CN117481034A - 一种诱导沉香愈伤组织形成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导沉香愈伤组织形成的方法,本发明选择沉香苗顶部幼嫩无病害的组织作为外植体,利用叶盘法诱导愈伤培养得到愈伤组织,愈伤组织更高效更稳定,可突破沉香木结香的技术瓶颈。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术,具体涉及一种诱导沉香愈伤组织形成的方法。
背景技术
沉香大多都是由白木香形成。白木香(Aquilaria sinensis L.),是瑞香科沉香属植物。沉香具有极好的药用价值和经济价值。作为药材它是中国传统名贵中药的一种,具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效。作为工艺品,可被做成手串,雕饰;作为香料,可做香水的定香剂。但是,作为药材使用的树脂部分使用传统的“结香”方法,具有周期长、比例低、品质参差不齐等缺陷,这就使得野生沉香资源稀缺。部分高品质沉香的售价可高于黄金价格,达数万元/克。人们发现,正常生长的白木香树木并不会产生“沉香”。只有树木受到外界伤害,抑或是病原菌侵害的时候,沉香树脂才会被合成并在创面积累。自然的结香过程一般十分漫长,可长达数十甚至数百年,所以天然沉香遭到大量采集后难以短时间内再生,致使野生沉香资源日渐稀缺。而人工种植的白木香常面临存活率低、结香率低等问题。因此,探究诱导沉香愈伤组织形成的方法,对提高沉香的产量具有很大帮助。
现有的白木香培育方式大多为扦插,嫁接等基本繁殖方法,需要耗费大量的人力物力资源。长久以来,人们利用物理、化学与生物等方法尝试提高人工培育的沉香的结香成功率、产量与品质,但效果均不稳定,加之其背后的成因仍不明确,进一步加大了人工沉香结香的难度,在试验过程中需要保证苗木资源供应充足。因此,利用现代科学技术手段,提高沉香愈伤组织的形成,有助于解决人工种植沉香结香难问题。
近年来,随着生物技术手段的进步,组织培养在植物培育中的应用也逐渐占据主要地位,因为其具有速度快,数量多等优点。而现有的针对沉香组织培养技术很少。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是提供一种诱导沉香愈伤组织形成的方法,本发明选择沉香苗顶部幼嫩无病害的组织作为外植体,利用叶盘法诱导愈伤培养得到愈伤组织,愈伤组织更高效更稳定,可突破沉香木结香的技术瓶颈。
本发明采取的具体技术方案是:
一种诱导沉香愈伤组织形成的方法,所述方法包括如下步骤:
(1)外植体的选择:从白木香苗的上部摘取健康无病害的叶片作为外植体,或者,选择白木香苗当年生枝条顶部的直径2cm以上的绿色茎段,诱导其腋芽萌发后,待其伸长至2cm左右,将其从原始茎段上取下于培养基中继续培养,获得无菌苗,摘取无菌苗上的叶片作为外植体;
(2)外植体的处理:
选择从白木香苗的上部摘取健康无病害的叶片作为外植体:用自来水将叶片表面的灰尘和杂质冲洗干净后,将洗净的外植体收集在容器里,置于超净工作台中,然后进行消毒处理;
无菌苗上的叶片无需进行消毒处理:
(3)愈伤诱导培养:
选择从白木香苗的上部摘取健康无病害的叶片作为外植体:用剪刀将消毒后叶片剪成面积为0.5-1.0cm2的小块即叶盘,正面朝上接种在愈伤诱导培养基中进行诱导培养;
选择无菌苗上的叶片作为外植体:将无菌苗上的叶片直接取下剪成面积为0.5-1.0cm2的小块即叶盘正面朝上接种在愈伤诱导培养基中进行诱导培养;
所述愈伤诱导培养基为:1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.1-0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L pH=5.8;
(4)愈伤继代培养:
叶盘培养至30d,边缘愈伤进一步膨大,将其从原始叶盘上剥离,置于愈伤继代培养基中培养,所述愈伤继代培养基为:1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.1-0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L pH=5.8 pH=5.8。
进一步地,步骤(2)所述的消毒处理为:先使用75%乙醇浸泡30s,用无菌水清洗2遍;再将外植体用0.1%的升汞消毒8min,无菌水清洗5遍,叶片于滤纸上晾干至表面无明显水迹。
进一步地,将消毒后叶片剪成面积为0.5-1.0cm2的小块,所述小块中不能带有主脉或叶缘。
进一步地,所述愈伤诱导培养的培养环境为26±2℃,全黑暗培养。
进一步地,所述愈伤继代培养的培养环境为26±2℃,全黑暗培养,每30d继代一次。
进一步地,选择白木香苗当年生枝条顶部的直径2cm以上的绿色茎段,诱导其腋芽萌发获得无菌苗的具体方法为:
(1)用剪刀将茎段剪下以后,摘除上面的叶片,再截短为长约为2cm的小段,每段带有1-2个腋芽,取下以后浸泡在水中;用自来水冲洗干净外植体表面的灰尘和杂质后,收集在容器里,置于超净工作台中;
(2)将步骤(1)处理后外植体转入无菌三角瓶中,首先使用75%乙醇浸泡30s,用无菌水清洗2遍;再将外植体用0.1%的升汞消毒8min,无菌水清洗5遍,茎段于滤纸上晾干至表面无明显水迹;
(3)将晾干后的茎段芽点朝上接种在腋芽诱导培养基中,接种完成的腋芽培养基转入培养室中培养,待叶腋间的芽点长至1-2cm时,将腋芽从茎上切除获得无菌芽,转移至壮苗培养基中继续培养,培养至长成高度6-10cm的无菌苗。
进一步地,所述腋芽诱导培养培养环境为26±2℃,日光灯光源,光照强度为3000Lux,光照时长16h/天。
进一步地,所述的腋芽诱导培养基为:1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L,pH=5.8。
进一步地,所述转移至壮苗培养基中继续培养,培养环境为26±2℃,日光灯光源,光照强度3000Lux,光照时长16h/天。
进一步地,所述的壮苗培养基为:1/2 MS + 蔗糖30g/L + Agar 7g/L,pH=5.8。
本发明的有益效果是:
本发明采用沉香苗顶部幼嫩无病害的组织作为外植体,并筛选出最优的培养基及培养条件,利用叶盘法诱导愈伤培养得到愈伤组织,解决了现有沉香愈伤组织培养周期长,培养速度慢的问题。
沉香作为药材有着重要的药用价值,通过愈伤组织培养,可以大规模生产含有药用成分的组织,用于药物的制备。
白木香愈伤组织可以产生多种代谢产物,如倍半萜、色酮、黄酮等,这些物质在香料、药物、化妆品等领域有广泛应用。
通过愈伤组织培养,可以进行基因转化,引入特定基因或调节基因表达,实现沉香植株的遗传改良,增强其抗病虫害、逆境适应等特性。
白木香是濒危植物,利用愈伤组织培养技术可以减少野生种群的采伐压力,保护植物资源。
附图说明
图1为外植体取样示意图(左)和顶部茎段(右);
图2为成熟叶片(左)与幼嫩叶片(右)(红框为取材部位);
图3为实施例1继代培养的愈伤组织;
图4为实施例1愈伤诱导培养出的愈伤组织效果图;
图5为实施例2培养的愈伤组织效果图;
图6为实施例3培养的愈伤组织效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1:
一种诱导沉香愈伤组织形成的方法,包括如下步骤:
步骤A:从白木香苗的上部摘取健康无病害的叶片作为外植体;
步骤B:用自来水将叶片表面的灰尘和杂质冲洗干净后,将洗净的外植体收集在容器里,置于超净工作台中;
步骤C:将外植体转入无菌三角瓶中,首先使用75%乙醇浸泡30s,用无菌水清洗2遍。再将外植体用0.1%的升汞消毒8min,无菌水清洗5遍,叶片于滤纸上晾干至表面无明显水迹;
步骤D:用剪刀将消毒后叶片剪成面积为0.5-1.0cm2的小块(小块中不能带有主脉或叶缘),正面朝上接种在诱导培养基中;
步骤E:接种完成的诱导培养基转入暗室中培养,培养环境为26±2℃,全黑暗培养,所述愈伤诱导培养基为:1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar7g/L pH=5.8。
步骤F:叶盘培养至30d,边缘愈伤进一步膨大,可将其从原始叶盘上剥离,置于愈伤继代培养基中培养,培养环境为26±2℃,全黑暗培养,每30d继代一次。所述愈伤继代培养基为:1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L pH=5.8;培养至直径约2-3mm。
经统计,采用本实施例的方法,愈伤的诱导率为78.8%。
实施例2:
一种诱导沉香愈伤组织形成的方法,包括如下步骤:
步骤A:选择白木香苗当年生枝条顶部的直径2cm以上的绿色茎段作为外植体,以期通过器官发生途径诱导其腋芽萌发以获得无菌苗。顶部茎段的腋芽生长活力强,幼嫩且木质化程度轻,带病菌的几率更小,接种后不易污染;
步骤B:用剪刀将茎段剪下以后,摘除上面的叶片,再截短为长约为2cm的小段,每段带有1-2个腋芽,取下以后浸泡在水中;用自来水冲洗干净外植体表面的灰尘和杂质后,收集在容器里,置于超净工作台中;
步骤C:将外植体转入无菌三角瓶中,首先使用75%乙醇浸泡30s,用无菌水清洗2遍。再将外植体用0.1%的升汞消毒8min,无菌水清洗5遍,茎段于滤纸上晾干至表面无明显水迹;
步骤D:晾干后的茎段芽点朝上接种在诱导培养基中。接种完成的培养基转入培养室中培养,培养环境为26±2℃,日光灯光源,光照强度为3000Lux,光照时长16h/天。一个月内持续观察记录。期间及时清理污染的外植体,更换新培养基。所述的腋芽诱导培养基为:1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L,pH=5.8;
步骤F:茎段接种10d后,叶腋间的芽点开始萌动,培养至30d,芽可长至1-2cm,此时将腋芽从茎上切除获得无菌芽,将其从原始茎段上切下,转移至壮苗培养基中继续培养,培养环境为26±2℃,日光灯光源,光照强度3000 Lux,光照时长16h/天,约45d后,芽的基部开始长出根系。所述的壮苗培养基为:1/2 MS + 蔗糖30g/L + Agar 7g/L,pH=5.8;
步骤G:无菌芽在壮苗培养基中培育60d左右,即可长成高度6-10cm的无菌苗,其叶片可直接切成叶盘用于愈伤的诱导,培养环境为26±2℃,全黑暗培养,所述愈伤诱导培养基:1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L pH=5.8;
步骤H:叶盘培养至30d,边缘愈伤进一步膨大,可将其从原始叶盘上剥离,置于愈伤继代培养基中培养,培养环境为26±2℃,全黑暗培养,每30d继代一次。所述愈伤继代培养基为:1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L pH=5.8;培养至直径约2-3mm。
经统计,采用本实施例的方法,愈伤的诱导率为90.34%。
实施例3:
与实施例2其它均相同,不同之处在愈伤诱导培养基中2,4-D浓度为0.1 mg/L。
经统计,采用本实施例的方法,愈伤的诱导率为47.6%。
对照例1:
与实施例1其它均相同,不同之处在于培养基的培养环境为:26±2℃,日光灯光源,光照强度3000Lux,光照时长16h/天。
经统计,采用本对照例的方法,愈伤诱导率仅为6.5%。
由实施例1-3和对照例1的培养结果可知,愈伤诱导培养基在实验过程中2,4-D浓度由0.1mg/L调整到0.3mg/L对于愈伤的诱导效果更好;叶片接种完成后的培养基在黑暗条件下比光照条件下生长效果更好;采用白木香苗当年生枝条顶部的直径2cm以上的绿色茎段培养的无菌苗的叶片作为外植体,无需经过消毒步骤,且诱导的愈伤质量更高,愈伤诱导率可达90%以上。
尽管已经对上述各实施例进行了描述,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例做出另外的变更和修改,所以以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利保护范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (10)
1.一种诱导沉香愈伤组织形成的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)外植体的选择:从白木香苗的上部摘取健康无病害的叶片作为外植体,或者,选择白木香苗当年生枝条顶部的直径2cm以上的绿色茎段,诱导其腋芽萌发后,待其伸长至2cm左右,将其从原始茎段上取下于培养基中继续培养,获得无菌苗,摘取无菌苗上的叶片作为外植体;
(2)外植体的处理:
选择从白木香苗的上部摘取健康无病害的叶片作为外植体:用自来水将叶片表面的灰尘和杂质冲洗干净后,将洗净的外植体收集在容器里,置于超净工作台中,然后进行消毒处理;
无菌苗上的叶片无需进行消毒处理:
(3)愈伤诱导培养:
选择从白木香苗的上部摘取健康无病害的叶片作为外植体:用剪刀将消毒后叶片剪成面积为0.5-1.0cm2的小块即叶盘,正面朝上接种在愈伤诱导培养基中进行诱导培养;
选择无菌苗上的叶片作为外植体:将无菌苗上的叶片直接取下剪成面积为0.5-1.0cm2的小块即叶盘正面朝上接种在愈伤诱导培养基中进行诱导培养;
所述愈伤诱导培养基为:1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.1-0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L pH=5.8;
(4)愈伤继代培养:
叶盘培养至30d,边缘愈伤进一步膨大,将其从原始叶盘上剥离,置于愈伤继代培养基中培养,所述愈伤继代培养基为:1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.1-0.3mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L pH=5.8。
2.根据权利要求1所述的诱导沉香愈伤组织形成的方法,其特征在于,步骤(2)所述的消毒处理为:先使用75%乙醇浸泡30s,用无菌水清洗2遍;再将外植体用0.1%的升汞消毒8min,无菌水清洗5遍,叶片于滤纸上晾干至表面无明显水迹。
3.根据权利要求1所述的诱导沉香愈伤组织形成的方法,其特征在于,将消毒后叶片剪成面积为0.5-1.0cm2的小块,所述小块中不能带有主脉或叶缘。
4.根据权利要求1所述的诱导沉香愈伤组织形成的方法,其特征在于,所述愈伤诱导培养的培养环境为26±2℃,全黑暗培养。
5.根据权利要求1所述的诱导沉香愈伤组织形成的方法,其特征在于,所述愈伤继代培养的培养环境为26±2℃,全黑暗培养,每30d继代一次。
6.根据权利要求1所述的诱导沉香愈伤组织形成的方法,其特征在于,选择白木香苗当年生枝条顶部的直径2cm以上的绿色茎段,诱导其腋芽萌发获得无菌苗的具体方法为:
(1)用剪刀将茎段剪下以后,摘除上面的叶片,再截短为长约为2cm的小段,每段带有1-2个腋芽,取下以后浸泡在水中;用自来水冲洗干净外植体表面的灰尘和杂质后,收集在容器里,置于超净工作台中;
(2)将步骤(1)处理后外植体转入无菌三角瓶中,首先使用75%乙醇浸泡30s,用无菌水清洗2遍;再将外植体用0.1%的升汞消毒8min,无菌水清洗5遍,茎段于滤纸上晾干至表面无明显水迹;
(3)将晾干后的茎段芽点朝上接种在腋芽诱导培养基中,接种完成的腋芽培养基转入培养室中培养,待叶腋间的芽点长至1-2cm时,将腋芽从茎上切除获得无菌芽,转移至壮苗培养基中继续培养,培养至长成高度6-10cm的无菌苗。
7.根据权利要求6所述的诱导沉香愈伤组织形成的方法,其特征在于,所述腋芽诱导培养培养环境为26±2℃,日光灯光源,光照强度为3000Lux,光照时长16h/天。
8.根据权利要求6所述的诱导沉香愈伤组织形成的方法,其特征在于,所述的腋芽诱导培养基为:1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L,pH=5.8。
9.根据权利要求6所述的诱导沉香愈伤组织形成的方法,其特征在于,所述转移至壮苗培养基中继续培养,培养环境为26±2℃,日光灯光源,光照强度3000Lux,光照时长16h/天。
10.根据权利要求6所述的诱导沉香愈伤组织形成的方法,其特征在于,所述的壮苗培养基为:1/2 MS + 蔗糖30g/L + Agar 7g/L,pH=5.8。
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