异性的格式；特异性地结合两个或更多个不同的抗原(例如OX40和不同的抗原，例如PD-L1)。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体的单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward等Nature 341:544-546(1989)，PCT公开WO 90/05144)，其包括单个可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH可以通过分开的基因编码，但也可以使用重组方法，通过人工接头将它们连接在一起，所述接头能使其作为单个蛋白质链产生，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等Science 242:423-426(1988)；和Huston等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。这样的单链抗体也旨在包括在术语抗体的“抗原结合部分”以及以上给出的等效术语内。该术语还包括其他形式的单链抗体，如双链抗体(diabody)。双链抗体可以是二价的、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短以致不允许同一链上的两个结构域之间配对，并由此迫使这些结构域分别与另一条链的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))。这样的抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dübel编辑，Antibody Engineering(Springer-Verlag，NewYork，2001)，p.790(ISBN 3-540-41354-5))。此外，单链抗体还包括包含一对串联Fv区段(VH-VH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补轻链多肽一起，形成一对抗原结合区(Zapata等，Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995)；和美国专利No.5,641,870)。
免疫球蛋白恒定区(C)结构域是指重链(CH)或轻链(CL)恒定结构域。鼠和人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。
术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能少量存在的可能天然发生的突变外，构成群的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原决定簇(表位)。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种mAb针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。
术语“人(源)序列“，就根据本申请的抗体或结合蛋白的轻链恒定结构域CL、重链恒定结构域CH和Fc区而言，意为该序列属于或来自人免疫球蛋白序列。本公开的人序列可以是天然的人序列，或其包括一个或多个(例如，多达20、15、10)氨基酸残基的变化的变体。
术语“嵌合抗体”是指包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一个物种的恒定区序列的抗体，如具有连接人恒定区的小鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语“CDR-移植的抗体”是指包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列被另一个物种的CDR序列替换，如具有人重链和轻链可变区的抗体，其中一个或多个人CDR已经被鼠CDR序列替代。
术语“人源化抗体”是指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL序列的至少一部分已被改变为更像“人”的，即更类似于人类种系可变序列。一种类型的人源化抗体是CDR-移植的抗体，其中将来自非人物种(例如小鼠)的CDR序列引入人VH和VL框架序列中。人源化抗体是免疫特异性地结合目标抗原的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其中所述抗体包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架区和恒定区但具有基本上是非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如本文所用，术语“基本上”就CDR而言是指与非人抗体CDR的氨基酸序列至少具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包含至少一个并且通常是两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的，并且所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的。在一个实施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，所述免疫球蛋白恒定区通常是人免疫球蛋白的。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在具体的实施方案中，人源化抗体仅含有轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。
人源化抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可包含来自一种以上类别或同种型的序列，并且可使用本领域公知的技术，选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架和CDR区不需要与亲本序列精确对应，例如，可以通过至少一个氨基酸残基的置换、插入和/或缺失来诱变供体抗体CDR或受体框架，使得该位点的CDR或框架残基与供体抗体或共有框架不对应。然而，在一个示例性实施方案中，此类突变不会是大量的。通常，人源化抗体残基的至少80％，至少85％，至少90％，或至少95％将对应于亲本FR和CDR序列。在特定框架位置的回复突变以恢复为出现在供体抗体中该位置的相同氨基酸，通常可以用于保留特定的环结构或正确定向CDR序列以与靶抗原接触。
术语“CDR”指抗体可变域序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR，其被称为CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。如本文所用的术语“CDR组”是指在能够结合抗原的单个可变区中出现的三个CDR的组。这些CDR的确切边界已被不同地定义在以下不同的系统中。Kabat描述的系统(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Maryland(1991)))不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供了定义三个CDR的精确残基边界。
在过去的二十年中，可变重链和轻链区氨基酸序列广泛的公共数据库的增长和分析，使得人们了解了可变区序列内框架区(FR)和CDR序列之间的典型边界，并使得本领域技术人员能够根据Kabat编号、Chothia编号或其他系统准确确定CDR。参见，例如，Martin,"Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,"Kontermann and Dübel,eds.,Antibody Engineering(Springer-Verlag,Berlin,2001)，第31章，第432-433页。
术语“多价结合蛋白”表示包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白在某些情况下被工程化为具有三个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然存在的抗体。
术语“双特异性结合蛋白”(可与术语“双特异性抗体”互换使用，除非另有说明)是指能够结合两个不同特异性靶标的结合蛋白。本公开的FIT-Ig结合蛋白包含四个抗原结合位点，并且通常是四价结合蛋白。根据本公开的FIT-Ig结合OX40和PD-L1两者，并且是双特异性的。
包含两条长(重)V-C-V-C-Fc链多肽和四条短(轻)V-C链多肽的FIT-Ig结合蛋白形成具有四个Fab抗原结合位点的六聚体(VH-CH1与VL-CL配对，有时称为VH-CH1::VL-CL)。FIT-Ig的每一半均包含一个重链多肽和两个轻链多肽，并且三条链的VH-CH1和VL-CL元件的互补免疫球蛋白配对产生两个Fab结构的抗原结合位点，其串联排列。在本公开中，优选地包含Fab元件的免疫球蛋白结构域直接融合在重链多肽中，而不使用结构域间接头。即，长(重)多肽链的N末端V-C元件在其C末端直接融合至另一V-C元件的N末端，后者又与C末端Fc区连接。在双特异性FIT-Ig结合蛋白中，串联Fab元件可与不同的抗原反应。每个Fab抗原结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，每个抗原结合位点总共有六个CDR。
在PCT公开WO2015/103072中提供了对FIT-Ig分子的设计、表达和表征的描述。这种FIT-Ig分子的优选示例包括一条重链和两条不同的轻链。重链包含结构式VLA-CL-VHB-CH1-Fc，其中CL直接与VHB融合，(即"Format LH")或VHB-CH1-VLA-CL-Fc，其中CH1直接与VLA(即"Format HL")融合，而FIT-Ig的两条轻多肽链相应地分别具有结构式VHA-CH1和VLB-CL；或者，重链包含结构式VLB-CL-VHA-CH1-Fc，其中CL直接与VHA融合(对于"Format LH")或VHA-CH1-VLB-CL-Fc，其中CH1直接与VLB融合(对于"Format HL")，并且FIT-Ig的两条轻多肽链相应地分别具有结构式VLA-CL和VHB-CH1。其中，VLA是来自结合抗原A的亲本抗体的可变轻链结构域，VLB是来自结合抗原B的亲本抗体的可变轻域，VHA是来自结合抗原A的亲本抗体的可变重域，VHB是来自结合抗原B的亲本抗体的可变重链结构域，CL是轻链恒定结构域，CH1是重链恒定结构域，而Fc是免疫球蛋白Fc区(例如，IgG1抗体重链的C末端铰链-CH2-CH3部分)。在双特异性FIT-Ig的实施方案中，抗原A和抗原B是不同的抗原、或相同抗原的不同表位。在本公开中，A和B中的一个是OX40，另一个是PD-L1，例如，A是OX40，B是PD-L1。
如本文中使用的，术语“kon”(也称为“Kon”，“kon”)意指结合蛋白(例如，抗体)与抗原结合形成如本领域已知的结合复合物(例如，抗体/抗原复合物)的结合速率常数。“kon”也称为术语“缔合速率常数”或“ka”，如本文中可互换使用的。该值表示抗体与其靶抗原的结合速率或抗体与抗原之间的复合物形成速率，如下式所示：
抗体(“Ab”)+抗原(“Ag”)→Ab-Ag。
如本文所用，术语“koff”(也称为“Koff”，“koff”)意指，如本领域已知的，结合蛋白(例如，抗体)从结合复合物(例如，抗体/抗原复合物)解离的速率常数、或“解离速率常数”。该值表示抗体从其靶抗原的解离速率、或Ab-Ag复合物随时间分离成游离抗体和抗原的速率，如下式所示：
Ab+Ag←Ab-Ag。
如本文中使用的，术语“KD”(也为“Kd”)旨在表示“平衡解离常数”，并且是指在平衡时滴定测量中获得的值，或者通过解离速率常数(koff)除以结合速率常数(kon)而获得的值。结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和平衡解离常数(KD)用于表示抗体与抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法是本领域公知的。可以使用基于荧光的技术，提供高灵敏度以及在平衡状态下生理缓冲液中检查样品的能力。可以使用其他实验方法和仪器，例如(生物分子相互作用分析)测定法(例如，可从BIAcore InternationalAB，GE Healthcare公司，Uppsala，Sweden获得的仪器)。使用例如/>RED96系统(PallFortéBio LLC)的生物膜干涉(BLI)是另一种亲和力测定技术。另外，还可以使用获自Sapidyne Instruments(Boise，Idaho)的/>(动力学排除测定)试验。
术语“分离的核酸”指这样的(例如，基因组的、cDNA或合成来源的，或其某些组合)多核苷酸，其中所述多核苷酸通过人为干预而与在自然界与其相关的全部或部分多核苷酸分开；可操作地连接天然与其不相连的多核苷酸；或是以在自然界中不存在的更大序列的一部分出现。
如本文中使用的，术语“载体”意指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接另外的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时整合至宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本公开旨在包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们起到等效的作用。
术语“可操作地连接”是指并置，其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以这样的方式连接，即所述方式将使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列、以及以反式或远距离起作用的方式控制目的基因的表达控制序列。如本文所用的术语“表达控制序列”是指影响与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始序列、终止序列、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接和多腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白质分泌的序列。这些控制序列的性质根据宿主生物而不同；在原核生物中，这种控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，通常，这种控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达和加工而言是必不可少的组分，并且还可以包括其存在是有利的其他组分，例如前导序列和融合伴侣序列。
如本文所用的“转化”是指外源DNA进入宿主细胞的任何过程。可以使用本领域公知的各种方法在天然或人工条件下进行转化。转化可依赖于任何已知的方法将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞中。基于待转化的宿主细胞选择该方法，并且可以包括，但不限于，转染、病毒感染、电穿孔、脂质转染和粒子轰击。这种“转化的”细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分复制。也包括在有限时间内瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。
术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意指其中已引入外源DNA的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞包含编码抗体的两个或更多个(例如，多个)核酸，例如，如美国专利号7,262,028中描述的宿主细胞。这些术语不仅旨在指特定的主题细胞，还指这种细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这些后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞包括选自任何生命界的原核和真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌(Escherichia coli)；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293、Jurkat、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
如本文中使用的，术语“有效量”是指治疗量，所述量足以降低或改善病症的严重性和/或持续时间或其一种或多种症状；防止疾病的进展；导致疾病消退；预防与疾病相关的一种或多种症状的复发、发展或进展；检测疾病；或增强或改善另一种疗法(例如预防剂或治疗剂)的预防或治疗效果。
如本文所用，"T细胞的活化"或"T细胞活化"是指细胞介导的免疫的核心过程，其中特定的外来抗原诱导同源的初始T细胞对其作出响应。T细胞活化，其反映在T细胞的增殖和/或分化以及大量效应T细胞(例如，诸如细胞毒性T淋巴细胞)的产生，可以引起例如外来抗原的减少或消除。这个过程是复杂的，受许多因素的调节，例如，免疫抑制性肿瘤微环境。可以测量该过程的T细胞活化的迹象包括但不限于：T细胞分泌的IL-2或IFN-γ显著增加，和/或抗原应答增加(如肿瘤清除)。测量的方法是本领域技术人员已知的。
根据本公开内容的抗体、其抗原结合片段和结合蛋白可以通过使用本领域可用于纯化抗体和结合蛋白的多种方法和材料中的一种或多种来纯化(用于预定用途)。此类方法和材料包括但不限于亲和层析(例如，使用与蛋白A、蛋白G、蛋白L或抗体的特定配体、其功能片段或结合蛋白缀合的树脂、颗粒或膜)、离子交换层析(例如，使用离子交换颗粒或膜)、疏水相互作用层析(“HIC”；例如，使用疏水性颗粒或膜)、超滤、纳米过滤、渗滤、尺寸排阻层析(“SEC”)、低pH处理(以灭活污染的病毒)及其组合，以获得预期用途可接受的纯度。用于灭活污染的病毒的低pH值处理的非限制性实例包括在18℃-25℃下，用0.5M磷酸将包含本发明的抗体、其功能片段或结合蛋白的溶液或悬浮液的pH值降低至pH3.5，持续60至70分钟。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书、或者按照本领域通常实施的方式或如本文所述的方式进行。前述技术和程序通常可以根据本领域公知的常规方法进行，这些方法也描述在本说明书通篇引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版。(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
抗OX40和抗PD-L1单特异性抗体
本公开的抗OX40和抗PD-L1抗体可以通过本领域中已知的任何数量的技术来生产。参见，例如，WO2021/1034434，其内容在此通过参考而纳入。例如，从宿主细胞表达，其中将编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体是可能的，但特别考虑在真核细胞中表达抗体，例如在哺乳动物宿主细胞中，因为这种真核细胞(例如，哺乳动物细胞)更可能比原核细胞组装和分泌正确折叠和免疫活性的抗体。
在一些实施方案中，用于表达本公开的重组抗体的哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216-4220(1980)，与DHFR选择标记一起使用，例如，如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.，159：601-621(1982)中所述)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达的一段时间来产生抗体，或使抗体进一步分泌到宿主细胞生长的培养基中从而产生抗体。可以用标准的蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
宿主细胞也可用于生产抗原结合片段，如Fab片段或scFv分子。可以理解的是，上述程序的变化是在本公开的范围内。例如，可能需要用编码本公开的抗体的轻链和/或重链的抗原结合片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于除去编码轻链和重链之一或两者的DNA中的一些或全部，这些DNA对于结合目标抗原不是必需的。由这种截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体中。此外，双功能抗体可以通过标准的化学交联方法将本公开的抗体与第二种抗体或另一种功能分子交联而产生。
在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的一个示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已经转染了载体的CHO细胞。培养选择的转染宿主细胞以允许抗体重链和轻链的表达，并从培养基中收集完整的抗体。可以将标准分子生物学技术用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转染体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。本公开还提供了一种制作重组抗OX40或抗PD-L1抗体的方法，通过在适当的培养基中培养本公开的转染的宿主细胞直至产生本公开的重组抗体。可选地，该方法进一步包括从培养基中分离重组抗体。
抗OX40抗体
在一些实施方案中，本公开内容提供了在OX40 Ig样结构域的膜近端CRD处与OX40结合的抗体。在一些实施方案中，本文公开的抗体具有高的细胞结合效力，和/或以低内化率为特征，例如，如在基于细胞的测定中测量的。
在一些实施方案中，本公开内容公开了一种特异性地与OX40结合的分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，所述抗OX40抗体或其抗原结合片段包含一组六个CDR，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中。
-CDR-H1包含SSWMN(SEQ ID NO:1)的序列。
-CDR-H2包含RIYPGDEITNYNGKFKD(SEQ ID NO:2)或RIYPGDEITNYNAKFKD(SEQ IDNO:4)的序列。
-CDR-H3包含DLLMPY的序列(SEQ ID NO:3)。
-CDR-L1包含RSSKSLLYSNGITYLY(SEQ ID NO:5)或RSSKSLLYSNAITYLY(SEQ ID NO:8)的序列。
-CDR-L2包含QMSNLAP(SEQ ID NO:6)的序列；以及
-CDR-L3包含AQNLELPFT(SEQ ID NO:7)的序列。
其中，CDR是根据Kabat编号来定义的。
在一些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合片段在根据Kabat编号的H31-H35、H50-H66和H99-H104位置包含选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列：(i)SEQID NO：1，2，3；或(ii)SEQ ID NO：1，4，3。
在一个实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合片段对于CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3在根据Kabat编号的L24-39、L55-61和L94-102位置分别包含SEQ ID NO：5、6和7或SEQ IDNO：8、6和7的氨基酸序列。
在某些实施方案中，根据Kabat编号，抗OX40抗体或其抗原结合片段包括VH结构域的G62A突变。在某些实施方案中，根据Kabat编号，抗OX40抗体或其抗原结合片段包括VL结构域中的G34A突变。在某些实施方案中，突变降低了抗OX40抗体或其抗原结合片段中天冬酰胺脱氨基化的倾向。在一些实施方案中，具有突变的抗OX40抗体或其抗原结合片段相对于没有突变的亲本抗体具有更高的稳定性。
在一些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1-3和5-7的CDR序列中的至少一个、两个、三个、四个，但不超过五个残基修饰。在一些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1、4、3和5-7的CDR序列中的至少一个、两个、三个、四个，但不超过五个残基修饰。在一些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1-3和8，6，7的CDR序列中的至少一个，两个，三个，四个，但不超过五个残基修饰。在一些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1、4、3和8、6、7的CDR序列中的至少一个、两个、三个、四个，但不超过五个残基修饰。氨基酸修饰可以是氨基酸的取代、缺失和/或添加，例如，保守性取代。
在一个实施方案中，根据本公开的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述VH和VL选自包含以下VH/VL序列对的组。SEQ ID NO:11/19,12/19,13/19,14/19,11/20,12/20,13/20,14/20,10/17,9/18,10/18,9/19,11/17,15/21,15/18,16/21和16/18。本领域技术人员可以使用最广泛的CDR定义方案，例如Kabat、Chothia或IMGT定义，来确定CDR。
在一个实施方案中，根据本公开的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL，其中：
-所述VH结构域包含SEQ ID NO:9或10的序列，或与之具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列，和/或
-所述VL结构域包含SEQ ID NO:17或18的序列，或与之具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列。
在另一个实施方案中，根据本公开的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL，其中：
-所述VH结构域包含选自SEQ ID NO:11-16的序列，或与之具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列，和/或
-所述VL结构域包含选自SEQ ID NO:19-21的序列，或与之具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列。
在一些实施方案中，抗OX40抗体包含如下的VH序列：相对于参考序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，含有取代(例如，保守性取代)、添加或缺失，同时保留以相同或改进的结合特性与OX40结合的能力，诸如解离速率和/或结合速率。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:9、10或SEQ ID NO:11-16中的任何一个中共计取代、添加和/或缺失了1至11个氨基酸。在某些实施方案中，取代、添加或缺失发生在CDR以外的区域(即在FR中)。任选地，抗OX40抗体包含SEQ ID NO:9、10或SEQ ID NO:11-16中的任何一个的VH序列，包含该序列的翻译后修饰。在一个特定的实施方案中，VH包含一个、两个或三个CDR，选自：(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1，(b)包含SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，VH序列是人源化VH序列。
在一些实施方案中，抗OX40抗体包含如下的VL序列：相对于参考序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，含有取代(例如，保守性取代)、添加或缺失，同时保留以相同或改进的结合特性与OX40结合的能力，诸如解离速率和/或结合速率。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：17、18或SEQ ID NO：19-21中的任何一个中共计取代、添加和/或缺失了1至5个氨基酸。在某些实施方案中，取代、添加或缺失发生在CDR以外的区域(即在FR中)。任选地，抗OX40抗体包含SEQ ID NO:17、18或SEQID NO：19-21中的任何一个的VL序列，包含该序列的翻译后修饰。在一个特定的实施方案中，VL序列包含一个、两个或三个CDR，选自：(a)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1，(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L2，和(c)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VL序列是人源化VL序列。
在一个实施方案中，根据本公开的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQID NO：16或由其组成的重链可变结构域VH，和包含SEQ ID NO：21或由其组成的轻链可变结构域VL。
在一个实施方案中，根据本公开的分离的抗OX40抗体或抗原结合片段是嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，抗OX40抗体或抗原结合片段是人源化抗体。
在一些实施方案中，根据本公开的人源化分离的抗OX40抗体或抗原结合片段包含在框架区域的位置上的一个或多个回复突变以改善结合特性。在一些实施方案中，根据本公开的人源化抗OX40抗体或抗原结合片段的VH结构域包含从人源到如下残基的回复突变：根据Kabat编号，第1位的Glu(1E)，以及可选的第5位的Gln(5Q)，第27位的His(27H)，第28位的Ala(28A)，第38位的Lys(38K)，第40位的Arg(40R)，第43位的Lys(43K)，第48位的Ile(48I)，第67位的Lys(67K)，第68位的Ala(68A)，和第70位的Leu(70L)的一个或多个。在一个实施方案中，根据本公开的人源化抗OX40抗体或抗原结合片段的VL结构域可选地包含从人源到如下残基的回复突变：根据Kabat编号，在第69位的Ser(69S)。
在一个实施方案中，根据本公开的分离的抗OX40抗体或抗原结合片段是在VH结构域中包含选自以下组的回复突变的氨基酸残基：(i)1E，(ii)1E和27H，(iii)1E、27H、48I和70L，(iv)1E、27H、38K、43K、48I、67K和70L，(v)1E、40R和43K，(vi)1E、5Q、27H、28A、38K、40R、43K、48I、67K、68A和70L，皆根据Kabat编号；和/或在VL结构域中包含根据Kabat编号的69S的回复突变的氨基酸残基的人源化抗体。
在一个实施方案中，根据本公开的分离的抗OX40抗体或抗原结合片段是在VH结构域中根据Kabat编号包含氨基酸残基1E,5Q,27H,28A,38K,40R,43K,48I,67K,68A,和70L，以及在VL结构域中根据Kabat编号包含氨基酸残基69S的人源化抗体。在另一个实施方案中，根据本公开的分离的抗OX40抗体或抗原结合片段进一步包含根据Kabat编号的VH结构域中的G62A突变和根据Kabat编号的VL结构域中的G34A突变。
在一些实施方案中，根据本公开的分离的抗OX40抗体或抗原结合片段包含选自以下组的VH和VL序列的组合。
在一些实施方案中，该抗体包含：包含SEQ ID NO:16的序列或由其组成的VH结构域，和包含SEQ ID NO:21的序列或由其组成的VL结构域。
在根据本公开的抗OX40抗体或抗原结合片段的一些实施方案中，该抗体或抗原结合片段包含Fc区，其可以是天然的或变体Fc区。在特定的实施方案中，Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的人Fc区。根据抗体的效用，可能需要使用变体Fc区来改变(例如，减少或消除)至少一种效应子功能，例如，ADCC和/或CDC。在一些实施方案中，本发明提供了一种抗OX40抗体或抗原结合片段，其包含具有一个或多个突变以改变至少一种效应子功能的Fc区，例如，L234A和L235A。
在一些实施方案中，根据本公开的抗OX40抗体的抗原结合片段可以是，例如Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体(diabody)；线性抗体；或单链抗体分子(例如scFv)。
在一个实施方案中，本文所描述的抗OX40抗体或其抗原结合片段与OX40胞外结构域或其一部分结合。在一些实施方案中，OX40胞外结构域包含UniProt Identifier P43489下的人OX40蛋白的氨基酸序列L29-A214，或SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或与之具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列：
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO:44)
在一个实施方案中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段在OX40胞外结构域的CRD3区域与OX40结合。
在一个实施方案中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段对人类OX40的结合速率常数(kon)至少为1×104M-1s-1，至少3×104M-1s-1，至少5×104M-1s-1，至少7×104M-1s-1，至少9×104M-1s-1，至少1×105M-1s-1，如通过生物层干涉法或表面等离子体共振测定的。
在另一个实施方案中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段-4对人类OX40的解离速率常数(koff)小于5×10-3s-1、小于3×10-3s-1、小于2×10-3s-1、小于1×10-3s-1、小于9×10-4s-1、小于6×10-4s-1、小于3×10-4s-1、小于2.5×10-4s-1、小于2×10-4s-1、小于1×10-4s-1、小于8×10-5s-1、小于5×10-5s-1，如通过表面等离子体共振或生物层干涉法测定的。在另一个实施方案中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，且对人OX40的koff约为具有SEQ ID NO：9/10和17/18的VH和VL序列对的抗体在相同抗体格式下对人OX40的koff值的50-500％，例如约80-150％。一般而言，长时间的解离速率与形成的复合物的缓慢解离有关，而短时间的解离速率则与快速解离有关。在一个实施方案中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段对目标OX40的亲和力高于WO2015153513中所述的1A7.gr.1的亲和力，如更低的解离速率所示。
在一个实施方案中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段对OX40的解离常数(KD)在纳摩尔至皮摩尔(10-8至10-10)范围内，例如，小于8×10-8M、小于5×10-8M、小于3×10-8M、小于1×10-8M、小于8×10-9M、小于5×10-9M、小于3×10-9M、小于2×10-9M、小于1×10-9M、小于8×10-10M、小于6×10-10M、小于4×10-10M、小于2×10-10M、或小于1×10-10M。
在一个实施方案中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段特异性地与OX40+靶细胞上展示的OX40结合，例如表达OX40的CHO细胞系或T细胞系(例如原代T细胞和Jurkat)。如通过流式细胞仪在基于细胞的检测中测量，抗OX40抗体对OX40+细胞显示出强大的结合效力，其中所述细胞结合效力由约5nM或更低、4nM或更低、3nM或更低、2nM或更低、1nM或更低的EC50反映。在另一个实施方案中，EC50为0.5nM或更低。在一些实施方案中，与具有SEQ ID NO：9/10和17/18的VH和VL序列对的抗体相比，本文所述的抗OX40抗体或抗原结合片段对显示在靶细胞上的OX40显示类似或更高的结合效力。在一个实施方案中，抗体对OX40表达细胞的结合效力是在实施例1.2所述的基于细胞的检测中测量的。在一些实施方案中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段与OX40的结合效力达到上述的结合效力，足以在体内或体外诱发细胞效应。在另一个实施方案中，所述效应是T细胞的活化和/或增殖。
在一个实施方案中，所述抗体可以像其配体OX40L在表达OX40的细胞表面那样结合OX40。在另一个实施方案中，所述抗体可用于增强OX40/OX40L信号传导。在另一个实施方案中，所述抗体可用于诱导和/或增强与OX40/OX40L途径相关的T细胞活化和增殖。
抗PD-L1抗体
本公开还提供了能够结合人类PD-L1的抗体。
在一些实施方案中，根据本公开的抗PD-L1抗体包含：一组六个CDR，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中。
CDR-H1包含TYGIN(SEQ ID NO:22)的序列；
CDR-H2包含YIYIGNAYTEYNEKFKG(SEQ ID NO:23)或YIYIGNGYTEYNEKFKG(SEQ IDNO:25)的序列；
CDR-H3包含DLMVIAPKTMDY的序列(SEQ ID NO:24)；
CDR-L1包含KASQDVGTAVA的序列(SEQ ID NO:26)；
CDR-L2包含WASTRHT(SEQ ID NO:27)的序列；和
CDR-L3包含QQYSSYPYT的序列(SEQ ID NO:28)；
其中，CDR是根据Kabat编号来定义的。
在一些实施方案中，根据本申请的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：
-包含SEQ ID NO：29、30或31的序列或与之具有至少80％-90％或95％-99％同一性的序列的VH结构域，和/或
-包含SEQ ID NO：32、33或34的序列或与之具有至少80％-90％，或95％-99％同一性的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:31序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:34序列的VL结构域。
在一些实施方案中，根据本公开的抗OX40抗体或根据本公开的抗PD-L1抗体可用于通过本领域确立已久的技术制造识别相同目标抗原的衍生结合蛋白。此类衍生物可以是，例如，单链抗体(scFv)、Fab片段(Fab)、Fab'片段、F(ab')2、Fv和二硫键连接的Fv。此类衍生物可以是，例如，包含根据本公开的抗OX40抗体或根据本公开的抗PD-L1抗体的融合蛋白或缀合物。融合蛋白可以是多特异性抗体或CAR分子。所述缀合物可以是抗体-药物缀合物(ADC)，或与检测剂(诸如放射性同位素)缀合的抗体。
在一个实施方案中，本文所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段对PD-L1，如人PD-L1的解离常数(KD)为亚纳摩尔水平，例如，小于1×10-9M，小于8×10-10M，小于6×10-10M，小于4×10-10M，小于3×10-10M。在一个实施方案中，本文所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段与PD-L1+目标细胞上展示的PD-L1特异性结合。如通过流式细胞术、生物层干涉法和/或表面等离子体共振所测量的，抗PD-L1抗体对PD-L1+细胞显示出强大的结合效力。根据FACS结合的EC50和/或BLI或BIAcore的KD，所述细胞对人PD-L1的结合效力与对食蟹猴PD-L1的结合效力相似，例如，<5倍的差异或<3倍的差异。
OX40xPD-L1双特异性结合蛋白
在另一个方面，本公开内容提供了OX40/PD-L1双特异性结合蛋白，特别是Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)，其能够与OX40和PD-L1两者结合。FIT-Ig中的每个可变结构域(VH或VL)可以从一个或多个结合目标抗原即OX40或PD-L1之一的"亲本"单克隆抗体获得。FIT-Ig结合蛋白可使用本文所公开的抗OX40和抗PD-L1单克隆抗体(例如人源化抗OX40和人源化抗PD-L1亲本抗体)的可变结构域序列来生产。
本公开的一个方面涉及选择具有FIT-Ig分子中所需要的至少一种或多种特性的亲本抗体。在一个实施方案中，抗体特性选自抗原特异性、与抗原的亲和力、解离速率、细胞结合效能、生物功能、表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性、直系同源抗原结合，等等。
在一些实施方案中，根据本公开的双特异性FIT-Ig蛋白被配置为没有任何结构域间肽接头。而在具有串联结合位点的多价工程免疫球蛋白格式中，本领域通常认为，除非使用柔性接头在空间上隔开结合位点，否则相邻的结合位点会相互干扰。然而，对于本公开的OX40/PD-L1 FIT-Ig来说，已经发现根据本文公开的链式排列的免疫球蛋白结构域使得多肽链在转染的哺乳动物细胞中表达良好，组装恰当，并作为结合目标抗原OX40和PD-L1的、完整的双特异性、多价免疫球蛋白样的结合蛋白被分泌。参见下文的实施例。此外，省略结合蛋白中的合成接头序列可以避免产生哺乳动物免疫系统可识别的抗原位点，以这种方式消除接头降低了FIT-Ig可能的免疫原性，并导致其在循环中的半衰期与天然抗体一样。
在一些实施方案中，根据本申请的OX40 x PD-L1双特异性结合蛋白包含：
a)特异性地结合OX40的第一抗原结合位点；和
b)特异性地结合PD-L1的第二抗原结合位点。
在一个实施方案中，如本文所描述的双特异性结合蛋白包含一组六个CDR，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，它们来源于根据本申请和本文所描述的任何抗OX40抗体或其抗原结合片段，以形成双特异性结合蛋白的OX40结合位点。在一些进一步的实施方案中，本文所述的双特异性结合蛋白包含源自根据本申请和本文所描述的任何抗OX40抗体或其抗原结合片段的VH/VL对，以形成双特异性结合蛋白的OX40结合位点。
在一个实施方案中，如本文所述的双特异性结合蛋白进一步包括一组六个CDR，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，它们来源于根据本申请和本文所描述的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，以形成双特异性结合蛋白的PD-L1结合位点。在一些进一步的实施方案中，本文所述的双特异性结合蛋白包括源自根据本申请和本文所描述的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的VH/VL对，以形成双特异性结合蛋白的PD-L1结合位点。
在一个实施方案中，根据本申请的双特异性OX40/PD-L1结合蛋白中的OX40结合位点和PD-L1结合位点是人源化的，分别包含人源化的VH/VL序列。
双特异性FIT-Ig结合蛋白
在一个实施方案中，根据本申请的OX40 x PD-L1双特异性结合蛋白是一种能够结合OX40和PD-L1双特异性FIT-Ig结合蛋白。Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)结合蛋白是一种双特异性、四价的结合蛋白，其包含六条多肽链，并具有四个功能性Fab结合区，有两个外Fab结合区和两个内Fab结合区。该结合蛋白采用(外Fab-内Fab-Fc)x2的格式，结合抗原A和抗原B两者。在一个方面，根据本申请的OX40 x PD-L1双特异性结合蛋白是双特异性FIT-Ig结合蛋白，其中FIT-Ig蛋白的两个Fab结构域赋予特异性结合OX40的第一抗原结合位点；而FIT-Ig蛋白的另外两个Fab结构域赋予特异性结合PD-L1的第二抗原结合位点。在一些实施方案中，根据本公开的FIT-Ig结合蛋白在免疫球蛋白结构域之间没有采用接头。
在一个实施方案中，结合蛋白包含从氨基到羧基末端包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc或VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，从氨基到羧基末端包含VHA-CH1的第二多肽，和从氨基到羧基末端包括VLB-CL的第三多肽。或者，结合蛋白包含从氨基到羧基端包含VLB-CL-VHA-CH1-Fc或VHA-CH1-VLB-CL-Fc的第一多肽，从氨基到羧基端包含VHB-CH1的第二多肽，和从氨基到羧基端包含VLA-CL的第三多肽，其中VL代表轻链可变结构域，CL代表轻链恒定结构域，VH代表重链可变结构域，CH1代表重链的第一个恒定结构域，A代表OX40，B代表PD-L1。每个双特异性结合蛋白是一个六聚体，包含两个所述的第一多肽、两个所述的第二多肽和两个所述的第三多肽，表现出四个Fab抗原结合位点，两个用于结合OX40(VHA-CH1与VLA-CL配对，标注VHA-CH1::VLA-CL)和两个用于结合PD-L1(VHB-CH1与VLB-CL配对，标注VHB-CH1::VLB-CL)。
在一些实施方案中，由FIT-Ig结合蛋白中的VL-CL与VH-CH1配对形成的结合OX40的Fab(例如，当A是OX40时，由VLA-CL和VHA-CH1形成。或当B是OX40时，由VLB-CL和VHB-CH1形成)包括一组六个CDR，即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，根据本申请并在此描述的任何抗OX40抗体或其抗原结合片段衍生，形成双特异性结合蛋白的OX40结合位点。在一些进一步的实施方案中，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分别包含SEQ ID NO:1、2、3和5、6、7的序列；SEQ ID NO:1、4、3和5、6、7的序列；SEQ ID NO:1、2、3和8、6、7的序列；或SEQ ID NO:1、4、3和8、6、7的序列。
在一些实施方案中，FIT-Ig结合蛋白中与OX40结合的Fab包含根据本申请和本文所述的任何抗OX40抗体或其抗原结合片段衍生的VH/VL对。在一些进一步的实施方案中，该VH/VL对包含选自以下的VH/VL序列对的序列：SEQ ID NO：11/19、12/19、13/19、14/19、11/20、12/20、13/20、14/20、10/17、9/18、10/18、9/19、11/17、15/21、15/18、16/21和16/18，或与之具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，FIT-Ig结合蛋白中结合OX40的Fab包含SEQ ID NO:16的VH序列和SEQ ID NO:21的VL序列。
在一些实施方案中，由FIT-Ig结合蛋白中的VL-CL与VH-CH1配对形成的结合PD-L1的Fab(例如，当A是PD-L1时，由VLA-CL和VHA-CH1形成。或当B是PD-L1时，由VLB-CL和VHB-CH1形成)包含一组六个CDR，即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，根据本申请和本文所述的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合片段衍生，形成双特异性结合蛋白的PD-L1结合位点。在一些实施方案中，由FIT-Ig结合蛋白中的VL-CL与VH-CH1配对形成的结合PD-L1的Fab包含一组六个CDR，其中CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分别包含SEQ ID NO:22、23、24和26、27、28的序列；或SEQ ID NO:22、25、24和26、27、28的序列。在一些进一步的实施方案中，结合PD-L1的Fab包含：包含SEQ ID NO：31和34的序列的VH/VL对，或与之具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。
在本公开中，OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白包含第一、第二和第三多肽链，其中第一多肽链从氨基到羧基端包含VLOX40-CL-VHPD-L1-CH1-Fc，且CL直接融合到VHPD-L1，或VHPD-L1-CH1-VLOX40-CL-Fc，且CH1直接融合到VLOX40；其中第二多肽链从氨基到羧基端包含VHOX40-CH1；其中第三多肽链从氨基到羧基端包含：VLPD-L1-CL。在另一个实施方案中，OX40/PD-L1FIT-Ig结合蛋白包含第一、第二和第三多肽链，其中第一多肽链从氨基到羧基端包括VHOX40-CH1-VLPD-L1-CL-Fc，且CH1直接融合到VLPD-L1，或VLPD-L1-CL-VHOX40-CH1-Fc，且CL直接融合到VHOX40；其中第二多肽链从氨基到羧基端包含VHPD-L1-CH1；以及其中第三多肽链从氨基到羧基端包含VLOX40-CL。在一些实施方案中，VLOX40是抗OX40抗体的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VHOX40是抗OX40抗体的重链可变结构域，CH1是重链恒定结构域，VLPD-L1是抗PD-L1抗体的轻链可变结构域，VHPD-L1是抗PD-L1抗体的重链可变结构；并且任选地，结构域VLPD-L1-CL与抗PD-L1亲本抗体的轻链相同，结构域VHPD-L1-CH1与抗PD-L1亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域相同，结构域VLOX40-CL与抗OX40亲本抗体的轻链相同，结构域VHOX40-CH1与抗OX40亲本抗体的重链可变结构域和重链恒定结构相同。
在一个实施方案中，VHOX40-CH1包括与SEQ ID NO:38至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：
SEQ ID NO:38:
EVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGHAFSSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDEITNYNAKFKDKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDLLMPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
在一个实施方案中，VLOX40-CL包含与SEQ ID NO:37至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：
SEQ ID NO:37:
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYSNAITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLAPGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一个实施方案中，VHPDL1-CH1包含与SEQ ID NO:36至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：
SEQ ID NO:36:
EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGINWVRQAPGQGLEWMGYIYIGNAYTEYNEKFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDLMVIAPKTMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
在一个实施方案中，VLPDL1-CL包含与SEQ ID NO:39至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：
SEQ ID NO:39:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在上述FIT-Ig结合蛋白的结构式中，Fc区是来自IgG1的人Fc区，其至少有一种减少或消除的Fc效应子功能(例如Fc与FcγR的结合、ADCC和/或CDC)，例如，通过引入LALA突变(Leu234到Ala234，Leu235到Ala235，根据EU编号系统)。在另一个实施方案中，Fc区的氨基酸序列与SEQ ID NO：40至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％相同。在一个实施方案中，Fc区的氨基酸序列进一步包含三联突变M252Y/S254T/T256E(YTE，根据EU编号系统进行编号)。在另一个实施方案中，Fc区的氨基酸序列与SEQ ID NO：41至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同。
SEQ ID NO:40:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:41:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在一个实施方案中，本公开的FIT-Ig结合蛋白保留了亲本抗体的一个或多个特性。在一些实施方案中，FIT-Ig对目标抗原(即PD-L1和OX40)的结合亲和力与亲本抗体相当，这意味着FIT-Ig结合蛋白对OX40和PD-L1抗原目标的结合亲和力与亲本抗体对其各自目标抗原的结合亲和力相比，变化不超过10倍，如通过表面等离子体共振或生物层干涉法所测量的。
在一个实施方案中，本公开的FIT-Ig结合蛋白与OX40和PD-L1结合，并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链，其中：
-第一多肽链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或与之具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
-第二多肽链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，或与之有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，以及
-第三多肽链包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或与之具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一个实施方案中，本公开的FIT-Ig结合蛋白与OX40和PD-L1结合，并包含：包含SEQ ID NO:35的序列、由SEQ ID NO:35的序列组成、或基本上由SEQ ID NO:35的序列组成的第一多肽链；包含SEQ ID NO:36的序列、由SEQ ID NO:36的序列组成、或基本上由SEQ IDNO:36的序列组成的第二多肽链；以及包含SEQ ID NO:37的序列、由SEQ ID NO:37的序列组成、或基本上由SEQ ID NO:37的序列组成的第三多肽链。
双特异性结合蛋白的特性
在一个实施方案中，本文所描述的能够结合PD-L1和OX40两者的双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白包含人源化OX40结合位点，或嵌合OX40结合位点，例如，人源化OX40结合位点。在一个实施方案中，相对于相同的FIT-Ig格式中的嵌合OX40结合位点(由SEQ IDNO:10和18的VH和VL对组成)，FIT-Ig蛋白格式中的人源化OX40结合位点具有更慢的OX40结合的解离速度。在一个进一步的实施方案中，人源化OX40结合位点相对于嵌合OX40结合位点的解离速率比小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％，如通过表面等离子体共振或生物层干涉法所测量的。在一个实施方案中，本文所述的FIT-Ig结合蛋白的OX40的解离速率小于5×10-3s-1、小于3×10-3s-1、小于2×10-3s-1、小于1×10-3s-1、小于9×10-4s-1、小于6×10-4s-1、小于3×10-4s-1、小于2.5×10-4s-1、小于2×10-4s-1、小于1×10-4s-1、小于8×10-5s-1、小于5×10-5s-1，如通过表面等离子体共振或生物层干涉法所测量的。在一个实施方案中，本文所述的FIT-Ig结合蛋白抗体或其抗原结合片段对OX40的解离常数(KD)在10-8至10-10范围内，例如，小于8×10-8M，小于5×10-8M，小于3×10-8M。小于2×10-8M，小于1×10-8M，小于8×10-9M，小于5×10-9M，小于3×10-9M，小于2×10-9M，或小于1×10-9M，小于8×10-10M，小于6×10-10M，小于4×10-10M，小于2×10-10M，或小于1×10-10M。在一个实施方案中，本文所述的FIT-Ig结合蛋白抗体或其抗原结合片段在OX40结合方面具有1×10-3s-1至1×10-4s-1的范围内的解离速率，例如，小于5×10-4s-1，以及在1×10-8M至1×10-9M范围内的KD，例如，小于7×10-9M。在一个实施方案中，如本文所描述的能够结合PD-L1和OX40的双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白，如通过SEC-HPLC检测的，在使用蛋白A亲和层析从细胞培养基中一步纯化后，具有不低于90％的纯度。在一个实施方案中，如通过SEC-HPLC检测的，一步纯化的结合蛋白具有不低于91％、92％、93％、95％、97％、99％的纯度。
在一个实施方案中，本文所述的双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白能够结合表达PD-L1的细胞和表达OX40的细胞两者。在一个实施方案中，表达PD-L1的细胞是转染人PD-L1的CHO细胞系，或肿瘤细胞。在一个实施方案中，表达OX40的细胞是表达OX40的T细胞/细胞系，例如，CD8+T细胞、CD4+T细胞、Treg细胞或Jurkat细胞。
在一个实施方案中，如通过流式细胞术在基于细胞的检测中所测量的，双特异性FIT-Ig结合蛋白与表达OX40的细胞的结合效能等同于或相当于相应的亲本抗OX40单克隆IgG抗体，所述亲本抗体包含与双特异性FIT-Ig蛋白相同的用于OX40结合的VH/VL序列对。在一个实施方案中，如通过流式细胞术所检测的，双特异性FIT-Ig结合蛋白与表达PD-L1的细胞的结合效能等同于或相当于相应的亲本抗PD-L1单克隆IgG抗体，所述亲本抗体包含与双特异性FIT-Ig蛋白相同的用于PD-L1结合的VH/VL序列对，诸如，在实施例3和4中描述的检测中。
在一个实施方案中，本文所述的双特异性结合蛋白能够调控OX40、PD-L1或两者的生物功能。在一个实施方案中，本文所述的双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白能够按PD-L1依赖的方式激活OX40信号传导。在一个实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白表现出通过OX40信号途径活化T细胞的作用。在一个实施方案中，本发明所述的双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白以表现出PD-L1依赖的OX40活化的T细胞针对肿瘤细胞的细胞毒作用。在一个实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白用于以PD-L1依赖的方式增强T细胞针对肿瘤细胞的细胞因子分泌活性。
在一个实施方案中，本文所述的双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白结合蛋白表现出PD-L1依赖性的OX40活化作用。在一个实施方案中，表达PD-L1的细胞与表达OX40的T细胞的比例约为1：1。在另一个实施方案中，双特异性OX40/PD-L1结合蛋白在存在表达PD-L1的细胞的情况下，在T细胞活化中表现出OX40激活，相比之下，在不存在表达PD-L1的细胞的情况下，T细胞的OX40激活少得多；以及相比之下，在存在表达PD-L1的细胞的情况下，由相应的包含与双特异性FIT-Ig蛋白相同的用于PD-L1结合的VH/VL序列对的亲本抗PD-L1单克隆IgG抗体和相应的包含与双特异性FIT-Ig蛋白相同的用于OX40结合的VH/VL序列对的亲本抗OX40单克隆IgG抗体的组合所诱导的T细胞活化中，OX40激活少得多。
在一个实施方案中，如本文所述的双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白产生针对肿瘤细胞的T细胞毒性或细胞因子分泌活性。在另一个实施方案中，如本文所述的双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白增强了抗肿瘤免疫力和/或阻碍了肿瘤免疫逃逸。在另一个实施方案中，如本文所述的双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白表现出抗肿瘤活性，如减少肿瘤负担，抑制肿瘤生长，或抑制肿瘤细胞扩增。在一些实施方案中，双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白能够介导超聚集。在一些实施方案中，双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白能够诱导高阶OX40聚集。在一些实施方案中，双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白能够以条件性PD-L1依赖方式活化T细胞。在一些实施方案中，双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白能够通过PD-L1交联触发足够的OX40信号，例如，因此克服了抗OX40单药治疗的限制。在一些实施方案中，当与适当的对照，例如两个亲本抗体组合的加成效应相比较时，双特异性OX40/PD-L1 FIT-Ig结合蛋白协同地刺激T细胞活性，例如，如通过本领域已知的方法所测量的，诸如IL-2的产生。
核酸、载体和宿主细胞
在另一个方面，本公开提供了：分离的核酸，其编码本公开的抗OX40抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸序列；分离的核酸，其编码本公开的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸序列；和分离的核酸，其编码双特异性结合蛋白的一个或多个氨基酸序列，所述双特异性结合蛋白包括能够结合OX40和PD-L1两者的Fabs-in-Tandem免疫球蛋白(FIT-Ig)结合蛋白。此类核酸可以插入到一个载体中，用于进行各种遗传分析，或用于表达本文所述的抗体或结合蛋白、表征或改善一个或多个特性。载体可包括编码本文所述抗体或结合蛋白的一个或多个氨基酸序列的一个或多个核酸分子，其中一个或多个核酸分子与适当的转录和/或翻译序列可操作地连接，允许在携带该载体的特定宿主细胞中表达抗体或结合蛋白。用于克隆或表达编码本文所述结合蛋白的氨基酸序列的核酸的载体的例子包括但不限于pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ以及其衍生物。
本公开还提供了表达或能够表达包含编码本文所述抗体或结合蛋白的一个或多个氨基酸序列的核酸的载体的宿主细胞。对本公开内容有用的宿主细胞可以是原核的或真核的。一个示例性的原核宿主细胞是大肠杆菌。在本发明中作为宿主细胞有用的真核细胞包括原生动物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。一个示例性的真菌细胞是酵母细胞，包括酿酒酵母。根据本公开内容，可用作宿主细胞的示例性动物细胞包括但不限于哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞。示例性的哺乳动物细胞包括但不限于CHO细胞、HEK细胞、Jurkat细胞和COS细胞。
生产方法
在另一个方面，本公开提供了一种生产抗OX40抗体或其抗原结合片段的方法，包括在培养基中培养包含编码抗体或抗原结合片段的表达载体的宿主细胞，其条件足以引起所述宿主细胞表达能够结合OX40的所述抗体或片段。
在另一个方面，本公开提供了一种生产抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的方法，包括在培养基中培养包括编码抗体或抗原结合片段的表达载体的宿主细胞，其条件足以引起所述宿主细胞表达能够结合PD-L1的所述抗体或片段。
在另一个方面，本公开提供了一种生产能够结合OX40和PD-L1的双特异性多价结合蛋白的方法，特别是结合OX40和PD-L1的FIT-Ig结合蛋白，包括在培养基中培养包含编码FIT-Ig结合蛋白的表达载体的宿主细胞，其条件足以引起所述宿主细胞表达能够结合OX40和PD-L1的所述结合蛋白。由本文公开的方法生产的蛋白质可以被分离出来，并用于本文所述的各种组合物和方法。
抗体和结合蛋白的用途
鉴于它们结合人OX40和/或PD-L1的能力，本文所述的抗体，其抗原结合片段和本文所述的双特异性多价结合蛋白可用于检测OX40或PD-L1，或二者，例如在含有表达那些靶抗原的一者或二者的细胞的生物样品中。本公开的抗体、抗原结合片段和结合蛋白可用于常规免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。本公开提供了一种检测生物样品中OX40或PD-L1的方法，包括使生物样品与本公开的抗体，其抗原结合部分或结合蛋白接触，并检测是否发生与靶抗原的结合，从而检测生物样本中是否存在靶标。可以用可检测物质直接或间接标记抗体，抗原结合片段，或结合蛋白以便于检测结合或未结合的抗体/片段/结合蛋白。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；合适的放射性物质的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
在一些实施方案中，本公开的抗体、其抗原结合片段能够在体外和体内中和人类PD-L1活性。因此，本公开的抗体、其抗原结合片段可用于抑制人类PD-L1的活性，例如，在含有表达PD-L1的细胞的细胞培养物中，在人类受试者中，或在具有与本公开的抗体、其抗原结合片段或结合蛋白发生交叉反应的PD-L1的其他哺乳动物受试者中，抑制与PD-L1相关联的细胞信号传导。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了本公开内容的抗体或双特异性结合蛋白，用于治疗患有其中PD-L1活性有害的疾病或病症的受试者，其中抗体或结合蛋白被施用于受试者，使受试者中由PD-L1介导的活性降低。如本文所用，术语“其中PD-L1活性有害的疾病”旨在包括这样的疾病和其他病症，在患有所述疾病的受试者中的PD-L1与其受体(例如，PD-1)的相互作用是所述疾病的病理生理学的原因，或是促成所述疾病恶化的一个因素。这种疾病或病症的实例是与免疫逃逸有关的肿瘤，或表现出肿瘤免疫逃逸的肿瘤。由此，在PD-L1活性有害的疾病中，抑制PD-L1活性可以预期将缓解该疾病的症状和/或进展。在一个实施方案中，本公开的抗PD-L1抗体、其抗原结合片段或双特异性结合蛋白被用于抑制恶性细胞生长或存活或减少肿瘤负担的方法中。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白(FIT-Ig)在体外和体内都能够增强T细胞针对表达PD-L1的肿瘤细胞的细胞毒性或细胞因子分泌活性。因此，在人受试者中，或在具有与本公开的抗体、其抗原结合片段或结合蛋白发生交叉反应的PD-L1的其他哺乳动物受试者中，本公开的双特异性结合蛋白可用于抑制表达PD-L1的恶性细胞的生长或扩张。
在另一个实施方案中，本公开提供了本公开的抗体或双特异性结合蛋白，用于治疗患有其中OX40介导的信号活性有益的疾病或疾病的受试者(例如OX40+T细胞浸润的肿瘤)。这里的术语“其中OX40介导的信号活性有益的疾病”旨在包括这样的疾病和其他病症：在患有所述疾病或病症的受试者中的OX40的超聚集和/或激活将进而活化T细胞并逆转疾病或病症的影响/减轻疾病或病症症状/减缓疾病或病症的进展，诸如，肿瘤。在一个实施方案中，本公开的抗OX40抗体、其抗原结合片段或双特异性结合蛋白被用于抑制恶性细胞生长或存活或减少肿瘤负担的方法中。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了一种PD-L1/OX40双特异性(FIT-Ig)结合蛋白，用于通过OX40激活T细胞来治疗受试者中表达PD-L1的恶性疾病，其中该结合蛋白被施用于受试者。在一些实施方案中，所述恶性疾病是肿瘤，例如实体瘤，诸如结肠癌。
在一些进一步的实施方案中，本公开的抗体(包括其抗原结合片段)和结合蛋白被用于纳入或制造适合给受试者服用的药物组合物(上文所述)。通常，药物组合物包含本发明的抗体或结合蛋白和药物学上可接受的载体。如本文中使用的，“药物学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药物学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)或氯化钠。药物学上可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其可以增强组合物中存在的抗体或结合蛋白的保质期或有效性。本公开的药物组合物被配制成与其预期的给药途径相容。
本公开的方法可包括施用配制用于通过注射(例如，通过推注或连续输注)肠胃外给药的组合物。用于注射的制剂可以以单位剂型(例如，在安瓿或多剂量容器中)与添加的防腐剂一起提供。组合物可以采取如油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，主要活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载体(例如无菌无热原水)构建。
本公开的用途可包括施用配制成储库型制剂(depot preparation)的组合物。这种长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌肉内)或通过肌内注射给药。例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。
本公开的抗体、其抗原结合片段或结合蛋白还可以与一种或多种用于治疗各种疾病的其他治疗剂一起施用。本文所述的抗体、其抗原结合片段和结合蛋白可单独使用或与另外的药剂(例如，另外的治疗剂)组合使用，所述另外的药剂由技术人员基于其预期目的而选择。例如，另外的药剂可以是本领域公认为可用于治疗由本公开的抗体或结合蛋白治疗的疾病或病症的治疗剂。另外的药剂也可以是赋予治疗组合物有益属性的药剂，例如影响组合物粘度的药剂。
药物组合物
本公开还提供了药物组合物，包含本公开的抗体或其抗原结合部分，或双特异性多价结合蛋白(即，主要活性成分)和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，本公开的药物组合物可包含本公开的两种或多种抗体，例如，抗OX40抗体和抗PD-L1抗体。在另一个实施方案中，本公开的药物组合物可包含根据本公开的至少一种抗体，和至少一种双特异性结合蛋白。在一个具体的实施方案中，组合物包含一个或多个本公开的抗体或结合蛋白。本公开还提供了药物组合物，其包含本文所述的抗体(例如，抗OX40和抗PD-L1抗体)或其抗原结合片段的组合，以及药学上可接受的载体。特别地，本公开提供了包含至少一种能够结合OX40和PD-L1的FIT-Ig结合蛋白和药学上可接受的载体药物组合物。本公开的药物组合物可进一步包含至少一种额外的活性成分。在一些实施方案中，这种附加成分包括但不限于预防和/或治疗剂、检测剂，如抗肿瘤药物、细胞毒剂、不同特异性的抗体或其抗原结合片段、可检测的标签或报告分子。在一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种额外的预防或治疗剂，即除本公开的抗体或结合蛋白以外的试剂，用于治疗其中PD-L1活性有害和/或OX40活性有益的疾病。在一个实施方案中，额外的预防或治疗剂是已知的对预防、治疗、管理或改善某种疾病或其一种或多种症状有用、已经使用或目前正在使用的。
包含本公开的蛋白质的药物组合物可用于(但不限于)诊断、检测或监测病症；治疗、管理或改善病症或其一个或多个症状；和/或研究之中。在一些实施方案中，所述组合物可进一步包含载体、稀释剂或赋形剂。赋形剂一般是指为组合物提供主要活性成分以外(即，除本公开的抗体、其抗原结合部分或结合蛋白以外)的所需特征的任何化合物或化合物的组合。
治疗方法和医药用途
在一个实施方案中，本公开提供了一种调节受试者的免疫反应的方法，其中所述方法包括向受试者施用根据本公开的至少一种抗体和/或至少一种双特异性结合蛋白。
在一些实施方案中，本公开提供了一种活化T细胞的方法。在一些进一步的实施方案中，T细胞的活化可导致T细胞介导的抗肿瘤活性的诱导和/或增强。在一些进一步的实施方案中，抗肿瘤活性是针对肿瘤细胞的细胞毒性和/或细胞因子的产生，其中所述细胞因子是，例如，IL-2或IFN-γ。在一些进一步的实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在其他一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是效应性T细胞。
在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗受试者癌症的方法，包括向受试者施用根据本公开的至少一种抗体和/或至少一种双特异性结合蛋白。在一些实施方案中，所述癌症是肿瘤免疫逃逸，或表现出肿瘤免疫逃逸的肿瘤。在一些进一步的实施方案中，癌症是对T细胞活化有反应的癌症，如具有T细胞功能障碍的癌症。在一些进一步的实施方案中，癌症是具有PD-L1蛋白表达水平增加或编码PD-L1的核酸水平增加的癌症，例如，与正常个体或正常细胞中的水平相比。在一个实施方案中，本公开内容提供了在有需要的受试者中治疗其中OX40介导的信号活性有益的疾病(诸如OX40+T细胞浸润的肿瘤)的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的抗OX40抗体或其OX40结合片段，其中所述抗体或结合片段能够在表达OX40的细胞中结合OX40并激活OX40介导的信号。在另一个实施方案中，本披露提供了有效量的本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段在治疗此类病症中的用途。在另一个实施方案中，本公开提供了本文所描述的抗OX40抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗此类病症的组合物中的用途。在另一个实施方案中，本公开提供了本文所描述的抗OX40抗体或其抗原结合片段用于治疗此类病症。
在本文所述方法或用途的另一个实施方案中，本公开的抗OX40抗体或抗原结合片段与OX40结合，并包含：包含SEQ ID NO:16的序列、由SEQ ID NO:16的序列组成、或基本上由SEQ ID NO:16的序列组成的VH结构域；和包含SEQ ID NO:21的序列、由SEQ ID NO:21的序列组成、或基本上由SEQ ID NO:21的序列组成的VL结构域。
在一些实施方案中，本公开内容提供了在有需要的受试者中治疗其中PD-L1活性有害的病症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的抗PD-L1抗体或其PD-L1结合片段，其中所述抗体或结合片段能够结合PD-L1并阻断PD-L1与PD-L1的受体(例如，PD-1)的相互作用，因此能够在表达PD-L1的受体的细胞中抑制与PD-L1相关的信号传导。
在本文所述方法或用途的另一个实施方案中，本公开的抗PD-L1抗体或抗原结合片段与PD-L1结合，并包含：包含SEQ ID NO:31的序列、由SEQ ID NO:31的序列组成、或基本上由SEQ ID NO:31的序列组成的VH结构域；和包含SEQ ID NO:34的序列、由SEQ ID NO:34的序列组成、或基本上由SEQ ID NO:34的序列组成的VL结构域。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了在需要的受试者中治疗其中OX40介导的信号活性有益(如OX40+T细胞浸润的肿瘤)和/或PD-L1活性是有害的疾病的方法，该方法包括向受试者施用如本文所描述能够结合PD-L1和OX40的双特异性FIT-Ig结合蛋白。在另一个实施方案中，本公开提供了有效量的本文所述的双特异性FIT-Ig结合蛋白在治疗这种疾病中的用途。在另一个实施方案中，本公开提供了本文所述的双特异性FIT-Ig结合蛋白在制备用于治疗此类疾病的组合物中的用途。在另一个实施方案中，本公开提供了本文所述的双特异性FIT-Ig结合蛋白用于治疗此类疾病。
在本文所述方法或用途的另一个实施方案中，本公开的FIT-Ig结合蛋白与OX40和PD-L1结合，并包含：包含SEQ ID NO:35的序列、由SEQ ID NO:35的序列组成、或基本上由SEQ ID NO:35的序列组成的第一多肽链；包含SEQ ID NO:36的序列、由SEQ ID NO:36的序列组成、或基本上由SEQ ID NO:36的序列组成的第二多肽链；以及包含SEQ ID NO:37的序列、由SEQ ID NO:37的序列组成、或基本上由SEQ ID NO:37的序列组成的第三多肽链。
在一些实施方案中，可以用根据本公开的抗体或结合蛋白治疗的疾病包括在恶性细胞的细胞表面表达PD-L1的各种恶性疾病。在一些进一步的实施方案中，可以用根据本公开的抗体或结合蛋白治疗的疾病包括表现出肿瘤免疫逃逸(例如，通过PD-L1/PD-1相互作用)的肿瘤。在另一个实施方案中，所述抗体或结合蛋白可抑制恶性细胞的生长或存活。在另一个实施方案中，所述抗体或结合蛋白减少肿瘤负担。在另一个实施方案中，所述癌症是结肠癌。
本文所述的治疗方法可进一步包括向需要的受试者施用额外的活性成分，所述活性成分适当地与本发明的抗体或结合蛋白联合存在，以达到预期的治疗目的，例如，另一种具有抗肿瘤活性的药物。在本公开的治疗方法中，可将额外的活性成分纳入包含本公开的抗体或结合蛋白的组合物中，并将所述组合物施用于需要治疗的受试者。在另一个实施方案中，本公开的治疗方法可包括向需要治疗的受试者施用本文所述的抗体或结合蛋白的步骤，以及单独的在向受试者施用本公开的抗体或结合蛋白的步骤之前、同时或之后向受试者施用额外活性成分的步骤。
现在已经详细描述了本公开，通过参考以下实施例将更清楚地理解本公开，这些实施例仅出于举例说明的目的而包括在内，并不意图限制本发明。
具体实施方式
实施例1抗OX40抗体的产生
实施例1.1抗OX40单克隆抗体8G9D5C5的筛选，克隆和序列分析
抗OX40单克隆抗体是通过标准杂交瘤筛选方案产生的。利用细胞免疫和基因枪(DNA免疫)进行免疫，其中免疫原分别是过表达人OX40的HEK293细胞，和含有人OX40基因的表达质粒。使用表达人OX40的CHO-K1细胞，对杂交瘤克隆进行了结合活性和生物活性的筛选。克隆8G9D5C5被选作进一步的表征。
为了扩增抗体的重链和轻链可变区，用TRIzol试剂(Cat.No.15596,Invitrogen)从>5x106细胞中分离出克隆8G9D5C5的总RNA，并用SuperScriptTMIII First-StrandSynthesis SuperMix(18080,Invitrogen)进行逆转录，以产生cDNA，后者在使用Mouse Ig-Primer Set(Cat.No.69831-3,Novagen)的PCR中应用作为模板。PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳分析，用SYBR Safe DNA凝胶染色。用Gel and PCR Clean-up(Cat.No.740609,MACHEREY-NAGEL)纯化具有正确大小的DNA片段，各自亚克隆到pMD18-T载体，然后转化到感受态大肠杆菌细胞中。从每个转化中选择15个菌落，通过DNA测序分析插入片段的序列。如果大多数被测序的菌落(15个中至少有8个)得到相同的序列，则确认序列。克隆8G9D5C5可变区的氨基酸序列列在表1中。互补决定区(CDR)根据Kabat编号系统，标为下划线。
表1抗OX40抗体可变区的氨基酸序列
实施例1.2嵌合抗体的产生和表征
将如表1中提供的8G9D5C5的VH和VK基因分别地合成并克隆到含有人IgG1和人kappa恒定结构域的载体之中。用重链载体和轻链载体两者共转染的293E细胞培养7天，然后收获上清液，用蛋白A层析纯化。
纯化的嵌合抗体被命名为EM1007-44c。通过FACS评估与细胞表面的人类或食蟹猴OX40的结合活性。简而言之，在96孔板(Corning,#3799)的每个孔中铺种5×105个细胞。细胞以400g离心5分钟，弃去上清液。每孔加入100μl从100nM浓度开始的3倍连续稀释的抗体并与细胞混合。在4℃孵育60分钟后，洗板以去除多余的抗体。然后加入二抗Alexa647偶联的羊抗人IgG抗体(1:500新鲜稀释度，Jackson ImmunoResearch，#109-606-098)并在室温下与细胞孵育20分钟。经过另一轮离心和洗涤，将细胞重悬在FACS缓冲液中，在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)上读取。中值荧光强度(MFI)的读数相对于抗体浓度作图，并用GraphPad Prism 8.0进行分析。
在Jurkat-OX40-NF-κB荧光素酶测定中检测OX40激活下游信号的能力。简而言之，高结合板(Corning，#3361)用从100nM开始的3倍连续稀释的EM1007-44c在4℃下包被过夜，洗净，然后每孔铺种1×105个细胞的OX40-NF-κB报告子，在37℃下孵育6小时。孵育结束后，根据制造商的说明制备并添加ONE-GloTM发光检测试剂盒的试剂(Promega，Cat.#E6130)。在VarioskanTMLUX读板仪(ThermoFisher Scientific)上读取平板的发光信号。
进一步评估EM1007-44c活化原代T细胞和促进T细胞增殖的能力。简而言之，在高结合板(Corning，#3361)中测量原代T细胞的刺激，所述板用从100nM和1μg/ml OKT3(Biolegend，#317326)开始的EM1007-44c的3倍连续稀释液通过在4℃下孵育过夜进行共包被。用商购的人类T细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies,#17951)从人PBMC中纯化出PD-L1+T细胞，并按每孔1×105个细胞加入到新鲜包被并经PBS洗涤的平板中。平板在37℃和5％CO2下孵育96小时。每孔收集100μl上清液用于IFN-γ定量，然后根据制造商的说明，加入50μl/孔 发光细胞活力测定(Promega，#G7570)混合液，在室温下孵育10分钟，以进行细胞活力检测。
表2中总结的数据证明EM1007-44c与细胞表面的人OX40和食蟹猴OX40有相似的结合活性，并能激活OX40信号和原代T细胞。
表2 EM1007-44c的特征
特征测定 结果
结合CHO-K1-hOX40，EC50(nM) 2.6
结合CHO-K1-cOX40，EC50(nM) 2.11
T细胞活化测定，IFN-γ的分泌，EC50(nM) 1.18
T细胞活化CTG，EC50(nM) 3.7
OX40-Jurkat-NF-κB-Reporter,EC50(nM) 0.43
OX40-Jurkat-NF-κB-Reporter,最大倍数变化 1.517
实施例1.3 EM1007-44c的人源化
采用表1中提供的EM1007-mAb044c可变区基因创建人源化抗体。首先，EM1007-mAb044c的VH结构域和VK(VL kappa)结构域的氨基酸序列与V BASE数据库(https:// www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php)中现有的人类Ig V基因序列进行比较，以找到总体上最佳匹配的人胚系Ig V基因序列。VH和VK的框架段也与V BASE中J区序列中的现有FR序列进行了比较，以找到分别与鼠类VH和VK区具有最高同源性的人类框架。对于轻链，最接近的人类V基因匹配是O1基因；而对于重链，最接近的人类匹配是VH1-69基因。然后，人源化可变结构域序列被设计为具有以下：EM1007-044c轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3移植到O1基因的框架序列和JK2框架4序列上，而EM1007-mAb044c重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3移植到VH1-69和JH1框架4序列的框架序列上。
同时，生成了EM1007-mAb044c的三维Fv模型，以鉴定小鼠氨基酸对支持环状结构或VH/VK界面至关重要的任何框架位置。人框架序列中的相应残基应在这些鉴定的位置向小鼠残基进行回复突变，以保持亲和力/活性。为EM1007-mAb044c的VH和VK指定了几个需要的回复突变，并构建了替代的VH和VK设计，如下表3所示。由于在EM1007-mAb044c的CDR-H2和CDR-L1中发现的"NG"(Asn-Gly)模式倾向于发生脱氨，并可能在生产过程中带来异质性，因此还设计并评价了含有NG(Asn-Gly)到NA(Asn-Ala)突变的VH和VL结构(用粗斜体突出标示)，例如，命名为"EM1007-mAb044VH(G-A)"和"EM1007-mAb044VK(G-A)"。
表3具有回复突变的EM1007-044的人源化VH/VK设计*。
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*CDR序列根据Kabat编号系统，标为单线下划线；框架回复突变标为双线下划线，NG(Asn-Gly)到NA(Asn-Ala)突变为粗斜体。
合成人源化的VH和VK(VL kappa)基因，然后分别克隆到含有经LALA突变的人IgG1重链恒定结构域和人kappa轻链恒定结构域的载体中(序列如下所示)。
具有LALA突变的人IgG1重链恒定结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人Kappa轻链恒定结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
将人源化的VH链和人源化的VK链配对，产生了10个人源化的抗体，命名为"HuEM1007-044-1"至"HuEM1007-044-8"、"HuEM1007-044-14"和"HuEM1007-044-16"，如表4所示，连同命名为"EM1007-mAb044c-9"至"EM1007-mAb044c-13"、"EM1007-mAb044c-15"和"EM1007-mAb044c-17"的嵌合抗体，以评估在CDR-H2和CDR-L1中因G-A突变而产生的潜在影响。
表4.抗OX40人源化EM1007-044抗体
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所有的17种抗体表4通过HEK293细胞的瞬时转染表达，通过蛋白A层析纯化，并测定解离速率常数(koff)和按之排序。简而言之，抗体的结合亲和力和动力学通过RED96生物层干涉仪(Pall FortéBio LLC)进行表征。抗体以100nM浓度由Anti-hIgG FcCapture(AHC)Biosensors(Pall)捕获120秒。之后，将传感器浸入运行缓冲液(1X pH7.2PBS，0.05％Tween 20，0.1％BSA)60秒以检查基线，然后浸入指定浓度的重组人OX40/His融合蛋白(Novoprotein，CB17)200秒以测量结合，接着浸入运行缓冲液600秒以解离。该测定在四个试验组中进行(如表5中所列)，四组都含有EM1007-044c嵌合抗体作为归一化基础。使用FortéBio Data Analysis软件(Pall)将结合和解离曲线拟合为1:1的Langmuir结合模型，以获得解离速率常数，如下方表5所示。将每个抗体的解离速率与同组中的EM1007-mAb044c嵌合抗体的解离速率进行比较，得出相应的解离速率比，作为归一化指数。抗体的归一化指数表示对人OX40更高的亲和力。
表5人源化和嵌合EM1007-044抗体的解离速率(koff)
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EM1007-mAb044c-11的解离速率与EM1007-mAb044c相似，表明前者的VH和VL中同时存在NG(Asn-Gly)到NA(Asn-Ala)的突变并不影响其结合亲和力。因此，HuEM1007-044-16是能够最好地保持亲和力同时又含有全部两个NG到NA突变的人源化设计，将被用于双特异性分子的构建。
实施例1.4抗OX40抗体的表征
实施例1.4.1表位鉴定
OX40胞外结构域的4个富含半胱氨酸的结构域(CRD)是从UniProt(Identifier:P43489)鉴定的，并且全长的细胞外OX40(CRD1-4)和截短的OX40变体ΔCRD1(缺乏CRD1)，ΔCRD1-2(缺乏CRD1和CRD2)，ΔCRD1-3(缺乏CRD1、CRD2和CRD3)，mCRD1(CRD1-4中的CRD1结构域被小鼠CRD1替代)。mCRD2(CRD1-4，其中的CRD2结构域被小鼠CRD2取代)，mCRD3(CRD1-4，其中的CRD3结构域被小鼠CRD3取代)和mCRD4(CRD1-4，其中的CRD4结构域被小鼠CRD4取代)是由Biointron合成的。使用ELISA分析HuEM1007-044-16、OX40-Tabl(WO2015153513)、OX40-Tab2(WO2020151761)与OX40或OX40截短蛋白的结合，以确定相关的结合表位。简而言之，将OX40变体以1μg/ml在4℃下孵育过夜包被在96孔板(Corning,#3361)上，，用含0.05％Tween 20的PBS清洗，在37℃下用封闭缓冲液(含0.05％Tween 20和2％BSA的PBS)阻断2小时。在包被并封闭的平板上加入连续稀释的抗体，在37℃下孵育1小时，清洗3次后加入HRP标记的二抗。加入四甲基联苯胺(TMB)显色液进行5分钟的显色，然后用1M盐酸淬灭反应。在读板仪上测量450纳米的吸光度(OD450)。图1a显示了上述ELISA检测的结果，表明OX40-mAb靶向CRD 3结构域，而OX40-Tab1和OX40-Tab2分别靶向构象表位，和CRD1结构域或包含CRD1结构域的构象表位。另一ELISA测定也是类似地进行的，除了使用了指定CRD结构域被相应鼠源对应结构取代的OX40变体，结果显示在图1b中，进一步表明人CRD1、CRD2和CRD4结构域对Tab2的结合至关重要。
实施例1.4.2 T效应细胞的选择性增殖
抗OX40抗体的激动作用是通过CD4初始细胞的Treg分化来衡量的。简而言之，使用市售试剂盒(Stemcells,#17555)分离CD4初始T细胞，将5×106个细胞/孔接种到预包被有2μg/ml OKT3和30nM HuEM1007-044-16的6孔板之中。在补充了2μg/ml CD28(Biolegend，#302934)和5ng/ml TGF-beta并孵育5天后，利用FACS分析来评估由CD25+Foxp3+定义的Treg细胞群，以及非Treg T细胞群。图2显示用HuEM1007-044-16处理诱导了T效应细胞相对于Treg细胞的选择性增殖，而且甚至在30nM浓度时减少了Treg极化。
实施例1.4.3 OX40激动剂mAb内化试验
简而言之，可将5×105个过表达人OX40(CHO-HOX40)的CHO细胞铺种到96孔板(Corning，#3799)的每个孔中，并在有或没有内化抑制剂的情况下进行不同浓度的HuEM1007-044-16处理。在37℃孵育60分钟后，洗板数次以去除多余的抗体，然后加入二抗Alexa647偶联的羊抗人IgG抗体(1:500新鲜稀释，Jackson ImmunoResearch，#109-606-098)并在室温下孵育20分钟。再经过一轮离心和洗涤后，将细胞重悬在FACS缓冲液中，在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)上进行读取。中值荧光强度(MFI)读数可以相对于抗体浓度作图，并用GraphPad Prism 8.0进行分析。
实施例2抗PDL1抗体的产生和表征
抗PD-L1抗体EM0005-mAb86如WO2021/104434中所描述获得。通过HEK293细胞表达并通过蛋白A层析纯化后，EM0005-mAb86表现出大于10％的聚集率，这表明无论是抗体本身还是利用其作为结合域的双特异性分子的CMC开发都面临挑战。为了使抗体具有更好的可开发性，采用EM0005-mAb86的VH和VL序列(列在表6中)并进行了框架序列的改变，以改变全长抗体的物理化学特性，如改变总电荷，打破疏水斑块，和/或增加亲水性，而不影响或尽量不影响其生物活性。
表6 EM0005-mAb86*的可变区的氨基酸序列
*根据Kabat编号的CDR标为下划线。
简而言之，EM0005-mAb86的人源化可变结构域序列被设计为将其CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(如在表6中所提供的EM0005-mAb86的VL)移植到V BASE的各种种系基因的框架序列上，且在CDR-L3之后是JK4框架4序列；其CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(如在表6中所提供的EM0005-mAb86的VH)移植到V BASE的各种VH框架序列上，且在CDR-H3后是JH6框架4序列。
合成设计的VH和VK(VL kappa)基因，然后分别克隆到含有人IgG1重链恒定结构域和人kappa轻链恒定结构域的载体中(序列提供于实施例1.3)。将人源化的VH链和人源化的VK链配对创建了50个人源化抗体，其中49个被命名为"HuEM0005-86-15"至"HuEM0005-86-63"，连同HuEM0005-86-64，其被设计为具有与HuEM0005-86-21相同的序列，除了：在第1位有Q(Gln)到E(Glu)的突变和在第82a位有C(Cys)到S(Ser)的突变(Kabat编号方式)。另外一个嵌合变体EM0005-86c-1被设计成在“EM0005-86c”的CDR-H2中有一个G55A突变，以评估NG(Asn-Gly)到NA(Asn-Ala)突变对抗体结合特性的影响，这被认为是避免EM0005-mAb86的CDR-H2中“NG”(Asn-Gly)所需的，因这种模式容易发生脱氨反应，可能引起制造中的异质性。
所有的抗体都在HEK293中瞬时表达，通过一步法蛋白A纯化，并通过SEC-HPLC评估表达滴度和纯度。由于纯化的抗体的杂质主要是聚集部分，更高的纯度表明相应抗体的聚集倾向较低。
根据滴度和纯度，从50个人源化抗体中选出10个，分两组进一步检测解离速率常数(koff)，如表7所示。具有与EM0005-mAb86相同的VH/VL序列的嵌合抗体EM0005-86c(如表6中所提供)被用作每组的阳性对照，并作为归一化的基础。简而言之，通过RED96生物层干涉仪(Pall FortéBio LLC)表征抗体的亲和力和结合动力学。将捕获了抗体(以100nM捕获120秒)的Anti-hIgG Fc Capture(AHC)Biosensors(Pall)浸入运行缓冲液(1XpH 7.2PBS,0.05％Tween 20,0.1％BSA)60秒以检查基线，然后浸入单一浓度的重组人PD-L1/His融合蛋白(Novoprotein，Cat.No.C315)200秒以测量结合，然后浸入运行缓冲液600秒以测量解离。使用FortéBio Data Analysis软件(Pall)将结合和解离曲线拟合为1：1的Langmuir结合模型。表7中显示的解离速率比是通过在同一测试组中人源化抗体的解离速率与EM0005-86c的解离速率计算的。解离速率比作为归一化的指数，以便于人源化抗体可以在不同的试验组中相互比较。更低的解离速率比表明抗体对人PD-L1的亲和力更高。基于纯度和解离速率数据，选择HuEM0005-86-21进行进一步研究。
表7.人源化和嵌合EM0005-mAb86抗体的解离速率(koff)
在HuEM0005-86-21的基础上，进一步设计了HuEM0005-86-64，以包括C82aS突变并用于FIT-Ig的构建。HuEM0005-86-64的序列如表8中所示。
表8 HuEM0005-86-64的氨基酸序列
实施例3 PDL1/OX40 FIT-Ig的生成和表征
实施例3.1 PDL1/OX40 FIT-Ig FIT1014-20a的构建
利用亲本抗体HuEM0005-86-64(人源化抗PD-L1，见表8)和HuEM1007-44-16(人源化抗OX40，见表3和表4)的免疫球蛋白结构域编码序列，构建了PD-L1/OX40 FIT-Ig，命名为FIT1014-20a。FIT-Ig FIT1014-20a是包含三个组成部分多肽链的六聚体：
多肽链#1具有如下结构域结构式：HuEM0005-86-64的VL-CL直接与HuEM1007-44-16的VH-CH1融合，后者还直接与变体人恒定IgG1的Fc融合；其中CH2结构域的三联突变M252Y/S254T/T256E('YTE'，EU编号)引起与人新生儿Fc受体(FcRn)增加10倍的结合。这可能会增加FIT1014-20a的血清半衰期。
多肽链#2具有如下结构域结构式：HuEM0005-86-64的VH-CH1；
多肽链#3具有如下结构域结构式：HuEM1007-44-16的轻链(VL-CL)。
三条表达的FIT1014-20a多肽链的氨基酸序列如下方表9所示。
表9:FIT1014-20a组成链的氨基酸序列*
*可变区标记为粗体；YTE突变标记为下划线。
合成了编码三个组成多肽链中每条氨基酸序列的DNA分子，并克隆到pcDNA3.1哺乳动物表达载体中。将用于表达三个组成多肽链中的每一条的三个重组pcDNA3.1表达载体共同转染到HEK 293E细胞。转染后细胞培养大约六天后，收获上清液并进行蛋白A亲和层析，得到纯化的PD-L1/OX40 FIT-Ig双特异性结合蛋白。
实施例3.2 PDL1/OX40 FIT-Ig的结合活性
FACS结合
分别针对过表达人PD-L1的CHO细胞(ATCC，#CCL-61)(CHO-PD-L1)和过量表达OX40的CHO细胞(CHO-OX40)测量PD-L1/OX40抗体的细胞结合亲和力。简而言之，在96孔板(Corning,#3799)的每个孔中铺种5×105个细胞。细胞以400g离心5分钟，弃去上清液。每孔加入100μl从100nM开始的3倍连续稀释的抗体溶液并与细胞混合。在4℃孵育60分钟后，洗板数次以去除多余的抗体。然后加入二抗Alexa647偶联的羊抗人IgG抗体(1:500新鲜稀释，Jackson ImmunoResearch，#109-606-098)，并在室温下与细胞孵育20分钟。经过另一轮离心和洗涤，将细胞重悬在FACS缓冲液中，在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)上读取。中值荧光强度(MFI)的读数相对于抗体浓度作图，并用GraphPad Prism 8.0进行分析。
如图3所示，FIT-1014-20a与CHO-PD-L1的结合亲和力相当接近于其亲本抗PD-L1单克隆抗体(HuEM0005-86-64)，而阴性无关的人IgG没有显示任何结合。
图4所示的与转染人OX40的CHO细胞结合的FACS亲和力结果表明，FIT1014-20a的结合亲和力相对低于其亲本OX40抗体HuEM1007-44-16(EC50为4.3nM vs.1.8nM)。
对PD-L1和OX40的亲和力
使用Red传感设备(ForteBio，Red96)通过生物层干涉测量法检测FIT1014-20a的PD-L1结合活性。将捕获(以100nM浓度捕获30秒)了FIT1014-20a(YTE)的Anti-hIgG Fc Capture(AHC)Biosensors(Pall)浸入运行缓冲液(1X pH 7.2 PBS，0.05％Tween 20，0.1％BSA)60秒以检查基线，然后浸入重组人或食蟹猴PD-L1-his蛋白的连续稀释液(100nM，33.3nM，11.1nM，3.7nM)，测量结合200秒，然后浸入运行缓冲液，测量解离1200秒。使用FortéBio Data Analysis软件(Pall)将结合和解离曲线拟合为1:1的Langmuir结合模型，产生动力学速率常数Kon和Koff。然后通过KD＝Koff/Kon计算抗体和相关目标蛋白之间反应的平衡解离常数KD(M)。对OX40的亲和力检测按类似方式进行，除了用人或食蟹猴OX40(300nM，100nM，33.3nM，11.1nM)代替PD-L1-his蛋白。结果如下方表10所示。
表10 FIT1014-20a与PD-L1和OX40蛋白的结合亲和力
分析物 kon(1/Ms) koff(1/s) KD(M)
人OX40 7.81E+04 4.70E-04 6.02E-09
食蟹猴OX40 7.80E+04 4.00E-04 5.13E-09
人PD-L1 6.20E+05 1.58E-04 2.55E-10
食蟹猴PD-L1 4.70E+05 2.76E-04 5.87E-10
实施例4 PD-L1阻断
实施例4.1阻断PD-1/PD-L1的结合
在基于细胞的受体阻断测定(RBA)中评估对PD-1/PD-L1结合的阻断，将100μl 2×105个细胞/孔的CHO-PD-L1细胞加入到96孔圆底板(Corning，Cat#3799)中，50μl按0.016nM至50nM连续稀释的抗体和50μl 50μg/ml PD-1-mFc(Novoprotein，#C754)加入到每个孔中，轻轻混合后在4℃孵育1小时。洗涤细胞并使用Alexa647抗小鼠IgG(1:500，JacksonImmunoResearch，#115-606-008)染色。用FACS读出信号，曲线用GraphPad Prism 8.0拟合。如图5所示，FIT1014-20a显示了阻断PD-1蛋白结合至PD-L1超表达细胞的效力，与其亲本抗PD-L1抗体HuEM0005-86-64相似。
实施例4.2阻断PD-L1介导的抑制性信号传导
通过对CHO-PD-L1-OS8(如US8735553中公开的，OS8用作T细胞激活分子，PD-L1被稳定传导)和Jurkat-PD-1-NFAT-荧光素酶报告基因细胞系(表达由NFAT响应元件驱动的荧光素酶报告基因和人PD-1)进行共培养，来研究阻断PD-L1的抑制性信号。简而言之，收获对数生长期的CHO-PD-L1-OS8，洗净后重悬于测定培养基(RPMI1640加10％FBS)中，96孔板(Corning，Cat.#3799)中每孔铺种50μl 1×105个细胞，然后每孔加入50μl 1×105个Jurkat-PD-1-NFAT-luciferase报告基因细胞。加入50μl连续稀释的样品抗体，并与细胞混合物在37℃下孵育6小时，孵育后，根据制造商的说明制备并加入ONE-GloTM发光检测试剂盒(Promega，Cat.#E6130)的试剂。在VarioskanTMLUX读板仪(ThermoFisher Scientific)上读取平板的发光信号。如图6所示，FIT1014-20a在阻断PD-L1介导的PD-1下游信号方面表现出与它的亲本抗PD-L1抗体HuEM0005-86-64类似的性能。
实施例5.OX40的下游信号传导的PD-L1依赖性激活
诱导PD-L1依赖性OX40下游信号激活的能力通过以下评估：将CHO-PD-L1与Jurkat-OX40-NFκB-荧光素酶报告基因细胞系共培养，然后通过PD-L1交联检查OX40的激活情况。4×104个细胞/孔的100μl表达PD-L1的CHO细胞和1×105个细胞/孔的100μl表达OX40的NFκB-荧光素酶报告基因细胞共同铺种到96孔板(Corning,Cat.#3799)之中，与50μl连续稀释的抗体在37℃下孵育6小时。孵育结束后，根据制造商的说明制备并加入ONE-GloTM发光检测试剂盒(Promega，Cat.#E6130)的试剂。在VarioskanTMLUX读板仪(ThermoFisherScientific)上读取平板的发光信号。如图所示，在PD-L1阳性细胞存在的情况下，FIT1014-20a以剂量依赖的方式诱导了OX40下游NF-κB信号通路的激活(图7，顶部)，而亲本mAb的组合则没有。进行了平行测定，使用相同的抗体和报告基因细胞系，但使用PD-L1阴性的CHO细胞作为对照，如图7(底部)所示的激活缺失表明，FIT1014-20a诱导的激活是依赖于PD-L1的。
实施例6.T细胞活化
实施例6.1原代T细胞产生IFN-γ和IL2
在CHO-PD-L1-OS8细胞和人原代T细胞共培养系统中，通过IFN-γ和IL2的产生来测量T细胞的活化。简而言之，收获CHO-PD-L1-OS8细胞，洗涤并重悬于测定培养基(RPMI1640加10％FBS)中至4×105个细胞/ml，然后将100μl细胞加入96孔板(Corning，#3799)。用商购的人T细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies，#17951)从人PBMC中纯化T细胞，并以4×105个细胞/ml将100μl加入细胞培养板。加入测试抗体和阴性无关的人类IgG，并与细胞混合物在37℃下孵育48小时，对上清液进行取样，使用PerkinElmer IFN-γ检测试剂盒(PerkinElmer；#TRF1217M)测量IFN-γ的产生。孵育72小时后进一步取样上清液，使用PerkinElmer IL-2检测试剂盒(PerkinElmer；#TRF1221M)测量IL-2的产生。根据如图8中显示的IFN-γ和IL2的产生情况，与单特异性亲本抗体的组合相比，FIT1014-20a可以活化T细胞，使其以剂量依赖的方式产生IFN-γ和IL2。
实施例6.2混合淋巴细胞反应(MLR)测定
为了确定本文所述的双特异性抗体(BsAb)是否可以通过同时激活OX40和阻断PD-L1/PD-1来协同刺激T细胞，按照报道的内容(Tourkva等，2001)建立了混合淋巴细胞反应(MLR)测定来评估对T细胞活化的影响。简而言之，用单核细胞富集试剂盒(Stemcell，19058)从PBMC中分离出的单核细胞在补充有50ng/ml GM-CSF(R&D，#215-GM-050/CF)、35ng/ml IL-4(R&D，#204-IL-050/CF)的培养基(RPMI1640+10％FBS)中维持6天。通过补充20ng/ml TNF-a(R&D，#210-TA-005/CF)、50μg/ml Poly I:C(Sigma，#I3036)来诱导成熟DC，并在37℃和5％的CO2下再培养2天。通过EasySepTM human CD4+T富集试剂盒(Stemcell，#17952)从PBMC中分离出异体人CD4+T细胞，以100μl每孔1×105个细胞将CD4+T细胞铺种到96孔圆底板(Corning，#3799)中，并将100μl的成熟DC以每孔1×105个细胞加入板，与连续稀释的抗体进行孵育。3天后收集上清液以检测IL-2的产生作为MLR反应的读出值。如图9所示的来自MLR测定的IL2水平表明，FIT1014-20a在促进IL-2产生方面比两种亲本抗体的组合更有效。
实施例6.3葡萄球菌肠毒素B(SEB)测定
使用超级抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)进行细菌毒素刺激测定，进一步评估对T细胞活化的影响。简言之，将来自健康人供体的100μl PBMC以2×105个细胞/孔铺种到96孔实验板中，然后加入50μl连续稀释的测试抗体，在37℃下与PBMC孵育30分钟。加入50μl终浓度为10ng/ml的SEB溶液，并将平板进一步孵育96小时。收集100μl细胞培养上清液，使用PerkinElmer IL-2检测试剂盒(PerkinElmer；#TRF1221M)测量IL-2。如图10中所示的IL-2水平所表明的，FIT-1014-20a在增强T细胞活化方面比其亲本抗OX40和PD-L1抗体的组合更有效。
实施例7Fc介导的效应子功能的研究
实施例7.1对活化的CD4+细胞的补体依赖性细胞毒性
用EasySepTM人CD4+T富集试剂盒(Stemcell，#17952)从PBMC中分离出人CD4+T细胞，并用T细胞活化剂(Stemcell，#10971)活化3天，收获活化的CD4+T细胞并稀释为1×106个细胞/ml，将50μL活化的CD4+T细胞溶液加入到96孔细胞板(Corning,#3799)之中，将50μL正常人血清补体(Quidel，#A113)加入细胞板中，然后加入50μL连续稀释的抗体、不相关的人IgG(作为阴性对照)或抗HLA(作为阳性对照，AntibodyGenie，AGEL1612)。在37℃，5％CO2下孵育6小时后，细胞的细胞毒性通过alamarBlueTMCell Viability Reagent(Thermofisher，#DAL1100)检测。如图11所示，FIT1014-20a对活化的人CD4+T细胞不产生任何细胞毒性，而阳性对照抗HLA对活化的人CD4+T细胞显示出剂量依赖性的细胞毒性。
实施例7.2对CHO-OX40的吞噬作用
简言之，从新鲜PBMC中分离出CD14+单核细胞，与100ng/ml的M-CSF(R&D；216-MC-010/CF)孵育6天，分化为巨噬细胞，然后用CellTraceTMFar Red(Thermo FisherScientific，C34564)标记。在96孔板(Corning，7007)中按每孔2×105个细胞加入100μLCellTraceTMCFSE(Thermo Fisher Scientific，C34554)标记的CHO-OX40细胞，50μL密度为4×105的Far Red标记的人巨噬细胞，以及50μL指定浓度的抗体，然后在37℃孵育3小时。经由流式细胞仪，通过CFSE+细胞在Far Red+细胞中的百分比来评估吞噬作用。如图12所示，FIT1014-20a和HuEM1007-044-16(亲本OX40 mAb)几乎不产生吞噬作用，而其亲本的具有hIgG1的HuEM1007-044-16和参考抗体OX40-Tab2显示出一些吞噬作用。
实施例8携带MC38结肠肿瘤模型的人源化PD-L1和OX40小鼠中的抗肿瘤疗效
FIT1014-20a的抗肿瘤疗效在携带表达人PD-L1的MC38肿瘤细胞(Shanghai ModelOrganisms Center Inc.，中国上海)的hPD-L1/hOX40转基因同系(syngeneic)小鼠模型(Biocytogen，中国北京)中进行了检验。将悬浮在0.1毫升PBS中的表达PD-L1的MC38细胞(5x106个细胞)皮下注射到hPD-L1/HOX40tg雌性小鼠的右背侧部位。五天后(第0天)，基于肿瘤体积(平均70mm3)，将小鼠随机分配到各组(n＝6)。在第0、3、6、9天腹腔注射测试抗体。每周测量两次肿瘤尺寸和体重。图13中的结果表明FIT1014-20a治疗组小鼠的肿瘤生长抑制效果优于阿替利珠单抗或亲本PD-L1 mAb(HuEM0005-86-64)的单一疗法。
实施例9携带CT26结肠肿瘤模型的人源化PD-L1，PD-1和OX40小鼠中的抗肿瘤疗效
进一步研究了FIT1014-20a针对在人PD-1/PD-L1/OX40基因敲入小鼠(GemPharmatech，中国)中建立的CT26-hPD-L1同系肿瘤的体内抗肿瘤活性。将悬浮在0.1毫升PBS中的表达PD-L1的CT26细胞(2.5x106个细胞)皮下注射到hPD-L1/hPD-1/hOX40转基因雌性小鼠的右背侧部位。五天后(第0天)，基于肿瘤体积(平均80mm3)对小鼠进行随机分组(n＝8)，并在第0、3、6天进行腹腔注射测试抗体。每周测量两次肿瘤尺寸和体重。图14中的结果表明，FIT1014-20a治疗组小鼠的肿瘤生长抑制作用优于阿替利珠单抗的单一疗法。
序列列表
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<213> 人工序列
<220>
<223> HuEM1007-mAb044VK.1
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuEM1007-mAb044VK.1a
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuEM1007-mAb044VK.1b
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Ala Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1 HCDR1
<400> 22
Thr Tyr Gly Ile Asn
1 5
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1 HCDR2
<400> 23
Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Ala Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1 HCDR3
<400> 24
Asp Leu Met Val Ile Ala Pro Lys Thr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1 HCDR1
<400> 25
Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1 LCDR2
<400> 26
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1 LCDR2
<400> 27
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1 LCDR3
<400> 28
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 29
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1 EM0005-mAb86
VH
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Pro Ser Ser Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Met Val Ile Ala Pro Lys Thr Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuEM0005-86-21 VH
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Ala Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Met Val Ile Ala Pro Lys Thr Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuEM0005-86-64 VH
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Ala Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Met Val Ile Ala Pro Lys Thr Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1 EM0005-mAb86 VL
<400> 32
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys
100 105
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuEM0005-86-21 VL
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HuEM0005-86-64 VL
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 659
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT1014-20a 链#1 VLPDL1-CL-VHOX40-CH1-Fc
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu
210 215 220
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
225 230 235 240
His Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly
245 250 255
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Ile Thr
260 265 270
Asn Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
275 280 285
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
290 295 300
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Leu Met Pro Tyr Trp Gly
305 310 315 320
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
325 330 335
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
340 345 350
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
355 360 365
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
370 375 380
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
385 390 395 400
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
405 410 415
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
420 425 430
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
435 440 445
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
450 455 460
Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
465 470 475 480
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
485 490 495
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
500 505 510
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
515 520 525
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
530 535 540
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
545 550 555 560
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
565 570 575
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
580 585 590
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
595 600 605
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
610 615 620
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
625 630 635 640
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
645 650 655
Pro Gly Lys
<210> 36
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT1014-20a 链#2 VHPDL1-CH1
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Ala Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Met Val Ile Ala Pro Lys Thr Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 37
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIT1014-20a 链#3 VLOX40-CL
<400> 37
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Ala Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 38
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHOX40-CH1
<400> 38
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Ala Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Ile Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Leu Met Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
<210> 39
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLPDL1-CL
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 40
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自hIgG1的Fc区，具有LALA突变
<400> 40
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 41
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自hIgG1的Fc区，具有LALA&YTE突变
<400> 41
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
20 25 30
Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 42
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自hIgG1的重链恒定区，具有LALA突变
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人κ轻链恒定区
<400> 43
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 44
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 人OX40
<400> 44
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275

Claims (30)

1.特异性结合OX40的分离的抗体或其抗原结合片段，包含一组六个CDR：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
CDR-H1包含SSWMN(SEQ ID NO:1)的序列；
CDR-H2包含RIYPGDEITNYNGKFKD(SEQ ID NO:2)或RIYPGDEITNYNAKFKD(SEQ ID NO:4)的序列；
CDR-H3包含DLLMPY(SEQ ID NO:3)的序列；
CDR-L1包含RSSKSLLYSNGITYLY(SEQ ID NO:5)或RSSKSLLYSNAITYLY(SEQ ID NO:8)的序列；
CDR-L2包含QMSNLAP(SEQ ID NO:6)的序列；并且
CDR-L3包含AQNLELPFT(SEQ ID NO:7)的序列，
任选地其中CDR根据Kabat编号定义。
2.如权利要求1所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含可变重链结构域VH和可变轻链结构域VL，其中：
VH结构域包含SEQ ID NO:9或10的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列，和/或VL结构域包含SEQID NO:17或18的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列；
或
VH结构域包含选自SEQ ID NO:11-16中任一项的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列，和/或VL结构域包含选自SEQ ID NO:19-21中任一项的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。
3.如权利要求1所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体，任选地所述抗体是人源化抗体，
并进一步任选地，所述抗体的所述VH结构域根据Kabat编号包含氨基酸残基1E，和选自5Q、27H、28A、38K、40R、43K、48I、67K、68A、70L中的1至10个残基，例如10个残基；并且所述VL结构域根据Kabat编号包含氨基酸残基69G或69S，例如69S。
4.如权利要求1所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含选自下组的VH和VL序列的组合：
组合 VH序列 VL序列 1 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:19 2 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:19 3 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:19 4 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:19 5 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:20 6 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:20 7 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:20 8 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:20 9 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:17 10 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:18 11 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:18 12 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:19 13 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:17 14 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:21 15 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:18 16 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:21 17 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:18
任选地，其中所述抗体包含包含SEQ ID NO:16序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:21序列的VL结构域。
5.如权利要求1-4中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有以下一种或多种特征：
(i)与表达OX40的细胞(例如表达OX40的T细胞)的细胞表面结合后，显示对OX40+细胞的强结合效能，其中所述细胞结合效能通过约5nM或更低、4nM或更低、3nM或更低、2nM或更低、或1nM或更低的EC50所反映，如在基于细胞的测定中通过流式细胞术测量的；
(ii)抗体在OX40细胞外结构域的CRD3处与人OX40结合；
(iii)抗体与OX40的结合诱导T细胞的抗肿瘤免疫，例如减少肿瘤负荷/生长/细胞扩增，任选地其中所述抗肿瘤免疫包括抗肿瘤细胞毒性和抗肿瘤细胞因子的分泌。
6.如权利要求1-5中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的Fc区。
7.包含权利要求1-6中任一项的分离的抗体或抗原结合片段的融合物或缀合物。
8.特异性结合PD-L1的分离的抗体或其抗原结合片段，包含一组六个CDR，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
CDR-H1包含TYGIN(SEQ ID NO:22)的序列；
CDR-H2包含YIYIGNAYTEYNEKFKG(SEQ ID NO:23)或YIYIGNGYTEYNEKFKG(SEQ ID NO:25)的序列；
CDR-H3包含DLMVIAPKTMDY(SEQ ID NO:24)的序列；
CDR-L1包含KASQDVGTAVA(SEQ ID NO:26)的序列；
CDR-L2包含WASTRHT(SEQ ID NO:27)的序列；和
CDR-L3包含QQYSSYPYT(SEQ ID NO:28)的序列，
任选其中CDR根据Kabat编号定义。
9.如权利要求8所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含可变重链结构域VH和可变轻链结构域VL，其中：
VH结构域包含SEQ ID NO:29的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列，和/或VL结构域包含SEQID NO:32的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列；
或
VH结构域包含选自SEQ ID NO:30或31中任一项的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列，和/或VL结构域包含选自SEQ ID NO：33或34中任一项的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。
10.根据权利要求8所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体，任选地所述抗体是人源化抗体。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的Fc区。
12.包含权利要求8-11中任一项的分离的抗体或抗原结合片段的融合物或缀合物。
13.编码权利要求1-6和8-11中任一项的分离的抗体或抗原结合片段的核酸分子。
14.载体，其包含权利要求13的核酸分子。
15.宿主细胞，其表达编码权利要求1-6和8-11中任一项的分离的抗体或抗原结合片段的核酸分子。
16.药物组合物，其包含权利要求1-6和8-11中任一项的分离的抗体或抗原结合片段、权利要求7和12的融合物或缀合物、权利要求13的核酸分子、权利要求14的载体，或权利要求15的宿主细胞。
17.检测生物样品中OX40的方法，其包括使生物样品与权利要求1-6中任一项的分离的抗体或抗原结合片段或权利要求7的融合物或缀合物接触。
18.检测生物样品中的PD-L1的方法，其包括使生物样品与权利要求8-11中任一项的分离的抗体或抗原结合片段或权利要求12的融合物或缀合物接触。
19.特异性结合OX40和PD-L1的双特异性结合蛋白，其包含特异性结合OX40的第一抗原结合位点和特异性结合PD-L1的第二抗原结合位点，其中
第一抗原结合位点包含一组六个CDR，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
CDR-H1包含SSWMN(SEQ ID NO:1)的序列，
CDR-H2包含RIYPGDEITNYNGKFKD(SEQ ID NO:2)或RIYPGDEITNYNAKFKD(SEQ ID NO:4)的序列，
CDR-H3包含DLLMPY(SEQ ID NO:3)的序列，
CDR-L1包含RSSKSLLYSNGITYLY(SEQ ID NO:5)或RSSKSLLYSNAITYLY(SEQ ID NO:8)的序列，
CDR-L2包含QMSNLAP(SEQ ID NO:6)的序列，并且
CDR-L3包含AQNLELPFT(SEQ ID NO:7)的序列，
任选地，第一抗原结合位点包含如权利要求2-4任一项中所定义的VH结构域和VL结构域；
和/或第二抗原结合位点包含一组六个CDR，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
CDR-H1包含TYGIN的序列(SEQ ID NO:22)，
CDR-H2包含YIYIGNAYTEYNEKFKG(SEQ ID NO:23)或YIYIGNGYTEYNEKFKG(SEQ ID NO:25)的序列，
CDR-H3包含DLMVIAPKTMDY(SEQ ID NO:24)的序列，
CDR-Ll包含KASQDVGTAVA(SEQ ID NO:26)的序列，
CDR-L2包含WASTRHT(SEQ ID NO:27)的序列，和
CDR-L3包含QQYSSYPYT(SEQ ID NO:28)的序列，
任选地，第二抗原结合位点包含VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:31的序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列，和/或VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:34的序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列；
其中CDR是根据Kabat编号定义的。
20.如权利要求19所述的双特异性结合蛋白，包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链，
其中
(i)第一条多肽链从氨基末端到羧基末端包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc，且CL直接与VHB融合，或VHB-CH1-VLA-CL-Fc，且CH1直接与VLA融合；第二多肽链从氨基末端到羧基末端包含VHA-CH1；第三多肽链从氨基末端到羧基末端包含VLB-CL；或者
(ii)第一多肽链从氨基末端到羧基末端包含VHA-CH1-VLB-CL-Fc，且CH1直接与VLB融合，或VLB-CL-VHA-CH1-Fc，其中CL直接与VHA融合；第二多肽链从氨基末端到羧基末端包含VHB-CH1；第三多肽链从氨基末端到羧基末端包含VLA-CL；
其中VL为轻链可变结构域，CL为轻链恒定结构域，VH为重链可变结构域，CH1为重链的第一个恒定结构域，Fc为免疫球蛋白Fc区，例如IgGl的Fc(任选地，从氨基末端到羧基末端包含铰链区-CH2-CH3)，
其中VLA-CL与VHA-CH1配对以形成特异性结合第一抗原A的第一Fab，并且VLB-CL与VHB-CH1配对以形成特异性结合第二抗原B的第二Fab，并且其中第一抗原A是OX40，第二抗原B是PD-L1，
其中两条第一多肽链、两条第二多肽链和两条第三多肽链关联形成FIT-Ig蛋白。
21.如权利要求19所述的双特异性结合蛋白，其中：
第一多肽链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列，
第二多肽链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列，并且
第三多肽链包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。
22.如权利要求19-21中任一项所述的双特异性结合蛋白，其特征在于，所述双特异性结合蛋白具有以下一种或多种特征：
(i)与表达OX40的细胞(例如表达OX40的T细胞)的细胞表面结合后，显示对OX40+细胞的强结合效能，其中所述细胞结合效能通过约5nM或更低、4nM或更低、3nM或更低、2nM或更低、或1nM或更低的EC50所反映，如在基于细胞的测定中通过流式细胞术测量的；
(ii)结合蛋白在OX40细胞外结构域的CRD3处与人OX40结合；
(iii)结合蛋白与OX40的结合诱导促进T细胞的抗肿瘤免疫，例如减少肿瘤负荷/生长/细胞扩增，任选地其中所述抗肿瘤免疫包括抗肿瘤细胞毒性和/或抗肿瘤细胞因子的分泌。
23.核酸分子，其编码权利要求19-22中任一项的双特异性结合蛋白。
24.载体，其包含权利要求23的核酸分子。
25.宿主细胞，其包含权利要求23的核酸分子或权利要求24的载体。
26.制备权利要求1-6和8-11中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，或权利要求19-22中任一项所述的双特异性结合蛋白的方法，包括：在允许产生抗体、抗原结合片段或双特异性结合蛋白的条件下培养权利要求15或权利要求25的宿主细胞；并且从培养物中回收抗体、抗原结合片段或双特异性结合蛋白。
27.药物组合物，其包含权利要求19-22中任一项的双特异性结合蛋白、权利要求23的核酸分子、权利要求24的载体或权利要求25的宿主细胞。
28.治疗其中PD-L1相关活性是有害的和/或OX40介导的活性是有益的的病症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求16或权利要求27的药物组合物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述受试者是人。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述病症是癌症。
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