CN117482303A - 肝素抗凝涂层及其制备方法、应用 - Google Patents

肝素抗凝涂层及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肝素抗凝涂层及其制备方法、应用。上述肝素抗凝涂层的制备方法，包括如下步骤：在基材表面接枝多氨基类物质，多氨基类物质的分子量≥1kDa；对肝素进行改性，使肝素携带双键，以得到改性后的肝素；获取第一溶液和第二溶液，第一溶液中含有改性后的肝素、自由基交联剂和引发剂，第二溶液中含有多氨基类物质；依次用第一溶液和第二溶液对接枝后的基材进行处理，然后重复对接枝后的基材进行处理的步骤，再在引发剂的作用下，使处理后的基材表面的改性后的肝素和自由基交联剂发生自由基聚合，形成肝素抗凝涂层。上述肝素抗凝涂层的制备昂奋能够使肝素抗凝涂层在保持生物活性的同时，稳定结合于基材表面。

Description

肝素抗凝涂层及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及医疗器械领域，特别是涉及一种肝素抗凝涂层及其制备方法、应用。
背景技术
应用血液接触类医疗器械进行临床疾病治疗已经成为当前非常常规的方法，如体外膜肺氧合、支架、瓣膜、动脉微栓过滤器、各类管道等。但是这些医疗器械所用材料的生物相容性均不理想，直接与血液接触时，血浆蛋白会快速吸附到材料表面，并与血小板上的糖蛋白受体结合，导致血小板活化、凝血级联以及补体激活，最终形成血栓，从而导致医疗器械失效。
使用抗凝剂是一种有效防止和减轻血栓形成的方法。其中，肝素是最为常用的一种抗凝剂。肝素可与抗凝血酶Ⅲ结合，形成AT-Ⅲ复合物，对具有丝氨酸蛋白酶活性的凝血因子，如因子Ⅻa、Ⅺa和Ⅹa等灭活，从而实现优良的抗凝血效果。但是全身化肝素会破坏机体对血液凝固的自身调节能力，增加出血风险，还会影响肝肾的功能。因此，近年来的趋势是将肝素涂覆在医疗器械材料表面，实现局部抗凝的效果，同时也降低全身化肝素所带来的影响。
目前比较常用的是通过离子键结合方式、共价结合方式和终点固定法在医疗器械表面制备肝素涂层。由于离子键结合的不稳定性，肝素容易脱落，所以商业上较为常见的是通过共价结合方式和终点固定法在医疗器械表面制备肝素涂层。共价结合方式是指利用肝素本身存在的羧基、羟基以及氨基等活性基团和材料表面的活性基团反应，但这种方式往往会导致肝素和材料表面的结合点位过多，使其失去生物活性。另外，这种方式形成的肝素和材料表面的共价键大多是可逆的酰胺键或者酯键，在器械后续处理或者使用过程中会发生共价键的断裂。终点固定法是指通过亚硝酸或者高碘酸盐等部分降解肝素，产生末端带有醛基的肝素片段，醛基与生物材料表面的活性氨基反应结合生成席夫碱，随后被特定的还原剂如硼氢化钠还原为稳定的共价键。但这种方式使肝素分子发生部分降解，会导致生物活性的降低，同时材料表面的活性氨基可能会优先与肝素发生离子结合，从而影响共价结合的效果。
发明内容
基于此，有必要提供一种肝素抗凝涂层的制备方法，该方法能够使肝素抗凝涂层在保持生物活性的同时，稳定结合于基材表面。
此外，还有必要提供一种肝素抗凝涂层、该肝素抗凝涂层的应用。
一种肝素抗凝涂层的制备方法，包括如下步骤：
在基材表面接枝多氨基类物质，所述多氨基类物质的数均分子量≥1kDa；
用含双键的羧酸、含双键的酸酐、含双键的环氧化合物或含双键的酰胺化合物对肝素进行改性，使所述肝素携带双键，以得到改性后的肝素；
获取第一溶液和第二溶液，所述第一溶液中含有所述改性后的肝素、自由基交联剂和引发剂，所述第二溶液中含有所述多氨基类物质；及
依次用所述第一溶液和所述第二溶液对接枝后的基材进行处理，再使处理后的基材表面的所述改性后的肝素和所述自由基交联剂在所述引发剂的作用下发生自由基聚合，形成肝素抗凝涂层。
在其中一个实施例中，所述在基材表面接枝多氨基类物质的步骤包括：先对所述基材进行表面活化，然后在含有所述多氨基类物质的溶液中反应0.5h～3h。
在其中一个实施例中，对所述基材进行表面活化的方法包括：等离子体处理、紫外辐照、化学改性或光化学接枝；及/或，
含有所述多氨基类物质的溶液为纯水溶液、磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
在其中一个实施例中，所述多氨基类物质选自聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚烯丙基胺、聚烯丙基胺盐酸盐、聚L-精氨酸、聚L-精氨酸盐酸盐、聚L-赖氨酸及聚L-赖氨酸氢溴酸盐中的至少一种；及/或，
所述多氨基类物质的数均分子量为1kDa～10kDa；及/或，
所述基材为金属基生物材料或高分子基生物材料。
在其中一个实施例中，在所述用含双键的羧酸或含双键的酸酐对肝素进行改性的步骤中，将所述肝素与所述含双键的羧酸或所述含双键的酸酐在碱性溶液中反应3h～8h，所述肝素与所述含双键的羧酸或所述含双键的酸酐的质量比为1:(0.05～0.5)；或者，
在所述用含双键的环氧化合物对肝素进行改性的步骤中，将所述肝素与所述含双键的环氧化合物在pH为7～8的溶液中反应3天～8天，所述肝素与所述含双键的环氧化合物的质量比为1:(0.3～1)；或者，
在所述用含双键的酰胺化合物对肝素进行改性的步骤中，将所述肝素与所述含双键的酰胺化合物在活化剂和缩合剂的作用下，在0-4℃下搅拌反应3h～8h，所述肝素、所述含双键的酰胺化合物、所述活化剂及所缩合剂的质量比为(1～1.2):(0.8～1):(0.8～1):(0.8～1.2)。
在其中一个实施例中，所述含双键的羧酸的通式为CHX＝CY-(L)n-COOZ，式中，X为氢或苯基，Y为氢、C1～C6的烷基或卤素取代的C1～C6的烷基，L为二价连接基，n为0或1，Z为氢或钠；
所述含双键的酸酐的通式为R1-C(＝O)O-C(＝O)-R2，R1和R2中至少一个为C2～C6的烯基，或者，R1和R2形成5～7元单环，所述5～7元单环含有碳碳双键或者具有含碳碳双键的取代基；
所述含双键的环氧化合物选自甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚、环氧丁烯及其同系物、1,2-环氧-4-乙烯基环己烷及3,4-环氧-1-环己烯中的至少一种；
所述含双键的酰胺化合物为N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐。
在其中一个实施例中，在所述第一溶液中，所述改性后的肝素的浓度为2mg/mL～5mg/mL，所述改性后的肝素、所述自由基交联剂和所述引发剂的质量比为1:(0.02～0.1):(0.005～0.05)；及/或，
所述第一溶液的pH为6～6.8；及/或，
所述引发剂选自2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮、二苯甲酮、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、2,2'-偶氮(2-甲基-N-(2-羟基乙基)丙酰胺、核黄素及曙红Y中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述自由基交联剂选自双官能或多官能的双键化合物、双官能或多官能的巯基化合物中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述双官能或多官能的双键化合物选自二醇类二丙烯酸酯、二醇类二乙烯基醚、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、1,3,5-三聚氰酸三烯丙基酯、三烯丙基异氰脲酸酯及三甘醇二乙烯基醚中的至少一种；及/或，
所述双官能或多官能的巯基化合物选自季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)、乙氧基化季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)、二季戊四醇六(巯基乙酸酯)、三羟甲基丙烷三(2-巯基乙酸酯)、季戊四醇四(2-巯基乙酸酯)、三季戊四醇八巯基乙酸酯、乙二醇双(3-巯基丙酸酯)、硫醇封端的丙氧基化甘油及硫醇封端的聚乙二醇中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述第二溶液中还含有自由基交联剂和引发剂，所述第二溶液中的自由基交联剂和引发剂与所述第一溶液中的自由基交联剂和引发剂各自独立地相同或不同。
在其中一个实施例中，在所述第二溶液中，所述多氨基类物质的浓度为1mg/mL～3mg/mL，所述自由基交联剂和所述多氨基类物质的质量比≤0.1:1，所述引发剂与所述多氨基类物质的质量比≤0.05:1。
在其中一个实施例中，用所述第一溶液和所述第二溶液对改性后的基材进行处理的步骤中，采用涂覆的方式进行处理。
在其中一个实施例中，涂覆的方式为浸涂、喷涂或旋涂；及/或，
每次涂覆的时间独立地为15min～3h。
在其中一个实施例中，所述引发剂为光引发剂，使处理后的基材表面的所述改性后的肝素和所述自由基交联剂在所述引发剂的作用下发生自由基聚合的步骤中，对所述处理后的基材进行光照处理。
在其中一个实施例中，光照的时间为15min～2h。
一种肝素抗凝涂层，由权利要求上述的肝素抗凝涂层的制备方法制备得到。
上述的肝素抗凝涂层在制备血液接触类医用器材中的应用。
上述肝素抗凝涂层的制备方法先分别对基材和肝素进行改性，使基材接枝分子量大的多氨基类物质，肝素携带双键，然后用含有改性后的肝素、自由基交联剂和引发剂的溶液与含有多氨基类物质的溶液对改性后的基材进行处理，再在引发剂的作用下，使改性后的肝素和自由基交联剂之间发生自由基聚合，与基材表面接枝的多氨基类物质形成互穿网络结构，最终形成稳定结合于基材表面的肝素抗凝涂层。这种方法制备的肝素抗凝涂层不仅存在肝素和多氨基类物质之间的静电吸附，还存在强烈的物理互穿，具有很强的结合力。而相比于传统的共价结合，该肝素抗凝涂层中存在的共价键是通过自由基聚合形成的稳定的不可逆的共价键，不会在后续处理或使用过程中发生断裂。另外，在对肝素进行改性的过程中，肝素的反应位点通过改性试剂(含双键的羧酸、含双键的酸酐、含双键的环氧化合物或含双键的酰胺化合物)进行了限制，从而确保了肝素的生物活性。因此，上述肝素抗凝涂层的制备方法能够使肝素抗凝涂层在保持生物活性的同时，稳定结合于基材表面。
附图说明
图1为一实施方式的肝素抗凝涂层的制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合具体实施方式对本发明进行更全面的描述。具体实施方式中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体地实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在本文中，“氨基”是指-NH2或-NH-。
“双键”指碳碳双键。
“携带”指通过共价结合的方式具有，例如，使基材携带双键是指通过共价结合的方式使基材具有双键。
“多XX”中的“多”是指≥3。例如，多氨基类物质是指具有≥3个氨基，多官能是指具有≥3个官能团。
“烷基”是指包含伯(正)碳原子、或仲碳原子、或叔碳原子、或季碳原子、或其组合的饱和烃。包含该术语的短语，例如，“C1～C6烷基”是指包含1～6个碳原子的烷基，每次出现时，可以互相独立地为C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基。合适的实例包括但不限于：甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、n-丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、i-丙基、-CH(CH3)2)等。
“亚烷基”是指在烷基的基础上除去一个氢原子衍生形成具有两个单价基团中心的烃基，其可以是饱和的支链烷基或饱和的直链烷基。合适的实例包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、1,1-乙基(-CH(CH3)-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,1-丙基(-CH(CH2CH3)-)、1,2-丙基(-CH2CH(CH3)-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)和1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。
“同系物”是指结构相似、分子组成相差若干个-CH2-的有机化合物。
针对当前共价结合肝素的抗凝涂层所存在影响肝素活性低、结合不牢固等问题，本申请提供了一种肝素抗凝涂层的制备方法，通过本申请所制备的肝素抗凝涂层可以实现肝素的牢固结合，并且能够保持肝素的生物活性，从而使医疗器械具备持续抗凝的能力。
具体地，为实现上述目的，请参阅图1，一实施方式的肝素抗凝涂层的制备方法，包括如下步骤：
步骤S110：在基材表面接枝多氨基类物质，多氨基类物质的数均分子量≥1kDa。
其中，基材为金属基生物材料或高分子基生物材料。具体地，金属基生物材料为不锈钢、钴基合金、钛及钛合金或镁及镁合金。高分子基生物材料为涤纶(PET)、聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚醚醚酮(PEEK)、聚氨酯(PU)、硅橡胶、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)或聚甲基戊烯(PMP)。
在其中一个实施例中，步骤S110包括：先对基材进行表面活化，然后在含有多氨基类物质的水溶液中反应0.5h～3h。
具体地，对基材进行表面活化的方法包括：等离子体处理、紫外辐照、化学改性或光化学接枝。例如，在一个具体的示例中，将基材用氧等离子体处理10～30分钟。或者，将基材置于浓度为1.5mg/mL的丙烯酸水溶液中，用紫外光照射30分钟。或者，将基材用浓硫酸处理10～15分钟。或者，将基材置于丙烯酸浓度为2mg/mL、二苯甲酮浓度为0.03mg/mL的乙醇溶液中，用紫外光照射15分钟。可以理解，上述仅列出了几种常见的对基材进行表面活化的方法，但并不限于此。
具体地，多氨基类物质选自聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚烯丙基胺、聚烯丙基胺盐酸盐、聚L-精氨酸、聚L-精氨酸盐酸盐、聚L-赖氨酸及聚L-赖氨酸氢溴酸盐中的至少一种。进一步地，多氨基类物质的数均分子量为1kDa～10kDa。在基材表面接枝了一层多氨基类物质，利用氨基对负电性肝素的静电吸附，可以吸附更多的肝素，保证了所制备的肝素抗凝涂层的肝素密度。
进一步地，含有多氨基类物质的水溶液为纯水溶液、PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)或Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)。
进一步地，还包括对反应后的基材进行洗涤和干燥的步骤。例如，在一个具体的示例中，用纯水洗涤，然后冷冻干燥。
步骤S120：用含双键的羧酸、含双键的酸酐、含双键的环氧化合物或含双键的酰胺化合物对肝素进行改性，使肝素携带双键，以得到改性后的肝素。
其中，用含双键的羧酸或含双键的酸酐对肝素进行改性的步骤包括：将含双键的羧酸或含双键的酸酐与肝素在碱性溶液中反应3h～8h，然后透析、冷冻干燥。
具体地，肝素与含双键的羧酸或含双键的酸酐的质量比为1:(0.05～0.5)。在一个具体的示例中，肝素与含双键的羧酸或含双键的酸酐的质量比为1:0.05、1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5或这些值中任意两者组成的范围。
具体地，含双键的羧酸的通式为CHX＝CY-(L)n-COOZ，式中，X为氢或苯基，Y为氢、C1～C6的烷基或卤素取代的C1～C6的烷基，L为二价连接基，n为0或1，Z为氢或钠。进一步地，Y为氢、甲基或卤素取代的甲基。例如，卤素取代的甲基可以为三氟甲基。优选地，L为亚烷基。亚烷基可以为直链或支链。例如，亚烷基为亚甲基(-CH2-)、1,1-乙基(-CH(CH3)-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,1-丙基(-CH(CH2CH3)-)、1,2-丙基(-CH2CH(CH3)-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)和1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)。
在其中一个实施例中，含双键的羧酸为CH2＝CH-(L)n-COOH、CH2＝CH-(L)n-COONa、CH2＝C(CH3)-(L)n-COOH、CH2＝C(CH3)-(L)n-COONa、CH2＝C(CF3)-COOH或C6H5-CH＝CH-COOH，n为0或1，L为亚烷基。在一个具体的示例中，含双键的羧酸可以为丙烯酸、丁烯酸、戊烯酸、十一烯酸、油酸、甲基丙烯酸、甲基丁烯酸、丙烯酸钠、丁烯酸钠、戊烯酸钠、十一烯酸钠、油酸钠、甲基丙烯酸钠、甲基丁烯酸钠、肉桂酸、三氟甲基丙烯酸等。
具体地，含双键的酸酐的通式为R1-C(＝O)O-C(＝O)-R2，R1和R2中至少一个为C2～C6的烯基，或者，R1和R2形成5～7元单环，所述5～7元单环含有碳碳双键或者具有含碳碳双键的取代基。在一个具体的示例中，含双键的酸酐选自丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐及马来酸酐中的至少一种。
在其中一个实施例中，碱性溶液的pH可以为8。碱性溶液可以为氢氧化钠水溶液。
具体地，用含双键的环氧化合物对肝素进行改性的步骤包括：将肝素与含双键的环氧化合物在pH为7～8的溶液中反应3天～8天，然后透析、冷冻干燥。
进一步地，肝素与含双键的环氧化合物的质量比为1:(0.3～1)。在一个具体的示例中，肝素与含双键的环氧化合物的质量比为1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1或这些值中任意两者组成的范围。
进一步地，含双键的环氧化合物选自甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚、1,2-环氧-4-乙烯基环己烷、3,4-环氧-1-环己烯、环氧丁烯及其同系物中的至少一种。在一个具体的示例中，环氧丁烯的同系物可以为环氧戊烯等。
在其中一个实施例中，pH为7～8的溶液可以为磷酸盐缓冲液。
具体地，用含双键的酰胺化合物对肝素进行改性的步骤包括：将肝素与含双键的酰胺化合物在活化剂和缩合剂的作用下，在0℃～4℃下搅拌反应3h～8h，然后透析、冷冻干燥。
进一步地，肝素、含双键的酰胺化合物、活化剂及缩合剂的质量比为(1～1.2):(0.8～1):(0.8～1):(0.8～1.2)。优选地，肝素、含双键的酰胺化合物、活化剂及缩合剂的质量比为1.2:1:1:1。在其中一个实施例中，活化剂为NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)，缩合剂为EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)。含双键的酰胺化合物为N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐。
步骤S130：获取第一溶液和第二溶液，第一溶液中含有改性后的肝素、自由基交联剂和引发剂，第二溶液中含有多氨基类物质。
具体地，在第一溶液中，pH为6～6.8。进一步地，第一溶液为PBS缓冲液。
进一步地，改性后的肝素的浓度为2mg/mL～5mg/mL。在一个具体的示例中，改性后的肝素的浓度为2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL或这些值中任意两者组成的范围。改性后的肝素、自由基交联剂和引发剂的质量比为1:(0.02～0.1):(0.005～0.05)。进一步地，第一溶液中的引发剂为光引发剂。
具体地，在第二溶液中，pH为7.4～8。进一步地，第二溶液为PBS缓冲液。在第二溶液中，多氨基类物质的浓度为1mg/mL～3mg/mL。在一个具体的示例中，多氨基类物质的溶度为1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL或这些值中任意两者组成的范围。
进一步地，第二溶液中还含有自由基交联剂和引发剂。自由基交联剂和所述多氨基类物质的质量比≤0.1:1，引发剂与多氨基类物质的质量比≤0.05:1。进一步地，第二溶液中的引发剂为光引发剂。在第二溶液中含有自由基交联剂和引发剂能够使所制备的肝素抗凝涂层的稳定性更好。
第一溶液中的自由基交联剂和第二溶液中的自由基交联剂各自独立地选自双官能或多官能的双键化合物、双官能或多官能的巯基化合物中的至少一种。其中，双官能或多官能的双键化合物选自二醇类二丙烯酸酯、二醇类二乙烯基醚、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、1,3,5-三聚氰酸三烯丙基酯、三烯丙基异氰脲酸酯及三甘醇二乙烯基醚中的至少一种。在一个具体的示例中，二醇类二丙烯酸酯可以为乙二醇类二丙烯酸酯、丙二醇类二丙烯酸酯。
双官能或多官能的巯基化合物选自戊四醇四(3-巯基丙酸酯)、乙氧基化季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)、二季戊四醇六巯基乙酸酯、三羟甲基丙烷三(2-巯基乙酸酯)、季戊四醇四(2-巯基乙酸酯)、三季戊四醇八巯基乙酸酯、乙二醇双(3-巯基丙酸酯)、以Capcure3-800出售的硫醇封端的丙氧基化甘油及硫醇封端的聚乙二醇中的至少一种。
进一步地，第一溶液中的引发剂和第二溶液中的引发剂各自独立地选自Irgacure2959(2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮)、二苯甲酮、LAP(苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐)、BAPO-Oli(双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐)、VA-086(2,2'-偶氮(2-甲基-N-(2-羟基乙基)丙酰胺)、核黄素及曙红Y中的至少一种。
更进一步地，第一溶液中的自由基交联剂和引发剂均与第二溶液中的自由基交联剂和引发剂相同。
步骤S140：依次用第一溶液和第二溶液对接枝后的基材进行处理，再在引发剂的作用下，使处理后的基材表面的改性后的肝素和自由基交联剂发生自由基聚合，形成肝素抗凝涂层。
具体地，将依次用第一溶液和第二溶液对接枝后的基材进行处理作为一个循环，步骤S140还包括重复上述循环的步骤。进一步地，在步骤S140中，累计循环的次数为1次～15次。在一个具体的示例中，累计循环的次数为1次、2次、5次、8次、10次、12次、15次或这些值中任意两者组成的范围。
具体地，采用涂覆的方式对接枝后的基材进行处理。具体地，涂覆的方式为浸涂、旋涂或喷涂。在其中一个实施例中，每次涂覆的时间独立地为15min～3h。例如，每次涂覆的时间独立地为15min、20min、30min、60min、90min、120min、150min、180min或这些值中任意两者组成的范围。进一步地，在每次涂覆后，用纯水洗涤基材，再进行下一次涂覆。
引发剂为光引发剂，在引发剂的作用下，使处理后的基材表面的改性后的肝素和自由基交联剂发生自由基聚合的步骤中，对处理后的基材进行光照处理。进一步地，光照的时间为15min～2h。在一个具体的示例中，光照的时间为15min、20min、30min、60min、90min、120min或这些值中任意两者组成的范围。
上述肝素抗凝涂层的制备方法至少具有以下优点：
(1)上述肝素抗凝涂层的制备方法将肝素进行双键化改性与自由基聚合结合，在引发剂的用下，改性后的肝素和交联剂之间发生自由基聚合，与基材表面接枝的多氨基类物质形成互穿网络结构，最终形成稳定结合于基材表面的抗凝涂层。在基材表面接上大量氨基后，可以对肝素产生静电吸附，保证了在自由基聚合前涂层的稳定性。另外，多氨基类物质起到了载体放大作用，可以有效提高表面肝素密度。相比于传统的离子键结合，这种方法制备的肝素抗凝涂层不仅存在肝素和多氨基类物质之间的静电吸附，还存在强烈的物理互穿，具有很强的结合力。而相比于传统的单纯共价结合，上述的该肝素抗凝涂层中存在的共价键是通过自由基聚合形成的稳定的共价键，不会在后续处理或使用过程中发生断裂。同时，在对肝素进行改性的过程中，肝素的反应位点通过改性试剂(羧酸、酸酐、环氧或酰胺)进行了限制，从而确保了肝素的生物活性。
(2)上述肝素抗凝涂层的制备方法还可以通过调控肝素和改性试剂的比例和改性的方法，有效控制肝素双键化的量，从而既可保证肝素的生物活性，又实现了肝素的双键化程度可调节。
(3)上述肝素抗凝涂层的制备方法所得到的肝素抗凝涂层中，肝素与多氨基类物质的物理互穿是依靠肝素在多氨基类物质之间的化学交联实现的，上述方法提供了多种自由基交联剂的选择，可根据实际需求，如肝素密度、涂层亲疏水性、涂层厚度等，选择不同的交联剂。
(4)上述肝素抗凝涂层的制备方法中，通过光引发聚合，使改性后的肝素通过交联剂发生化学交联，从而与多氨基类物质形成物理互穿。上述方法中提供了多种光引发剂，可以根据实际情况，如光照波长、光照时间、引发剂浓度等，选择不同的光引发剂。
(5)上述肝素抗凝涂层的制备方法在涂覆过程中，采用逐层堆积，再光引发自由基聚合的方式，可以通过控制涂覆次数，有效控制基材表面肝素密度和涂层厚度，最终以实现医疗器械持续抗凝的效果。
本申请还提供一实施方式的肝素抗凝涂层，由上述肝素抗凝涂层的制备方法制备得到。
本申请还提供一实施方式的肝素抗凝涂层在制备血液接触类医用器材中的应用。
为了使本发明的目的以及优点更加清楚，以下结合具体实施例对本发明的肝素抗凝涂层的制备方法及其效果做进一步详细的说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不得用以限定本发明。
实施例1～实施例3
实施例1～实施例3提供一种肝素抗凝涂层的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)对基材进行改性
对需要表面改性的聚乙烯薄膜进行清洗、干燥后，用氧等离子体处理1h。然后将聚乙烯薄膜浸入PEI浓度为1.5mg/mL的磷酸盐缓冲液中(pH为8)，反应1h后，取出用纯水清洗。
(2)对肝素进行改性
采用三种方法对肝素进行改性，其中采用方法a对肝素进行改性并通过后续步骤(3)和步骤(4)所得的肝素抗凝涂层为实施例1所制备的肝素抗凝涂层，采用方法b对肝素进行改性并通过后续步骤(3)和步骤(4)所得的肝素抗凝涂层为实施例2所制备的肝素抗凝涂层，采用方法c对肝素进行改性并通过后续步骤(3)和步骤(4)所得的肝素抗凝涂层为实施例3所制备的肝素抗凝涂层。
具体地，方法a为：将1g肝素与0.9g N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐在0.9gNHS和1.2g EDC的作用下，在0℃下搅拌反应6小时，接着透析、冷冻干燥，得到改性后的肝素。
方法b为：将1g肝素与0.3g丙烯酸酐在pH值为8的氢氧化钠水溶液中反应5小时，然后透析、冷冻干燥，得到改性后的肝素。
方法c为：将1g肝素与0.5g甲基丙烯酸缩水甘油酯在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中反应5天，接着透析、冷冻干燥，得到改性后的肝素。
(3)配制第一溶液和第二溶液
取0.8g上述改性后的肝素与30mg 1,3,5-三聚氰酸三烯丙基酯和15mgIrgacure2959配制成PBS缓冲液，pH值调节为6.5，即为第一溶液。
将1g PEI、30mg1,3,5-三聚氰酸三烯丙基酯和15mg Irgacure2959配制成PBS缓冲液，pH值调节为7.4，即为第二溶液。
(4)涂层制备
将步骤(1)所得的改性后的聚乙烯薄膜置于步骤(3)所得的第一溶液中浸泡25min，用纯化水清洗，再置于步骤(3)所得的第二溶液中浸泡25min，用纯化水清洗，将在步骤(3)所得的第一溶液中浸泡一次加在步骤(3)所得的第二溶液中浸泡一次作为一个循环，累计进行6个循环。然后将所得聚乙烯薄膜置于紫外辐照下，照射30min后，用纯化水洗涤、干燥，得到一层厚度均匀的肝素抗凝涂层。
实施例4
本实施例提供一种肝素抗凝涂层的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)对基材进行改性
对需要表面改性的聚醚醚酮薄膜进行清洗、干燥后，用紫外光照射，并多次喷涂丙烯酸水溶液(浓度为10mg/mL)，持续1h。然后将聚醚醚酮薄膜浸入PEI浓度为1.5mg/mL的磷酸盐缓冲液中(pH为8)，反应1.5h后，取出用纯水清洗。
(2)对肝素进行改性
将1g肝素与0.9g N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐在0.9g NHS和1.2gEDC的作用下，在0℃下搅拌反应6小时，接着透析、冷冻干燥，得到改性后的肝素。
(3)配制第一溶液和第二溶液
取0.8g上述改性后的肝素与20mg三乙二醇二乙烯基醚和12mg Irgacure2959配制成PBS缓冲液，pH值调节为6.8，即为第一溶液。
将1g PEI、20mg三乙二醇二乙烯基醚和12mg Irgacure2959配制成PBS缓冲液，pH值调节为7.4，即为第二溶液。
(4)涂层制备
将步骤(1)所得的改性后的聚醚醚酮薄膜置于步骤(3)所得的第一溶液中浸泡30min，用纯化水清洗，再置于步骤(3)所得的第二溶液中浸泡30min，用纯化水清洗，将在步骤(3)所得的第一溶液中浸泡一次加在步骤(3)所得的第二溶液中浸泡一次作为一个循环，累计进行8个循环。然后将所得的聚醚醚酮薄膜置于紫外辐照下，照射1h后，用纯水洗涤、干燥，得到一层厚度均匀的肝素抗凝涂层。
实施例5
本实施例提供一种肝素抗凝涂层的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)对基材进行改性
对需要表面改性的医用不锈钢进行抛光、清洗、干燥后，用氧等离子体处理15min后，将医用不锈钢基材浸入PEI的纯水溶液中，反应1h后，取出用纯水清洗。
(2)对肝素进行改性
将1g肝素与0.1g丙烯酸酐在pH值为8.0的氢氧化钠水溶液中反应5小时，然后透析、冷冻干燥，得到改性后的肝素。
(3)配制第一溶液和第二溶液
取0.8g上述改性后的肝素与20mg三乙二醇二乙烯基醚和12mg Irgacure2959配制成PBS缓冲液，pH值调节为6.5，即为第一溶液。
将1g PEI、20mg三乙二醇二乙烯基醚和12mg Irgacure2959配制成PBS缓冲液，pH值调节为7.4，即为第二溶液。
(4)涂层制备
将步骤(1)所得改性后的医用不锈钢基材置于步骤(3)所得的第一溶液中浸泡30min，用纯化水清洗，再置于步骤(3)所得的第二溶液中浸泡30min，用纯化水清洗，将在步骤(3)所得的第一溶液中浸泡一次加在步骤(3)所得的第二溶液中浸泡一次作为一个循环，累计进行5个循环。然后将所得的医用不锈钢基材置于紫外辐照下，照射45min后，用纯水洗涤、干燥，得到一层厚度均匀的肝素抗凝涂层。
实施例6
本实施例提供一种肝素抗凝涂层的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)对基材进行改性
对需要表面改性的镁合金支架进行清洗、干燥后，将镁合金支架浸入PEI浓度为1.5mg/mL的磷酸盐缓冲液中(pH为8)，反应1h后，取出用纯水清洗。
(2)对肝素进行改性
将1g肝素与0.5g甲基丙烯酸缩水甘油酯在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中反应5天，接着透析、冷冻干燥，得到改性后的肝素。
(3)配制第一溶液和第二溶液
取0.8g上述改性后的肝素与20mg 1,6-己二醇二丙烯酸酯和20mg LAP配制成PBS缓冲液，pH值调节为6.5，即为第一溶液。
将1g PEI、20mg 1,6-己二醇二丙烯酸酯和20mg LAP配制成PBS缓冲液，pH值调节为7.4，即为第二溶液。
(4)涂层制备
将步骤(1)所得改性后的镁合金支架置于步骤(3)所得的第一溶液中浸泡30min，用纯化水清洗，再置于步骤(3)所得的第二溶液中浸泡30min，用纯化水清洗，将在步骤(3)所得的第一溶液中浸泡一次加在步骤(3)所得的第二溶液中浸泡一次作为一个循环，累计进行4个循环。然后将所得镁合金支架置于紫外辐照下，照射30min后，用纯水洗涤、干燥，得到一层厚度均匀的肝素抗凝涂层。
实施例7
本实施例提供一种肝素抗凝涂层的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)对基材进行改性
对需要表面改性的聚乳酸支架进行清洗、干燥后，将聚乳酸支架浸入含10mg二苯甲酮、200mg丙烯酸的100mL水溶液中，紫外光照射30min后取出，用纯水清洗。然后将其浸入PEI浓度为1.5mg/mL的磷酸盐缓冲液中(pH为8)，反应1h后，取出用纯水清洗。
(2)对肝素进行改性
将1g肝素与0.1g甲基丙烯酸酐在pH值为8的氢氧化钠水溶液中反应8小时，然后透析、冷冻干燥，得到改性后的肝素。
(3)配制第一溶液和第二溶液
取0.8g上述改性后的肝素与20mg乙二醇双(3-巯基丙酸酯)和20mg LAP配制成PBS缓冲液，pH值调节为6.5，即为第一溶液。
将1g PEI、20mg乙二醇双(3-巯基丙酸酯)和20mg LAP配制成PBS缓冲液，pH值调节为7.4，即为第二溶液。
(4)涂层制备
将步骤(1)所得的改性后的聚乳酸支架置于步骤(3)所得的第一溶液中浸泡20min，用纯化水清洗，再置于步骤(3)所得的第二溶液中浸泡20min，用纯化水清洗，将在步骤(3)所得的第一溶液中浸泡一次加在步骤(3)所得的第二溶液中浸泡一次作为一个循环，累计进行6个循环。然后将聚乳酸支架置于紫外辐照下，照射40min后，用纯水洗涤、干燥，得到一层厚度均匀的肝素抗凝涂层。
实施例8
本实施例提供一种肝素抗凝涂层的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)对基材进行改性
对需要表面改性的PET薄膜进行清洗、干燥后，将PEI薄膜用浓硫酸处理10min后，用纯水清洗，随后将其浸入PEI浓度为1.8mg/mL的Tris-HCl缓冲液中(pH为7.5)，反应1h后，取出用纯水清洗。
(2)对肝素进行改性
将1g肝素与0.5g 1,2-环氧-4-乙烯基环己烷在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中反应5天，接着透析、冷冻干燥，得到改性后的肝素。
(3)配制第一溶液和第二溶液
取0.8g上述改性后的肝素与0.2g硫醇封端的PEG(分子量2000)和50mg核黄素配制成PBS缓冲液，pH值调节为6.5，即为第一溶液。
将1g PEI、0.2g硫醇封端的PEG(分子量2000)和50mg核黄素配制成PBS缓冲液，pH值调节为8，即为第二溶液。
(4)涂层制备
将步骤(1)所得的改性后的PEI薄膜置于步骤(3)所得的第一溶液中浸泡40min，用纯化水清洗，再置于步骤(3)所得的第二溶液中浸泡40min，用纯化水清洗，将在步骤(3)所得的第一溶液中浸泡一次加在步骤(3)所得的第二溶液中浸泡一次作为一个循环，累计进行3个循环。然后将所得的PEI薄膜置于紫外辐照下，照射40min后，用纯水洗涤，干燥，得到一层厚度均匀的肝素抗凝涂层。
实施例9
本实施例提供一种肝素抗凝涂层的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)对基材进行改性
对需要表面改性的PVC管材进行清洗、干燥后，将PVC管材用氧等离子体处理30min，然后将其浸入PEI浓度为1.5mg/mL的Tris-HCl缓冲液中(pH为7.5)，反应45min后，取出用纯水清洗。
(2)对肝素进行改性
将1g肝素与0.1g甲基丙烯酸在pH值为8的氢氧化钠水溶液中反应8小时，然后透析、冷冻干燥，得到改性后的肝素。
(3)配制第一溶液和第二溶液
取0.8g上述改性后的肝素与30mg三甘醇二乙烯基醚和15mg Irgacure2959配制成PBS缓冲液，pH值调节为6.8，即为第一溶液。
将1g PEI、30mg三甘醇二乙烯基醚和15mg Irgacure295配制成PBS缓冲液，pH值调节为7.4，即为第二溶液。
(4)涂层制备
将步骤(1)所得的改性后的PVC管材置于步骤(3)所得的第一溶液中浸泡30min，用纯化水清洗，再置于步骤(3)所得的第二溶液中浸泡30min，用纯化水清洗，将在步骤(3)所得的第一溶液中浸泡一次加在步骤(3)所得的第二溶液中浸泡一次作为一个循环，累计进行6个循环。然后将所得的PVC管材置于紫外辐照下，照射45min后，用纯水洗涤，干燥，得到一层厚度均匀的肝素抗凝涂层。
实施例10
本实施例提供一种肝素抗凝涂层的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)对基材进行改性
对需要表面改性的PMP膜进行清洗、干燥后，将PMP膜用氧等离子体处理20min，然后将其浸入浓度为1.5mg/mL的PEI水溶液中，反应30min后，取出用纯水清洗。
(2)对肝素进行改性
将1g肝素与0.1g甲基丙烯酸酐在pH值为8的氢氧化钠水溶液中反应5小时，然后透析、冷冻干燥，得到改性后的肝素。
(3)配制第一溶液和第二溶液
取0.8g上述改性后的肝素与0.2g硫醇封端的PEG(分子量2000)和20mgIrgacure295配制成PBS缓冲液，pH值调节为6.8，即为第一溶液。
将1g PEI、0.2g硫醇封端的PEG(分子量2000)和20mg Irgacure295配制成PBS缓冲液，pH值调节为7.4，即为第二溶液。
(4)涂层制备
将步骤(1)所得的改性后的PMP膜置于步骤(3)所得的第一溶液中浸泡30min，用纯化水清洗，再置于步骤(3)所得的第二溶液中浸泡30min，用纯化水清洗，将在步骤(3)所得的第一溶液中浸泡一次加在步骤(3)所得的第二溶液中浸泡一次作为一个循环，累计进行5个循环。然后将所得的PMP膜置于紫外辐照下，照射40min后，用纯水洗涤、干燥，得到一层厚度均匀的肝素抗凝涂层。
实施例11
实施例11的肝素抗凝涂层的制备过程与实施例1的肝素抗凝涂层的制备过程相似，区别在于，步骤(3)不同，本实施例的步骤(3)为：取0.8g改性后的肝素与0.2g硫醇封端的PEG(分子量2000)和50mg核黄素配制成PBS缓冲液，pH值调节为6.5，即为第一溶液。
将1g PEI配制成PBS缓冲液，pH值调节为8，即为第二溶液。
对比实施例1
对比实施例1通过传统静电吸附法制备肝素抗凝涂层，具体包括如下步骤：
(1)对需要表面改性的聚乙烯薄膜进行清洗、干燥后，用氧等离子体处理1h。然后将处理后的聚乙烯薄膜浸入PEI浓度为1.5mg/mL磷酸盐缓冲液中(pH为8)，反应1h后，取出用纯水清洗。
(2)配制肝素浓度为1.5mg/mL的PBS缓冲液，pH值为6.5。
(3)配制PEI浓度为1.5mg/mL的PBS缓冲液，pH值为7.4。
(4)将步骤(1)所得的聚乙烯薄膜置于步骤(2)所得的溶液中浸泡25min，用纯化水清洗，然后再置于步骤(3)所得的溶液中浸泡25min，用纯化水清洗，将在步骤(2)所得的溶液中浸泡一次加在步骤(3)所得的溶液中浸泡一次作为一个循环，累计进行6个循环后，干燥，得到一层静电吸附的肝素抗凝涂层。
对比实施例2
对比实施例2通过酰胺键固定肝素制备肝素抗凝涂层，具体包括如下步骤：
(1)对需要表面改性的聚乙烯薄膜进行清洗、干燥，用氧等离子体处理1h。然后将处理后的聚乙烯薄膜浸入PEI浓度为1.5mg/mL磷酸盐缓冲液中(pH为8)，反应1h后，取出用纯水清洗。
(2)将肝素溶于PBS缓冲液中，浓度为2.0mg/mL，用0.02mg/mL的EDC/NHS活化处理，pH值为6.4。
(3)将步骤(1)所得的聚乙烯薄膜置于步骤(2)所得的溶液中，搅拌反应5小时后，提起，用纯化水洗涤，干燥，得到一层通过酰胺共价固定法制备的肝素抗凝涂层。
对比实施例3
对比实施例3的肝素抗凝涂层的制备过程与实施例1的肝素抗凝涂层的制备过程相似，区别在于，步骤(4)不同，对比实施例3的步骤(4)为：
将步骤(1)所得的改性后的聚乙烯薄膜置于步骤(3)所得的第一溶液中浸泡25min，用纯化水清洗，然后再置于步骤(3)所得的第一溶液中浸泡25min，用纯化水清洗。重复用第一溶液对聚乙烯薄膜涂覆，累计涂覆6次，然后将所得的聚乙烯薄膜置于紫外辐照下，照射30min后，用纯水洗涤，干燥，得到一层厚度均匀的肝素抗凝涂层。
对比实施例4
对比实施例4的肝素抗凝涂层的制备过程与实施例1的肝素抗凝涂层的制备过程相似，区别在于，步骤(1)不同，对比实施例4的步骤(1)为：对需要表面改性的聚乙烯薄膜进行清洗、干燥后，用氧等离子体处理1h。然后将聚乙烯薄膜浸入磷酸盐缓冲液中(pH为8)，反应1h后，取出用纯水清洗。
以下为测试部分：
(1)肝素含量测定
用甲苯胺蓝比色法分别测定对比实施例1～3、实施例1～实施例11制备得到的肝素抗凝涂层中的肝素含量，测试结果如表1所示。
表1各实施例的肝素抗凝涂层中的肝素含量
样品 肝素含量
对比实施例1 1.71±0.01μg/cm2
对比实施例2 1.34±0.01μg/cm2
对比实施例3 1.40±0.01μg/cm2
实施例1 1.90±0.01μg/cm2
实施例2 1.86±0.01μg/cm2
实施例3 1.92±0.01μg/cm2
实施例4 1.91±0.01μg/cm2
实施例5 1.68±0.01μg/cm2
实施例6 1.66±0.01μg/cm2
实施例7 1.81±0.01μg/cm2
实施例8 1.79±0.01μg/cm2
实施例9 1.86±0.01μg/cm2
实施例10 1.89±0.01μg/cm2
实施例11 1.76±0.01μg/cm2
如表1所示，对比实施例1-3和实施例1-11制备的肝素抗凝涂层均具有较高的肝素含量。但是，对比实施例2相对较低的肝素含量表明，直接酰胺共价固定肝素的量少于本发明方法所固定的肝素。对比实施例3所制备的抗凝涂层在制备过程中未进行第一溶液和第二溶液的循环涂布，因此难以形成互穿交联网络，固定的肝素含量大幅下降。而实施例11则由于第二溶液不含交联剂和引发剂，也产生了一定程度的肝素含量降低，但肝素含量仍较对比实施例2～3高。
(2)涂层稳定性测试
分别将对比实施例1～3、实施例1～实施例3和实施例11所制备的含有肝素抗凝涂层的聚乙烯薄膜在pH值为1的盐酸溶液、pH值为12的氢氧化钠溶液和生理盐水中浸泡1小时、2小时、6小时和24小时，取出后用纯化水清洗，再用甲苯胺蓝比色法测量其肝素含量，结果如表2。
表2涂层稳定性测试结果
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如表2所示，对比实施例1的肝素抗凝涂层在酸性、碱性以及生理盐水中都发生了明显的肝素分子脱落，这是由于该肝素抗凝涂层是通过静电吸附连接在基材表面，结合不稳定。对比实施例2的肝素抗凝涂层也发生了较为明显的肝素分子脱落，这是酰胺共价固定不够稳定所导致的。而实施例1～实施例3所制备的肝素抗凝涂层是将肝素双键化改性并交联在涂层中，这些涂层在不同环境下都具有稳定的肝素含量，这表明肝素分子不会发生脱落。同时，实施例1～实施例3所制备的肝素抗凝涂层中的肝素含量变化不大，这说明通过不同的改性方法对肝素进行改性所制备的肝素抗凝涂层具有相似的效果。此外，对比实施例3所制备的肝素抗凝涂层也发生了非常明显的肝素分子脱落现象，这是因为在制备过程中未进行第一溶液和第二溶液的循环涂布，因此难以形成互穿交联网络，在浸泡后肝素分子迅速发生脱离。而实施例11所制备的肝素抗凝涂层虽然较对比实施例1～3具有较好的稳定性，但是由于在第二溶液中未添加交联剂和引发剂，导致互穿效果下降，浸泡后仍有一定程度的肝素分子脱落。
需要说明的是，以上仅以实施例1～实施例3所制备的肝素抗凝涂层为例进行稳定性测试，但其他实施例所制备的肝素抗凝涂层同样具有与实施例1～实施例3所制备的肝素抗凝涂层相当的稳定性。
(3)长期稳定性测试
将实施例1制备的含有肝素抗凝涂层的聚乙烯薄膜放置于PBS缓冲液中(pH为7.4)7天后，用纯化水清洗，再用甲苯胺蓝比色法测定肝素含量为1.72±0.01μg/cm2。这表明实施例1所制备的肝素抗凝涂层具有较好的长期稳定性。
需要说明的是，以上仅以实施例1所制备的肝素抗凝涂层为例进行长期稳定性测试，但其他实施例所制备的肝素抗凝涂层同样具有与实施例1所制备的肝素抗凝涂层相当的长期稳定性。
(4)血小板黏附测试
取新鲜兔血用枸橼酸钠抗凝，以1000rpm离心15min得到富含血小板的上清液。将实施例1～3、实施例4和实施例8制备的含有肝素抗凝涂层的薄膜用PBS缓冲液清洗后，放置于24孔板上，在每个孔中加入1mL富血小板血浆，在37℃下孵育1h(使用实施例中含有肝素抗凝涂层的薄膜的为实验组，无肝素抗凝涂层的聚乙烯薄膜作为对照组)。孵育完成后，用PBS缓冲液清洗薄膜，以去除未黏附的血小板，并用LDH细胞毒性试剂盒检测细胞释放的LDH间接定量黏附在材料表面的血小板数量。反应完成后，用酶标仪测量490nm处的吸光度(纯PBS缓冲液为空白组)。血小板的相对黏附＝(实验组490nm吸光度-空白组490nm吸光度)/(对照组490nm吸光度-空白组490nm吸光度)。结果如表3所示。
表3血小板的相对黏附
血小板的相对黏附
对照组 1.00
实施例1 0.12±0.01
实施例2 0.12±0.01
实施例3 0.13±0.01
实施例4 0.11±0.01
实施例8 0.12±0.01
由表3中可以看出，相比于无涂层的聚乙烯薄膜，实施例1～3、实施例4和实施例8制备的含有肝素抗凝涂层的薄膜都表现出了明显的抗凝效果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (15)

1.一种肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
在基材表面接枝多氨基类物质，所述多氨基类物质的数均分子量≥1kDa；
用含双键的羧酸、含双键的酸酐、含双键的环氧化合物或含双键的酰胺化合物对肝素进行改性，使所述肝素携带双键，以得到改性后的肝素；
获取第一溶液和第二溶液，所述第一溶液中含有所述改性后的肝素、自由基交联剂和引发剂，所述第二溶液中含有所述多氨基类物质；及
依次用所述第一溶液和所述第二溶液对接枝后的基材进行处理，再使处理后的基材表面的所述改性后的肝素和所述自由基交联剂在所述引发剂的作用下发生自由基聚合，形成肝素抗凝涂层。
2.根据权利要求1所述的肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，所述在基材表面接枝多氨基类物质的步骤包括：先对所述基材进行表面活化，然后在含有所述多氨基类物质的溶液中反应0.5h～3h。
3.根据权利要求2所述的肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，对所述基材进行表面活化的方法包括：等离子体处理、紫外辐照、化学改性或光化学接枝；及/或，
含有所述多氨基类物质的溶液为纯水溶液、磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
4.根据权利要求1～3任一项所述的肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，所述多氨基类物质选自聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚烯丙基胺、聚烯丙基胺盐酸盐、聚L-精氨酸、聚L-精氨酸盐酸盐、聚L-赖氨酸及聚L-赖氨酸氢溴酸盐中的至少一种；及/或，
所述多氨基类物质的数均分子量为1kDa～10kDa；及/或，
所述基材为金属基生物材料或高分子基生物材料。
5.根据权利要求1所述的肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，在所述用含双键的羧酸或含双键的酸酐对肝素进行改性的步骤中，将所述肝素与所述含双键的羧酸或所述含双键的酸酐在碱性溶液中反应3h～8h，所述肝素与所述含双键的羧酸或所述含双键的酸酐的质量比为1:(0.05～0.5)；或者，
在所述用含双键的环氧化合物对肝素进行改性的步骤中，将所述肝素与所述含双键的环氧化合物在pH为7～8的溶液中反应3天～8天，所述肝素与所述含双键的环氧化合物的质量比为1:(0.3～1)；或者，
在所述用含双键的酰胺化合物对肝素进行改性的步骤中，将所述肝素与所述含双键的酰胺化合物在活化剂和缩合剂的作用下，在0-4℃下搅拌反应3h～8h，所述肝素、所述含双键的酰胺化合物、所述活化剂及所缩合剂的质量比为(1～1.2):(0.8～1):(0.8～1):(0.8～1.2)。
6.根据权利要求1或5所述的肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，所述含双键的羧酸的通式为CHX＝CY-(L)n-COOZ，式中，X为氢或苯基，Y为氢、C1～C6的烷基或卤素取代的C1～C6的烷基，L为二价连接基，n为0或1，Z为氢或钠；
所述含双键的酸酐的通式为R1-C(＝O)O-C(＝O)-R2，R1和R2中至少一个为C2～C6的烯基，或者，R1和R2形成5～7元单环，所述5～7元单环含有碳碳双键或者具有含碳碳双键的取代基；
所述含双键的环氧化合物选自甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚、环氧丁烯及其同系物、1,2-环氧-4-乙烯基环己烷及3,4-环氧-1-环己烯中的至少一种；
所述含双键的酰胺化合物为N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐。
7.根据权利要求1所述的肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，在所述第一溶液中，所述改性后的肝素的浓度为2mg/mL～5mg/mL，所述改性后的肝素、所述自由基交联剂和所述引发剂的质量比为1:(0.02～0.1):(0.005～0.05)；及/或，
所述第一溶液的pH为6～6.8；及/或，
所述引发剂选自2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮、二苯甲酮、苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、2,2'-偶氮(2-甲基-N-(2-羟基乙基)丙酰胺、核黄素及曙红Y中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，所述自由基交联剂选自双官能或多官能的双键化合物、双官能或多官能的巯基化合物中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，所述双官能或多官能的双键化合物选自二醇类二丙烯酸酯、二醇类二乙烯基醚、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、1,3,5-三聚氰酸三烯丙基酯、三烯丙基异氰脲酸酯及三甘醇二乙烯基醚中的至少一种；及/或，
所述双官能或多官能的巯基化合物选自季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)、乙氧基化季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)、二季戊四醇六(巯基乙酸酯)、三羟甲基丙烷三(2-巯基乙酸酯)、季戊四醇四(2-巯基乙酸酯)、三季戊四醇八巯基乙酸酯、乙二醇双(3-巯基丙酸酯)、硫醇封端的丙氧基化甘油及硫醇封端的聚乙二醇中的至少一种。
10.根据权利要求1及7～9任一项所述的肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，所述第二溶液中还含有自由基交联剂和引发剂，所述第二溶液中的自由基交联剂和引发剂与所述第一溶液中的自由基交联剂和引发剂各自独立地相同或不同。
11.根据权利要求10所述的肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，在所述第二溶液中，所述多氨基类物质的浓度为1mg/mL～3mg/mL，所述自由基交联剂和所述多氨基类物质的质量比≤0.1:1，所述引发剂与所述多氨基类物质的质量比≤0.05:1。
12.根据权利要求1所述的肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，用所述第一溶液和所述第二溶液对改性后的基材进行处理的步骤中，采用浸涂、喷涂或旋涂的方式进行处理；及/或，
用所述第一溶液和所述第二溶液对改性后的基材进行处理的步骤中，每次处理的时间独立地为15min～3h。
13.根据权利要求1所述的肝素抗凝涂层的制备方法，其特征在于，所述引发剂为光引发剂，使处理后的基材表面的所述改性后的肝素和所述自由基交联剂在所述引发剂的作用下发生自由基聚合的步骤中，对所述处理后的基材进行光照处理15min～2h。
14.一种肝素抗凝涂层，其特征在于，由权利要求1～13任一项所述的肝素抗凝涂层的制备方法制备得到。
15.如权利要求14所述的肝素抗凝涂层在制备血液接触类医用器材中的应用。
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