CN117529332A - 靶向非洲猪瘟病毒的疫苗和免疫球蛋白、其制备方法及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种分离和制备活的非洲猪瘟(ASF)病毒(ASFV)的方法和一种由ASF病毒粒子、ASF病毒组分和/或免疫抑制蛋白因子组成的ASFV疫苗。所述ASFV疫苗可用于免疫接种猪和野猪，或者可用于免疫接种猪或野猪之外的物种例如禽、牛、山羊、兔、驴或马，以产生对ASFV具有广谱特异性的多克隆免疫球蛋白。然后可以提取并纯化所述ASFV特异性免疫球蛋白。所述ASFV特异性免疫球蛋白可以为ASF感染的猪或野猪提供急性治疗，或为有ASF风险的猪或野猪例如可能已暴露于ASFV或ASFV感染的受试者的猪或野猪提供预防性治疗。

Description

靶向非洲猪瘟病毒的疫苗和免疫球蛋白、其制备方法及其使 用方法
技术领域
本公开总的来说涉及用于治疗和预防非洲猪瘟(ASF)病毒(ASFV)感染的在主动和/或被动免疫接种中使用的组合物。本公开还涉及分离和制备完整ASF病毒粒子与ASF单独病毒组分的组合的方法，所述组合在猪和/或非猪物种宿主中作为疫苗用于产生特异性针对ASFV的免疫球蛋白的目的。本文公开的特异性针对ASFV的免疫球蛋白为被ASFV感染或对ASFV易感的猪和野猪提供了广谱免疫。
与相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月22日提交的美国临时申请第63/164,309号的权益，所述临时申请整体通过引用并入本文。
序列表
本申请含有以ASCII格式电子提交并整体通过引用并入本文的序列表。在2022年3月22日生成的所述ASCII副本名为Seq_Listings_for_1401870-00015.txt，大小为8,548个字节。
背景技术
ASF是一种由ASFV引起的高度传染性出血性疾病。(USDA Surveillance Program,pg 3)。ASF影响猪科的哺乳动物，包括家猪、野生猪和欧亚野猪。(USDA SurveillanceProgram,pg 3)。所述病毒于20世纪初在东非首次被鉴定到，并在大多数撒哈拉以南非洲国家，从本地疣猪传播到家猪种群。(Sánchez-Cordón等，非洲猪瘟：威胁全球养猪业的重新出现的病毒性疾病(African swine fever:A re-emerging viral disease threateningthe global pig industry)，233Vet.J.41,41(2018))。非洲疣猪和灌丛猪是ASFV的天然贮存宿主，几乎不表现出临床症状，并保持持续感染(Dixon等，非洲猪瘟病毒的宿主防御逃避(African swine fever virus evasion of host defences)，266Virus Res.25,25(2019))。相比之下，家猪、野生猪或野猪的感染导致高死亡率的急性出血热(Dixon等，第25页)。
ASFV在1950年代末传播到欧洲，后来传播到南美洲和加勒比地区(Sánchez-Cordón等，第41页)。由于没有有效的疫苗，用于控制所述病毒传播的方法仅限于隔离和屠宰受感染和暴露的猪(Netherton等，非洲猪瘟病毒抗原的鉴定和免疫原性(Identification andImmunogenicity of African Swine Fever Virus Antigens)，10Front.Immun.1,1(2019))。1990年代中期，在非洲以外地区成功根除了ASF，但到2007年，所述病毒再次经历了第二次跨洲传播，传播到格鲁吉亚和东欧(Sánchez-Cordón等，第41页)。最近，在中国、越南、蒙古、柬埔寨和韩国报告了ASF的爆发(FAO网站；ASF情况更新)。ASF传播到中国尤其令人担忧，因为中国是世界上最大的猪生产国(Netherton等，第1页)。
ASFV本身是一种大型复杂双链DNA病毒，其在巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞的细胞质中复制(Dixon等，第25页)。研究小组已经记录了超过20种基因型，并鉴定了至少8种血清型(Kolbasov等，非洲猪瘟病毒基因型和血清群的比较分析(Comparative Analysisof African Swine Fever Virus Genotypes and Serogroups)，21Emerg.Infect.Dis.312,312(2015))。传统的灭活疫苗一直不成功，减毒活疫苗也未能产生所需的效力(Sánchez-Cordón等，第44页)。与开发成功的ASF疫苗相关的挑战被认为是由于对所述病毒如何调节宿主对感染的应答缺乏了解以及未鉴定的保护性抗原(Sánchez-Cordón等，第44页)。
发明内容
本发明人开发了一种分离活的ASFV和ASF病毒组分以制备ASFV疫苗的方法，所述疫苗包含完整ASF病毒粒子、单独ASF病毒结构蛋白和参与加重感染的ASF病毒组分，包括但不限于免疫抑制因子和/或宿主免疫因子，它们通常衍生自ASFV感染的脾和/或ASFV感染的外周血。此类ASFV疫苗在γ辐照后可用于主动免疫接种或疫苗接种猪、野猪或对ASF感染易感的其他物种。此外或可选地，活的或γ-辐照的ASFV疫苗可用于主动免疫接种或疫苗接种猪或野猪之外的物种例如禽、牛、兔、山羊、驴或马，以产生对ASFV具有广谱特异性的多克隆免疫球蛋白。在优选实施方式中，使用所述ASFV疫苗对产蛋禽例如鸡进行疫苗接种，然后可以从蛋黄提取并纯化抗体或抗体级分。所产生的产蛋禽抗体可用于预防病毒黏附、病毒传播、治疗ASF、预防ASF。来自禽或鸟的IgY同种型的抗体在这些应用中特别有用。
所述ASFV特异性免疫球蛋白可以被施用于ASFV感染的猪或野猪的急性治疗。所述急性治疗可以包括肠胃外和/或口服施用所述免疫球蛋白，例如通过腹膜内或肌肉内注射和/或在食物组合物中。此外或可选地，所述免疫球蛋白可以通过相同的施用途径作为预防性治疗施用。在一个实施方式中，所述ASFV特异性免疫球蛋白可以采取液体或重构的冻干粉的形式，然后可以腹膜内或肌肉内注射，优选地注射剂量为例如约0.5至约1.0mg/kg体重，每周两次共一周或更多周，施用到一只或多只感染或暴露于ASFV的猪或野猪。或者，ASFV特异性免疫球蛋白可以口服施用，例如口服剂量为约1.0mg/kg体重，例如添加到饲料中，每天一次连续约5至约7天，施用到一只或多只感染或暴露于ASFV的猪或野猪。
在一个实施方式中，本文公开了一种在感染的猪或野猪中治疗ASFV感染的方法，所述方法包括向所述感染的猪或野猪施用有效量的包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物。
本文还公开了在感染的猪或野猪中治疗ASFV感染的方法，其中所述组合物以一定的量施用，所述量提供的特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的剂量为约0.05mg至约1.0mg/kg感染的猪或野猪的体重。
在另一个示例性实施方式中，所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物被施用一段时间，所述时间包括每周至少一次或连续7天。
一方面，所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物通过肌肉内或腹膜内注射来肠胃外施用。
另一方面，所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物是口服施用的食品。
在另一个实施方式中，提供了一种在有ASF病毒感染风险的猪或野猪中预防ASF病毒感染、降低其发生率和/或降低其严重程度的方法，所述方法包括向所述猪或野猪施用有效量的包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物。
一方面，所述组合物以一定的量施用，所述量提供的特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的剂量为约0.05mg至约1.0mg/kg有ASF病毒感染风险的猪或野猪的体重。
另一方面，所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物被施用一段时间，所述时间包括每周至少一次或连续7天。
还应该理解，本公开设想了所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物可以被肠胃外施用。
另一方面，所述包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物是口服施用的食品。
在另一个实施方式中，本文公开了一种生产ASFV特异性免疫球蛋白的方法，其中将包含完整或片段化ASF病毒粒子、ASF病毒组分和/或免疫抑制蛋白因子的ASFV疫苗施用到非猪物种宿主，用于产生ASFV特异性免疫球蛋白。
在一个示例性实施方式中，所述宿主是产蛋禽。
本文公开的另一个实施方式是一种单位剂型，其包含治疗或预防有效量的包含特异性针对ASF病毒组分的免疫球蛋白的组合物。
在另一个实施方式中，所述组合物是被配制成口服施用的食品。
本文还公开了一种在有ASF病毒感染风险的猪或野猪中预防ASF病毒感染、降低其发生率和/或降低其严重程度的方法，所述方法包括向所述猪或野猪施用有效量的包含ASF病毒粒子、ASF病毒组分和/或免疫抑制蛋白因子的ASFV疫苗组合物。
一方面，所述ASF病毒组分是无活性的。
另一方面，所述ASFV疫苗组合物通过肌肉内或腹膜内注射来肠胃外施用。
还公开了一个示例性实施方式，其中所述ASFV疫苗组合物以一定的量施用，所述量提供的ASF病毒粒子、ASF病毒组分和/或免疫抑制蛋白因子的剂量为约0.05mg至约1.0mg/猪或野猪。
在另一个实施方式中，单位剂型包含有效量的ASFV疫苗组合物，所述疫苗组合物包含ASF病毒粒子、ASF病毒组分和/或免疫抑制蛋白因子。
一方面，所述ASF病毒组分衍生自ASF感染的脾单核细胞(SMNC)、ASF感染的外周血和单核细胞(PBMC)和/或ASF感染的原代肺泡巨噬细胞(PAM)。
另一方面，所述ASF病毒粒子和/或ASF病毒组分被灭活。
另一方面，所述ASFV疫苗用于在有ASF感染风险的猪或野猪中治疗和/或预防ASF感染。
在一个实施方式中，提供了一种特异性针对ASF病毒粒子和ASF病毒组分的免疫球蛋白，其用于在有ASF感染风险的猪或野猪中治疗和/或预防ASF感染。
在本文中应该理解并设想，所述ASFV疫苗可用于预防性治疗猪或野猪以对抗ASF感染。在另一个实施方式中，所述ASFV疫苗和ASFV特异性免疫球蛋白可以组合使用和/或可以在治疗方案中一起施用到猪或野猪。
附图说明
图1示出了制备ASFV疫苗的方法的示例性实施方式，通过施用ASFV疫苗来主动免疫接种猪或野猪的方法的实施方式，免疫接种或疫苗接种非猪或非易感物种宿主以产生ASFV特异性免疫球蛋白的方法的实施方式，以及通过施用ASFV特异性免疫球蛋白来被动免疫接种猪或野猪的方法的实施方式。
图2A-2D示出了用活ASFV疫苗组合物感染的原代肺泡巨噬细胞(PAM)的细胞病变效应。图2A示出了在用活ASFV疫苗组合物感染之前健康的PAM培养物的代表性显微镜图像。在用活ASFV疫苗组合物感染之后，可以在感染后3天(图2B)、感染后4天(图2C)和感染后7天(图2D)观察到培养物中PAM的细胞病变效应。
图3A和3B示出了通过向猪或野猪(图3A)或非猪或非易感物种宿主施用ASFV疫苗以产生ASFV特异性免疫球蛋白(图3B)的主动免疫接种的示例性实施方式。
图4示出了一个示例性实施方式的qPCR结果，在用活ASFV疫苗免疫接种的母鸡的血液中不存在ASFV。
图5示出了超过γ辐照的上限(即25kGy)对ASFV蛋白的影响。凝胶电泳显示，与未辐照的ASFV蛋白(第1-6道)相比，25kGy的γ辐照剂量后ASFV蛋白的结构显著改变(第8-11道)。分子量梯(Thang)示出在第7道中；顶部分子量标记物条带为200kDa，下部分子量标记物条带为10kDa。
图6A和6B示出了在第1天、第14天和第28天使用2种不同ASFV疫苗组合物和作为对照的盐水(无ASFV疫苗)进行免疫接种的3组母鸡中的ASFV p72特异性抗体滴度。收集由免疫接种的母鸡产下的蛋，提取免疫球蛋白，并在第14天(图6A)和第28天(图6B)使用重组ASFV主要衣壳蛋白p72(ASFV p72；NP_042775.1；SEQ ID NO：2)包被的酶联免疫吸附测定(ELISA)板评估ASFV特异性抗体滴度。
图7示出了在第1天、第14天和第28天使用2种不同ASFV疫苗组合物和作为对照的盐水(无ASFV病毒疫苗)进行免疫接种的3组母鸡中的ASFV特异性抗体滴度。从第30天开始收集由免疫接种的母鸡产下的蛋，提取免疫球蛋白，并使用重组ASFV主要衣壳蛋白p72(SEQID NO：2)包被的ELISA板评估ASFV特异性抗体滴度。
具体实施方式
定义
在下文中提供了一些定义。然而，定义也可能位于下面的“实施方式”部分中，并且上述标题“定义”并不意味着“实施方式”部分中的此类公开不是定义。
本文所使用的“约”、“大约”和“基本上”被理解为是指在一定数值范围，例如所指称数字的-10％至+10％、优选为所指称数字的-5％至+5％、更优选为所指称数字的-1％至+1％、最优选为所指称数字的-0.1％至+0.1％范围内的数字。
本文中的所有数值范围应该被理解为包括所述范围内的所有整数或分数。此外，这些数值范围应该被解释为对涉及该范围内的任何数字或数字子集的权利要求提供支持。例如，从1至10的公开应当被解释为支持从1至8、从3至7、从1至9、从3.6至4.6、从3.5至9.9等的范围。
当在本公开和权利要求书中使用时，没有具体数目的指称包括复数指称物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“组分”的指称包括两个或更多个组分。
词语“包含”应该被包含性而不是排他性地解释。同样地，术语“包括”、“含有”和“具有”均应被解释为包含性的，除非上下文明确禁止了这种解释。此外，就此而言，这些术语规定了所陈述的特征的存在，但不排除额外或其他特征的存在。
然而，本文公开的组合物和方法可以缺少本文中未具体公开的任何要素。因此，使用术语“包含”的实施方式的公开是(i)具有所鉴定的组分或步骤以及额外的组分或步骤的实施方式的公开，(ii)基本上由所鉴定的组分或步骤组成的实施方式的公开，和(iii)由所鉴定的组分或步骤组成的实施方式的公开。本文公开的任何实施方式可以与本文公开的任何其他实施方式组合。
在“X和/或Y”的情形中使用的术语“和/或”应该被解释为“X”或“Y”或“X和Y”。同样地，“X或Y中的至少一者”应该被解释为“X”或“Y”或“X和Y”。
当在本文中使用时，术语“实例”和“例如”，特别是在后面跟有条目列表时，仅仅是示例性和说明性的，并且不应被视为排他性或全面的。
“受试者”或“个体”是哺乳动物，优选为猪或野猪。本文所使用的“有效量”是在个体中预防感染、治疗疾病或医学病症的量，或者更通常来说，在一段时间内减轻疾病症状、管控疾病进展或减弱病毒感染的量。
术语“猪(pig)”是指家猪、野猪或野生猪。
术语“猪(swine)”是指家猪、野猪或野生猪。
术语“禽”是指野生或驯养的产蛋禽，例如鸡、鸭、天鹅、鹅、火鸡、孔雀、雌珍珠鸡、鸵鸟、鸽子、鹌鹑、野鸡或鸠。
术语“非易感物种”或“非易感宿主”是指对ASFV感染或总的来说ASF不易感的物种。
术语“免疫球蛋白”或“抗体”是指由白细胞和淋巴细胞产生的糖蛋白分子，并通过特异性识别和结合特定抗原并协助它们的中和而参与身体的免疫系统和免疫应答。
术语“抗原”或“免疫原”或“半抗原”是对身体来说是或被认为是外来的，并且单独地或在与较大分子形成复合物后唤起免疫应答的物质或结构或小分子。术语“抗原”、“免疫原”或“半抗原”在本公开中可互换使用。
术语“被动免疫”或“被动免疫接种”是指作为将来自另一个人、动物、物种或其他外部来源的抗体引入到受试者中的结果而产生的免疫。
术语“主动免疫”或“主动免疫接种”是指作为将抗原自然和/或人工引入到受试者中的结果而产生的免疫。
术语“佐剂”或“免疫佐剂”是指可以添加到疫苗中以刺激受试者免疫系统的应答的物质。
术语“免疫抑制蛋白因子”和/或“宿主过度反应性免疫因子”是指多种因子，它们可以包括但不限于细胞因子(例如TNF家族的细胞因子)、促炎性细胞因子(包括但不限于TNF-α(例如AEP25618)、IFN-α(例如AFK92985)、IL-1β(例如NP_001289317)、IL-6(例如AFK92986)、IL-8(例如NP_999032)、IL-12(例如AAA73897和/或NP_999178)、IL-18(例如NP_999162)和RANTES(例如NP_001123418))和/或参与被称为“细胞因子风暴”的免疫应答的细胞因子。术语“免疫抑制蛋白因子”和/或“宿主过度反应性免疫因子”在本文中可互换使用，并且通常是指逃避先天和/或适应性免疫应答的因子。“免疫抑制蛋白因子”和/或“宿主过度反应性免疫因子”可以衍生自ASFV感染的肺组织、脾组织和/或ASFV感染的外周血。
术语“治疗”包括预防性治疗(阻止和/或减缓靶向病理状况、感染、障碍或疾病的发展)和治愈性、治疗性或疾病改良性治疗两者，包括治愈、减缓、减轻被诊断的病理状况、感染、障碍或疾病的症状和/或停止其进展的治疗措施；以及对有发生疾病或感染的风险或疑似已发生疾病或感染的受试者以及患病或已被诊断为患有病理状况、感染、障碍或疾病的受试者的治疗。术语“治疗”并不一定暗示受试者接受治疗直至完全康复。术语“治疗”也指在未患有病理状况、感染、障碍或疾病，但可能易发生病理状况、感染、障碍或病症的个体中维持和/或促进健康。术语“治疗”还旨在包括一种或多种主要预防或治疗措施的强化或以其他方式的增强。作为非限制性实例，治疗可以由医生、医疗保健专业人员、兽医、兽医专业人员、动物管理员或其他人进行。
本文所使用的术语“单位剂型”是指适合作为单位剂量用于受试者的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的本文公开的组合物以及药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物，所述量足以产生所需效果。单位剂型的规格取决于所使用的具体化合物、要达到的效果以及宿主中与每种化合物相关的药效学。
术语“无菌的”被理解为意味着没有任何细菌或其他活微生物。
本文所使用的术语“药学上可接受的”是指当施用到受试者时不引起显著不良的过敏或免疫反应的物质。
除非另有表述，否则本文中表述的所有百分率均为组合物总重量的重量百分率。当本文提及pH时，数值对应于使用标准设备在约25℃下测量的pH。“环境温度”或“室温”在约15℃至约25℃之间，环境压力为约100kPa。
本文所使用的术语“mM”是指水性溶液的摩尔浓度单位，其是mmol/L。例如，1.0mM等于1.0mmol/L。
在提及特定组分时使用的术语“基本上没有”、“实质上不含”或“基本上不含”意味着存在的任何所述组分占比不超过约3.0重量％，例如不超过约2.0重量％、不超过约1.0重量％、优选地不超过约0.5重量％或者更优选地不超过约0.1重量％。
术语“食物”、“食品”和“食物组合物”意味着旨在供动物摄入并为所述动物提供至少一种营养素的产品或组合物。食品的优选实施方式包括蛋白、碳水化合物、脂类、维生素或矿物质中的至少一者。食品可以包括宏量营养素和/或微量营养素。
在本公开中，术语“免疫接种”或“疫苗接种”可互换使用。
实施方式
ASFV疫苗
本公开总的来说涉及一种ASFV疫苗，其包含全活ASFV粒子和天然表达的ASFV组分以及免疫抑制蛋白因子和/或宿主过度反应性免疫因子的组合，任选地在无菌缓冲液中稀释，例如在无菌盐水缓冲液中稀释至约10％。所述ASFV疫苗可用于主动免疫接种或疫苗接种非易感物种宿主以产生ASFV特异性免疫球蛋白。非易感物种宿主可以是非猪哺乳动物宿主例如禽、马、牛、驴、山羊或兔。
另一个实施方式涉及一种ASFV疫苗，其包含完整ASFV粒子和/或其片段和天然表达的ASFV组分的组合，任选地在无菌缓冲液中稀释。所述ASFV疫苗可用于主动免疫接种或疫苗接种非易感物种宿主以产生ASFV特异性免疫球蛋白。
本公开的另一方面总的来说涉及一种生产ASFV疫苗的方法。在优选实施方式中，所述ASFV抗原以及免疫抑制蛋白因子和/或宿主过度反应性免疫因子从ASF感染的猪或野猪获得。在一个实施方式中，可以从ASF感染的猪或野猪抽取血液并收集在含有抗凝剂的采血管中。可以例如将采血管在约4℃下以约1,500x g离心约15分钟，以获得血沉棕黄层。或者，可以通过Ficoll上的标准梯度离心或本领域技术人员已知的其他方法从血液分离含有外周血和单核细胞(PBMC)的血浆。此外，可以使用包含约0.83％ NH4Cl的溶液或通过本领域技术人员已知的任何其他方法裂解任何红细胞(RBC)。
收集和/或分离的PBMC可以通过一个或多个冻融循环来破坏和/或裂解，例如在干冰乙醇浴(约-72℃)中放置第一预定时间段，然后在室温下放置第二预定时间段。这个过程可以重复一次或多次。可以将所述破坏的PBMC在第二个离心步骤中离心，例如在约4℃下以约800x g离心约15分钟。所述上清液优选地含有完整ASF病毒粒子、ASF病毒组分、免疫抑制蛋白因子和/或宿主过度反应性免疫因子，并且可以被收集并用预定pH的缓冲液例如无菌盐水缓冲液稀释一倍或多倍，例如10倍。得到的ASFV疫苗可以分为一个或多个部分在低于室温的温度下储存，例如在等于或低于约-20℃下以约1ml的等分试样储存。在一个示例性实施方式中，在冷冻和储存之前可以评估上清液中的蛋白质含量和/或病毒滴度。
在另一个实施方式中，所述ASFV疫苗可以从ASFV感染的淋巴器官例如脾脏获得。可以从ASFV感染的猪或野猪收获脾脏，并将其解剖成多个组织切片。ASFV感染的脾组织不仅含有ASF病毒粒子和/或ASF病毒组分，而且含有免疫抑制蛋白因子和/或宿主过度反应性免疫因子。优选地，所述解剖在收获后立即进行。可以将所述组织切片添加到缓冲液中，并使用金属网切碎或在冰上匀浆。可以将所述匀浆的组织混合物离心以产生单细胞悬液，例如以约800x g在预定时间和预定温度下离心，例如在约4℃下离心约15分钟。所述单细胞悬液可能含有RBC和脾单核细胞(SMNC)。RBC可以使用包含约0.83％ NH4Cl的溶液或通过本领域技术人员已知的任何其他方法裂解。SMNC可以通过本领域技术人员已知的任何方法收集和裂解。可以通过离心除去细胞碎片，并且可以收集上清液。
所述上清液优选地含有完整ASF病毒粒子、ASF病毒组分、免疫抑制蛋白因子，并且可以通过Ficoll梯度离心收集SMNC。可以收集所述上清液和SMNC并进行一个或多个冻融循环，其中可以将所述混合物降低到低温，例如在干冰乙醇浴(约-70℃)中放置第一预定时间段，然后在室温下放置第二预定时间段。可以将上清液与破坏的SMNC的混合物在约4℃下以约800x g离心约15分钟。可以收集所述上清液并用预定pH下的缓冲液例如无菌盐水缓冲液稀释一倍或多倍，例如10倍。可以将得到的ASFV疫苗分成一个或多个部分在低于室温的温度下储存，例如在等于或低于-20℃、优选地约-70℃下以约1ml的等分试样储存。在另一个示例性实施方式中，可以在冷冻和储存之前评估上清液中的蛋白质含量和/或病毒滴度。
在另一个实施方式中，所述ASFV疫苗可以从其他ASFV感染的组织或器官例如肺获得。可以从ASFV感染的猪或野猪收获肺，并将其解剖成多个组织切片。ASFV感染的肺组织不仅含有ASF病毒粒子和/或ASF病毒组分，而且含有免疫抑制蛋白因子和/或宿主过度反应性免疫因子。优选地，所述解剖在收获后立即进行。可以将所述组织切片添加到缓冲液中，并使用金属网切碎或在冰上匀浆。可以将所述匀浆的组织混合物离心以产生单细胞悬液，例如以约800x g在预定时间和预定温度下离心，例如在约4℃下离心约15分钟。所述细胞悬液可以使用本领域普通技术人员已知的方法制备和裂解，以产生优选地含有完整ASF病毒粒子、ASF病毒组分和免疫抑制蛋白因子和/或宿主过度反应性免疫因子的上清液。
所述免疫抑制蛋白因子和/或宿主过度反应性因子例如TNF-α、IFN-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18和/或RANTES的量可以随着疾病进展和/或组织类型而变。使用总蛋白的总量将所述ASFV疫苗组合物标准化。
在另一个实施方式中，从健康的猪收集新鲜的原代肺泡巨噬细胞(PAM)，并铺于细胞培养瓶中，使用含有胎牛血清(FBS；图2A)的完全培养基进行过夜培养。在约24小时后，可以向培养物添加活的ASFV储用物。可以将所述ASF感染的PAM培养到在培养物中观察到至少约75％的细胞病变效应，例如在ASFV感染后约5至约7天之后(图2B、2C和2D)。可以收获、收集PAM和培养上清液，并且可以进行一个或多个冻融循环，其中可以将所述PAM混合物降低到低温，例如在干冰乙醇浴(约-70℃)中放置第一预定时间段，然后在室温下放置第二预定时间段。可以将上清液与破坏的PAM的混合物在约4℃下以约800x g离心约15分钟。可以收集所述上清液并用预定pH下的缓冲液例如无菌盐水缓冲液稀释一倍或多倍，例如10倍。可以将得到的ASFV疫苗分成一个或多个部分在低于室温的温度下储存，例如在等于或低于-20℃、优选地约-70℃下以约1ml的等分试样储存。在另一个示例性实施方式中，可以在冷冻和储存之前评估上清液中的蛋白质含量和/或病毒滴度。
在优选实施方式中，所述ASFV疫苗组合物包含来自SMNC、PBMC和/或PAM中的一者或超过一者的蛋白质混合物、ASF病毒粒子、ASF病毒组分和免疫抑制蛋白因子/宿主过度反应性因子。
在本文中应该理解并设想，所述ASFV疫苗组合物含有广范围的天然合成的ASFV抗原(即全面的ASFV蛋白)。应该理解，可以构成所述ASFV疫苗组合物的蛋白质或抗原可以包括完全的完整ASFV蛋白，和/或也可以包含所公开的ASFV蛋白的部分或区段。
还应该理解，如果需要，可以通过首先测试所述感染的猪来选择用于生产所述ASFV疫苗组合物的ASFV的特定基因型或血清型。此外或可选地，本文公开的ASFV治疗方法可以提供针对密切相关的病毒毒株、ASFV基因型和/或ASFV血清型的交叉保护。
本文还公开了在使用前灭活所述ASFV疫苗组合物的方法。在一个示例性实施方式中，可以使用γ辐照器以约2kGy至约20kGy的剂量范围辐照所述ASFV疫苗组合物。在约15kGy或约20kGy的剂量下，ASFV DNA被损坏，而病毒形态和病毒蛋白完整性通常得以保留。
此外或可选地，可以使用未辐照的ASFV疫苗疫苗接种或免疫接种非猪哺乳动物宿主例如禽、马、牛、驴、山羊或兔，以例如产生ASFV特异性免疫球蛋白。
ASFV特异性免疫球蛋白
本公开的另一方面总的来说涉及免疫接种或疫苗接种非易感物种宿主以产生ASFV特异性免疫球蛋白的方法。可以将包含完整ASF病毒粒子、ASF病毒组分、免疫抑制蛋白因子和宿主过度反应性免疫因子的ASFV疫苗例如约10％ ASFV疫苗在无菌盐水缓冲液中的等分试样(例如约1ml)融化至预定温度，涡旋振荡，并肌肉内注射到非猪哺乳动物宿主例如禽、马、牛、驴、山羊或兔中。在初始和任选的再免疫接种后，可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法收集宿主的静脉血样品。
在优选实施方式中，所述抗ASFV免疫球蛋白是由免疫接种或疫苗接种的产蛋禽例如鸡产生的IgY抗体。可以将包含完整ASF病毒粒子、ASF病毒组分和免疫抑制蛋白因子的ASFV疫苗例如约10％ASFV疫苗在无菌盐水缓冲液中的等分试样(例如约1ml)融化至室温，涡旋振荡，并肌肉内注射到产蛋禽中。优选地，将所述ASFV疫苗分成相等的级分(约100μg蛋白质含量/级分)，其中将一个级分注射到母鸡的左胸中并将第二个级分注射到母鸡的右胸中，任选地以大致相等的体积量，例如约500ml注射到右胸中和约500ml注射到左胸中。此外或可选地，在将ASFV疫苗注射到母鸡中之前，可以用完全弗氏佐剂(CFA)以约1:1的比例乳化所述ASFV疫苗。在另一个实施方式中，后续免疫接种可以包括包含约1:1的ASFV疫苗和不完全弗氏佐剂(IFA)的溶液的ASFV疫苗组合物。
在初始免疫接种后，例如在初始免疫接种后约7天和/或初始免疫接种后约14天和/或初始免疫接种后约28天，可以对所述母鸡进行再免疫接种。在初始免疫接种和任何再免疫接种后(例如在初始免疫接种后约27天)，可以收集由免疫接种的母鸡产下的蛋一天或多天，用于IgY抗体的纯化。或者，可以在免疫接种期间连续收集蛋。所述IgY抗体可以通过水溶性级分从所述收集的蛋黄中获得。可以将一个或多个蛋黄合并，并用冷却的3mM HCl稀释约10倍，以给出最终pH为约5的悬液(用约10％乙酸调节)。可以将所述悬液在例如约-20℃下冷冻过夜。在融化至预定温度后，可以将所述混合物在约4℃下以约13,000x g离心约15分钟，并且可以收集含有IgY免疫球蛋白的上清液。所述IgY免疫球蛋白可以通过本领域普通技术人员已知的各种沉淀方法进一步纯化，例如使用硫酸铵或生物相容性氯化钠(参见Hodek,P.等，提供电泳均质的制剂的鸡抗体(IgY)纯化的优化方案(Optimized Protocolof Chicken Antibody(IgY)Purification Providing Electrophoretically HomogenousPreparations)，8Int.J.Electrochem.Sci.113,113-124(2013))。或者，所述IgY免疫球蛋白可以从蛋清级分获得。
在某些实施方式中，所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物包含蛋黄或其任何含有IgY抗体的级分。蛋黄是鸡蛋的优选部分，因为蛋黄通常含有与蛋清相比浓度高得多的IgY。然而，蛋清可能含有足以用于某些应用的IgY浓度。
在所述抗体组合物的某些实施方式中，从鸡蛋的组成成分中浓缩、分离或纯化IgY。这可以通过各种方法例如本领域普通技术人员已知的方法来实现。如果需要，可以通过免疫测定法例如ELISA来确定IgY抗体的滴度。
在所述抗体组合物的某些实施方式中，所述组合物通过包括下述步骤的方法制备：获得由先前主动接种针对ASFV的疫苗的禽产下的蛋，并从所述蛋的蛋黄分离抗体级分。所述禽优选为驯养的禽。所述驯养的禽可以是鸡、鸭、天鹅、鹅、火鸡、孔雀、雌珍珠鸡、鸵鸟、鸽子、鹌鹑、野鸡、鸠或其他驯养的禽。所述驯养的禽优选为鸡。更优选地，所述驯养的禽是主要为生产蛋或肉而饲养的驯养鸡。
在所述抗体组合物的某些实施方式中，所述抗体组合物通过包括下述步骤的方法制备：用针对ASFV的疫苗主动接种母鸡，在免疫接种期后从所述母鸡收集鸡蛋，并从所述鸡蛋的蛋黄分离抗体级分。任选地，从母鸡收集鸡蛋可以在免疫接种期后连续进行。
产生具有特定靶的IgY的其他方法对于本领域技术人员来说是已知的，但是以前不知道这些方法可成功用于生产针对ASFV的抗体。本章节中公开的抗体适合用于本公开中描述的任何方法和组合物中。
已经发现，来自禽蛋的IgY抗体通常具有高成本效益，并且是病毒黏附抑制剂(即免疫球蛋白)的丰富来源。此类抗体结合到携带抗原的病毒(例如ASFV)的表面，从而阻止病毒与潜在宿主细胞之间的接触的初始阶段。其他IgY抗体与在感染细胞表面上表达的内部病毒蛋白结合，进一步减少和/或防止病毒从感染细胞传播到未感染细胞。正如本公开中别处所解释的，阻止病毒与宿主细胞之间的黏附的初始阶段以及抑制病毒传播具有大量应用，包括治疗病毒性疾病和预防病毒性疾病。
在所述抑制剂的某些实施方式中，所述抑制剂包含禽蛋的组成成分，其中所述禽蛋包含抑制黏附的有效量的特异性针对ASFV的IgY。此外或可选地，所述抑制剂包含禽蛋的组成成分，其中所述禽蛋包含有效量的特异性针对ASFV的IgY以抑制病毒传播。所述禽蛋的组成成分可以是本公开中被描述为适合的抗体组合物的任何组成成分。
提供了阻止病毒与细胞的黏附和/或病毒传播的方法。病毒感染细胞中的第一步是病毒与细胞之间的接触和黏附。尽管这一步骤对建立感染至关重要，但在这个早期阶段预防感染的方法很少。更通常，病毒感染使用诸如主动疫苗接种的技术来对抗，所述技术使身体产生中和病毒的抗体。如果主动疫苗接种不可行，大多数情况下病毒性疾病只能进行对症治疗。这里描述的方法提供了一种有效的方式来阻止感染过程中的这一早期步骤，而不需像主动疫苗接种所要求的那样在受试者暴露于病原体之前很早就施用。
抗体可以通过与病毒结合并干扰病毒结合其靶膜受体的能力，起到防止病毒与细胞之间的黏附的作用。此外，抗体可以通过与在感染细胞的表面上表达的病毒蛋白结合，起到阻止病毒从感染细胞传播到未感染细胞的作用。在这种应用中，禽抗体(例如IgY)与哺乳动物抗体相比具有明显优势，特别是当受试者是哺乳动物时。如上所述，IgY抗体的优点包括IgY抗体与哺乳动物抗体相比更具特异性、更稳定，并且引起更少的不想要的形式的免疫应答。IgY抗体也可以容易且廉价地从鸡蛋获得。
在所述方法的一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用有效抑制黏附的量的病毒黏附抑制剂。所述病毒黏附抑制剂可以是本文公开的ASFV特异性免疫球蛋白组合物的任何实施方式。在所述方法的某些实施方式中，所述病毒黏附抑制剂包含禽蛋的组成成分，所述组成成分包括有效抑制黏附的量的特异性针对ASFV的IgY。所述组成成分可以是本文公开的作为适合的抗体组合物的任何组成成分。
在所述方法的某些实施方式中，所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物是包含禽蛋的内含物的药物，所述禽蛋的内含物包括有效量的特异性针对ASFV的IgY。所述药物可以包含本文所讨论的额外组分。所述药物可以通过本领域中已知的或本文所描述的任何方法施用。
治疗方法
本公开的又一个方面总的来说涉及一种ASFV疫苗和ASFV特异性免疫球蛋白的药学上可接受的组合物，其可以施用到感染或暴露于ASFV的猪或野猪。此外或可选地，所述ASFV疫苗可以施用到如前所述的非猪哺乳动物宿主。
在一个实施方式中，所述ASFV疫苗和/或ASFV特异性免疫球蛋白采取组合物、例如但不限于药物组合物的形式。所公开的组合物可以包含一种或多种上文公开的此类组合物以及药学上可接受的载体。此类载体和配制方法的实例可以在《Remington药物学科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)(第20版，Lippincott,Williams&Wilkins,Daniel Limmer主编)中找到。为了形成适合于施用的药学上可接受的组合物，此类ASFV特异性免疫球蛋白组合物含有治疗有效量的抗体。所述抗体的治疗有效量可以是在受试者(即猪或野猪)中有效抑制黏附的量和/或有效产生被动免疫的量。此外或可选地，为了形成适合于施用的药学上可接受的组合物，此类ASFV疫苗组合物含有治疗有效量的ASFV抗原(例如ASFV病毒粒子和/或ASF病毒组分)。所述被辐照的ASFV抗原的治疗有效量可以是在受试者(即猪或野猪)中有效产生保护性免疫的量。
本公开的药物组合物可用于本公开的治疗和预防方法中。此类组合物可以以足以递送治疗有效量的ASFV特异性免疫球蛋白或ASFV疫苗的量施用到猪或野猪，以便在本文公开的治疗和预防方法中有效。所述治疗有效量可以随着各种因素而变，例如但不限于受试者的状况、体重、性别和年龄。其他因素包括施用方式和部位。所述药物组合物可以以本领域中已知的任何方法提供给所述受试者。示例性施用途径包括但不限于腹膜内、肌肉内、皮下、静脉内、局部、表皮、口服、骨内、鼻内。ASFV特异性免疫球蛋白的口服施用可以通过添加到受试者的饲料(固体或液体)来实现。
本公开的组合物可以仅对受试者施用一次或对受试者施用超过一次。此外，当所述组合物被施用到受试者超过一次时，可以使用各种方案，例如但不限于每天一次、每周一次、每月一次或每年一次。所述组合物也可以每天向受试者施用超过一次。所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物和/或ASFV疫苗组合物的治疗有效量和适合的给药方案可以通过常规测试来鉴定，以便获得最佳活性，同时使任何潜在副作用最小化。所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物和ASFV疫苗组合物可以单独施用到独立的受试者。此外或可选地，所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物和ASFV疫苗组合物可以在各种治疗方案中共同施用到有需要的个体受试者。此外，其他药剂的共同施用或顺序施用可能是合乎需要的。
本公开的组合物可以全身性施用，例如通过腹膜内、静脉内或肌肉内施用。
本公开的组合物还可以包含改善抗体的溶解性、半衰期、吸收等的试剂。此外，本公开的组合物还可以包含减轻抗体的不希望的副作用和/或降低其毒性的试剂。此类试剂的实例被描述在各种文本中，例如但不限于《Remington药物学科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)(第20版，Lippincott,Williams&Wilkins,Daniel Limmer主编)。
本公开的组合物可以以各种给药剂型施用。例如，所述组合物可以以例如但不限于注射液、冻干粉或颗粒的形式施用。
在本公开中，所述药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。此类载体包括但不限于媒介物、佐剂、悬浮剂、惰性填充剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、黏合剂、缓冲剂、崩解剂和载体。通常，药学上可接受的载体在使用条件下对活性抗体是化学惰性的，并且没有有害副作用或毒性。药学上可接受的载体可以包括聚合物和聚合物基质。药学上可接受的载体的性质可以根据所使用的特定剂型和组合物的其他特征而不同。
例如，对于采取固体形式例如但不限于粉末或颗粒的ASFV特异性免疫球蛋白的口服施用而言，抗体可以与口服无毒的药学上可接受的惰性载体组合，例如但不限于惰性填充剂、适合的黏合剂、润滑剂、崩解剂和辅助剂。适合的黏合剂包括但不限于淀粉、明胶、天然糖类例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶例如阿拉伯树胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。在这些剂型中使用的润滑剂包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。
适合于胃肠外施用的制剂包括等渗无菌注射水溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，以使所述制剂与受试者的血液等渗；以及水性悬液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。所述组合物可在生理上可接受的稀释剂中施用，所述稀释剂例如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和相关的糖溶液。
可用于胃肠外制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物油。用于胃肠外制剂的适合的脂肪酸包括聚乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯例如失水山梨糖醇单油酸酯，以及环氧乙烷与疏水性碱的高分子量加合物，其通过环氧丙烷与丙二醇、油酸、硬脂酸和异硬脂酸的缩合而形成。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是适合的脂肪酸酯的实例。用于肠胃外制剂的适合的皂包括脂肪碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，适合的去污剂包括(a)阳离子型去污剂，例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶鎓卤化物，(b)阴离子型去污剂，例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘油酯硫酸盐，以及磺基琥珀酸酯，(c)非离子型去污剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性去污剂，例如β-氨基丙酸烷基酯和2-烷基咪唑啉季铵盐，以及(e)它们的混合物。
适合的防腐剂和缓冲液可用于此类制剂中。为了最小化或消除注射部位处的刺激，此类组合物可以含有一种或多种亲水-亲脂平衡(HLB)为约12至约17的非离子型表面活性剂。
本公开的组合物也可以与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。此类聚合物可以包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或被棕榈酰基残基取代的聚环氧乙烯聚赖氨酸。此外，本发明的抗体可以与一类可用于实现药物的受控释放的可生物降解聚合物偶联，例如聚乳酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。
本公开的药物组合物可以被修饰以防止在受试者中的不良反应。此类潜在的不良反应包括宿主识别、变态反应、局部炎症和其他形式的过敏反应。
对免疫球蛋白组合物的不良反应在异源抗体治疗中比在同源抗体治疗中更常见，尽管IgY抗体在这方面的优势已被解释。在所述药物组合物的某些实施方式中，抗体被修饰以改变分子的Fc区。在其他实施方式中，抗体被处理以防止抗体的Fc区与细胞的Fc受体之间的结合。
本公开的药物制剂可以以任何药学上可接受的形式储存，包括水溶液、冷冻水溶液、冻干粉或本文描述的任何其他形式。
所述药学上可接受的ASFV特异性免疫球蛋白组合物和/或ASFV疫苗组合物的非限制性实例优选地还包含抗炎药。
所述药学上可接受的ASFV特异性免疫球蛋白组合物的非限制性实例优选还包含抗体的抗原结合片段例如Fab或Fab2片段，其可以替代抗体。例如，所述抗原结合片段可以是包括原始IgY的抗原结合区的任何片段。在所述组合物和方法的某些实施方式中，可以用IgY抗体的修饰版本代替IgY抗体，只要所述IgY抗体的抗原结合区保留其识别ASFV的能力即可。
所述药学上可接受的ASFV疫苗组合物的非限制性实例优选地还包含冻干粉的组合物，以例如用于长期储存和/或运输。所述冻干疫苗可以在用于免疫接种或疫苗接种之前在溶液例如盐水中重构至大约原始体积。
本公开的一个方面是一种治疗感染或暴露于ASFV的猪或野猪的优选方法，所述方法包括在感染或暴露于ASFV的猪或野猪中产生被动免疫(图1)。所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物可包含额外的组分作为本公开中别处讨论的药物组分。所述ASFV特异性免疫球蛋白组合物可通过腹膜内或肌肉内注射施用到有需要的感染或暴露于ASFV的猪或野猪，剂量为约0.5至约1.0mg/kg体重，每周两次，持续一周或多周。
本公开的一个方面是一种通过施用包含ASFV特异性免疫球蛋白的组合物来治疗感染或暴露于ASFV的猪或野猪的方法。ASFV特异性免疫球蛋白可以口服施用到有需要的感染或暴露于ASFV的猪或野猪，剂量为约1.0mg/kg体重，添加到饲料，每天约一次，连续约5至约7天。
此类ASFV特异性免疫球蛋白的口服施用方法另外包括单独地或与蛋清相组合口服施用未煮过的蛋黄或蛋黄级分。生蛋黄或蛋黄级分的口服施用可以例如通过食用蛋黄级分来进行。蛋黄级分或水溶性蛋黄级分可与其他成分相组合施用，以使其更可口或更有营养。因此，蛋黄级分可以被受试者作为食物摄入；或者，蛋黄级分可以作为药物组合物的一部分来摄入。它优选是未煮过或非常轻微煮过的蛋黄级分，因为煮熟可以使抗体失活。
在一个实施方式中，蛋黄的水溶性级分可以容易地与任何类型的食物或任何可食用成分混合。所述组合物也可以被配制成含有或提供动物所需的一部分宏量营养素和微量营养素，并且可以作为动物常规饮食的替代品或补充品提供。所述组合物可以作为零食、甜食、咀嚼物或正常食物摄入的其他补充剂提供、添加到其中或与其混合。
所述治疗方法的非限制性实例包括肠胃外或口服施用的增加剂量的ASFV特异性免疫球蛋白，并组合或可选地以增加的给药频率施用。本公开的一个方面是一种用于治疗感染或暴露于ASFV的猪或野猪的妊娠母猪、母猪的胎儿和/或仔猪的优选方法。通过本公开中别处讨论的方法将ASFV特异性免疫球蛋白施用到妊娠母猪。仔猪和/或猪胎儿在妊娠和/或哺乳期间直接或间接接受所述ASFV疫苗。
本公开的另一方面是一种用于对ASF感染易感的猪或野猪的优选的预防性治疗方法(图1)。可以将辐照过的ASFV疫苗组合物优选地施用到受试者(即猪或野猪)，包括但不限于已暴露于ASFV的受试者、对ASF感染易感的受试者和/或被ASFV感染的受试者。所述ASFV疫苗组合物可以包含额外的组分，例如本公开中别处讨论的药物组分。所述ASFV疫苗组合物可以通过腹膜内、皮下或肌肉内注射施用到受试者，对于体重为大约20kg的较年轻(即不老的)猪来说剂量为约0.05mg/剂至约1.0mg/剂。优选地，所述ASFV疫苗组合物以大约100μg的剂量施用。此外或可选地，所述ASFV疫苗组合物可以向个体受试者施用超过一次。例如，免疫接种可以在第一次或初次免疫接种后14天加强一次。此外，第三次免疫接种可以在第一次或初次免疫接种后21天进行。
本文公开了图3A中图示的示例性实施方式，具体来说是一种治疗受试者的方法，所述方法包括：将第一剂ASFV疫苗组合物与CFA以1:1的比例一起施用。然后在大约两周后，可以将第二剂ASFV疫苗组合物与IFA以1:1的比例一起施用到受试者。在第一次或初次免疫接种后约四周，所述猪或野猪可以接受ASFV攻毒，以确定免疫接种的受试者是否可以在致命的ASF感染中存活。辐照过的ASFV疫苗可以以相当于约104HAD50(50％血细胞吸附剂量)至约105HAD50的活病毒的范围给药。
实施例
下面的非限制性实施例支持了使用药学上可接受的ASF疫苗组合物来产生用于治疗感染的猪和/或野猪或用于预防猪和/或野猪的感染的抗体的概念。
实施例1
来自ASFV感染的免疫细胞的活ASFV疫苗组合物
从ASFV感染的猪收集新鲜脾脏，并将10g脾脏转移到带有金属网的皮氏培养皿中。使用金属网将脾组织切碎，并收集单细胞。使用0.83％ NH4Cl裂解污染的RBC。将SMNC用冷PBS清洗，并进行两次冻融循环。将SMNC裂解物离心并收集上清液。
从ASFV感染的猪采集外周血(40ml)到乙二胺四乙酸(EDTA)处理的采血管中，并进行离心。收集含有白细胞或PBMC的血沉棕黄层。将PBMC用冷PBS清洗，并进行两次冻融循环。将PBMC裂解物离心并收集上清液。
接下来，从健康、未感染的猪收集肺泡巨噬细胞，并在无血清培养基中培养(图2A)。第二天，将PAM用ASFV储用物感染。将ASFV感染的PAM培养7天。在ASFV感染后3天(图2B)、ASFV感染后4天(图2C)和ASFV感染后7天(图2D)观察PAM的细胞病变效应。收集包括细胞和培养基在内的ASFV感染的PAM培养物的全部内含物(约2x 108个细胞)并进行两个冻融循环，离心并收集上清液。
使用血细胞吸附测试确定来自SMNC、PBMC和PAM裂解物的上清液的病毒滴度。基于50％血细胞吸附剂量(HAD50)将裂解物等量混合，得到活ASFV疫苗组合物。分析衍生自SMNC、PBMC和ASFV的活疫苗组合物的蛋白质浓度(表1)。
表1：活ASFV疫苗组合物
疫苗衍生自： SMNC PBMC PAM
体积(ml) 50 100 20
蛋白质浓度(mg/ml) 0.33 0.3 0.67
病毒滴度(log10HAD50/ml) 6.18 6.49 6.14
实施例2
灭活ASFV疫苗组合物
首先，从患有严重ASFV感染的猪收集新鲜脾脏和肺，并使用组织匀浆器在冷PBS中匀浆。将匀浆物进行两次冻融循环并离心。收集来自ASFV感染的组织的上清液，测定病毒滴度，并如实施例1中所述将上清液用于制备活ASFV疫苗组合物。
将衍生自ASFV感染的组织(来自患有严重ASFV感染的猪的新鲜脾脏和肺)的活ASFV疫苗组合物以及实施例1中描述的衍生自SMNC、PBMC和PAM裂解物的活ASFV疫苗组合物，通过使用60Co辐照器对组合物进行γ-辐照来灭活。
将γ-辐照过的ASFV疫苗组合物添加到健康PAM培养物中。当在培养超过7天后PAM未显示出血细胞吸附或细胞病变效应时，证实了γ-辐照的ASFV疫苗组合物的完全ASFV失活。也将所述γ-辐照过的ASFV疫苗组合物注射到健康猪中，其没有出现ASF症状。
实施例3
用活ASFV疫苗组合物免疫接种母鸡
将三组母鸡(每组n＝3)在第1天、第14天和第28天用活ASFV疫苗免疫接种。第1组接受作为对照的盐水(无疫苗)，第2组接受ASFV疫苗制剂1，其含有全ASF病毒粒子、ASF病毒组分和源自受感染的脾脏的免疫抑制蛋白因子，第3组接受ASFV疫苗制剂2，其包含全ASF病毒粒子、ASF病毒组分和源自受感染的脾脏和外周血的免疫抑制蛋白因子。在第二次和第三次免疫接种后采集血液样品，并使用qPCR分析ASFV DNA的存在。在先前用活ASFV疫苗组合物免疫接种的鸡的血液样品中未检测到ASFV DNA，证实了在免疫接种的母鸡中没有病毒脱落。图4是代表性qPCR图，显示了在来自第2组中的免疫接种的母鸡的血液样品中没有ASFVDNA。
实施例4
ASFV蛋白的γ辐照
分离衍生自ASFV感染的组织的ASFV蛋白，并对其进行γ辐照。图5显示了高剂量γ辐照(即25kGy)对ASFV蛋白的损伤作用。凝胶电泳揭示了25kGy辐照对ASFV蛋白的影响(50mg/道；第8-11道)并与未辐照的ASFV蛋白样品(50mg/道；第1-6道)进行比较；分子量梯显示在第7道(Thang)中，顶部分子量标志物条带为200kDa，下部条带为10kDa。γ辐照的剂量对活ASFV疫苗的生存率至关重要(参见图5)。实验4显示，γ辐照剂量应低于25kGy，优选地不超过约20kGy，因为更高剂量的γ辐照对ASFV疫苗产生抗体来说是不可行的，因为它们改变了ASFV蛋白的结构。
实施例5
ASFV特异性免疫球蛋白的产生
在第二次和第三次免疫接种后，从实施例3中描述的免疫接种的母鸡收集鸡蛋。使用简单的水稀释法从蛋黄提取IgY免疫球蛋白。然后使用重组ASFV主要衣壳蛋白p72包被的ELISA板(SEQ ID NO：2)分析这些免疫球蛋白组合物的ASFV特异性抗体的滴度。如图6中所示，实施例5的结果证实，用活ASFV疫苗组合物免疫接种的鸡在14天后(图6A)和28天后(图6B)产生对ASFV组分例如ASFV主要衣壳蛋白p72(SEQ ID NO：2)具有全面特异性的IgY抗体池。
实施例6
单剂ASFV特异性免疫球蛋白延迟了具有严重ASFV感染的猪的ASF症状发作并延长其生存期
从来自ASFV感染的猪的ASFV感染的脾脏的匀浆物和ASFV感染的含有PBMC的血沉棕黄层制备ASFV疫苗组合物。将PBMC混合物在干冰乙醇浴中冷冻并融化至室温。将冻融程序重复两次。向三组产蛋鸡(n＝3/组)施用对照或ASFV疫苗的两种不同制剂之一。第1组接受作为对照的盐水(无疫苗)，第2组接受ASFV疫苗制剂1(从脾脏匀浆物制备)，第3组接受ASFV疫苗制剂2(从脾脏匀浆物制备)。在第1天、第14天和第30天，通过施用ASFV疫苗组合物(通过肌肉内注射)或给予对照，对母鸡进行主动免疫接种。在第14天第二次免疫接种后从鸡获取血液样品，qPCR证实没有病毒脱落。
在第三次免疫接种后每天收集鸡蛋。使用简单的水稀释法从蛋黄提取IgY免疫球蛋白。如前文实施例5中所述分析ASFV特异性抗体的滴度；结果示出在图7中。
由于ASFV特异性抗体滴度高，将从接受ASFV疫苗组合物制剂2的母鸡收集的鸡蛋用于制备将要施用到猪的ASFV特异性免疫球蛋白组合物。
三组成年猪被指定为A、B和C。A组由6只成年猪(每只约20kg)组成，在暴露于ASFV前一天(第1天)接受100mg ASFV特异性免疫球蛋白组合物。B组由3只成年猪组成，它们在暴露于ASFV后一天(第3天)接受100mg ASFV特异性免疫球蛋白组合物。最后，C组由3只成年猪组成，暴露于ASFV，并且不接受ASFV特异性免疫球蛋白组合物。所有三组猪都接受了产生了严重ASFV感染的大约105个活的传染性病毒粒子的高剂量ASFV(第2天)。
临床观察显示，使用ASFV特异性免疫球蛋白的治疗延迟了ASFV暴露后的症状发作。未治疗的猪(C组)在第6天开始显示出最初的ASF症状，包括活动减少(即嗜睡)、食欲下降(即食物消耗减少)和呼吸急促(即呼吸困难)。症状迅速恶化，并且到第8天，来自C组的三只猪都停止进食。在严重ASFV感染后一天接受ASFV特异性免疫球蛋白的猪(B组)经历症状发作的延迟，在第8天表现出最初的ASF症状。在严重ASFV感染前一天接受ASFV特异性免疫球蛋白的猪(A组)中观察到ASF症状发作的甚至更大的延迟。A组猪在第10天出现最初的ASF症状。
除了延迟严重ASFV感染后的症状发作之外，使用ASFV特异性免疫球蛋白的治疗还延长了生存期。C组猪的平均存活日为第9天，C组的最后一只猪活到第11天。与未治疗的猪相比，使用ASFV特异性免疫球蛋白治疗的猪经历了延长的生存期，平均生存期为第13天。A组和B组的最后一只猪存活到第17天。
结果显示，在严重ASFV感染之前或之后施用ASFV特异性免疫球蛋白组合物产生被动免疫，延迟ASF症状发作，并延长生存期。
序列表
<110> IGY免疫技术和生命科学公司（IGY Immune Technologies and Life SciencesInc.）
<120> 靶向非洲猪瘟病毒的疫苗和免疫球蛋白、其制备方法及其使用方法
<130> 1401870.00015
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1941
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒
<400> 1
atggcatcag gaggagcttt ttgtcttatt gctaacgatg ggaaggccga caagattata 60
ttggcccaag acttgcttaa tagcaggatt tctaacatta aaaatgtgaa caaaagttat 120
gggaaacccg accccgaacc cactttgagt caaatcgaag aaacacattt ggttcatttt 180
aatgcgcatt ttaagcctta tgttccagta gggtttgaat acaataaagt acgcccgcat 240
acgggtaccc ccaccttggg aaacaagctt acctttggta ttccccagta cggagacttt 300
ttccatgata tggtgggcca ccatatattg ggtgcatgtc attcgtcctg gcaggatgct 360
ccgattcagg gcacggccca gatgggggcc catggtcagc ttcaaacgtt tcctcgcaac 420
ggatatgact gggacaacca aacaccttta gagggcgccg tttacacgct tgtagatccc 480
tttggaagac ctattgtacc cggcacaaag aatgcgtacc gaaacttggt ttactactgc 540
gaataccccg gagaacgact ttatgaaaac gtaagattcg atgtaaatgg aaattccctg 600
gacgaatata gttcggatgt cacaacgctt gtgcgcaaat tttgcatccc aggggataaa 660
atgactggat ataagcactt ggtcggccag gaggtatcgg tggagggaac tagtggccct 720
ctcctatgca acattcatga tttgcacaag ccgcaccaaa gcaaacctat tcttaccgat 780
gaaaatgata cgcagcgaac gtgcagccat accaacccga aattcctttc acaacatttt 840
cccgagaact ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tattacggac 900
gcaacgtatc tggacataag acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct 960
aaatactatc agccccctct tgcgctctgg attaagctgc gcttttggtt taacgagaac 1020
gtgaaccttg ctattccctc ggtatccatt cccttcggcg agcgctttat caccataaag 1080
cttgcatcgc aaaaggattt ggtgaatgaa tttcctggac tttttatacg ccagtcgcgt 1140
tttatacctg gacgccccag tagacgcaat atacgcttta aaccatggtt tatcccagga 1200
gtcattaatg aaatctcgct cacgaataat gaactttaca tcaataacct gtttgtaacc 1260
cctgaaatac acaacctttt tgtaaaacgc gttcgatttt ccctgatacg tgtccataaa 1320
acgcaggtga cccacaccaa caataaccac cacgatgaaa aactaatgtc tgctcttaaa 1380
tggcccattg aatatatgtt tataggatta aaacctacct ggaacatctc cgatcaaaat 1440
cctcatcaac accgagattg gcacaagttc ggacatgttg ttaacgccat tatgcagcct 1500
actcaccacg cagagataag ctttcaggat agagatacag ctcttccaga cgcatgttca 1560
tctatatcgg atattagccc cgttacgtat ccgatcacat tacctattat taaaaacatt 1620
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tccagagcaa gagaatttta tattagttgg gacacggatt acgtggggtc tatcactacg 1860
gctgatcttg tggtatcggc atctgctatt aactttcttc ttcttcagaa cggttcagct 1920
gtgctgcgtt acagtaccta a 1941
<210> 2
<211> 646
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒
<400> 2
Met Ala Ser Gly Gly Ala Phe Cys Leu Ile Ala Asn Asp Gly Lys Ala
1 5 10 15
Asp Lys Ile Ile Leu Ala Gln Asp Leu Leu Asn Ser Arg Ile Ser Asn
20 25 30
Ile Lys Asn Val Asn Lys Ser Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Glu Pro Thr
35 40 45
Leu Ser Gln Ile Glu Glu Thr His Leu Val His Phe Asn Ala His Phe
50 55 60
Lys Pro Tyr Val Pro Val Gly Phe Glu Tyr Asn Lys Val Arg Pro His
65 70 75 80
Thr Gly Thr Pro Thr Leu Gly Asn Lys Leu Thr Phe Gly Ile Pro Gln
85 90 95
Tyr Gly Asp Phe Phe His Asp Met Val Gly His His Ile Leu Gly Ala
100 105 110
Cys His Ser Ser Trp Gln Asp Ala Pro Ile Gln Gly Thr Ala Gln Met
115 120 125
Gly Ala His Gly Gln Leu Gln Thr Phe Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp
130 135 140
Asp Asn Gln Thr Pro Leu Glu Gly Ala Val Tyr Thr Leu Val Asp Pro
145 150 155 160
Phe Gly Arg Pro Ile Val Pro Gly Thr Lys Asn Ala Tyr Arg Asn Leu
165 170 175
Val Tyr Tyr Cys Glu Tyr Pro Gly Glu Arg Leu Tyr Glu Asn Val Arg
180 185 190
Phe Asp Val Asn Gly Asn Ser Leu Asp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Thr
195 200 205
Thr Leu Val Arg Lys Phe Cys Ile Pro Gly Asp Lys Met Thr Gly Tyr
210 215 220
Lys His Leu Val Gly Gln Glu Val Ser Val Glu Gly Thr Ser Gly Pro
225 230 235 240
Leu Leu Cys Asn Ile His Asp Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys Pro
245 250 255
Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp Thr Gln Arg Thr Cys Ser His Thr Asn
260 265 270
Pro Lys Phe Leu Ser Gln His Phe Pro Glu Asn Ser His Asn Ile Gln
275 280 285
Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile Thr Pro Ile Thr Asp Ala Thr Tyr Leu
290 295 300
Asp Ile Arg Arg Asn Val His Tyr Ser Cys Asn Gly Pro Gln Thr Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Tyr Gln Pro Pro Leu Ala Leu Trp Ile Lys Leu Arg Phe Trp
325 330 335
Phe Asn Glu Asn Val Asn Leu Ala Ile Pro Ser Val Ser Ile Pro Phe
340 345 350
Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala Ser Gln Lys Asp Leu Val
355 360 365
Asn Glu Phe Pro Gly Leu Phe Ile Arg Gln Ser Arg Phe Ile Pro Gly
370 375 380
Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly
385 390 395 400
Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn
405 410 415
Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg
420 425 430
Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr His Thr Asn Asn
435 440 445
Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu
450 455 460
Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile Ser Asp Gln Asn
465 470 475 480
Pro His Gln His Arg Asp Trp His Lys Phe Gly His Val Val Asn Ala
485 490 495
Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Ile Ser Phe Gln Asp Arg Asp
500 505 510
Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro Val
515 520 525
Thr Tyr Pro Ile Thr Leu Pro Ile Ile Lys Asn Ile Ser Val Thr Ala
530 535 540
His Gly Ile Asn Leu Ile Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser
545 550 555 560
Tyr Ile Pro Phe His Tyr Gly Gly Asn Ala Ile Lys Thr Pro Asp Asp
565 570 575
Pro Gly Ala Met Met Ile Thr Phe Ala Leu Lys Pro Arg Glu Glu Tyr
580 585 590
Gln Pro Ser Gly His Ile Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile
595 600 605
Ser Trp Asp Thr Asp Tyr Val Gly Ser Ile Thr Thr Ala Asp Leu Val
610 615 620
Val Ser Ala Ser Ala Ile Asn Phe Leu Leu Leu Gln Asn Gly Ser Ala
625 630 635 640
Val Leu Arg Tyr Ser Thr
645

Claims (50)

1.一种在感染的猪或野猪中治疗非洲猪瘟(ASF)病毒(ASFV)感染的方法，所述方法包括：
向产蛋禽施用第一组合物，所述第一组合物包含一种或多种免疫抑制蛋白因子并且还包含ASF病毒粒子和/或ASF病毒组分；和
向所述感染的猪或野猪提供第二组合物，所述第二组合物包含来自已施用所述第一组合物的产蛋禽的蛋黄的水溶性级分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二组合物以一定的量施用到所述感染的猪或野猪，所述量提供的蛋黄的水溶性级分的剂量为约0.05mg至约1.0mg/kg所述感染的猪或野猪的体重。
3.根据权利要求1所述的方法，其中将所述第二组合物施用到所述感染的猪或野猪一段时间，所述时间包括每周至少一次或连续7天。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二组合物通过肌肉内或腹膜内注射而肠胃外施用到所述感染的猪或野猪。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二组合物是口服施用的食品。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述食品还包含食物物质、营养素和/或调味剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述营养素包括宏量营养素。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述营养素包括微量营养素。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述ASF病毒粒子和ASF病毒组分被灭活。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述ASF病毒粒子和ASF病毒组分通过γ辐照来灭活。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述ASF病毒粒子、ASF病毒组分和/或免疫抑制蛋白因子衍生自ASFV感染的脾单核细胞(SMNC)、ASF感染的外周血和单核细胞(PBMC)和/或ASF感染的原代肺泡巨噬细胞(PAM)。
12.一种在有ASF病毒感染风险的猪或野猪中预防ASF病毒感染、降低其发生率和/或降低其严重程度的方法，所述方法包括：
向产蛋禽施用第一组合物，所述第一组合物包含一种或多种免疫抑制蛋白因子并且还包含ASF病毒粒子和/或ASF病毒组分；和
向所述猪或野猪提供第二组合物，所述第二组合物包含来自已施用所述第一组合物的产蛋禽的蛋黄的水溶性级分。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二组合物以一定的量施用到所述猪或野猪，所述量提供的蛋黄的水溶性级分的剂量为约0.05mg至约1.0mg/kg有ASF病毒感染风险的感染的猪或野猪的体重。
14.根据权利要求12所述的方法，其中将所述第二组合物施用到所述猪或野猪一段时间，所述时间包括每周至少一次或连续7天。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二组合物肠胃外施用到所述猪或野猪。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二组合物通过肌肉内或腹膜内注射而肠胃外施用到所述猪或野猪。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二组合物是口服施用的食品。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述食品还包含食物物质、营养素和/或调味剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述营养素包括宏量营养素。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述营养素包括微量营养素。
21.根据权利要求12所述的方法，其中所述ASF病毒粒子和ASF病毒组分被灭活。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述ASF病毒粒子和ASF病毒组分通过γ辐照来灭活。
23.一种生产在感染的猪或野猪中有效治疗、预防非洲猪瘟(ASF)病毒(ASFV)感染、降低其发生率和/或降低其严重程度的可口服施用的组合物的方法，所述方法包括将从已施用一种或多种免疫抑制蛋白因子和ASF病毒粒子和/或ASF病毒组分的产蛋禽获得的蛋黄的水溶性级分添加到至少一种其他可食用成分中，从而形成所述可口服施用的组合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述ASF病毒粒子、ASF病毒组分和/或免疫抑制蛋白因子衍生自ASF感染的脾单核细胞(SMNC)、ASF感染的外周血和单核细胞(PBMC)和/或ASF感染的原代肺泡巨噬细胞(PAM)。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述ASF病毒粒子和ASF病毒组分被灭活。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述ASF病毒粒子和ASF病毒组分通过γ辐照来灭活。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述至少一种其他可食用成分包含食物物质、营养素和/或调味剂。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述营养素包括宏量营养素。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述营养素包括微量营养素。
30.一种单位剂型，其包含治疗或预防有效量的组合物，所述组合物包含从已施用一种或多种免疫抑制蛋白因子和ASF病毒粒子和/或ASF病毒组分的产蛋禽获得的蛋黄的水溶性级分。
31.根据权利要求30所述的单位剂型，其中所述ASF病毒粒子、ASF病毒组分和/或免疫抑制蛋白因子衍生自ASF感染的脾单核细胞(SMNC)、ASF感染的外周血和单核细胞(PBMC)和/或ASF感染的原代肺泡巨噬细胞(PAM)。
32.根据权利要求30所述的单位剂型，其中所述ASF病毒粒子、ASF病毒组分和/或免疫抑制蛋白因子被灭活。
33.根据权利要求32所述的单位剂型，其中所述ASF病毒粒子、ASF病毒组分和/或免疫抑制蛋白因子通过γ辐照来灭活。
34.根据权利要求30所述的单位剂型，其中所述单位剂型是药学上可接受的组合物。
35.根据权利要求34所述的单位剂型，其中所述药学上可接受的组合物被配制成肠胃外施用到受试者。
36.根据权利要求35所述的单位剂型，其中所述药学上可接受的组合物被配制成通过肌肉内或腹膜内注射而肠胃外施用到受试者。
37.根据权利要求1所述的方法，其中一种或多种免疫抑制蛋白因子包括细胞因子，例如(i)TNF细胞因子和/或(ii)促炎性细胞因子例如IL-17F和/或干扰素。
38.根据权利要求1所述的方法，其中一种或多种免疫抑制蛋白因子包括白介素、趋化因子、集落刺激因子和/或参与细胞因子风暴的细胞因子。
39.根据权利要求1所述的方法，其中一种或多种免疫抑制蛋白因子包括TNF-α、IFN-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18和/或RANTES。
40.根据权利要求12所述的方法，其中一种或多种免疫抑制蛋白因子包括细胞因子，例如(i)TNF细胞因子和/或(ii)促炎性细胞因子例如IL-17F和/或干扰素。
41.根据权利要求12所述的方法，其中一种或多种免疫抑制蛋白因子包括白介素、趋化因子、集落刺激因子和/或参与细胞因子风暴的细胞因子。
42.根据权利要求12所述的方法，其中一种或多种免疫抑制蛋白因子包括TNF-α、IFN-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18和/或RANTES。
43.根据权利要求23所述的方法，其中一种或多种免疫抑制蛋白因子包括细胞因子，例如(i)TNF细胞因子和/或(ii)促炎性细胞因子例如IL-17F和/或干扰素。
44.根据权利要求23所述的方法，其中一种或多种免疫抑制蛋白因子包括白介素、趋化因子、集落刺激因子和/或参与细胞因子风暴的细胞因子。
45.根据权利要求23所述的方法，其中一种或多种免疫抑制蛋白因子包括TNF-α、IFN-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18和/或RANTES。
46.根据权利要求30所述的单位剂型，其中一种或多种免疫抑制蛋白因子包括细胞因子，例如(i)TNF细胞因子和/或(ii)促炎性细胞因子例如IL-17F和/或干扰素。
47.根据权利要求30所述的单位剂型，其中一种或多种免疫抑制蛋白因子包括白介素、趋化因子、集落刺激因子和/或参与细胞因子风暴的细胞因子。
48.根据权利要求30所述的单位剂型，其中一种或多种免疫抑制蛋白因子包括TNF-α、IFN-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18和/或RANTES。
49.根据权利要求26所述的方法，其中γ辐照剂量为约15kGy至约20kGy。
50.根据权利要求33所述的单位剂型，其中γ辐照剂量为约15kGy至约20kGy。
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