CN117511002A - 一种改性透明质酸水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供基于改性透明质酸的水凝胶及其制备方法及用途。本公开的改性透明质酸水凝胶由酪胺改性的透明质酸和聚‑2‑丙烯酰胺‑2‑甲基丙磺酸钠改性的透明质酸在辣根过氧化物酶和过氧化氢的作用下形成。本公开的改性透明质酸水凝胶在制备时使用的交联剂为辣根过氧化物酶，制得的水凝胶具有良好的生物相容性；水凝胶中包含具有刷状结构的组分，制得的水凝胶润滑性好，有利于用于骨关节炎的治疗。

Description

一种改性透明质酸水凝胶及其制备方法
技术领域
本公开涉及生物相容性材料，具体涉及一种可负载生物活性物质的改性透明质酸水凝胶及其制备方法。
背景技术
骨关节炎作为临床上最常见的关节炎类型，是一种退行性的关节病变。其发病主要由滑膜组织中的淋巴细胞和巨噬细胞等分泌促炎症因子，继而逐渐影响软骨、滑膜和骨组织，最终导致慢性炎症和关节功能障碍。目前，临床上常用的关节软骨修复策略包括非类固醇抗炎药物治疗、微骨折手术治疗、自体细胞微注射治疗以及全膝关节置换术等。但以上治疗手段各自有其局限性，包括药物副反应、组织再生缓慢以及手术创伤、感染和假体僵硬等问题。因此开发新型骨关节炎治疗策略具有重要研究价值。
近年来，组织工程和再生医学领域的发展给骨关节炎的治疗带来了新的思路。透明质酸(hyaluronic acid,HA)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖为二糖单位的以β-l,3和β-l,4糖苷链交替连接组成的一种线性粘多糖，广泛存在于人体组织中。透明质酸具有良好的生物相容性、生物可降解性、黏弹性和易于改性等特征，因而被认为非常适合用来开发新型骨关节炎治疗的生物活性支架。但透明质酸生物支架的制备过程中通常会用到具有明显细胞毒性的化学试剂，同时有限的润滑性和抗炎活性等问题限制了这种策略的进一步应用。
外泌体是一种由细胞旁分泌作用产生的具有磷脂双分子层结构的小囊泡。近年来，因其在多种疾病中表现出良好的生物活性而被研究者们广泛关注。许多研究表明，间充质干细胞来源的外泌体具有良好的抗炎活性，同时也是目前被研究者们应用最为广泛的外泌体。但外泌体在组织体内通常半衰期较短，限制了其进一步应用。
发明内容
有鉴于现有的透明质酸生物支架生物相容性、安全性不理想，润滑性、抗炎活性不足等问题，本公开提供一种基于改性透明质酸的水凝胶及其制备方法及用途。
本公开的一方面提供一种改性透明质酸水凝胶，其由酪胺改性的透明质酸和聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸在辣根过氧化物酶和过氧化氢的作用下形成。
本公开进一步提供负载生物活性物质的改性透明质酸水凝胶，其由酪胺改性的透明质酸、聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸、生物活性物质在辣根过氧化物酶和过氧化氢的作用下形成。
在本公开进一步的实施方案中，所述生物活性物质为选自间充质干细胞来源的外泌体、姜黄素、槲皮素、灵芝多糖的一种或多种。
本公开的另一方面提供改性透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将酪胺改性的透明质酸配制成水溶液；
将聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸配制成水溶液；
将酪胺改性的透明质酸的水溶液和聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸的水溶液混合，向混合液中加入辣根过氧化物酶和过氧化氢，涡旋，得到改性透明质酸水凝胶。
在本公开进一步的实施方案中，所述酪胺改性的透明质酸由以下步骤制得：
将透明质酸溶解在缓冲液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，充分搅拌，再加入酪胺，搅拌反应；
反应完成后，对反应产物进行透析，冻干，制得酪胺改性的透明质酸。
在本公开进一步的实施方案中，所述聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸由以下步骤制得：
将透明质酸溶解在去离子水中，加入己二酸二酰肼，加入无水乙醇，并随反应进展调整pH；
反应完成后，对反应产物进行透析，冻干，制得己二酸二酰肼改性的透明质酸；
配制己二酸二酰肼改性的透明质酸的水溶液和聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠的水溶液，将上述两种水溶液混合，调节pH，加入N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，调节pH，搅拌反应；
反应完成后，对反应产物进行透析，冻干，制得聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸。
本公开的另一方面提供负载生物活性物质的改性透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将酪胺改性的透明质酸配制成水溶液；
将聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸配制成水溶液；
将酪胺改性的透明质酸的水溶液、聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸的水溶液和生物活性物质混合，向混合液中加入辣根过氧化物酶和过氧化氢，涡旋，得到负载生物活性物质的改性透明质酸水凝胶。
本公开的另一方面提供一种水凝胶前驱组合物，包含酪胺改性的透明质酸的水溶液和聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸。
本公开的另一方面提供一种试剂盒，包含酪胺改性的透明质酸的水溶液、聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸、辣根过氧化物酶、过氧化氢和去离子水。
本公开的又一方面提供改性透明质酸水凝胶在制备用于治疗骨关节炎的制剂、药物或医疗器械中的应用。
本公开的技术方案具备以下优点：
制备本公开的改性透明质酸水凝胶时，不需要使用传统的具有细胞毒性的化学交联剂，而是使用具有良好生物相容性的辣根过氧化物酶促进水凝胶的形成，制成的水凝胶生物相容性、安全性良好。
聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸能够在分子结构上形成一种新型的刷状结构，有利于增加由其制备出的水凝胶的润滑性，使得本公开的改性透明质酸水凝胶可施用于关节等部位，用于骨关节炎的治疗。
本公开的改性透明质酸水凝胶可灵活调整力学强度，适应不同的应用场景。本公开的改性透明质酸水凝胶还具有良好的可注射性和组织粘附性，易于制备成适合注射的制剂，供关节等局部使用；水凝胶可附着于施用的部位，发挥润滑、缓冲等作用。
本公开的改性透明质酸水凝胶还可负载生物活性物质，例如间充质干细胞来源的外泌体。在改性透明质酸水凝胶的保护下，活性物质的半衰期延长，可在关节局部稳定持久地发挥其生物学效应，因而提升了对骨关节炎等状况的治疗效果。
附图说明
参考以下附图，根据一个或多个不同实施例对本公开进行详细描述。提供的附图是为了便于理解本公开，而不应认为是对本公开的广度、范围或适用性的限制。
图1是HA、HA-Tyr、HA-ADH及HA-PA的FTIR检测图谱。
图2是HA及HA-PA的H-NMR检测图谱。
图3是由HA-Tyr/HA-PA改性水凝胶前驱体溶液形成水凝胶的过程。
图4是改性透明质酸水凝胶的流变学分析结果图。
图5是向HA-Tyr和HA-DA的混合溶液加入HRP和过氧化氢的现象。
图6是改性透明质酸水凝胶通过注射器针头的情况。
图7是改性透明质酸水凝胶的组织粘附性测试结果。
图8是改性透明质酸水凝胶的原子力显微镜检测图。
图9是不同配比的HA-Tyr/HA-PA改性水凝胶前驱体溶液形成水凝胶的过程。
图10是不同配比的HA-Tyr/HA-PA改性水凝胶前驱体溶液所形成的水凝胶的SEM检测图。
具体实施方式
本公开的一方面涉及一种改性透明质酸水凝胶及其制备方法。
本公开的改性透明质酸水凝胶由酪胺(tyramine,Tyr)改性的透明质酸(HA-Tyr)和聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠(poly-(2-acrylamido-2-methylpropanesulfonicacid，PAMPS)改性的透明质酸(HA-PA)共同形成。
酪胺改性的透明质酸
形成本公开的改性透明质酸水凝胶的组分之一是酪胺改性的透明质酸。透明质酸经酪胺改性后，分子中带有酚羟基，可供后续形成凝胶。
从适合关节等部位应用的角度出发，改性前的原料透明质酸的分子量优选1300-1500kDa。
透明质酸与酪胺发生酰胺化反应形成酪胺改性的透明质酸，这一过程可在活化剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的作用下进行。其基本反应过程如下：
酪胺改性的透明质酸的示例性的制备方法如下：
A1)将透明质酸溶解在缓冲液中；
A2)将NHS和EDC加入至A1)的溶液中，充分搅拌；
A3)将酪胺加入至A2)的溶液中，搅拌反应；
A4)对A3)的反应产物进行透析，除去未反应的试剂；
A5)将A4)的产物溶液冻干，即为HA-Tyr。可保存于4℃。
其中:
步骤A1)的缓冲液可选择2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液，例如浓度浓度0.01M，pH＝5.5的MES缓冲液；制得的透明质酸溶液的浓度为0.5～3w/v％。
步骤A2)中，NHS和EDC的比例可以是1:5～2:1。
步骤A3)中，酪胺的添加量可以是0.5～2w/v％。
步骤A4)中，透析的具体方式没有限制，优选先以0.5～1％氯化钠溶液透析，再用去离子水透析。可选择使用截留分子量(MWCO)为3～20kDa的透析膜/透析管。
聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸
形成本公开的改性透明质酸水凝胶的又一组分是聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸。
从适合关节等部位应用的角度出发，改性前的原料透明质酸的分子量优选1300-1500kDa。
可先用己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)对透明质酸进行改性，得到己二酸二酰肼改性的透明质酸(HA-ADH)，其带有酰肼基团。然后在活化剂EDC/NHS作用下进一步使HA-ADH的酰肼基团与PAMPS的末端羧基反应，得到PAMPS改性的透明质酸(HA-PA)。基本反应过程如下：
PAMPS改性的透明质酸的示例性的制备方法如下：
B1)将HA加入至适量去离子水中，搅拌至完全溶解；
B2)将ADH溶液加入至B1)的溶液中，搅拌均匀；
B3)将B2)的溶液的pH调整至4～5，加入无水乙醇，搅拌，再逐渐调整pH，直至反应完成；
B4)对B3)的反应产物进行透析，除去未反应的试剂；
B5)将B4)的产物溶液冻干，即为HA-ADH。可保存于4℃。
B6)分别将HA-ADH、PAMPS溶解配制为水溶液，然后将HA-ADH溶液和PAMPS溶液混合，将混合液的pH调节至4～5，充分搅拌；
B7)将EDC加入至B6)得到的混合液中，将溶液的pH值调整至4～5，搅拌反应；
B8)将NHS加入至B7)的溶液中，将溶液的pH值调整至4～6，搅拌反应，再将反应后溶液的pH值调整至6.8～7.4；
B9)对B8)的反应产物进行透析，除去未反应的试剂；
B10)将B9)的产物溶液冻干，即为HA-PA。可保存于4℃。
其中：
步骤B1)制备的HA溶液的浓度为0.2～1w/v％。
步骤B2)的ADH添加量为3～15w/v％。
步骤B3)中，加入的无水乙醇量与原溶液的体积比优选1:1；加入无水乙醇搅拌后，将溶液的pH值调整至4～5，搅拌，再将溶液的pH值调整至6.8～7.4。
步骤B4)中，优选依次用100mM氯化钠溶液、乙醇、去离子水进行透析；可选择使用MWCO为3～20kDa的透析膜/透析管。
步骤B5)中，制得的HA-ADH的接枝率优选70％～85％。HA-ADH的接枝率可通过产物的元素分析结果计算得到。HA单体的分子量为403.31，根据HA和ADH分子中氮原子的数目，HA-ADH的接枝率可按下式计算：
HA-ADH接枝率(％)＝HA-ADH产物的N含量百分比/(14×4/403.31)
步骤B6)中，配制的HA-ADH溶液的浓度为0.2～1w/v％；配制的PAMPS溶液的浓度为2～10wt％，pH值为2.0～3.0。HA-ADH溶液和PAMPS溶液的混合比例为1:1～1:3。
步骤B7)中，EDC的浓度为0.5～1w/v％。
步骤B8)中，NHS的浓度为0.2～1w/v％。
步骤B9)中，优选依次用100mM氯化钠溶液、乙醇、去离子水进行透析；可选择使用MWCO为3～20kDa的透析膜/透析管。
改性透明质酸水凝胶
HA-Tyr和HA-PA在适当的催化下可形成改性透明质酸水凝胶。HA-Tyr含有酚羟基，可在辣根过氧化物酶(HRP)和过氧化氢(H2O2)作用下发生自由基聚合。HA-PA也参与了改性透明质酸水凝胶空间网络的形成。
改性透明质酸水凝胶的示例性的制备方法如下：
C1)将HA-Tyr、HA-PA分别用去离子水配制成适当浓度的HA-Tyr溶液、HA-PA溶液；
C2)将配好的HA-Tyr溶液和HA-PA溶液以一定比例混合；
C3)将HRP和过氧化氢加入至C2)的溶液中，涡旋，形成改性透明质酸水凝胶。
其中：
步骤C1)配制的HA-Tyr溶液浓度为0.2～3w/v％，HA-PA溶液浓度为0.05～2w/v％；
步骤C2)中，HA-Tyr溶液和HA-PA溶液的混合比例为5:1～1:5；如需调整混合液中HA-Tyr或HA-PA的终浓度，本步骤还可根据实际需要加入一定量的去离子水；
步骤C3)中，HRP的浓度为0.5～10U/ml，过氧化氢的浓度为0.1～5mM，其中HRP和过氧化氢均按照50～500μl每1ml C2)混合溶液的比例加入。
负载活性物质的改性透明质酸水凝胶
本公开的改性透明质酸水凝胶还可进一步负载活性物质。一种代表性的活性物质是外泌体，特别是间充质干细胞来源的外泌体。其他活性物质的例子还有天然产物提取的具有抗炎活性的小分子，例如姜黄素、槲皮素、灵芝多糖等。
可在前述制备改性透明质酸水凝胶的步骤C2)中，将所需的活性物质添加到HA-Tyr和HA-PA的混合溶液中，再进行后续的HRP-过氧化氢催化交联步骤。由此制备出的改性透明质酸水凝胶均匀、稳定地负载了所需的活性物质。
水凝胶前驱组合物
本公开还提供一种水凝胶前驱组合物，包含冻干的HA-Tyr、冻干的HA-PA。使用时，可根据实际需要用去离子水将HA-Tyr、HA-PA溶解，混合，再加入HRP和H2O2成胶。
本公开还提供便于使用的水凝胶制备试剂盒，包含冻干的HA-Tyr、冻干的HA-PA、HRP和H2O2，还可进一步包含包装的去离子水。利用该试剂盒可方便地制备改性透明质酸水凝胶。使用试剂盒时，还可根据需要加入合适的生物活性物质。
以下结合实施例对本公开的技术方案作进一步解释。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本公开，而不应视为对本公开范围的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1制备HA-Tyr
a)将HA加入至浓度0.01M，pH＝5.5的MES缓冲液中，搅拌至完全溶解，制得1w/v％的HA溶液；
b)将NHS和EDC(比例为5:8)加入至a)的溶液中，室温搅拌1小时；
c)向b)的溶液中加入酪胺(添加量1.03w/v％)，室温搅拌反应72小时；
d)将c)的反应产物先以0.6％氯化钠溶液透析24小时，再以去离子水透析48小时，透析管为MWCO＝3.5kDa；
e)将d)的溶液冻干后保存于4℃，即HA-Tyr。
改性前的HA及制得的HA-Tyr的傅里叶转换红外光谱(FTIR)检测结果如图1所示。
实施例2制备HA-PA
a)将HA加入至去离子水中搅拌至完全溶解，配成浓度为0.5w/v％的HA溶液；
b)将ADH加入至a)的溶液中，ADH浓度8.68w/v％，室温搅拌15分钟；
c)用盐酸将b)溶液的pH值调整至4.75，以1:1的体积比加入无水乙醇，室温搅拌30分钟；
d)用氢氧化钠将c)溶液的pH值调整至4.8，室温搅拌2小时；
e)将d)溶液的pH值调整至7；
f)用MWCO＝3.5kDa的透析管，将e)的溶液依次以100mM氯化钠溶液透析1天、乙醇透析1天、去离子水透析2天；
g)将f)的溶液冻干，得HA-ADH，保存于4℃；
h)取HA-ADH，加入至去离子水中搅拌至完全溶解，配制成0.5w/v％的HA-ADH溶液；
i)将PAMPS配置成浓度为5wt％，将溶液的pH值调整至2.5，室温搅拌1小时；
j)将h)溶液和i)溶液混合，调整混合溶液的pH值调整至4.5，室温搅拌30分钟；
k)将EDC加入至j)溶液中，EDC浓度为0.625w/v％，将溶液的pH值调整至4.8，室温搅拌5分钟；
l)将NHS加入至k)溶液中，NHS的浓度为0.5w/v％,将溶液的pH值调整至5.5，室温搅拌36小时，再将溶液的pH值调整至7；
m)用MWCO＝3.5kDa的透析管，将l)的溶液依次以100mM氯化钠溶液透析1天、乙醇透析1天、去离子水透析2天；
n)将m)的溶液冻干，即为HA-PA，保存于4℃。
改性前的HA、制得的HA-ADH及HA-PA的FTIR检测结果如图1所示。改性前的HA及制得的HA-PA的核磁共振氢谱(H-NMR)检测结果如图2所示。
实施例3配制改性水凝胶前驱体溶液
取实施例1制备的HA-Tyr，用去离子水配制成浓度为2w/v％的HA-Tyr溶液。取实施例2制备的HA-PA，用去离子水配制成浓度为0.1w/v％的HA-PA溶液。将HA-Tyr溶液和HA-PA溶液以1:1的比例混合，配制成HA-Tyr/HA-PA改性水凝胶前驱体溶液。
实施例4制备HA-Tyr/HA-PA改性透明质酸水凝胶
取实施例3配制的HA-Tyr/HA-PA改性水凝胶前驱体溶液，向其加入将2.5U/ml的辣根过氧化物酶(HRP)和600μM过氧化氢，涡旋。
形成凝胶的过程如图3所示。从实验中可见，向HA-Tyr/HA-PA改性水凝胶前驱体溶液加入HRP和过氧化氢后30s内，溶液转变为水凝胶。成胶后，将试管口向下倾斜，管底的水凝胶并未自发流出。
对制得的HA-Tyr/HA-PA改性透明质酸水凝胶进行流变学分析，结果如图4所示。储能模量G’>损耗模量G”，证明加入HRP和H2O2之后，HA-Tyr/HA-PA前驱体水溶液固化转变为凝胶状态，即，成功形成了水凝胶。
对比例1HA-Tyr与透明质酸-多巴胺溶液成凝胶性能试验
取实施例1制备的HA-Tyr，用去离子水配制成浓度为2w/v％的HA-Tyr溶液。另取多巴胺改性的透明质酸(HA-DA)，用去离子水配制成浓度为1w/v％的HA-DA溶液。
将HA-Tyr和HA-DA溶液混合，加入HRP和过氧化氢。如图5所示，向HA-Tyr和HA-DA的混合溶液加入HRP和过氧化氢后，溶液始终未能形成水凝胶，仍呈现为流动的溶液状态。
虽然HA-Tyr含有可供形成凝胶的基团，但HA-Tyr和HA-DA混合后，形成凝胶的性能丧失。对比例1的配方不适合用于制备水凝胶。
实施例5制备负载外泌体的改性透明质酸水凝胶
取实施例3配制的HA-Tyr/HA-PA改性水凝胶前驱体溶液，加入一定含量的间充质干细胞来源的外泌体。将2.5U/ml的辣根过氧化物酶(HRP)和600μM过氧化氢加入至c)溶液中，涡旋，形成水凝胶。
由此可见，在加入适量生物活性物质的情况下，HA-Tyr/HA-PA改性水凝胶前驱体溶液可以保持其良好的成凝胶性能，形成的水凝胶可均匀稳定地负载生物活性物质。
实施例6HA-Tyr/HA-PA改性透明质酸水凝胶的性质
用普通医用2mL注射器吸取实施例4制备的HA-Tyr/HA-PA改性透明质酸水凝胶，安装21G型号针头，推动注射器。如图6所示，HA-Tyr/HA-PA改性透明质酸水凝胶可被吸入注射器，并顺畅地通过21G针头挤出，证明该水凝胶可注射性良好，适合以注射的方式施用于关节腔等部位。
测试HA-Tyr/HA-PA改性透明质酸水凝胶的组织粘附性能。如图7所示，将该水凝胶附着于指关节，观察到水凝胶可以粘附于手指表面并随着指关节弯曲而弯曲，且不会从手指表面脱离。同时该水凝胶可以粘附于金属药匙表面并发生一定程度的拉伸形变而不会断裂，表现出对金属材料的粘附性。证明HA-Tyr/HA-PA改性透明质酸水凝胶组织粘附性良好，具有保留在关节腔等注射部位的能力。
对HA-PA和HA-Tyr/HA-PA改性透明质酸水凝胶进行原子力显微镜检测。如图8所示，HA-PA表现出刷状结构，其以透明质酸长链为骨架，以PAMPS分子为侧链。将HA-PA与HA-Tyr共混后进行原子力显微镜检测，仍能观察到刷状结构。证明HA-Tyr/HA-PA改性透明质酸水凝胶具有类似于润滑素的刷状分子结构，具备减轻摩擦的能力。
实施例7HA-Tyr/HA-PA改性透明质酸水凝胶的系列配方
取实施例1制备的HA-Tyr，用去离子水配制成浓度为2w/v％的HA-Tyr溶液。取实施例2制备的HA-PA，用去离子水配制成浓度为0.1w/v％的HA-PA溶液。按照表1所示的配方取HA-Tyr、HA-PA溶液和去离子水，混合后加入HRP和过氧化氢引发水凝胶形成。
表1改性透明质酸水凝胶的系列配方
配方编号 1 2 3 4 5
2％HA-Tyr 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
0.1％HA-PA 0.2ml 0.4ml 0.6ml 0.8ml 1ml
200U/ml HRP 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
3.75％H2O2 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
H2O 0.8ml 0.6ml 0.4ml 0.2ml 1ml
配方1～5形成水凝胶的情况见图9。对配方1～5制备出的水凝胶进行扫描电子显微镜(SEM)检测，结果见图10。
从实验结果可见，在一定范围内将HA-Tyr溶液和HA-PA溶液以不同比例混合，加HRP和过氧化氢后均能形成水凝胶。因此本公开的水凝胶具有广泛的适应性。根据实际应用的需求，可在一定范围内灵活调整浓度，制得不同硬度、力学强度的改性透明质酸水凝胶。
制得的HA-Tyr/HA-PA改性透明质酸水凝胶呈现均匀的网状微结构，水凝胶的空腔微结构有利于进一步负载其他生物活性物质。
从以上实施例可见，本公开制备了两种改性HA(HA-Tyr和HA-PA)，并进一步利用这两种改性HA制备出了负载外泌体的改性透明质酸水凝胶。制备改性透明质酸水凝胶时，不需要使用传统的具有细胞毒性的化学交联剂，而是以HRP促进交联成胶，使得制成的水凝胶具有良好的生物相容性。HA-PA具有刷状分子结构，有效地改善了改性透明质酸水凝胶的润滑性。
本公开的改性透明质酸水凝胶还具有优良的可注射性和组织粘附性，因此本公开的改性透明质酸水凝胶可安全、方便地施用于关节等部位，粘附于施用的部位发挥润滑、缓冲等作用。
进一步地，本公开的改性透明质酸水凝胶还可负载生物活性物质，例如间充质干细胞来源的外泌体。在改性透明质酸水凝胶的保护下，活性物质的半衰期延长，可在关节局部稳定持久地发挥其生物学效应，因而提升了对骨关节炎等状况的治疗效果。
虽然已经参考优选实施例详细地示出和描述了本发明的特征，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围的精神的情况下，可以在其中进行其他改变。本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施例的限制。

Claims (10)

1.一种改性透明质酸水凝胶，其由酪胺改性的透明质酸和聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸在辣根过氧化物酶和过氧化氢的作用下形成。
2.一种负载生物活性物质的改性透明质酸水凝胶，其由酪胺改性的透明质酸、聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸、生物活性物质在辣根过氧化物酶和过氧化氢的作用下形成。
3.根据权利要求2所述的负载生物活性物质的改性透明质酸水凝胶，其中，所述生物活性物质为选自间充质干细胞来源的外泌体、姜黄素、槲皮素、灵芝多糖的一种或多种。
4.一种改性透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将酪胺改性的透明质酸配制成水溶液；
将聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸配制成水溶液；
将酪胺改性的透明质酸的水溶液和聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸的水溶液混合，向混合液中加入辣根过氧化物酶和过氧化氢，涡旋，得到改性透明质酸水凝胶。
5.根据权利要求4所述的改性透明质酸水凝胶的制备方法，其中，所述酪胺改性的透明质酸由以下步骤制得：
将透明质酸溶解在缓冲液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，充分搅拌，再加入酪胺，搅拌反应；
反应完成后，对反应产物进行透析，冻干，制得酪胺改性的透明质酸。
6.根据权利要求4所述的改性透明质酸水凝胶的制备方法，其中，所述聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸由以下步骤制得：
将透明质酸溶解在去离子水中，加入己二酸二酰肼，加入无水乙醇，并随反应进展调整pH；
反应完成后，对反应产物进行透析，冻干，制得己二酸二酰肼改性的透明质酸；
配制己二酸二酰肼改性的透明质酸的水溶液和聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠的水溶液，将上述两种水溶液混合，调节pH，加入N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，调节pH，搅拌反应；
反应完成后，对反应产物进行透析，冻干，制得聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸。
7.一种负载生物活性物质的改性透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将酪胺改性的透明质酸配制成水溶液；
将聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸配制成水溶液；
将酪胺改性的透明质酸的水溶液、聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸的水溶液和生物活性物质混合，向混合液中加入辣根过氧化物酶和过氧化氢，涡旋，得到负载生物活性物质的改性透明质酸水凝胶。
8.一种水凝胶前驱组合物，其包含酪胺改性的透明质酸的水溶液和聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸。
9.一种试剂盒，其包含酪胺改性的透明质酸的水溶液、聚-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸钠改性的透明质酸、辣根过氧化物酶、过氧化氢和去离子水。
10.改性透明质酸水凝胶在制备用于治疗骨关节炎的制剂、药物或医疗器械中的应用。
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