CN117510638A - 一种鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体及其应用 - Google Patents

一种鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗人胸苷激酶1（TK1）的鸡源重组全长单克隆IgY抗体（hTK1‑IgY‑rmAb）及其应用。通过改进的噬菌体展示方法，采用人TK1 C端195‑225多肽，开发了抗人TK1鸡源重组全长单克隆IgY抗体。三周内快速构建3.4×109pfu/mL超大文库，阳性克隆率高达98%。利用ELISA、免疫印迹及免疫组织化学检测方法，鉴定出高特异性和高灵敏度的优选hTK1‑IgY‑rmAb抗体。本发明提高了抗体批间的稳定性，实现了新一代基于重组IgY抗体的TK1检测试剂盒在全自动化学发光仪上运行，可满足大规模肿瘤早期风险筛查的检测需求。

Description

一种鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及一种鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体及其应用。
背景技术
胸苷激酶1（TK1）是嘧啶补救途径的一种激酶，在镁离子和ATP参与下，它催化脱氧胸苷（dT）转化为脱氧胸苷单磷酸（dTMP），参与细胞周期S期DNA的合成，是细胞周期调控的关键酶。正常成人细胞中TK1含量极低（<2pmol/L），只有细胞过度增殖的情况下TK1浓度才会升高释放至体液，导致血清胸苷激酶1（serumthymidinekinase1，STK1）水平增加。TK1是在细胞周期中参与DNA合成的关键酶，与细胞增殖速度密切相关。TK1在无任何肿瘤疾病的正常健康个体血清中含量极低，但在肿瘤患者细胞异常增殖下，血清和组织中TK1均易被检测到。TK1的升高与恶性肿瘤患者肿瘤细胞增殖速度有显著相关性，是一个公认的评估肿瘤细胞增殖度的精准生物标志物，用于不同类型恶性肿瘤的早期风险筛查、手术、放化疗治疗效果评估、肿瘤复发风险预测等。
目前市面上已有一系列小鼠抗人TK1 IgG单克隆抗体（mAb），例如瑞典AroCell公司（www.arocell.com），以及兔源抗人TK1重组单克隆抗体，例如美国Abcam公司（https：//www.abcam.com）。但是，这些抗体在血清学TK1检测上，大部分仅用于科学研究，缺乏血清学大规模临床检测性能验证。利用这些mAb，通过血清学TK1水平可以评估癌症患者治疗效果，但由于这些mAb特异性和灵敏度尚差，不能作为健康体检筛查中早期肿瘤的发现和风险进程评估，也不适用于肿瘤患者的预后评估，现尚无大样本文献数据公布。
华瑞同康生物技术（深圳）有限公司开发的商用型增强免疫点印迹化学发光法（ECL-dotblot）是采用人TK1的C端肽（195-225），开发的鸡抗人TK1-IgY多克隆抗体（TK1-IgY-pAbs），已成功地用于检测人血清中胸苷激酶1蛋白浓度（STK1p），在临床肿瘤和体检筛查的应用实践已超过15年，验证了TK1-IgY-pAbs不仅作为评估肿瘤患者转归和预后的可信性精准靶标，也可用于肿瘤患者预后和复发风险和生存效果的评估，尤其特别的是，可用于早期肿瘤进程的风险预警评估。基于2005-2016年在我国的四个独立的常规健康检查中心的160,086名体检者的数据，采用TK1-IgY-pAbs检测的STK1p高值可以在出现影像学异常之前，提示良、恶性肿瘤风险程度，即低风险或高风险人群，适用于不同的职业和群体，特别是在癌症高发地域，进行肿瘤早期风险筛查和健康管理有重要的价值，如接触致癌化学品的行业等，实现“肿瘤早筛查，早预防，早发现、早治疗”的目标。
对于上一代产品，由于接受免疫的母鸡的个体差异和生活环境，需要定期检测每个母鸡是否产生稳定性高、特异性好和灵敏度高的抗体，以控制每个生产批号抗体的检测性能。这些控制工作不但需要有精细的制备工艺和经验丰富的技术人员，同时耗费时间周期长，费用投入高。因此，基于上一代传统免疫母鸡获取IgY多克隆抗体产品，急需进一步改进。
发明内容
为了提高抗体批间的稳定性，本申请提供一种鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体及其应用。
第一方面，本申请提供一种鸡源抗人TK1重组IgY单链抗体，所述单链抗体由重链、连接肽和轻链构成，所述重链包括第一重链可变区域、第二重链可变区域和第三重链可变区域，所述单链抗体的轻链包括第一轻链可变区域、第二轻链可变区域和第三轻链可变区域；所述第一重链可变区域的氨基酸序列选自SEQID NO：1至SEQID NO：3中的一种，所述第二重链可变区域的氨基酸序列选自SEQID NO：4至SEQID NO：6中的一种，所述第三重链可变区域的氨基酸序列选自SEQID NO：7至SEQID NO：9中的一种；所述第一轻链可变区域的氨基酸序列选自SEQID NO：10至SEQID NO：14中的一种，所述第二轻链可变区域的氨基酸序列选自SEQID NO：15至SEQID NO：19中的一种，所述第三轻链可变区域的氨基酸序列选自SEQIDNO：20至SEQID NO：23中的一种
优选的，同一所述单链抗体的可变区域由重链的SEQID NO：1、SEQID NO：4、SEQIDNO：7和轻链的SEQID NO：10、SEQID NO：15、SEQID NO：20组成，或者由重链的SEQID NO：2、SEQID NO：5、SEQID NO：8和轻链的SEQID NO：11、SEQID NO：16、SEQID NO：21组成，或者由重链的SEQID NO：1、SEQID NO：4、SEQID NO：7和轻链的SEQID NO：12、SEQID NO：17、SEQID NO：20组成，或者由重链的SEQID NO：3、SEQID NO：6、SEQID NO：9和轻链的SEQID NO：13、SEQIDNO：18、SEQID NO：22组成，或者由重链的SEQID NO：2、SEQID NO：5、SEQID NO：8和轻链的SEQID NO：14、SEQID NO：19、SEQID NO：23组成。
SEQID NO：1 DRGMG；
SEQID NO：2 NHGMG；
SEQID NO：3 RHGMG；
SEQID NO：4 GVDDSGSSRDYAPAVKGRAT；
SEQID NO：5 GINSGAGSYTNYGAAVKGRAT；
SEQID NO：6 SINSGGSYTNYGAAVQGRAT；
SEQID NO：7 GSVVGFIDA；
SEQID NO：8 SVYGGSISLITDVIDT；
SEQID NO：9 DAGCTGGGTCYAYADRIDA；
SEQID NO：10 SGGGSYAGSYY；
SEQID NO：11 SGGANYYGSYYYG；
SEQID NO：12 SGGGRFAGSYYYG
SEQID NO：13 SGSSGSYG；
SEQID NO：14 SGSYSNYYG；
SEQID NO：15 NNNNRP；
SEQID NO：16 DNTKRP；
SEQID NO：17 DSTNRP；
SEQID NO：18 YNGKRP；
SEQID NO：19 ENNNRP；
SEQID NO：20 GSIDSSYVGI；
SEQID NO：21 GSYDSSAGYAG；
SEQID NO：22 GSRDSSYDGI；
SEQID NO：23 GGYDDSTDSGI;
第二方面，本申请提供一种鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体，其特征在于：包含上述重链和轻链，共有5种单克隆抗体，分别为SEQID NO：24至SEQID NO：28的氨基酸序列。
SEQID NO：24
TK1-hen-1 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSDRGMGWMRQAPGKGLEFVAGVDDSGSSRDY 60
TK1-hen-1 APAVKGRATISRDNGQSTLSLQLSDLRAEDTGTYYCTRGSVVGFIDAWGHGTEVIVSSG 119
TK1-hen-1 GGGSGGGGSGGGGSQAALTQPASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKSP 175
TK1-hen-1 GSAPVTVIYNNNNRPSGIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVQAEDEAIYYCGSIDSSYVGIFG 235
TK1-hen-1 AGTALTVL 243。
SEQID NO：25
K1-hen-2 AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSNHGMGWVRQAPGKGLEWVAGINSGAGSYTN60
TK1-hen-2 YGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCARSVYGGSISLITDVIDTWGHG 119
TK1-hen-2 TEVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAALTQPASVSANLGETVKITCSGGANYYGSYYY 175
TK1-hen-2 GWYQQKSPGSAPVTVINDNTKRPSNIPSRFSGSTSGSTGTLTITGVQADDEAVYFCGSYD 235
TK1-hen-2 SSAGYAGIFGAGTTLTVL253。
SEQID NO：26
TK1-hen-3 AVTLDESGGGLQTPGGTVSLVCKASGFTFSDRGMGWMRQAPGKGLEFVAGVDDSGSSRDY 60
TK1-hen-3 APAVKGRATISRDNGQDILRLQLNNLRAEDTATYYCTRGSVVGFIDAWGHGTEVIVSSG 120
TK1-hen-3 GGGSGGGGSGGGGSQAALTQPASVSASPGETVKITCSGGGRFAGSYYYGWYQQKSP 175
TK1-hen-3 GSAPVTVIYDSTNRPSNIPSRFSGSLSGSTTTLTITGVQADDEAVYFCGSIDSSYVGIFG 235
TK1-hen-3 AGTTLTVL 243。
SEQID NO：27
TK1-hen-4 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSFSRHGMGWVRQAPGKGLEWVASINSGGSYTNY 60
TK1-hen-4 GAAVQGRATIWRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCARDAGCTGGGTCYAYADRIDAWG 119
TK1-hen-4 HGTEVIVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAALTLPSSVSVNPGETVKITCSGSSGSYGWY 175
TK1-hen-4 QQKSPGSAPVTVIYYNGKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYFCGSRDSS 235
TK1-hen-4 YDGIFGAGTTLTVL 248。
SEQID NO：28
TK1-hen-4 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSFSRHGMGWVRQAPGKGLEWVASINSGGSYTNY 60
TK1-hen-4 GAAVQGRATIWRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCARDAGCTGGGTCYAYADRIDAWG 119
TK1-hen-4 HGTEVIVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAALTLPSSVSVNPGETVKITCSGSSGSYGWY 175
TK1-hen-4 QQKSPGSAPVTVIYYNGKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYFCGSRDSS 235
TK1-hen-4 YDGIFGAGTTLTVL 248。
优选的，所述单克隆抗体的氨基酸序列为SEQID NO：28所示。
第三方面，本申请提供一种重组载体，所述重组载体包含编码上述氨基酸的核酸，构建所述重组载体的为PTT5质粒。
第四方面，本申请提供一种含重组载体的细胞，所述细胞含有上述的重组载体，并使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞构建稳定细胞系。
第五方面，本申请提供一种检测卡、检测条或检测试剂盒，所述检测卡、检测条或检测试剂盒含有上述的单链抗体或单克隆抗体任一种。
第六方面，本申请提供一种药物，含有上述任一所述的抗体。
第七方面，本申请提供一种上述任一所述的抗体的筛选方法，包括以下步骤：
上述任一抗体是通过步骤1）从母鸡脾细胞分离mRMA、步骤2）PCR反转录、步骤3）PCR重叠获得全长scFv基因、步骤4）拼接浓缩scFv、步骤5）高活性细菌感受态中电转化、步骤6）噬菌体抗体包装以及步骤7）筛选，能够在三周内快速构建大容量噬菌体抗体展示文库。
优选的，所述步骤1）中母鸡处死后15min以内，迅速取脾细胞，用TriZol溶液匀浆，用氯仿和异丙醇分离总RNA；
所述步骤2）中采用oligodT作为引物，进行逆转录反应，制备cDNA用于后续扩增抗体基因；
所述步骤3）中，使用简并引物扩增所述重链可变区域和轻链可变区域的基因，通过重叠PCR(聚合酶链式反应)组装成scFv基因；
所述步骤4）中，分离PCR产物，并在通过T4DNA连接酶连接到噬菌粒载体pSCD-1（如附图1）之前用Sfi I和Not I进行切割；
所述步骤5）中，将连接混合物脱盐并电转化成TG1感受态细胞；
所述步骤6）中，将辅助噬菌体M13KO7添加到附图1所示的噬菌粒载体中，包装后扩增所得的噬菌体通过PEG 6000沉淀并进行滴定，用于进一步的筛选；
所述步骤7）中，将噬菌体文库加入含有靶标TK1的筛选板中，经过多次洗涤、孵育后，消化洗脱结合的噬菌体，扩增后经过多轮筛选、取出单个菌落接种培养，在600nm波长处的吸光值达到0.4-0.6时，以感染复数（MOI）为10-20之间加入辅助噬菌体培养，对噬菌体进行酶联免疫吸附法检测（ELISA）检测和DNA测序。根据DNA测序结果，重组所有独特的单链抗体，基于IgY全长抗体重链和轻链序列主链，通过连续PCR和克隆步骤构建全长抗体序列，然后装载入真核表达载体PTT5得到PTT5-TK1-IgY-H和PTT5-TK1-IgY-L表达载体对。
第八方面，本申请提供一种使用鸡源抗人TK1重组IgY抗体含有上述的单链抗体或单克隆抗体任一种的检测方法，应用上述任一种抗体，通过增强型化学发光（ECL）斑点印迹法或化学发光免疫分析法手动或全自动检测体液（包括血液、尿液、唾液、脑脊液、腔积液等）样本中TK1浓度。
在上代产品中发明人掌握了如何从免疫母鸡中优选获得特异性强和灵敏度高的TK1-IgY多克隆抗体。借鉴现有改进的重组抗体开发技术，其制备工艺更易于标准化，同时可降低时间、人力和费用成本的消耗，对实现TK1-IgY单克隆的开发是尤为重要和必要的。这将实现大批量生产特异性强、灵敏度高和稳定性高的抗体，确保人群体检筛查和临床肿瘤中的大规模检测需求。
在已有的TK1-IgY多克隆抗体技术基础上，发明人开发重组鸡IgY-TK1-mAb，由于重组单克隆IgY抗体是源自单个B细胞谱系的抗体，该谱系经历了重复的体细胞超突变和克隆选择，通常是识别单个独特表位的IgY同种型。现采用噬菌体展示技术可成功快速开发重组抗TK1单克隆IgY抗体，与相应的天然多克隆IgY抗体相比，重组抗TK1单克隆IgY抗体具有更强的特异性、更高的亲和力和稳定性。重组抗体还具有可编辑性等优点、可以根据实际需求对抗体的稳定性、亲和力、抗体修饰等方面进行改造来满足不同的新抗体应用需求。发明人团队首次成功开发了鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体，命名为“人TK1重组-IgY-单克隆抗体”，新一代人TK1重组-IgY-单克隆抗体将为早期肿瘤风险筛查和肿瘤医学的研究和应用提供创新前景。
癌症是一种慢性肿瘤细胞增殖性疾病，主要是由于细胞生长调节相关的某些酶和蛋白质中的基因突变而导致细胞不受控制地无限增殖，从而导致恶性肿瘤的发生。非侵入性血清学TK1检测方法提供了影像学无法实现的检测肿瘤早期风险进程的信息，因此TK1血清学生物标志物对于预测恶性肿瘤进展的风险具有非常重要的价值。TK1血清学标志物结合影像学和其他适用工具，将实现进行长期随访，以发现癌前病变或影像学检测不到的肿瘤早期风险迹象。发明人设计了特异性TK1-31肽抗原，成功地制备了鸡抗人TK1-IgY抗体，开发和建立了商用型高敏感的免疫增强化学发光斑点印迹（ECL斑点印迹）的检测系统，测定血清中的TK1蛋白（STK1p）浓度，从而替代了血清中TK1活性（STKa）的检测方法。基于对35,365例体检人群大数据血清样本TK1荟萃（Meta）研究，发明人设定了STK1p=2.0 pM为科学合理的“风险阈值”，有效地评估常规人群筛查中的异常细胞生长速度。在这项荟萃研究中，采国际公认的受试者工作特征曲线（ROC）分析法，对10种不同类型恶性肿瘤的术前患者（n＝720）和无恶性肿瘤/无肿瘤相关疾病的人（n＝4,103），进行分析，曲线下面积为0.96。当选择最佳特异性为0.997，灵敏度为0.80，最大似然值（+）值为236.5时，风险阈值为2.0pM。采用风险阈值为2.0pM，验证了发明人的增强化学发光点印迹免疫系统组装的TK1试剂盒，在常规人群体检筛查应用中的有效性。在这项荟萃研究中，发现STK1p的高风险组（STK1p＞2.0pM），在6年内发生新发恶性肿瘤的发病率比中国肿瘤统计新发病率（0.2%-0.3%）高出3-5倍。与STK1p低风险组比较（≦2.0 pM），STK1p高风险组在11年内发生新的恶性肿瘤风险甚至更高（44倍）。发明人的研究证实STK1p更为适用于各类肿瘤的疗效监测，癌症患者的复发和生存率评估，特别是适用于早期发现恶性肿瘤和预测肿瘤发展的风险进程，是一个预测恶性肿瘤和预测肿瘤发展风险的优选生物标志物。
本申请采用人TK1的C端195-225多肽，开发了鸡抗人TK1全长-IgY单克隆抗体。通过改进的噬菌体展示方法，阳性克隆率高达98%，3周内快速构建3.4×109pfu/mL超大文库，可彻底杜绝环境噬菌体污染，成功地得到符合发明人要求的单链抗体后，获得抗体重轻链可变区序列，将获得的抗体片段分析后进行全长IgY抗体的构建，然后通过真核表达系统表达全长抗体，并进行纯化。现对该抗体进行ELISA滴度测定、免疫印迹及免疫组织化学检测，验证了该抗体是一个特异性和灵敏度均高的抗体；更重要的是，血清学鉴定指出，采用发明人组装的两种血清检测用试剂盒的结果显示，两种试剂盒的检测结果符合率高达r=0.857。今后，全自动化学发光仪将替代过去的半自动增强化学发光免疫检测系统，实现新一代TK1-IgY重组抗体试剂盒在全自动化学发光仪上运行，已满足大规模早期肿瘤风险筛查的检测需求。目前，利用噬菌体展示文库技术成功构建TK1-IgY-rmAb抗体并在全自动化学发光仪上运行，尚未见报道，为国际首创。
发明人利用噬菌体展示文库技术成功获得TK1-IgY-rmAb抗体，现构建的稳定性细胞系，最终目的是为了制备大量具有高特异性、高灵敏度和稳定性的TK1-IgY-rmAb抗体，组装血清检测用的检测试剂盒，用于常规人群体检早期肿瘤风险筛查。在今后，TK1-IgY-rmAb试剂盒在常规人群体检早期肿瘤风险筛查中将展示巨大潜力，可用于预测癌前疾病和（或）与肿瘤相关风险疾病，以及评估今后进展为恶性肿瘤的风险预后可能性，给予患者进行及时早期干预治疗。并且该新一代TK1-IgY-rmAb试剂盒同样适用于临床肿瘤，包括肿瘤患者的随访和治疗效果监测，复发和生存的预测评估。
噬菌体展示技术已成为从免疫和非免疫来源制备单克隆抗体的重要方法。该方法操作简单快捷、耗时少，能够快速筛选获得单克隆抗体，而不受常规杂交瘤方法的限制，是目前发展最成熟、应用最广泛的基因工程抗体筛选技术。噬菌体展示技术具有筛选容量大、效率高、易于在基因水平操作、易于规模化生产等优点。它的库容量高达109-1012pfu/mL，可以对百万至亿万个分子进行选择，并且每一轮的淘选可以使抗原特异性较强的克隆得到富集；使特异性抗体的筛选变得更加易行。该方法可以根据不同目的对抗体进行改造，拓宽了抗体的应用范围。目前噬菌体展示技术在抗体应用方面已有重大成就，但大部分研究都是从免疫哺乳动物获得抗体库。研究显示，某些高度保守的哺乳动物抗原在免疫哺乳动物过程中通常存在免疫原性低的问题。
附图说明
图1是噬菌粒pSCD-1的示意图。
图2是噬菌体抗体库的构建，DNA(2000，1000，750，500，250和100bp)。其中，A为分离RNA，B为抗体轻链第二轮PCR，C为抗体重链第二轮PCR，D为重叠PCR拼接scFv基因，E为建库多样性检测。
图3是重组全长蛋白TK1-IgY-rmAb 5#真核表达，Elisa滴度法（Elisa titer）检测抗体效价（抗体浓度梯度稀释1000-7.8ng/mL），图3右上角是变性SDS-PAGE凝胶免疫电泳图。
图4A为TK1免疫组化（HIC）染色图示正常扁桃体组织和低分化卵巢癌患者组织中的TK1染色。
图4B为TK1-IgY-rmAb 5#用于ECL点印迹法和全自动化学发光法的结果。
图5为hTK1-IgY- rmAb和hTK1-IgY-pAb用于ECL点印迹法的结果。
具体实施方式
实施例1
本实施例公开鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体的制备过程
1. TK1-IgY-scFv噬菌体文库构建
步骤1），从母鸡脾细胞分离mRMA：采用人工合成的人TK1-31肽(GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ)与KLH的聚合物，免疫母鸡。收集鸡蛋并从蛋黄中分离粗TK1-IgY-pAb多抗粗品，然后通过亲和纯化方法得TK1-IgY-pAb纯化抗体，通过免疫印迹、免疫组织化学和血清学鉴定抗体的特异性和灵敏度。挑选生产高特异性和敏感性的TK1-IgY-Abs的母鸡进行建库。将母鸡处死，15min内迅速取脾细胞，用TriZol溶液(Invitrogen)匀浆。
步骤2）PCR反转录，用氯仿和异丙醇分离总RNA，然后采用oligodT作为引物，进行逆转录反应，制备cDNA。用于后续扩增抗体基因。
步骤3），重叠PCR，获得全长scFv基因：cDNA是使用来自TaKaRa™ Prime Script的1st Strand cDNA合成试剂盒制备的。使用简并引物扩增VH和VL基因。它们通过重叠的PCR(聚合酶链式反应)组装成scFv基因。
步骤4），拼接浓缩的scFv：分离PCR产物，并在通过T4DNA连接酶连接到噬菌粒载体pSCD-1（图1）之前用Sfi I和Not I进行切割。
步骤5），高活性细菌感受态中进行电转化：将连接混合物脱盐并电转化进入TG1感受态细胞。
步骤6），噬菌体抗体库包装：将辅助噬菌体M13KO7添加到噬菌粒载体中，包装后的噬菌体通过PEG 6000沉淀并进行常规滴定，为进一步的筛选过程做好准备。该库的构造如图2所示。在3周中完成大容量噬菌体抗体展示文库的快速构建，见附图2。最终获得具有抗体多样性的噬菌体文库，文库大小为3.4×109pfu/ml（pfu，plaque forming unit空斑形成单位），用于后续筛选。抗体库库容计算见表1。随机挑选50个单克隆进行菌落PCR鉴定，49个克隆扩增条带大小正确，阳性克隆率高达98%。
表1.库容计算方法
2. 筛选合格的阳性克隆。
将噬菌体文库加入封闭好的含有靶标TK1包被的96孔板中，并在37°C下孵育1h。用PBST洗涤9次后，通过胰蛋白酶消化洗脱结合的噬菌体。最后，在M13KO7辅助噬菌体的帮助下，洗脱液进行扩增并滴定以进行下一轮筛选，总共进行了三轮筛选。每轮依次增加PBST中Tween 20的含量（即第一轮0.1% Tween 20-PBS，第二轮为0.2% Tween 20-PBS，第三轮0.3%Tween 20-PBS），包被TK1抗原浓度从每一轮的初始浓度10μg/mL降低到2μg/mL。
计算每一轮的富集效率。计算结果显示每一轮淘选后，输出和输入噬菌体的比率稳定增加（表2），与第一轮筛选相比，第三轮筛选后噬菌体回收率增加约923倍，证明特异性抗体的有效富集。淘选的文库用于随后选择高亲和力抗体。
第3轮淘选结束后，从最终洗脱液中挑取单个菌落（不扩增），接种在含有100μL2YT-AG（2YT培养基，100μg/mL氨苄西林，0.1%葡萄糖）的96孔板中，37°C /220rpm过夜培养。第二天将20uL过夜培养菌转接到新的含有80uL 2YT-A（2YT培养基，100μg/mL氨苄西林）的96孔板中。当OD600达到约0.5时，以MOI为10-20加入M13KO7，37°C/180rpm振荡培养30min。随后，每孔加入100μL2YT-AK（2YT培养基，100μg/mL氨苄西林，50μg/mL卡那霉素），37°C /220rpm过夜培养。最后，将每孔100μL上清液转移到包被TK1靶标的测定板中进行Phage Elisa检测。
表2.噬菌体文库淘洗过程。
淘洗次数 输入（pfu） 输出（pfu） 富集率
1 5.0×1012 9.6×103 1.92×10-9
2 5.24×1012 7.44×104 1.42×10-8
3 5.28×1012 9.36×106 1.77×10-6
为鉴定抗体库质量，需要对抗体库进行测序：将Phage ELisa选择的阳性克隆接种至LB-A（LB培养基，100μg/mL氨苄西林）中,37°C /220rpm过夜培养。使用商用试剂盒分离每个克隆的质粒,通过DNA测序后，使用Geneious软件对序列dat进行分析。
总计49个样品测序，测序成功44个，其余5个测序失败。44个克隆中35个为正确克隆，其余9个存在移码突变。35个克隆均不相同，为独特序列。
采用极限稀释法（TK1抗原0.125μg-10μg/孔）检测亲和力，结果显示有5个阳性克隆具有高亲和力，这5个克隆对应的蛋白质基因序列，可变区域的序列如下：
基因序列一：
GCTGTAACGCTTGATGAATCTGGTGGGGGTTTACAAACACCGGGAGGAGCATTGTCGCTCGTTTGTAAGGCCAGCGGGTTCACATTCAGCGACAGGGGTATGGGATGGATGAGGCAAGCGCCCGGAAAAGGGCTAGAGTTTGTTGCGGGTGTAGATGATTCGGGTAGCAGTAGAGATTATGCCCCCGCAGTGAAAGGTAGGGCTACAATATCTAGGGATAACGGCCAGAGCACGCTAAGCCTCCAATTAAGTGATCTTCGCGCTGAAGACACGGGCACGTATTATTGCACACGGGGTTCCGTAGTAGGGTTCATAGACGCATGGGGTCACGGGACGGAAGTCATAGTATCATCAGGGGGAGGCGGATCCGGTGGCGGGGGATCCGGAGGTGGTGGTTCCCAGGCAGCGTTGACACAGCCGGCGTCAGTCAGTGCGAACCCAGGGGAAACGGTGAAAATTACGTGCTCCGGTGGAGGCTCTTATGCAGGGTCTTATTACTATGGTTGGTATCAACAAAAATCTCCTGGCAGTGCCCCAGTCACTGTCATTTATAATAACAACAACCGACCTAGTGGTATTCCGTCGCGTTTTAGCGGTTCCCTTTCGGGCTCCACGAATACCCTCACGATTACGGGCGTCCAAGCTGAAGACGAAGCGATCTACTACTGCGGATCTATCGACTCTTCCTACGTAGGTATATTTGGTGCCGGCACCGCTTTGACTGTATTA
重链可变区：DRGMGGVDDSGSSRDYAPAVKGRATGSVVGF-----IDA。
轻链可变区：SGGGSYAGSYYNNNNRPGSIDSS-YVGI。
基因序列二：
GCGGTAACATTAGACGAGTCAGGCGGGGGACTTCAAACGCCGGGAGGGGGCTTGTCTCTAGTATGCAAAGCGTCTGGATTTACCTTCAGCAATCATGGCATGGGGTGGGTGCGCCAAGCTCCTGGAAAAGGCTTGGAGTGGGTTGCAGGAATCAACAGCGGGGCAGGCTCTTACACAAACTACGGTGCAGCAGTAAAAGGTAGGGCAACCATCAGCCGAGACAACGGACAAAGCACAGTCAGGTTGCAGCTCAACAATTTAAGGGCAGAAGACACTGGCACATACTTCTGCGCACGGTCTGTCTACGGCGGTAGCATATCTCTCATAACGGATGTAATCGACACGTGGGGCCATGGGACGGAAGTGACAGTTTCATCCGGTGGTGGAGGGAGTGGTGGTGGAGGCTCCGGTGGTGGAGGGTCACAAGCAGCCCTGACACAACCGGCAAGCGTCTCAGCTAACTTGGGAGAAACAGTTAAAATCACCTGCTCTGGTGGTGCTAATTACTATGGCAGCTATTATTACGGATGGTACCAACAAAAAAGTCCAGGGTCAGCACCTGTCACAGTCATCAATGACAACACGAAACGCCCATCTAACATACCGTCCAGGTTTTCTGGCAGCACAAGCGGAAGTACAGGCACTCTCACAATTACGGGAGTGCAGGCCGACGATGAAGCTGTCTATTTCTGTGGCTCTTACGACTCTAGCGCTGGCTACGCAGGTATATTTGGAGCAGGTACAACTTTAACAGTATTA
重链可变区：NHGMGGINSGAGSYTNYGAAVKGRATSVYGGSISLITDVIDT。
轻链可变区：SGGANYYGSYYYGDNTKRPGSYDSSAGYAG。
基因序列三：
GCAGTAACATTGGATGAATCCGGTGGGGGTTTGCAAACTCCTGGTGGGACAGTCTCACTCGTGTGTAAGGCGTCAGGTTTCACTTTTTCCGATCGGGGTATGGGATGGATGCGGCAAGCGCCGGGCAAAGGACTTGAATTCGTAGCCGGAGTAGATGACTCTGGGTCCAGTCGTGACTACGCGCCCGCTGTCAAAGGTCGGGCGACGATAAGTCGTGACAATGGTCAAGACATATTACGGCTCCAGCTAAACAATCTACGTGCTGAAGATACAGCAACATATTATTGTACGAGAGGCTCAGTGGTAGGTTTCATAGATGCATGGGGACACGGCACGGAGGTTATAGTTTCCTCCGGTGGGGGAGGCTCTGGAGGCGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCACAAGCGGCGTTAACCCAACCCGCGTCAGTCTCAGCTTCCCCCGGGGAAACGGTCAAGATCACCTGTTCCGGGGGGGGGCGTTTTGCTGGATCTTATTACTATGGATGGTATCAACAGAAATCCCCCGGTAGTGCCCCGGTGACCGTTATTTACGACTCGACAAATCGGCCTTCTAATATACCGAGTCGTTTCTCTGGTAGCTTGTCTGGCTCAACAACAACGCTAACGATAACCGGTGTTCAGGCAGATGACGAGGCTGTGTATTTCTGCGGCTCTATCGACAGCAGCTATGTAGGGATATTCGGAGCTGGCACGACTCTTACCGTGTTA
重链可变区：DRGMGGVDDSGSSRDYAPAVKGRATGS------VVGFIDA。
轻链可变区：SGGGRFAGSYYYGDSTNRPGSIDSS-YVGI。
基因序列四：
GCTGTCACTCTAGACGAGTCAGGAGGCGGACTCCAGACACCTGGGGGGGCCCTAAGCTTGGTTTGTAAAGCATCAGGGTTTTCCTTTTCACGACATGGAATGGGATGGGTCCGGCAAGCCCCGGGAAAAGGACTGGAGTGGGTTGCGAGTATTAATTCAGGGGGATCGTATACGAACTATGGCGCAGCCGTGCAGGGAAGAGCGACTATATGGCGTGATAATGGTCAATCAACGGTAAGGCTACAATTGAATAACCTCCGGGCCGAGGATACGGCAACCTATTATTGTGCGCGAGATGCGGGATGCACTGGTGGCGGCACATGTTATGCATACGCGGACCGTATTGATGCGTGGGGACATGGGACGGAAGTTATTGTATCTAGTGGGGGCGGAGGCTCTGGGGGGGGGGGGTCGGGCGGTGGGGGCTCCCAGGCAGCGTTAACGCTCCCGAGCTCTGTGTCCGTGAATCCAGGAGAAACTGTTAAAATCACATGTTCAGGCTCTAGCGGCAGCTACGGCTGGTATCAACAAAAATCCCCCGGTTCCGCTCCAGTCACCGTTATTTACTACAATGGGAAGAGGCCGTCGGATATACCGTCTCGCTTCTCCGGTTCTAAATCCGGCTCAACGGGGACACTCACCATAACTGGCGTACAAGCTGAGGACGAGGCGGTGTACTTTTGCGGTAGTCGTGATAGCTCATACGACGGCATATTTGGAGCTGGTACAACACTGACGGTGCTT
重链可变区：RHGMGSINSGGSYTNYGAAVQGRATDAGCTGGGTCYAYADRIDA。
轻链可变区：SGSS---GS--YGYNGKRPGSRDSSYDGI。
基因序列五：
GCGGTTACACTAGATGAGAGCGGAGGTGGTCTACAAACGCCTGGTGGGGGTTTATCCCTCGTATGTAAAGCGTCTGGCTTCACATTTTCCAACCACGGGATGGGATGGGTACGCCAGGCACCCGGTAAAGGTCTCGAATGGGTGGCTGGAATAAATAGCGGAGCAGGATCTTATACCAACTACGGCGCAGCCGTTAAGGGGCGTGCAACTATCTCCCGCGACAATGGACAGTCCACCGTTCGACTCCAACTGAATAACCTTCGGGCTGAGGACACTGCTACTTATTACTGCGCCCGTTCGGTTTATGGTGGGAGTATTTCGTTAATTACAGATGTTATTGACACATGGGGCCACGGCACTGAGGTCATCGTCTCTTCTGGTGGGGGCGGCTCAGGAGGAGGCGGGTCTGGAGGAGGCGGTTCGCAGGCGGCCCTTACGCAACCATCAAGTGTCAGTGCAAATCCGGGAGAAACTGTTAAGATAACCTGTTCCGGATCTTACAGCAATTATTATGGCTGGTATCAGCAAAAATCTCCGGGGAGTGCTCCTGTTACTGTGATATACGAAAACAACAACAGGCCCAGCGATATTCCTTCACGTTTTTCGGGATCTAAATCTGGTTCTACTAACACTTTGACAATTACTGGTGTCCAGGTAGAGGACGAAGCCGTGTACTTTTGCGGCGGTTACGATGACTCTACGGACAGCGGAATATTCGGCGCAGGCACCACGCTGACCGTACTT
重链可变区：NHGMGGINSGAGSYTNYGAAVKGRATSVYGGSISLITDVIDT。
轻链可变区：SG—SYSN--YYGENNNRPGGYDDSTDSGI。
重组全长抗体蛋白进行真核表达。
筛选获得上述5个scFv阳性克隆独特性序列，分别构建了5个全长IgY抗体，SEQIDNO：24-28，依次对应分别命名为TK1-hen-1、2、3、4和5。首先转染到293T悬浮细胞中进行表达，收取培养6天后的上清液进行Elisa检测。
SEQID NO：24
TK1-hen-1 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSDRGMGWMRQAPGKGLEFVAGVDDSGSSRDY 60
TK1-hen-1 APAVKGRATISRDNGQSTLSLQLSDLRAEDTGTYYCTRGSVVGFIDAWGHGTEVIVSSG 119
TK1-hen-1 GGGSGGGGSGGGGSQAALTQPASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKSP 175
TK1-hen-1 GSAPVTVIYNNNNRPSGIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVQAEDEAIYYCGSIDSSYVGIFG235
TK1-hen-1 AGTALTVL 243。
SEQID NO：25
TK1-hen-2 AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSNHGMGWVRQAPGKGLEWVAGINSGAGSYTN60
TK1-hen-2 YGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCARSVYGGSISLITDVIDTWGHG119
TK1-hen-2 TEVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAALTQPASVSANLGETVKITCSGGANYYGSYYY175
TK1-hen-2 GWYQQKSPGSAPVTVINDNTKRPSNIPSRFSGSTSGSTGTLTITGVQADDEAVYFCGSYD235
TK1-hen-2 SSAGYAGIFGAGTTLTVL 253。
SEQID NO：26
TK1-hen-3 AVTLDESGGGLQTPGGTVSLVCKASGFTFSDRGMGWMRQAPGKGLEFVAGVDDSGSSRDY 60
TK1-hen-3 APAVKGRATISRDNGQDILRLQLNNLRAEDTATYYCTRGSVVGFIDAWGHGTEVIVSSG 120
TK1-hen-3 GGGSGGGGSGGGGSQAALTQPASVSASPGETVKITCSGGGRFAGSYYYGWYQQKSP175
TK1-hen-3GSAPVTVIYDSTNRPSNIPSRFSGSLSGSTTTLTITGVQADDEAVYFCGSIDSSYVGIFG235
TK1-hen-3 FGAGTTLTVL 245。
SEQID NO：27
TK1-hen-4 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSFSRHGMGWVRQAPGKGLEWVASINSGGSYTNY 60
TK1-hen-4GAAVQGRATIWRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCARDAGCTGGGTCYAYADRIDAWG 119
TK1-hen-4 HGTEVIVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAALTLPSSVSVNPGETVKITCSGSSGSYGWY 175
TK1-hen-4QQKSPGSAPVTVIYYNGKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYFCGSRDSS 235
TK1-hen-4 YDGIFGAGTTLTVL 248。
SEQID NO：28
TK1-hen-5 AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSNHGMGWVRQAPGKGLEWVAGINSGAGSYTN 60
TK1-hen-5 YGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCARSVYGGSISLITDVIDTWGHG 119
TK1-hen-5 TEVIVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAALTQPSSVSANPGETVKITCSGSYSNYYGWYQ 175
TK1-hen-5 QKSPGSAPVTVIYENNNRPSDIPSRFSGSKSGSTNTLTITGVQVEDEAVYFCGGYDDSTD235
TK1-hen-5 SGIFGAGTTLTVL 248。
1µg/mL TK1靶标包被抗原进行检测；从5个抗体中选取高亲和结合力的5#抗体，命名为人TK1-IgY-rmAb 5#。后续通过免疫印迹、免疫组织化学和血清学检测对该抗体进行灵敏度和特异性的验证(图3和图4)。
图3是ELISA滴度方法检测TK1-IgY-rmAb 5#：以1µg/mL TK1靶标为包被抗原检测纯化抗体的效价，进行2倍梯度稀释纯化抗体稀释至7.8ng/mL。在37°C下孵育1h，然后用PBST洗涤三次（0.1%吐温，PBS），之后加入带有HRP的二抗，用PBST洗涤五次，最后加入TMB显色，1M H2SO4终止后OD450处检测。重复检测结果显示（图3），该抗体的灵敏度高。
采用TK1阴性细胞系(143BTK1-/-)和TK1阳性细胞系（HT29）进行变性SDS-PAGE凝胶免疫电泳免疫（Western blot）检测。细胞裂解液分别上样50ng，TK1-IgY-rmAb 5#使用量为0.05ug/mL。检测结果显示,TK1阳性细胞裂解液中有一明显的TK1单体（25kD左右），是TK1特异表达的一条带，但TK1阴性细胞裂解液中，没有TK1单体特异条带出现，证明该抗体的特异性好。
#的TK1组织免疫化学和TK1血清学鉴定。
免疫组化（TK1）染色是用一例低分化卵巢癌患者（病理分级为3期）和正常扁桃体组织。扁桃体正常组织是包含2个不同的区域，包括增殖区和非增殖区。它通常用作评估抗体是否可以评估细胞增殖率的一好标准检测方法。因此，我们使用该组织来评估TK1-IgY-rmAb 5#的特异性和敏感性。图4A结果表明，仅在扁桃体增殖区域的细胞中观察到TK1染色，染色的特点是主要在细胞质中有不同程度的棕黄染色，但在非增殖区的扁桃体细胞的细胞质中没有观察到染色。此外，TK1在低分化卵巢癌患者（病理分级3级）中，染色的特点是主要在细胞质中有不同程度的棕黄染色。证明TK1-IgY-rmAb 5#具有高特异性和敏感性，与我们过去鉴定的IgY-pAb和TK1-IgG单克隆抗体相同。
使用ECL点印迹和全自动化学发光分析仪两种方法检测292份血清样本中的STK1p的浓度，然后进行比较分析。分析结果显示（图4B），两种方法的符合高达率r=0.857（超过0.75），说明两种检测方法符合率好，全自动化学发光分析仪将更加有利于大规模的早期肿瘤风险筛查。
实施例2
本实施例提供一种含有鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体的重组载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1），将IgY重链及轻链基因片段的设计合成：将重链（NHGMGGINSGAGSYTNYGAAVKGRATSVYGGSISLITDVIDT）和轻链可变区（SG—SYSN--YYGENNNRPGGYDDSTDSGI）对应的DNA片段序列与IgY骨架区DNA片段序列整合并分别在DNA片段前端添加EcoRI酶切位点序列及保护碱基，末端添加BamHI酶切位点序列及保护碱基；然后进行全基因合成。
步骤2），DNA片段装载进入真核表达载体PTT5中：合成的DNA片段用EcoRI和BamHI双酶切后插入真核表达载体PTT5的EcoRI/BamHI之间，获得含有重组鸡抗人TK1（5#）全长IgY单克隆抗体的重组载体。
实施例3
本实施例提供一种含有鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体基因的重组载体的细胞制备方法，包括以下步骤：
步骤1），调整细胞密度：293T悬浮细胞计数，离心弃上清，调整细胞密度至4.0×106个/mL，37℃下用体积浓度为5%的CO2，培养4h。
步骤2），转染：按照DNA（5#）(ug)： PEI(1mg/mL)=1：4比例加入转染培养基中，涡旋混匀，室温静置孵育15min；逐滴加入混合液于待转细胞悬液中，边加入边轻柔摇匀。
步骤3），细胞培养：转染完成的细胞，37℃下用体积浓度为5%的CO2培养120h后收取上清纯化。
实施例4
本实施例提供一种含有鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体的检测试剂盒的制备方法：
试剂盒包括校准品、质控品、封闭剂、偶合第一抗体的磁微粒试剂、生物素标记的第二抗体、链霉亲和素标记的碱性磷酸酶、发光底物、抗试剂、稀释液和洗涤液的制备方法如下：
1、偶合第一抗体的磁微粒试剂
1)将充分混匀后的甲苯磺酰基磁微粒浓缩液放入反应瓶中，待磁微粒全部被磁场吸附后，吸去上清，向反应瓶中加入10倍体积的磁微粒活化缓冲液，震荡洗涤10min，再将反应瓶放置在磁场中15min，吸去上清；重复清洗磁微粒2遍；最后将磁微粒溶液稀释至1-30mg/ml，混匀待用；
2)连接反应按照质量比甲苯磺酰基磁微粒溶液：第一抗体（重组鸡抗人TK1全长IgY单克隆抗体）为100：1的比例在步骤1)中所制备得到的甲苯磺酰基磁微粒溶液中加入第一抗体，加入总体积1/10的磁微粒催化缓冲液，在37℃中保持混匀状态反应18h；
3)在步骤2)中制备得到的磁微粒溶液中加入溶液总体积1/20的10％BSA，在37℃中保持混匀状态反应6h；
4)反应瓶在磁场中放置15min，待甲苯磺酰基磁微粒吸附至磁场后用磁微粒清洗液清洗3遍，随后定容至1-20mg/ml，4℃保存，制得磁微粒偶合的第一抗体。
其中，该磁微粒活化缓冲液的配制方法是将1-10g硼酸溶于900ml去离子水中，用NaOH调整pH至8-10，定容至1L后用0.45μm滤膜过滤；
磁微粒催化缓冲液的配制方法是：将30-300g硫酸铵溶解于1L磁微粒活化缓冲液中，完全溶解后用0.45μm滤膜过滤；
磁微粒清洗液是pH 7.4的TBST缓冲液。
2、生物素标记的第二抗体
使用PBS将重组鸡抗人TK1全长IgY单克隆抗体配制成0.1-20mg第二抗体溶液，生物素使用DMSO配制成5-50mg溶液，添加生物素溶液到抗体溶液里混匀，冰浴2h或室温反应30min，制得生物素标记的第二抗体溶液。
3、发光底物
碱性磷酸酶发光底物1号，货号：APSUB-1(北京爱维德生物技术有限公司)。
4、封闭剂
脱脂奶粉为赛默飞世尔科技（中国）有限公司所提供的。
5、稀释液
将0.1g-10g封闭剂溶于1LTris缓冲液，加入0.1-5mL防腐剂，完全溶解后0.22μm滤膜过滤后制备而成。
6、生物素化抗体工作液
将生物素化抗胸苷激酶1-IgY多克隆抗体稀释至终浓度为0.05-15ug/mL。
7、洗涤液
pH 7.4TBST缓冲液(30倍浓缩液)
8、链霉亲和素标记的碱性磷酸酶
链霉亲和素标记的碱性磷酸酶是购买Invitrogen链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，使用稀释液稀释50000倍后制得。
实施例5
本实施例提供一种含有鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体的药物的制备方法：
1、重组鸡抗人TK1全长IgY基因双表达框表达载体构建：以5#抗体重链、轻链氨基酸序列优化成CHO密码子合成基因，重链两端分别设计HindⅢ、XmaⅠ酶切位点，轻链两端分别设计BsiWⅠ、EcoRⅠ酶切位点。重链以设计酶切位点装载插入pEE 6.4载体，轻链以设计酶切位点装载插入pEE 12.4载体。两个表达载体再以NotⅠ、SalⅠ酶切，将pEE 6.4中的重链ORF回收后连接插入pEE 12.4中，PVUⅠ酶切线性化。
2、CHO转染加压：CHO细胞复苏，调整细胞状态至最佳。将线性化后的表达载体用GenePulserXcell™系统电击转染进入细胞，次日补充培养基MSX加压三周。待细胞大部分死亡后长出新的克隆团。选取30个高表达的细胞孔转移至24孔板中，然后转至6孔板，细胞密度达80%后冻存细胞。
3、单克隆细胞株筛选：小梯度多次加压有利于得到高表达细胞株，但是细胞株表达不稳定，在撤掉筛选压力后，表达水平往往下降，为下一步进行有限稀释法筛选做准备。加压浓度可根据实际培养情况灵活改动，暂定加压三轮，可根据实际情况进行调整。
有限稀释法筛选：细胞铺板密度摸索：以1000个/孔为起始密度，倍比稀释。每个密度铺10板，37℃下用体积浓度为5%的CO2培养，观察。取96孔板上清检测ELISA，挑选效价高的克隆号至12孔板培养。取12孔板上清检测ELISA，挑选效价高的克隆号至6孔板培养。取6孔板上清检测ELISA，挑选效价高的克隆号至摇瓶培养，通过镜下观察，细胞密度，活率综合评估细胞状态，活率大于95%冻存细胞株10-20支；取上清1.5-2.0mL检测ELISA和HPLC评估抗体表达，HPLC评估终末抗体产量（标准≥5g/L）。
4、稳定性观察：
每个培养代次在细胞活率降至50%以下，取上清1.5-2.0mL检测ELISA和HPLC评估抗体表达，HPLC评估终末抗体产量，要求终末产量下降小于10%，符合要求进行细胞库建立。
5、稳定细胞系发酵及纯化。
选取产量在5g/L以上的细胞株，进行发酵生产。细胞上清进行纯化及除杂，确保产品符抗体药标准。
本申请是应用改进的噬菌体展示方法，采用人TK1的C端195-225多肽，开发了鸡抗人TK1全长-IgY单克隆抗体。采用改进的噬菌体展示方法，阳性克隆率高达98%。，3周内快速构建3.4×109pfu/ml超大文库，可彻底杜绝环境噬菌体污染。因此，我们成功地得到符合发明人要求的单链抗体，并获得抗体重轻链可变区序列。将获得的抗体片段分析后进行全长IgY抗体的构建，然后通过真核表达系统表达抗体，并进行纯化。通过ELISA滴度、免疫印记、免疫组织化学等检测方法验证了该抗体具有高特异性和高灵敏度。
更重要的是，血清学鉴定指出，采用我们组装的两种血清检测用试剂盒进行血清检测，检测结果显示，两种方法符合相关系数高达r = 0.857。今后，全自动化学发光仪将替代过去的半自动增强化学发光免疫检测系统，实现了新一代TK1-IgY重组抗体试剂盒在全自动仪上运行，可满足大规模早期肿瘤风险筛查的检测需求。目前利用噬菌体展示文库技术成功构建了TK1-IgY -rmAb并在新全自动仪上运行，目前尚未见报道，为国际首创。
为了确认鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体（hTK1-IgY- rmAb）是可以替代鸡抗人TK1天然全长IgY多克隆抗体（hTK1-IgY-pAb），发明人分别用hTK1-IgY- rmAb和hTK1-IgY-pAb采用增强化学发光点印迹法 （ECL-dot blot）检测了95名自愿献血者（自述无肿瘤或传染病）中STK1p的浓度。如图5所示，皮尔逊试验的符合率为r=0.988，证实了用hTK1-IgY-rmAb替换hTK1-IgY-pAb是可信的。
本申请的血清和组织标本收集和使用是根据1964年赫尔辛基宣言的宣言和国际协调会议的临床实践三方指南进行的。本研究获得常州市肿瘤医院批准，伦理号2020-SY-032。所有参与者在进入研究之前都提供了知情同意书。
以上所述实施例仅为本发明优选实施例，用于解释说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的发明名称已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims (11)

1.一种鸡源抗人TK1重组IgY单链抗体，其特征在于：所述单链抗体由重链、连接肽和轻链构成，所述重链包括第一重链可变区域、第二重链可变区域和第三重链可变区域，所述单链抗体的轻链包括第一轻链可变区域、第二轻链可变区域和第三轻链可变区域；所述第一重链可变区域的氨基酸序列选自SEQID NO：1至SEQID NO：3中的一种，所述第二重链可变区域的氨基酸序列选自SEQID NO：4至SEQID NO：6中的一种，所述第三重链可变区域的氨基酸序列选自SEQID NO：7至SEQID NO：9中的一种；所述第一轻链可变区域的氨基酸序列选自SEQID NO：10至SEQID NO：14中的一种，所述第二轻链可变区域的氨基酸序列选自SEQIDNO：15至SEQID NO：19中的一种，所述第三轻链可变区域的氨基酸序列选自SEQID NO：20至SEQID NO：23中的一种。
2.根据权利要求1所述的鸡源抗人TK1重组IgY单链抗体，其特征在于：同一所述单链抗体的可变区域由重链的SEQID NO：1、SEQID NO：4、SEQID NO：7和轻链的SEQID NO：10、SEQIDNO：15、SEQID NO：20组成；或者由重链的SEQID NO：2、SEQID NO：5、SEQID NO：8和轻链的SEQID NO：11、SEQID NO：16、SEQID NO：21组成；或者由重链的SEQID NO：1、SEQID NO：4、SEQID NO：7和轻链的SEQID NO：12、SEQID NO：17、SEQID NO：20组成；或者由重链的SEQIDNO：3、SEQID NO：6、SEQID NO：9和轻链的SEQID NO：13、SEQID NO：18、SEQID NO：22组成；或者由重链的SEQID NO：2、SEQID NO：5、SEQID NO：8和轻链的SEQID NO：14、SEQID NO：19、SEQID NO：23组成。
3.一种鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体，其特征在于：包含权利要求1-2任一重链和轻链，共有5种单克隆抗体，分别为SEQID NO：24至SEQID NO：28的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的优选鸡源抗人TK1重组全长单克隆IgY抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的氨基酸序列为SEQID NO：28。
5.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包含编码权利要求1-4所述氨基酸序列的核酸，构建所述重组载体的为PTT5质粒。
6.一种含重组载体的细胞，其特征在于：所述细胞含有权利要求5所述的重组载体，并使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞构建稳定细胞系。
7.一种检测卡、检测条或检测试剂盒，其特征在于：所述检测卡、检测条或检测试剂盒含有权利要求1-4任一所述的抗体。
8.一种药物，其特征在于：含有权利要求1-4任一所述的抗体。
9.一种鸡源抗人TK1重组IgY抗体的噬菌体抗体展示文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：所述权利要求1-4中任一抗体是通过步骤1）从母鸡脾细胞中分离mRMA、步骤2）PCR反转录、步骤3）PCR重叠获得全长scFv基因、步骤4）拼接浓缩scFv、步骤5）高活性细菌感受态中电转化、步骤6）噬菌体抗体包装以及步骤7）筛选，能够在三周内快速构建大容量噬菌体抗体展示文库；鸡源抗人TK1重组IgY抗体含权利要求1-4任一所述的抗体。
10.根据权利要求9所述的鸡源抗人TK1重组IgY抗体的筛选方法，其特征在于：
所述步骤1）中母鸡处死后15min以内，迅速取脾细胞，用TriZol溶液匀浆，用氯仿和异丙醇分离总RNA；
所述步骤2）中采用oligodT作为引物，进行逆转录反应，制备cDNA用于后续扩增抗体基因；
所述步骤3）中，使用简并引物扩增所述重链可变区域和轻链可变区域的基因，通过重叠PCR(聚合酶链式反应)组装成scFv基因；
所述步骤4）中，分离PCR产物，并在通过T4DNA连接酶连接到噬菌粒载体pSCD-1（如附图1）之前用Sfi I和Not I进行切割；
所述步骤5）中，将连接混合物脱盐并电转进入TG1感受态细胞；
所述步骤6）中，将辅助噬菌体M13KO7添加到附图1所示的噬菌粒载体中进行包装，包装获得的噬菌体通过PEG 6000沉淀并进行滴定，用于进一步筛选；
所述步骤7）中，将噬菌体文库加入含有靶标TK1的筛选板中，经过多次洗涤、孵育后，消化洗脱结合的噬菌体，扩增后经过多轮筛选、取出单个菌落接种培养，在600nm波长处的吸光值达到0.4-0.6时，以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10-20之间加入辅助噬菌体培养，对噬菌体进行酶联免疫吸附法检测（ELISA）和DNA测序；根据DNA测序结果，重组所有独特的单链抗体，基于IgY全长抗体重链和轻链序列主链，通过连续PCR和克隆步骤构建全长抗体序列，然后装载入真核表达载体PTT5，得到PTT5-TK1-IgY-H和PTT5-TK1-IgY-L表达载体对。
11.一种使用鸡源抗人TK1重组IgY抗体的检测方法，其特征在于：应用权利要求1-4任一抗体，通过增强型化学发光（ECL）斑点印迹法或化学发光免疫分析法手动或全自动检测体液（包括血液、尿液、唾液、脑脊液、腔积液等）样本中TK1浓度。
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