CN117487014A - 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 - Google Patents
一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117487014A CN117487014A CN202311458329.8A CN202311458329A CN117487014A CN 117487014 A CN117487014 A CN 117487014A CN 202311458329 A CN202311458329 A CN 202311458329A CN 117487014 A CN117487014 A CN 117487014A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acid
- cdr
- seq
- acid sequence
- monoclonal antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 109
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 92
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 14
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 19
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 13
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 208000006552 Lewis Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 5
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000012200 cell viability kit Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000012917 library technology Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Abstract
本发明公开了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体或片段含有选自下列至少之一的CDR序列或与其至少有95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列SEQ ID NO:1～11；轻链可变区CDR序列SEQ ID NO:12～26，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自scFv氨基酸序列为SEQ ID NO:27～33。该单克隆抗体或其抗原结合片段特异性识别LL/2‑Luc2或其他肿瘤细胞相关抗原，具有抗肿瘤作用和用途，具有良好的应用前景。
Description
本申请是2023年03月07日提交的申请号为CN202310211947.6，发明名称为“一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途”的分案申请。
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途。
背景技术
肺癌目前占世界癌症死因的第一位，是世界上发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。对于肺癌的治疗门类众多，但肺癌的预后仍较差，总体治疗效果目前仍不理想。由于肺癌的早期诊断尚有困难，又缺乏有效的治疗方法，因此选择一种简单易行，成模时间短，成模率高的肺癌动物模型对更加深入探讨肺癌的致癌因素、发病机制以及制定有效的治疗手段及防治措施是十分必要的。
Lewis肺癌已被广泛应用于许多重要的研究。Lewis肺癌细胞株(LLC)最早是从小鼠Lewis肺癌中分离到的适应培养细胞克隆系。C57BL/6小鼠具有正常的免疫功能，价格低廉、耐受性强，模型成熟，常用于Lewis细胞的肺癌转移建模型构建。LLC细胞在C57BL/6小鼠体内保持高度致瘤性和肺转移性，LLC细胞采用基因工程技术修饰后可表达荧光素酶或绿色荧光蛋白，达到肿瘤细胞在活体内可视化效果(Bertram JS,Janik P.Establishment ofa cloned line of Lewis lung carcinoma cells adapted to cell culture[J].CancerLett，1980,11(1):63-73；Zhu H,et al.A simple bioluminescence imaging method forstudying cancer cell growth and metastasis after subcutaneous injection ofLewis lung carcinoma cells in syngeneic C57BL/6mice[J].React Oxyg Species(Apex),2018,5(14):118-125)。
随着噬菌体展示技术的出现和基因工程抗体技术的发展，噬菌体抗体库技术成为一种制备单克隆抗体的新方法。目前大多数的噬菌体抗体库为免疫噬菌体库，通过免疫后动物体内的抗体水平提高，更有利于筛选到针对特异性抗原的抗体，对后续诊断及治疗效果更有优势(许静，张磊等，B3HM细胞免疫小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及表达，中国生物工程杂志，2007，27(7)：12～16)。
目前尚未见关于LL/2-Luc2细胞免疫动物筛选出特异性单克隆抗体的报道。本发明利用噬菌体展示技术筛选出特异性靶向LL/2-Luc2细胞的单克隆抗体，为获得特异性识别肿瘤细胞的抗体和进一步制备抗肿瘤药物提供基础。
发明内容
本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体特异性靶向LL/2-Luc2肺癌细胞。利用基因工程的方法，在鼠源免疫噬菌体抗体库中淘选并鉴定出能特异性结合LL/2-Luc2细胞的单克隆抗体或其抗原结合片段，以达到能有效、快速识别LL/2-Luc2肺癌细胞的目的，为获得特异性靶向肿瘤细胞的单克隆抗体提供了思路和方法。
为实现本发明的目的提供了如下实施方案。
本发明的一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段包含重链可变区CDR和轻链可变区CDR，所述重链可变区CDR具有选自SEQ ID NO:1～11的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区CDR具有选自SEQ IDNO:12～26的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在一具体实施方案中，本发明的一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区CDR为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区CDR为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具有选自下列组的氨基酸序列：
1)CDR-H1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、CDR-H2具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和CDR-H3具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列且CDR-L1具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列、CDR-L2具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列和CDR-L3具有如SEQID NO:21所示的氨基酸序列；
2)CDR-H1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、CDR-H2具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和CDR-H3具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列且CDR-L1具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列、CDR-L2具有如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列和CDR-L3具有如SEQID NO:22所示的氨基酸序列；
3)CDR-H1具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、CDR-H2具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列和CDR-H3具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列且CDR-L1具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列、CDR-L2具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列和CDR-L3具有如SEQID NO:23所示的氨基酸序列；
4)CDR-H1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、CDR-H2具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列和CDR-H3具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列且CDR-L1具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列、CDR-L2具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列和CDR-L3具有如SEQID NO:24所示的氨基酸序列；
5)CDR-H1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、CDR-H2具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和CDR-H3具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列且CDR-L1具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列、CDR-L2具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列和CDR-L3具有如SEQID NO:25所示的氨基酸序列；
6)CDR-H1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、CDR-H2具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和CDR-H3具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列且CDR-L1具有如SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列、CDR-L2具有如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列和CDR-L3具有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；
7)CDR-H1具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、CDR-H2具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列和CDR-H3具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列且CDR-L1具有如SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列、CDR-L2具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列和CDR-L3具有如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
优选的，上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或抗原结合片段具有选自如SEQ ID NO.27～33所示的氨基酸序列。
更优选的，上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有选自表1中的抗体编号为501、Y003、Y005、Y008、Y009、Y010和RA001的序列。
本发明还提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种表达载体，含有上述本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重组载体，将IL-10信号肽-单克隆抗体的表达序列克隆到pcDNA3.4载体的Not1/Xba1酶多克隆位点处。
本发明还提供了一种真核宿主细胞，插入上述的表达载体，并转化。
上述的真核宿主细胞，所述真核宿主细胞为CHO细胞。
术语：CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别代表重链互补决定区1、重链互补决定区2、重链互补决定区3；CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分别代表轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3。
在另一具体实施方案中，本发明提供了一种靶向LL/2-Luc2细胞的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)、重链互补决定区3(CDR-H3)，以及轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)、轻链互补决定区3(CDR-L3)。所述重链可变区CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO:1～11所示；所述轻链可变区CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO:12～26所示。
优选的，在上述的另一具体实施方案中，本发明的靶向LL/2-Luc2细胞的单克隆抗体或其抗原结合片段，其CDR的氨基酸序列选自下列组：
(1)CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO:4、CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO:8；CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO:12、CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:16、CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO:21；
(2)CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO:4、CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO:8；CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO:13、CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:17、CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO:22；
(3)CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO:2、CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO:5、CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO:14、CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:18、CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO:23；
(4)CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO:6、CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO:14、CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:18、CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO:24；
(5)CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO:4、CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO:8；CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO:15、CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:19、CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO:25；
(6)CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO:4、CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO:14、CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:20、CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO:26；
(7)CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO:3、CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO:7、CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO:12、CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO:16、CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO:21。
进一步，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段选自scFv氨基酸序列如SEQ IDNO：27～33任一所示的序列。
本发明提供了所述单克隆抗体或其抗原结合片段的scFv序列的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
第一步，噬菌体抗体文库的构建；
第二步，噬菌体抗体文库的淘筛；
第三步，阳性细胞LL/2-Luc2富集成功后将其富集的phage菌液涂板，挑阳性单克隆噬菌体送测序公司测序，得到靶向LL/2-Luc2细胞的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链、轻链可变区序列；
第四步，用获得的重链、轻链可变区序列组装成scFv序列表达出相应抗体。
优选的是，所述第一步中噬菌体抗体文库的构建包括：
(1)用指数生长期的Lewis肺癌LL/2-Luc2细胞，腹腔注射免疫6只6～8周龄的C57小鼠，雌雄各半，每只注射1x105个细胞，隔周注射一次，免疫3次后处死小鼠；
(2)取6只免疫小鼠脾脏提取RNA；
(3)RNA反转录为cDNA，以其为模板PCR扩增VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)，再拼接成scFv片段；
(4)将scFv片段电转进入噬菌体，并评估文库质量；
(5)收集抗体库噬菌体，建立scFv噬菌体抗体库原始文库。
本发明还提供一种编码上述单克隆抗体或其抗原结合片段的DNA分子。
本发明提供了一种包含所述靶向LL/2-Luc2细胞的单克隆抗体的重组载体，所述载体包括前述的DNA分子；将IL-10信号肽-单克隆抗体的表达序列克隆到pcDNA3.4载体的Not1/Xba1酶多克隆位点处。
本发明提供了一种宿主细胞，它被上述表达载体转化。在一个较佳的实例中，该宿主细胞是CHO细胞。
本发明提供了一种制备上述本发明的单克隆抗体的方法，该方法包括：
(1)提供一种表达载体，该表达载体含有编码上述本发明的单克隆抗体的核酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；
(2)用步骤(1)所述的表达载体转化宿主细胞；
(3)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤(2)所得的宿主细胞；
(4)分离纯化获得所述单克隆抗体。
所述单克隆抗体为独特型抗体，可以与LL/2-Luc2细胞特异性结合。流式细胞仪检测结果显示，采用体外重组表达的含501抗体序列的嵌合抗体与LL/2-Luc2阳性细胞结合率高达35.84％，而与阴性细胞结合率约3.36％；免疫细胞化学实验结果显示，该含501抗体序列的嵌合抗体与LL/2-Luc2阳性细胞有强阳性结合，与阴性细胞几乎无结合，均说明所述嵌合抗体具有靶向LL/2-Luc2细胞的特性。
结合上述的技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的靶向LL/2-Luc2细胞的单克隆抗体或其抗原结合片段，为构建特异性靶向肿瘤细胞的基因工程抗体提供支持。本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性靶向LL/2-Luc2肺癌细胞，并抑制其生长，因此，具有抗肿瘤活性。
附图说明
图1为pcDNA3.4载体，并且表明了其中的元件及酶切位点；
图2为本发明所构建的表达载体，含有特异性识别LL/2-Luc2的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区基因(浅色区域为目标基因)；
图3为本发明的含有501抗体序列的嵌合抗体的蛋白纯化电泳图；
图4为本发明的含有501抗体序列的嵌合抗体的高效液相色谱图；
图5为本发明的含有501抗体序列的嵌合抗体特异性结合LL/2-Luc2的流式细胞仪检测结果图；
图6为本发明的含有501抗体序列的嵌合抗体特异性结合LL/2-Luc2的免疫细胞化学检测结果图(深色为阳性表达)；
图7为本发明的嵌合抗体对LL/2-Luc2细胞的生长抑制活性。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明和理解本发明的实质，但不以任何方式限制本发明的范围，任何在本发明的精神实质下进行的简单修饰和变通都属于本发明的范围。
阳性细胞：LL/2-Luc2小鼠Lewis肺癌细胞，ATCC购买，
阴性细胞：小鼠正常肺上皮细胞，上海复祥生物科技有限公司购买。
实施例1从抗体库中筛选靶向LL/2-Luc2细胞的抗体基因可变区
1)鼠源抗体文库的构建
用指数生长期的Lewis肺癌LL/2-Luc2细胞，腹腔注射免疫6只6～8周龄的C57小鼠，雌雄各半，每只注射1×105个细胞，隔周注射一次，免疫3次，末次免疫后第3天取尾静脉血并处死。
取小鼠血分离血清，以常规ELISA法检测抗体滴度。包被指数生长期的LL/2-Luc2细胞于96孔酶标板中，1×105细胞/孔，PBS缓冲液为阴性对照。一抗为免疫后鼠血清，按相应比例稀释，以PBS缓冲液注射小鼠的血清为阴性对照。二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，四甲基联苯胺(TMB)显色，加入中止液，用酶标仪检测波长450nm处的吸光值。OD450扣除空白值＞负对照2倍为阳性，结果显示6份鼠血清样本效价平均值为1:10以上。
取6只免疫小鼠脾脏混合，分离脾淋巴细胞。取2×107脾淋巴细胞按照总RNA提取试剂盒说明书从小鼠脾脏中提取总RNA。
在总RNA提取后立即使用反转录试剂盒进行反转录，PCR反应程序为：95℃预变性2min，继以94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环。得到的cDNA可暂存于4℃，需长期保存的cDNA存放于-20℃，避免反复冻融。
以cDNA为模板，使用高保真酶通过一轮PCR扩增获得VH/VL片段；再以VL为模板，通过第二轮PCR扩增获得Linker-VL片段；以VH和Linker-VL模板通过overlap PCR获得scFv片段。
将纯化后的scFv基因产物进行酶切回收，与经同样酶切和纯化的载体片段连接，然后将连接产物进行电击转化，电转产物活化并收集抗体文库噬菌体。
统计库容，从LB/Carb50平板中随机挑取10个单克隆进行PCR鉴定，统计GA插入效率＞90％。
2)噬菌体抗体文库的淘筛
通过消减淘筛法(先阴性选择，后阳性选择)筛选出能特异性结合LL/2-Luc2的抗体噬菌体。先用正常或对照细胞(3×106个)与文库噬菌体上清(滴度为2×1010)混悬，4℃孵育2h，吸附非特异性抗体，离心取phage上清液，再用靶细胞LL/2-Luc2(5×106个)与噬菌体上清液结合，4℃孵育2h进行亲和筛选。用4℃预冷的PT缓冲液清洗6-8次，感染alpha5F，加入辅助噬菌体过夜扩增培养。通过PEG8000/NaCl沉淀法，分离纯化噬菌体。进行3～4轮噬菌体淘筛，并将最后一轮噬菌体文库加入50％甘油储存在-80℃冰箱。
3)挑取阳性单克隆噬菌体抗体并测序获得scFv序列
将LL/2-Luc2细胞富集的phage菌液涂板挑阳性单克隆噬菌体抗体送测序公司测序，得到靶向LL/2-Luc2细胞的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区序列，组装成单链抗体501、Y003、Y005、Y008、Y009、Y010、RA001。其scFv氨基酸序列见表1。
表1靶向LL/2-Luc2细胞的scFv氨基酸序列
上述抗体的可变区氨基酸序列中，其关键作用的片段即互补决定区CDR的氨基酸序列见表2。
表2靶向LL/2-Luc2细胞的单克隆抗体的CDR氨基酸序列
靶向LL/2-Luc2细胞的具体每个单克隆抗体或其抗原结合片段的互补决定区(CDR)的组成见表3。
表3具体单克隆抗体的互补决定区的氨基酸序列
实施例2重组载体的制备
将筛选获得的抗体序列使用scFv+兔Fc蛋白的形式进行抗体表达。整理上述抗体序列为IL-10信号肽-嵌合抗体形式，克隆到pcDNA3.4载体中，其中
连接区的核苷酸序列SEQ ID NO.34：
GGTGGTGGCGGATCAGGTGGGGGAGGCTCTGGTGGAGGCGGTAGT。
IL-10信号肽的核苷酸序列SEQ ID NO.35：
GCGGCCGCAAACTACAAGACAGACTTGCAAAAGAAGGCATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCC。
Fc片段的核苷酸序列SEQ ID NO.36：
GCCCCCTCCACCGCTTCCAAGCCCACCTGCCCCCCCCCTGAGCTGCTGGGAGGACCTTCCGTGTTCATCTTCCCCCCCAAACCCAAAGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGACGACCCCGAGGTGCAGTTTACATGGTACATTAACAACGAGCAGGTGAGAACCGCCAGACCCCCCCTGCGCGAGCAGCAGTTCAACAGCACCATCAGAGTGGTGAGCACCCTGCCCATCGCCCACCAGGATTGGCTGAGAGGCAAGGAATTCAAGTGCAAAGTGCACAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATTGAGAAAACCATCAGCAAAGCCAGAGGCCAGCCCCTGGAACCCAAAGTGTACACCATGGGGCCCCCCAGAGAAGAACTGAGCAGCAGAAGCGTGAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCCAGCGACATCAGCGTGGAATGGGAAAAAAACGGCAAGGCCGAGGACAACTACAAGACCACCCCCGCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCCTGTACAGCAAGCTGAGCGTGCCCACCAGCGAGTGGCAGAGAGGCGACGTGTTCACCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCATCAGCAGAAGCCCCGGCAAGTGATTCTAGA。
将上述整合序列交由上海百英生物科技有限公司进行全序列合成，克隆至pcDNA3.4质粒(如图1所示)，委托百英生物通过上游NotⅠ酶切位点和下游XbaⅠ酶切位点构建，获得重组载体(如图2所示)。图2为构建的表达载体，含有特异性识别LL/2-Luc2的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区基因。
实施例3抗体的表达和纯化
将构建的带有嵌合抗体基因的表达载体pcDNA3.4-Vector+scFv+Fc转化大肠杆菌DH5α菌株中接种于100mL LB培养基中进行扩增，用超纯质粒DNA纯化试剂盒(UltrapurePlasmid DNA Purification Kit)抽提纯化质粒DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒(lipofectamine 2000transfection reagent,11668-027)，将上述纯化的质粒DNA共转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。
转化的CHO细胞在MTX选择培养基(sigma A-6770)上进行连续2周的选择，最后在96孔板上进行极限稀释培养,连续进行3次，进行单克隆化。
挑出的单克隆细胞系在RPMI 1640培养基(Invitrogen)上进行培养，用Protein A亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化出上述嵌合抗体，取纯化后的蛋白收集物进行SDA-PAGE电泳鉴定。由图3可知，筛选出的含501抗体序列的嵌合抗体蛋白在CHO细胞上有明显表达。
亲和层析的产物再次经过分子筛层析，7条表达并纯化后的嵌合抗体经HPLC鉴定纯度结果见表4。如图4所示，含501抗体序列的嵌合抗体获得了纯度>98％的样品。
表4靶向LL/2-Luc2细胞的嵌合抗体纯度
实施例4嵌合抗体的流式细胞术检测
将培养的阳性和阴性细胞经胰酶消化后充分吹打使之成为单细胞悬液，分别取阳性细胞和阴性细胞各1×106个，250g离心5min后弃去培养基，用预冷PBS洗涤细胞3次，250g离心5min，离心收集细胞沉淀备用。100μL PBS重悬细胞，加入嵌合抗体5uL混合，4℃避光孵育30min；350g离心5min，弃去上清液。预冷PBS洗涤细胞3次，去除未结合的抗体，分别得到阳性和阴性细胞-抗体复合物。
将上述细胞-抗体复合物分别和荧光标记的二抗驴抗兔IgG混匀，4℃避光孵育30min，预冷PBS洗涤细胞3次，去除未结合的荧光二抗驴抗兔IgG，分别得到阳性和阴性的细胞-抗体-二抗复合物。
另分别用阳性和阴性细胞只与二抗结合作为空白对照。
将上述细胞-抗体-二抗复合物和细胞-二抗复合物用300uL PBS重悬，采用流式细胞仪检测。用软件CytExpert分析流式结果。
鼠兔嵌合抗体特异性识别LL/2-Luc2细胞，然后用荧光标记的驴抗兔二抗识别该嵌合抗体，由此认为带有二抗荧光显色的细胞则为能与嵌合抗体结合的阳性细胞。流式结果如图5和表5所示，图5为含501抗体序列的嵌合抗体特异性结合LL/2-Luc2细胞的流式细胞仪检测结果。含501抗体序列的嵌合抗体与LL/2-Luc2阳性细胞结合率达35.84％，而与阴性细胞结合率约3.36％，验证了该嵌合抗体能与LL/2-Luc2细胞特异性结合。
表5靶向LL/2-Luc2细胞的嵌合抗体的阳性结合率
实施例5嵌合抗体的免疫细胞化学检测
(1)细胞爬片的制作：
分别取指数生长期的阳性和阴性细胞，胰酶消化后充分吹打使之成为单细胞悬液，1000rpm离心5分钟，吸除上清液，加适量完全培养基混悬计数。调节细胞密度至1～2×105个/mL。
取出无菌6孔板，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。将调整好的细胞悬液分别取2mL/孔接种于6孔板内(将细胞悬液一滴一滴地滴到玻片上)使细胞密度为约2×105个/孔，盖上盖子后置于37℃、5％CO2恒温培养至细胞完全贴壁。
(2)免疫细胞化学检测：
①固定：取出孔板，吸去培养基，用PBS轻柔洗涤细胞2次，再用4％多聚甲醛固定30min；
②封闭：吸取固定液，PBS洗涤2次，每次5min滴加山羊血清封闭液，室温20min；
③一抗：滴加嵌合抗体溶液，4℃过夜；
④二抗：滴加生物素标记羊抗兔IgG，37℃30min；PBS水洗3次，每次5min；
⑤滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃30min；PBS水洗3次，每次5min；
⑥DAB显色：使用DAB显色试剂盒，混匀试剂后滴加到细胞爬片上，室温显色，镜下控制反应时间，一般2min左右，蒸馏水洗涤；
⑦苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片。
⑧采用麦克奥迪实业集团有限公司生产的BA200Digital数码三目摄像显微摄像系统显微摄像系统对切片进行图像采集。
分别用阳性细胞和阴性细胞只与二抗结合作为空白对照组。
(3)结果
如图6所示，含501抗体序列的嵌合抗体特异性结合LL/2-Luc2的免疫细胞化学检测结果图，LL/2-Luc2细胞爬片上有强阳性显色，而正常肺上皮细胞爬片中无明显显色，说明含501抗体序列的嵌合抗体能特异性结合LL/2-Luc2细胞。
实施例6嵌合抗体的生长抑制活性
使用CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒(Promega，Cat#：G7570)，检测嵌合抗体针对LL/2-Luc2细胞的生长抑制作用。将指数生长期的LL/2-Luc2细胞消化收集，250g离心5分钟，然后用完全培养基重悬。将细胞密度调整为1×105个/mL，在96孔板的个孔内加入50μL细胞悬液，于37℃孵育过夜。将抗体用培养基稀释程不同浓度，在96孔板的个孔内加入50μL抗体稀释液，于37℃孵育3天。将96孔板于常温静置30分钟，添加100μL/孔的常温CellTiter-Glo显色液。之后样品避光常温孵育10分钟。用PE Enspire读板。生长抑制活性(％)＝[1-(luminescent sample)/(luminescent mock control)]×100。Rabbit IgGIsotype Control(Thermo Fisher Scientific，Cat#:02-6102)抗体作为阴性对照。如图7所示，含501、Y009和RA001抗体序列的嵌合抗体能以剂量依赖方式对LL/2-Luc2细胞产生生物抑制活性。抗体对LL/2-Luc2细胞的最大生长抑制率见表6。
表6嵌合抗体对LL/2-Luc2细胞的最大生长抑制活性
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种靶向LL/2-Luc2单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区CDR和轻链可变区CDR，所述可变区CDR具有下述氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列:
CDR-H1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
CDR-H2具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
CDR-H3具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；
CDR-L1具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；
CDR-L2具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；和
CDR-L3具有如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具有选自如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。
3.一种DNA分子，其特征在于编码权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
4.一种表达载体，含有权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的重组载体，其特征在于，将IL-10信号肽-单克隆抗体或其抗原结合片段的表达序列克隆到pcDNA3.4载体的Not1/Xba1酶多克隆位点处。
5.根据权利要求4所述的表达载体，所述重组载体包含权利要求3的DNA分子。
6.一种真核宿主细胞，含有权利要求4或5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的真核宿主细胞，所述真核宿主细胞为CHO细胞。
8.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制造抗肿瘤药物的用途。
9.如权利要求8所述的用途，所述肿瘤为肺癌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311458329.8A CN117487014A (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310211947.6A CN116082510B (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
| CN202311458329.8A CN117487014A (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310211947.6A Division CN116082510B (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117487014A true CN117487014A (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=86210294
Family Applications (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311458329.8A Pending CN117487014A (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
| CN202310211947.6A Active CN116082510B (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
| CN202311458324.5A Pending CN117487013A (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
| CN202311458333.4A Pending CN117510637A (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
| CN202311458337.2A Pending CN117567628A (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
Family Applications After (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310211947.6A Active CN116082510B (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
| CN202311458324.5A Pending CN117487013A (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
| CN202311458333.4A Pending CN117510637A (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
| CN202311458337.2A Pending CN117567628A (zh) | 2023-03-07 | 2023-03-07 | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (5) | CN117487014A (zh) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2493486A1 (en) * | 2009-10-30 | 2012-09-05 | University Of Arkansas For Medical Science | Use of autologous effector cells and antibodies for treatment of multiple myeloma |
| NZ742290A (en) * | 2015-10-23 | 2019-11-29 | Merus Nv | Binding molecules that inhibit cancer growth |
| JP7149935B2 (ja) * | 2016-10-19 | 2022-10-07 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | ヒト化された標的化部分および／または最適化されたキメラ抗原受容体相互作用ドメインを有する、キメラ抗原受容体エフェクター細胞スイッチ、ならびにその使用 |
-
2023
- 2023-03-07 CN CN202311458329.8A patent/CN117487014A/zh active Pending
- 2023-03-07 CN CN202310211947.6A patent/CN116082510B/zh active Active
- 2023-03-07 CN CN202311458324.5A patent/CN117487013A/zh active Pending
- 2023-03-07 CN CN202311458333.4A patent/CN117510637A/zh active Pending
- 2023-03-07 CN CN202311458337.2A patent/CN117567628A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117510637A (zh) | 2024-02-06 |
| CN117567628A (zh) | 2024-02-20 |
| CN117487013A (zh) | 2024-02-02 |
| CN116082510A (zh) | 2023-05-09 |
| CN116082510B (zh) | 2023-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112094343B (zh) | 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体 | |
| US10882900B2 (en) | Monoclonal antibody of human-derived procalcitonin, and preparation method and application thereof | |
| CN110655574B (zh) | 一种针对绿色荧光蛋白的纳米抗体、应用和gfp免疫亲和吸附材料 | |
| JP2021525282A (ja) | 抗体ライブラリーの構築方法およびその使用 | |
| CN116731182A (zh) | 靶向dll3的抗体、抗原结合片段及其用途 | |
| CN110372793B (zh) | Pd-l1的纳米抗体及其临床应用 | |
| CN114262377B (zh) | 一种阻断cd70与其配体cd27结合的抗人cd70纳米抗体的制备方法及其编码序列 | |
| WO2022199106A1 (zh) | Chi3l1抗体及其应用、核酸、重组表达载体系统和宿主细胞 | |
| CN110423277B (zh) | Pd-1的纳米抗体及其临床应用 | |
| CN106854244B (zh) | 一种针对her3的纳米抗体及其临床应用 | |
| CN116082510B (zh) | 一种单克隆抗体或其抗原结合片段及其抗肿瘤的用途 | |
| CN116874602A (zh) | 一种抗鸟苷酸环化酶2c的纳米抗体及其应用 | |
| CN113831411B (zh) | 针对l1cam的单域抗体及其衍生蛋白和应用 | |
| CN110804096B (zh) | Cd123单域抗体、核苷酸序列、表达载体及试剂盒 | |
| CN113461816A (zh) | 一种针对绿色荧光蛋白gfp的纳米抗体及其应用 | |
| KR20220007120A (ko) | 항-cd25 항체 및 이의 적용 | |
| CN116023495B (zh) | 一种抗cd40纳米抗体及其制备方法与应用 | |
| CN117820471B (zh) | Gfap特异性抗体及其在检测gfap试剂盒中的应用 | |
| CN110003334B (zh) | 多肽、cd19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒 | |
| EP4261228A1 (en) | Antibody specifically binding to strep-tag ii tag and use thereof | |
| CN114085289B (zh) | 一种半合成单域抗体库的构建方法及其应用 | |
| CN114133451B (zh) | 一种针对弓形虫毒力因子rop18的纳米抗体及其编码序列与应用 | |
| CN114249821B (zh) | 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体 | |
| CN114249820B (zh) | 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体 | |
| CN116514990A (zh) | 一种识别cd276-car分子的纳米抗体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |