CN117480182A - 抗s100a4人源化抗体、用途和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了分离的人源化抗S100A4抗体分子和产生所述抗体的方法。还提供了核酸、载体、分离的宿主细胞和含有所述抗体的药物组合物，以及包括施用所述抗体的治疗方法。

Description

抗S100A4人源化抗体、用途和方法
技术领域
本发明涉及分离的抗S100A4人源化抗体分子及其医学用途，并且更特别地涉及分离的抗S100A4人源化抗体分子，其能够抑制S100A4例如在促进慢性炎症、纤维化、肿瘤进展和/或在诱导肿瘤转移方面的生物活性，以及所述分离的抗S100A4人源化抗体分子在治疗纤维化疾病、炎性病症和癌症(特别是转移性癌症)中的用途。
背景技术
纤维化被定义为细胞外基质蛋白的过度沉积。纤维化疾病的早期阶段几乎总是以炎症反应为特征，所述炎症反应的功能是吸引、分化和激活成纤维细胞，所述成纤维细胞进而产生胶原蛋白和其他细胞外基质蛋白。如果这些过程变为慢性，炎症和/或纤维化反应会逐渐破坏生理组织功能，并且可能导致器官受损或衰竭。与慢性炎症和纤维化有关的机制是具有不同临床表现的广泛疾病的潜在驱动因素，除了纯粹的纤维化和炎性病症外，所述广泛疾病还包括动脉粥样硬化、癌症和神经系统变性疾病。在癌症中，患病的组织微环境为恶性细胞的增殖和扩散提供必要的支持机制。炎症和纤维化途径的激活在转移前的小生境的发展中起着重要作用，所述小生境为原发性肿瘤细胞扩散到远处的器官提供必要的条件。
S100A4已被鉴定为是参与放大和维持炎症和纤维化途径不适当激活的过程的关键蛋白。S100A4属于具有不同细胞外和细胞内功能的小Ca结合蛋白的S100家族(Donato，2003)。在生理条件下，S100A4主要位于细胞内，但在细胞应激或损伤时释放到细胞外环境(Fei等人，2017)。细胞外S100A4形成与模式识别受体(PRR)接合的高阶寡聚物，继而激活多种炎症和纤维化反应(Ambartsumian等人，2019；Fei等人，2017)。通过与PRR的相互作用，S100A4触发从免疫细胞释放炎性介质，刺激从成纤维细胞释放细胞外基质蛋白，并且参与上皮细胞向间充质细胞转化(Kalluri&Zeisberg，2006；Tomcik等人，2015；Neidhart等人，2019)。S100A4的过表达是慢性炎症和纤维化的标志。大量研究发现，与健康对照组相比，S100A4在不同的人疾病中水平升高，包括系统性硬化病、间质性肺纤维化、类风湿性关节炎、银屑病和皮肌炎(Tomcik等人，2015；Zibert等人，2008；等人，2007；Cerezo等人，2011；Akiyama等人，2020)。
采用基于细胞的测定或体内疾病模型的一些研究表明，S100A4因果地参与炎症和纤维化的发病机制(Ambartsumian等人，2019)。在成纤维细胞中敲减S100A4防止TGFβ诱导的成纤维细胞激活(Tomcik等人，2015)。S100A4的敲减抑制一些动物模型中的纤维化、炎症和癌症扩散，所述动物模型包括博来霉素诱导的皮肤或肺纤维化、紧致皮肤1皮肤纤维化和一些癌症模型(Ambartsumian等人，2019；Tomcik等人，2015)。
大量研究将S100A4活性与肿瘤进展和转移形成联系起来。已经使用癌细胞系、转基因和敲除小鼠模型的体外研究以及对于S100A4活性对癌症患者中转移的预后意义的评估来积累该证据(Boye等人，2010；Helfman等人，2005；Mishra等人，2011)。
S100A4活性与刺激癌细胞运动和侵袭、正常和异常增殖、凋亡和分化相关。S100A4参与导致细胞膜和细胞外基质重塑的信号传导途径；细胞骨架动力学的调节、侵袭力的获得和血管生成的诱导(Sherbet，2009)。
已显示S100A4在某些肿瘤细胞中表达，但更通常地，S100A4是从导致S100A4在肿瘤微环境中积累的某些癌症相关基质细胞中激活和分泌的。此外，已显示转移性微环境含有比原发性肿瘤微环境更多数量的S100A4阳性基质细胞(Cabezon等人，2007；Grum-Schwensen等人，2005；2010；Maelandsmo等人，2009；Schmidt-Hansen等人，2004a)。
此外，S100A4已显示在头颈癌和胶质母细胞瘤中维持癌症起始细胞的干性特性和致瘤性(Lo等人，2011；Chow等人，2017)。因此，能够抑制S100A4生物活性的药物的开发可代表用以调节在一系列人疾病中激活的多种炎症和纤维化途径的有前景的治疗选择。因此，对治疗性抗S100A4抗体，特别是人源化抗S100A4抗体的需求未得到满足，所述抗体特异性靶向S100A4的细胞外致病部分。
人源化抗体是来自非人物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加其与人类天然产生的抗体变体的相似性。“人源化”的过程通常应用于为向人施用而开发的单克隆抗体(例如，开发为抗癌药物的抗体)。当开发特异性抗体的过程涉及非人免疫系统(如小鼠中的免疫系统)的生成时，人源化可以是必要的。在非人免疫系统中产生的抗体的蛋白质序列与天然存在于人中的同源抗体有部分不同，并且因此当施用于人患者时具有潜在的免疫原性，这可以去除任何治疗益处并且可能在患者中引起不良影响。
发明内容
本发明提供了具有改进的安全性特征的人源化抗s100A4抗体。
诸位发明人已经发现，鼠IgG1和人源化IgG1抗S100A4抗体引发促炎性细胞因子TNFα的反常增加，而同时阻断S100A4刺激的IL-6和IL-10的增加。TNFα的增加是通过FcγRIIA受体簇集和激活引发的。此作用出人意料地依赖于抗S100A4抗体和S100A4蛋白两者，因为不存在S100A4时的抗S100A4抗体和与同种型对照抗体(人IgG1或人IgG4)组合的S100A4均不会导致FcγRIIA受体簇集。
诸位发明人已经发现，人源化抗S100A4抗体从IgG1支架至IgG4支架的亚类转换减弱了这种先前未报告的S100A4依赖性FcγRIIA受体簇集和激活，从而防止了不希望的促炎性细胞因子释放并且改善了所述抗体的安全性特征。与由鼠IgG1抗S100A4抗体引发的FcγRIIA受体簇集和激活相比，人源化IgG4抗体引发的FcγRIIA受体簇集和激活也显著降低。
在一个方面，提供了分离的抗体，所述分离的抗体包含：
a)重链可变(VH)区，所述重链可变区包含：
i.重链互补决定区1(CDR-H1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:4的氨基酸序列或由其组成；
ii.重链互补决定区2(CDR-H2)，所述重链互补决定区2包含SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:5的氨基酸序列或由其组成；和
iii.重链互补决定区3(CDR-H3)，所述重链互补决定区3包含SEQ ID NO:3或SEQID NO:6的氨基酸序列或由其组成；
以及
b)轻链可变(VL)区，所述轻链可变区包含：
i.CDR-L1，所述CDR-L1包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成；
ii.CDR-L2，所述CDR-L2包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成；和
iii.CDR-L3，所述CDR-L3包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成；
其中，所述VH区包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:13至17中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中不是如SEQ ID NO:1至6所定义的CDR序列的部分的任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变，
和/或其中，所述VL区包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:18至22中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中不是如SEQ ID NO:7至12所定义的CDR序列的部分的任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变。
在一个方面，提供了分离的抗体，所述分离的抗体包含：
i.重链可变(VH)区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:13至17中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变，
以及
ii.轻链可变(VL)区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:18至22中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变。
在一个方面，提供了编码如上文在“分离的抗S100A4抗体分子”章节中所述的抗体的分离的核酸分子。
在一个方面，提供了包含如本文所述的编码抗S100A4抗体分子的核酸分子的表达载体。
在一个方面，提供了包含如本文所述的分离的核酸分子或表达载体的分离的宿主细胞。
在一个方面，提供了产生抗S100A4抗体分子的方法，所述方法包括在其中表达所述抗体的条件下培养如本文所述的宿主细胞。
在一个方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的抗体、核酸分子、表达载体和/或宿主细胞，以及药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂。
在一个方面，还提供了治疗患有S100A4介导的病症的个体的方法，所述方法包括向有需要的个体施用如本文所述的抗体或宿主细胞。
在一个方面，提供了用于对个体的S100A4相关病症进行诊断或预后的方法，所述方法包括
(a)使来自所述个体的生物样品与能够结合所述样品中存在的S100A4多肽的如本文所述的抗S100A4抗体接触；并且
(b)确定所述抗体分子与所述S100A4多肽之间形成的复合物的存在和/或量。
附图说明
图1示出了单克隆人源化抗S100A4抗体对博来霉素激发的小鼠的纤维化读出的影响。抗S100A4抗体对真皮厚度(A)、成肌纤维细胞计数(B)和羟脯氨酸含量(C)的影响。HE染色的皮肤切片的代表性图像显示在D-E中。p值表示如下：0.05>p>0.01为*；0.01>p>0.001为**，与NaCl相比；0.05>p>0.01为#；0.01>p>0.001为##，与注射博来霉素三周接着再注射NaCl 3周的小鼠相比。结果进一步描述于实施例3中。
图2示出了通过Luminex分析而分析得出的单核细胞的IL-6分泌。所示数据是5个供体的平均值。在不存在或存在小鼠IgG1(A)、人IgG4(B)、AX-202(C)或6B12(D)的情况下，将从PBMC纯化的单核细胞与培养基、媒介物、LPS、S100A4一起培养6小时。数据示出通过Luminex测定量化的上清液中IL-6的水平。数据表示为来自五个单独供体的平均值+SEM。“+”指示至少一个供体高于IL-6检测限(19,200pg/mL)。“-”指示至少一个供体低于IL-6检测限(8.8pg/mL)。结果进一步描述于实施例4中。
图3示出了通过Luminex分析而分析得出的单核细胞的IL-10分泌。所示数据是5个供体的平均值。在不存在或存在小鼠IgG1(A)、人IgG4(B)、AX-202(C)或6B12(D)的情况下，将从PBMC纯化的单核细胞与培养基、媒介物、LPS、S100A4一起培养6小时。数据示出通过Luminex测定量化的上清液中的细胞因子IL-10。数据表示为来自五个单独供体的平均值+SEM。“-”指示至少一个供体低于IL-10检测限(8.6pg/mL)。结果进一步描述于实施例4中。
图4示出了通过Luminex分析而分析得出的单核细胞的TNF-α分泌。所示数据是5个供体的平均值。在不存在或存在小鼠IgG1(A)、人IgG4(B)、AX-202(C)或6B12(D)的情况下，将从PBMC纯化的单核细胞与培养基、媒介物、LPS、S100A4一起培养6小时。数据示出通过Luminex测定量化的上清液中TNF-α的水平。数据表示为来自五个单独供体的平均值+SEM。“-”指示至少一个供体低于TNF-α检测限(15.20pg/ml)。结果进一步描述于实施例4中。
图5示出了通过蛋白质印迹测量的6B12 mAb的三种人源化变体对不同其他S100家族成员的特异性。结果进一步描述于实施例5中。
图6示出了人变体对S100A4蛋白具有特异性，并且人变体不与野生型(wt)和S100A4敲除(ko)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中所示的随机细胞蛋白发生交叉反应。将细胞用DAPI复染并且肌动蛋白细胞骨架经鬼笔环肽复染。亲本单克隆小鼠抗S100A4抗体(6B12)用作对照。棒＝100μm。结果进一步描述于实施例5中。
图7示出了AX-202以浓度依赖性方式抑制S100A4诱导的TLR4激活。(A)S100A4以浓度依赖性方式激活HEKBlue hTLR4细胞中的NF-kB报告基因。(B)S100A4对NF-kB报告基因的激活依赖于TLR4。(C)AX-202以浓度依赖性方式抑制S100A4诱导的TLR4激活。结果进一步描述于实施例6中。
图8示出了FcγIIaR对于与2.5μg/ml重组人S100A4二聚体(A)或多聚体(B)组合的2μg/ml 6B12 mIgG1、AX-202hIgG1和AX-202hIgG4的结合活性的比较。对照IgG1或IgG4抗体不介导受体簇集和激活。结果进一步描述于实施例7中。棒指示SD。结果呈现为平均值±SD，n＝3次独立研究。对于具有0μg/ml S100A4的对照，n＝2。
具体实施方式
定义
如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确说明。因此，例如，提及“一种抗体”包括多种此类抗体。
蛋白质S100A4也称为18A2、42A、CAPL、FSP1、MTS1、P9KA、PEL98和S100钙结合蛋白A4。
术语“分离的”是指如下化合物，所述化合物可以是例如基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体或抗原结合部分的抗体或抗原结合部分。此外，分离的抗体抗原结合部分可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
如本文所定义的可操作地连接是指所提及的元件连接为相同核酸分子的一部分，其位置和取向适于从启动子起始转录。与启动子可操作地连接的DNA是在所述启动子的转录起始调节下或与所述启动子功能性组合。
如本文所用，术语“变体”定义DNA序列或其编码的RNA或蛋白质产物的天然存在的遗传突变体，或DNA序列或其编码的RNA或蛋白质产物的重组制备的变体。术语“变体”还可以指给定肽的天然存在的变体或给定肽或蛋白质的重组制备的变体，其中一个或多个氨基酸残基已经通过氨基酸取代、添加或缺失而被修饰。
如本文所用的“抑制”意指本发明的抗体的存在全部或部分地抑制配体与它们的受体的结合和/或受体在配体结合后所引发的信号的失能。这包括例如对细胞行为和过程有影响的下游信号传导。还包括抑制靶分子下游效应的其他机制，例如通过阻断靶分子的二聚化、寡聚化和/或多聚化。“抑制”、“阻断”和“中和”在本文中用作等同术语。
分离的抗S100A4抗体分子
在一个方面，提供了分离的抗体，所述分离的抗体包含：
a)重链可变(VH)区，所述重链可变区包含：
i.重链互补决定区1(CDR-H1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:4的氨基酸序列或由其组成；
ii.重链互补决定区2(CDR-H2)，所述重链互补决定区2包含SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:5的氨基酸序列或由其组成；和
iii.重链互补决定区3(CDR-H3)，所述重链互补决定区3包含SEQ ID NO:3或SEQID NO:6的氨基酸序列或由其组成；
以及
b)轻链可变(VL)区，所述轻链可变区包含：
i.CDR-L1，所述CDR-L1包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成；
ii.CDR-L2，所述CDR-L2包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成；和
iii.CDR-L3，所述CDR-L3包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成；
其中，所述VH区包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:13至17中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中不是如SEQ ID NO:1至6所定义的CDR序列的部分的任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变，
和/或其中，所述VL区包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:18至22中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中不是如SEQ ID NO:7至12所定义的CDR序列的部分的任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变。
在一些实施方案中，所述分离的抗体的重链可变(VH)区包含：
i.重链互补决定区1(CDR-H1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成；
ii.重链互补决定区2(CDR-H2)，所述重链互补决定区2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成；和
iii.重链互补决定区3(CDR-H3)，所述重链互补决定区3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成；
并且所述轻链可变(VL)区包含含有以下的轻链可变(VL)区：
i.轻链互补决定区1(CDR-L1)，所述轻链互补决定区1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成；
ii.轻链互补决定区2(CDR-L2)，所述轻链互补决定区2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成；和
iii.轻链互补决定区3(CDR-L3)，所述轻链互补决定区3包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，所述分离的抗体的重链可变(VH)区包含：
i.重链互补决定区1(CDR-H1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成；
ii.重链互补决定区2(CDR-H2)，所述重链互补决定区2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成；和
iii.重链互补决定区3(CDR-H3)，所述重链互补决定区3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成；
并且所述轻链可变(VL)区包含含有以下的轻链可变(VL)区：
i.轻链互补决定区1(CDR-L1)，所述轻链互补决定区1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成；
ii.轻链互补决定区2(CDR-L2)，所述轻链互补决定区2包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成；和
iii.轻链互补决定区3(CDR-L3)，所述轻链互补决定区3包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成。
在一个方面，提供了分离的抗体，所述分离的抗体包含：
i.重链可变(VH)区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:13至17中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变，
以及
ii.轻链可变(VL)区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:18至22中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变。
因此，在一些实施方案中，所述抗体的重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:13所定义的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的重链可变(VH)区包含SEQ IDNO:14所定义的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:15所定义的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:16所定义的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:17所定义的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:13至17所定义的氨基酸序列中任一个的变体或由其组成，其中任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中在每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变。
在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:18所定义的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:19所定义的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变(VL)区包含SEQID NO:20所定义的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:21所定义的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:22所定义的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:18至22所定义的氨基酸序列中任一个的变体或由其组成，其中任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中在每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变。
在一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体。
在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体。在一些实施方案中，所述抗体是Fab片段。在一些实施方案中，所述抗体是F(ab')片段。在一些实施方案中，所述抗体是F(ab′)2片段。在一些实施方案中，所述抗体是scFv。在一些实施方案中，所述抗体是双抗体。在一些实施方案中，所述抗体是三抗体。
在一些实施方案中，所述抗体是人IgG1免疫球蛋白亚类抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人IgG2免疫球蛋白亚类抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人IgG3免疫球蛋白亚类抗体。
诸位发明人已经发现，与媒介物对照相比，小鼠IgG1或人IgG4同种型对照没有增加S100A4诱导的TNFα水平，然而6B12(小鼠IgG1抗S100A4抗体)显著增加S100A4诱导的TNFα水平，并且人源化IgG4抗S100A4抗体不存在这种增加(更多细节参见实施例4和7)。对于本发明，使用具有免疫球蛋白亚类的抗体可能是有用的，所述免疫球蛋白亚类在宿主中引发弱促炎性应答或无促炎性应答。如图所示，当需要降低所述抗体的效应子或交联功能时，人IgG4亚类特别有用。因此，在一些实施方案中，所述抗体是人IgG4亚类抗体。在特定实施方案中，所述抗体是具有SEQ ID NO:58的HC序列和SEQ ID NO:59的LC序列的人IgG4亚类抗体。
在一些实施方案中，所述抗体包含人重链恒定(CH)区，所述人重链恒定区包含SEQID NO:56中所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体包含CH区，所述CH区包含SEQ ID NO:56的变体或由SEQ ID NO:56的变体组成，所述变体与SEQ ID NO:56具有至少80％，如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，所述抗体包含人轻链恒定(CL)区，所述人轻链恒定区包含SEQID NO:57中所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体包含CL区，所述CL区包含SEQ ID NO:57的变体或由SEQ ID NO:57的变体组成，所述变体与SEQ ID NO:57具有至少80％，如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，所述抗体包含具有突变的人IgG恒定区的Fc结构域。在一些实施方案中，所述抗体包含突变体人IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，所述突变体人IgG4重链恒定区包含根据EU编号进行编号的S228P取代。所述S228P取代可以防止体内和体外IgG4 Fab臂交换，这可能导致具有未知特异性的功能性单价双特异性抗体(bsAb)，并因此潜在地降低治疗效果。在一些实施方案中，已去除人IgG4重链恒定区的末端赖氨酸。
第一个人源化抗体是在英国剑桥的格雷格·温特(Greg Winter)的实验室在1986年制备的。此抗体的亲和力有中度的丧失，但将鼠CDR移植至人框架上的CDR移植策略被认为是成功的。下一个待人源化的抗体是治疗性抗体Campath-1，其亲和力明显降低，并且正是在这里，首先开始探索对CDR稳定性和VH/VL界面稳定性重要的框架氨基酸。
自20世纪90年代以来，鼠抗体的人源化作为一种制备用于人用途的可耐受治疗剂的手段而引起了极大的兴趣。从早期开始，人们就意识到框架氨基酸在以有利于其抗原结合的方式呈现CDR方面起着关键作用，但是没有自动或常规的方法来鉴定和决定要回复突变哪些残基以成功增加抗原亲和力。重要的是要考虑哪些位置对VL/VH界面的稳定性很重要以及在相似抗体框架中在给定位置处的每个氨基酸的频率。因此，框架回复突变可用于改善人源化抗体对其靶标的亲和力或稳定性。
因此，在一些实施方案中，所述抗体包含在SEQ ID NO:13至17中任一个的VH区的位置40处的氨基酸变为苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体包含在SEQID NO:13至17中任一个的VH区的位置43处的氨基酸变为丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体包含在SEQ ID NO:13至17中任一个的VH区的位置44处的氨基酸变为赖氨酸的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述抗体包含在SEQ ID NO:18至22中任一个的VL区的位置42处的氨基酸变为甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体包含在SEQ ID NO:18至22中任一个的VL区的位置43处的氨基酸变为苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体包含在SEQ ID NO:18至22中任一个的VL区的位置44处的氨基酸变为亮氨酸的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:24中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:25中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:26中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:27中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:28中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:29中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:30中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:31中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:32中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:33中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:34中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:35中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:36中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:37中所定义的VH区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含如SEQ ID NO:38中所定义的VH区或由其组成。
在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:39所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:40所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:41所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:42所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:43所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:44所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:45所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:46所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:47所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:48所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:49所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQID NO:50所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ IDNO:51所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:52所定义的VL区或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VL区包含如SEQ ID NO:53所定义的VL区或由其组成。
在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含SEQ ID NO:24(VH1_H40Phe)或由其组成，并且所述抗体的VL区包含SEQ ID NO:47(VL3_L44Leu)或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含SEQ ID NO:24(VH1_H40Phe)或由其组成，并且所述抗体的VL区包含SEQ ID NO:20(VL3)或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含SEQ ID NO:26(VH1_H44Lys)或由其组成，并且所述抗体的VL区包含SEQ ID NO:20(VL3)或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含SEQ ID NO:13(VH1)或由其组成，并且所述抗体的VL区包含SEQ ID NO:47(VL3_L44Leu)或由其组成。在一些实施方案中，所述抗体的VH区包含SEQID NO:13(VH1)或由其组成，并且所述抗体的VL区包含SEQ ID NO:20(VL3)或由其组成。
在一些实施方案中，所述抗体是聚乙二醇化的。
抗体功能和治疗效果
在一些实施方案中，根据本发明的抗体能够结合天然构象S100A4蛋白。在一些实施方案中，所述抗体能够结合S100A4蛋白的二聚体形式。在一些实施方案中，所述抗体能够结合S100A4蛋白的寡聚体形式。在一些实施方案中，所述抗体能够结合S100A4蛋白的多聚体形式。
在一些实施方案中，所述抗体能够结合与如SEQ ID NO:23(人S100A4)中所示的氨基酸1至101具有至少80％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述抗体能够结合与如SEQ ID NO:23中所示的氨基酸1至101具有至少85％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述抗体能够结合与如SEQ ID NO:23中所示的氨基酸1至101具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述抗体能够结合与如SEQ ID NO:23中所示的氨基酸1至101具有至少95％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述抗体能够结合SEQ ID NO:23的人S100A4多肽。
在一些实施方案中，所述抗体能够中和S100A4的生物活性。在一些实施方案中，S100A4的生物活性是促进肿瘤进展和/或诱导肿瘤转移。
在一些实施方案中，用抗S100A4抗体治疗减少纤维化。因此，在一些实施方案中，所述抗体能够减少S100A4介导的纤维化。纤维化可以通过本领域已知的方法测量真皮厚度、真皮羟脯氨酸含量、真皮CD3+细胞计数和/或真皮成肌纤维细胞计数来评估。因此，在一些实施方案中，用抗S100A4抗体治疗减少真皮厚度、真皮胶原蛋白或羟脯氨酸含量、真皮成肌细胞计数和/或T细胞计数。
在一些实施方案中，所述抗体能够抑制S100A4在促进肿瘤进展和/或诱导肿瘤转移和/或炎症方面的生物活性。
在一些实施方案中，所述抗体能够抑制由S100A4介导的T细胞募集。在一些实施方案中，所述抗体能够抑制由S100A4介导的巨噬细胞募集和/或浸润。
在一些实施方案中，所述抗体能够抑制S100A4蛋白在刺激细胞侵袭中的生物活性。在一些实施方案中，在3D Matrigel基质测定或T细胞侵袭测定中测定S100A4蛋白在刺激细胞侵袭方面的生物活性，其中S100A4刺激T细胞浸润到成纤维细胞单层中。在一些实施方案中，在小鼠体内异种移植模型中测定S100A4在诱导肿瘤转移方面的生物活性。
在一些实施方案中，所述抗体具有低或无效应子功能。在一些实施方案中，所述抗体诱导宿主细胞的低结合或无结合、交联和/或Fc受体依赖性效应子功能的激活。
编码所述抗体的核酸和表达载体
在一个方面，提供了编码如上文在“分离的抗S100A4抗体分子”章节中所述的抗体的分离的核酸分子。在一些实施方案中，将所述核酸分子针对表达它的细胞进行密码子优化。
在一个方面，还提供了包含如本文所述的编码抗S100A4抗体分子的核酸分子的表达载体。在一些实施方案中，所述表达载体的核酸分子可操作地连接至控制序列以指导其表达。此类控制序列包括可以控制编码抗S100A4抗体分子的序列的转录的调节元件，例如启动子(如被转录因子激活的启动子)、增强子或沉默子。在一些实施方案中，编码抗S100A4抗体分子的mRNA的翻译可以由不同的控制元件(如核糖开关)控制。合适的控制序列和载体是本领域熟知的。
用于产生和操纵核酸并且在细胞(如哺乳动物细胞)中表达核酸的合适技术是本领域普通技术人员熟知的。
包含所述抗体的宿主细胞
在一个方面，提供了包含如上文在“核酸和表达载体”章节中所述的分离的核酸分子或表达载体的分离的宿主细胞。
在一些实施方案中，所述分离的宿主细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述分离的宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明还可与离体基因疗法结合使用，其中将患者细胞在体外用编码如本文所公开的抗体的表达载体转染或转导。转染后，将细胞输注回患者体内以表达和分泌所述抗体。用于离体基因疗法的合适供体细胞包括T细胞。
产生如本文所述抗体的方法
在一个方面，提供了产生抗S100A4抗体分子的方法，所述方法包括在其中表达所述抗体的条件下培养如上文在“包含所述抗体的宿主细胞”章节中所述的宿主细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括纯化所述抗体并且分离由此产生的抗S100A4抗体。
药物组合物
在一个方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含如上文在“分离的抗S100A4抗体分子”章节中所述的抗体、如上文在“编码所述抗体的核酸和表达载体”章节中所述的核酸分子和/或表达载体、和/或如上文在“包含所述抗体的宿主细胞”章节中所述的宿主细胞，以及药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂。
治疗方法
在一个方面，还提供了治疗患有S100A4介导的病症的个体的方法，所述方法包括向有需要的个体施用如上文在“分离的抗S100A4抗体分子”章节中所述的抗体、如上文在“编码所述抗体的核酸和表达载体”章节中所述的核酸分子和/或表达载体、或如上文在“包含所述抗体的宿主细胞”章节中所述的宿主细胞。
在一些实施方案中，所述S100A4介导的病症是纤维化病症。
在一些实施方案中，所述纤维化病症是系统性硬化病。在一些实施方案中，所述纤维化病症是皮肤纤维化。在一些实施方案中，所述纤维化病症是肺间质纤维化。在一些实施方案中，所述纤维化病症是肝纤维化。在一些实施方案中，所述纤维化病症是肾脏纤维化。
将使用抗S100A4抗体的治疗与使用可用于治疗系统性硬化病的其他化合物的治疗组合可能是有益的。因此，在一些实施方案中，将所述抗体与用于治疗系统性硬化病的另一种化合物共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与血管紧张素转换酶抑制剂共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与血管紧张素受体阻断剂共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与硫唑嘌呤共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与钙通道阻断剂共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与环磷酰胺共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与羟氯喹共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与霉酚酸酯共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与甲氨蝶呤共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与糖皮质激素共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与磷酸二酯酶-5抑制剂共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与内皮素受体拮抗剂共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与α阻断剂共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与前列腺素类激素共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与利妥昔单抗共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与酪氨酸激酶抑制剂如尼达尼布共同施用。在一些实施方案中，将所述抗体与托珠单抗共同施用。
在一些实施方案中，所述S100A4介导的病症是炎性病症。在一些实施方案中，所述炎性病症是银屑病。在一些实施方案中，所述炎性病症是类风湿性关节炎。在一些实施方案中，所述炎性病症是炎性肌病。
在一些实施方案中，所述S100A4介导的病症是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是转移性癌症。
在一些实施方案中，所述癌症是胃癌。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是结直肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是甲状腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是头颈癌。在一些实施方案中，所述癌症是脑癌(包括多形性胶质母细胞瘤)。在一些实施方案中，所述癌症是肾细胞癌(包括肾透明细胞癌)。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，所述癌症是浆细胞瘤。在一些实施方案中，所述癌症是肉瘤。在一些实施方案中，所述癌症是神经胶质瘤。在一些实施方案中，所述癌症是胸腺瘤。在一些实施方案中，所述癌症是白血病。在一些实施方案中，所述癌症是结肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是食道癌。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，所述癌症是宫颈癌。在一些实施方案中，所述癌症是肝癌。
在一些实施方案中，将所述抗体、核酸分子、表达载体和/或宿主细胞通过肠胃外施用来施用。因此，在一些实施方案中，皮下施用所述抗体、核酸分子、表达载体和/或宿主细胞。在一些实施方案中，肌肉内施用所述抗体、核酸分子、表达载体和/或宿主细胞。在一些实施方案中，静脉内施用所述抗体、核酸分子、表达载体和/或宿主细胞。
在一些实施方案中，每周一次或更少施用所述抗体、核酸分子、表达载体和/或宿主细胞。在一些实施方案中，每周施用所述抗体，每周剂量在15mg至1000mg的范围内。
诊断或预后的方法
在一个方面，提供了用于对个体的S100A4相关病症进行诊断或预后的方法，所述方法包括
(a)使来自所述个体的生物样品与能够结合所述样品中存在的S100A4多肽的如本文所述的抗S100A4抗体接触；并且
(b)确定所述抗体分子与所述S100A4多肽之间形成的复合物的存在和/或量。
在一些实施方案中，所述生物样品是血液。在一些实施方案中，所述生物样品是血浆。在一些实施方案中，所述生物样品是血清。在一些实施方案中，所述生物样品是组织样品。在一些实施方案中，所述生物样品是间质组织液。在一些实施方案中，所述生物样品是唾液。在一些实施方案中，所述生物样品是脑脊液。在一些实施方案中，所述生物样品是滑膜。
实施例
实施例1-小鼠抗S100A4抗体的人源化
对小鼠单克隆IgG1抗S100A4抗体6B12(VH区和VL区分别如SEQ ID NO:54和SEQ IDNO:55定义)进行人源化。
序列分析和人源化变体比对
使用来自IMGT和Kabat的抗体编号系统标识6B12的VH和VL区的CDR。这两个编号系统将鼠抗体的不同残基标识为属于CDR，并且组合的IMGT/Kabat CDR序列用于CDR-环构象的最优保留。
最接近VH区的人种系基因V区标识为智人IGHV4-34*09。使用BLAST检索算法检索人IgG序列的数据库，以与鼠VH结构域比较，并且候选人可变结构域选自前200个BLAST结果。基于框架同源性的组合，将这些减少到每个四个候选者，保持关键框架残基和典型环结构。对于第五个受体序列，选择最接近的人种系IGHV4-34*09。
最接近VL区的人种系基因V区标识为智人IGKV1-27。同样地，使用BLAST检索算法检索人IgK序列的数据库，以与鼠VL结构域比较，并且候选人可变结构域选自前200个BLAST结果。基于框架同源性的组合，将这些减少到四个候选者，保持关键框架残基和典型环结构。对于第5个受体序列，选择最接近的人种系IGKV1-27。
然后将鼠VH和VL的CDR移植到这些受体框架中以产生5个人源化VH变体VH1-VH5(SEQ ID NO:13-17)和5个人源化VL变体VL1-VL5(SEQ ID NO:18-22)。
人源化检查
检查了人源化变体，以确定它们是否已根据WHO对人源化抗体的定义进行了人源化：人源化链的可变结构域具有如下V区氨基酸序列，从整体上分析，所述V区氨基酸序列更接近人而不是其他物种(使用Immunogenetics InformationDomainGapAlign工具评估)。
根据WHO对人源化抗体的定义，将所有变体分类为人源化。
重链和轻链的框架回复突变
分析了VL和VH区以寻找框架回复突变(以改善人源化抗体对其靶标的亲和力)的良好候选者。
这是通过检查鼠抗体中每个位置的氨基酸的频率来完成的，具体地是寻找频率非常低(如1％或更低)的氨基酸。进一步评价了这些氨基酸是否可能处于结构上重要的位置，并且这些氨基酸被认为是框架回复突变的潜在候选者。
对于VL区，L44(L)被标识为在此位置不常见(频率小于1％)。此位置已显示在VL/VH界面中很重要。在可能的亲本种系中，此位置是缬氨酸。这个位置最常见的是脯氨酸。这被认为是回复突变的良好候选者。尽管注意到5个人源化序列中的一个也具有此序列，但前面一个氨基酸L43(T)也被认为值得保留作为框架回复突变。在最接近的人种系序列中，这被标识为丙氨酸或缬氨酸。同样，L42(G)也被认为是框架回复突变的良好位置。
对于VH区，H43(S)处的氨基酸被认为是框架回复突变的良好候选者，因为它是VH/VL界面中的重要残基，并且因为此位置通常是赖氨酸、谷氨酰胺或精氨酸。同样，H40(F)和H44(K)也被认为是框架回复突变的良好位置，因为它们具有1％的频率。尽管没有在关键定义的位置严格考虑它们，但它们紧邻并且因此被认为是良好的候选者。
在实施例2中进一步描述了关于人源化抗体对S100A4的亲和力的框架回复突变结果。
实施例2-抗S100A4抗体与S100A4相互作用的动力学分析
使用表面等离子体共振(SPR)对14种人源化抗体和2种对照抗体与人S100A4二聚体之间的相互作用进行了定量动力学分析。
材料和方法
使用Biacore T200仪器在25℃的分析温度下以50μl/min的流速进行分析，以进行定量动力学相互作用分析。
分析缓冲液：10mM HEPES pH 7.4，300mM NaCl，1mM CaCl2，100μM EDTA，0.05％Tween 20
测定周期：
1.抗His捕获表面的制备
2.抗原(S100A4)的可逆捕获
3.MCK模式(0.78-200nM)抗体的定量分析
4.抗体-抗原复合物从捕获表面的完全去除
CM4传感芯片#2：
fc1：6878RU参考
fc2：6515RU捕获抗原(S100A4)
fc3：6804RU
fc4：6540RU
在此实验中分析了14种人源化抗体，其中一些在其VL和/或VH框架区中具有回复突变的特定氨基酸。每种抗体包含一个以下重链可变区(VH)：
VH0(SEQ ID NO:54)
VH1(SEQ ID NO:13)
VH1_H40Phe(SEQ ID NO:24)
VH1_H43Ser(SEQ ID NO:25)
VH1_H44Lys(SEQ ID NO:26)
每种抗体还包含一个以下轻链可变区(VL)：
VL0：(SEQ ID NO:55)
VL3(SEQ ID NO:20)
VL3_L42Gly(SEQ ID NO:45)
VL3_L43Thr(SEQ ID NO:46)
VL3_L44Leu(SEQ ID NO:47)
VL3_L42Gly+L44Leu
还分析了2种对照抗体：
6B12：如实施例1所述的小鼠单克隆IgG1抗S100A4
VH0VL0：人源化IgG4同种型框架中包含的6B12的VH和VL区。
结果和结论
分析结果可见于下表1。
表1-动力学数据汇总
所测试的14种抗体均具有与6B12抗体相似的解离常数，显示出与S100A4的高结合亲和力。然而，很明显，人源化轻链或重链中的一些特定框架回复突变对解离常数具有改善的作用。例如，VH1 VL3示出3.47E-09的Kd，而这被改进为VH1 VL3_L44Leu的2.25E-09和VH1VL3_L42Gly+L44Leu的1.99E-09。因此，一些手动设计的框架回复突变成功地增加了抗体与S100A4的亲和力。然而，重要的是要注意并非所有框架回复突变都增加了对S100A4的抗体亲和力，例如，VH1 VL3_L43Thr示出仅4.72E-09的Kd。
实施例3-人源化抗S100A4抗体在体内治疗博来霉素诱导的真皮纤维化中的功效
系统性硬化病(SSc)是具有高发病率和死亡率的系统性纤维化罕见病。SSc是所有自身免疫性风湿病中病例特异性死亡率最高的病症，其中超过一半的诊断为所述病症的病例最终死亡作为直接后果。所述疾病的标志是通过病理学激活的成纤维细胞实现的细胞外基质蛋白的积累。选择性抑制SSc中细胞外基质的异常释放的治疗方法迄今为止尚不可用。博来霉素诱导的真皮纤维化是最常用的SSc小鼠模型。它特别类似于SSc的早期炎症阶段。这里，我们的目的是评价人源化S100A4抗体在博来霉素诱导的皮肤纤维化中的作用。
材料和方法
抗体原液
AX-202作为人源化IgG4单克隆抗S100A4抗体用于本研究。所述抗体包含由SEQ IDNO:58定义的重链序列和由SEQ ID NO:59定义的轻链序列。将所述抗体溶解在PBS中并在-20℃下储存。
研究动物
对C57Bl/6小鼠进行实验。
动物数量：64
早期死亡：无
每只动物的总研究持续时间：6周
处理方案
将2mg/mL抗体原液在无菌PBS中稀释并以100μL体积腹膜内注射。
通过每天皮下注射博来霉素(2.5mg/kg，Sigma-Aldrich)在上背部的限定和标记区域(1cm2)诱导皮肤纤维化，持续长达六周。在用博来霉素预激发三周后开始处理，每周两次腹膜内(i.p.)注射或每周一次在尾静脉中静脉内(IV)注射。在第一次注射博来霉素后三周(第一次注射博来霉素后六周)分析结果。
研究设计和研究组
对照组中N＝8只小鼠，人源化抗体处理组中N＝10只小鼠
使用以下实验组：
第1组：对照/NaCl
第2组：博来霉素3周，NaCl 3周
第3组：博来霉素6周+NaCL最后3周(每3天腹膜内)
第4组：博来霉素6周+AX-202 16mg/kg最后3周(每周两次腹膜内)
第5组：博来霉素6周+AX-202 24mg/kg最后3周(每周静脉内尾静脉注射)
第6组：博来霉素6周+AX-202 8mg/kg最后3周(每周两次腹膜内)
研究实施
每天临床监测小鼠的行为、活动、毛皮质地和粪便稠度。处死后，对肺和皮肤进行肉眼宏观评价。
皮下增厚的量化
在通过颈椎脱位处死后，从肩胛骨之间的上背部的限定区域获得1cm2的皮肤样品。切离损伤皮肤区域，将其在4％福尔马林中固定6小时并包埋在石蜡中。切割5μm切片并将其用苏木精和伊红染色。通过以100倍放大率测量每只小鼠的损伤皮肤的在三个部位的表皮-真皮连接处与真皮-皮下脂肪连接处之间的距离来确定真皮厚度。
成肌纤维细胞的检测
成肌纤维细胞的特征在于α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)的表达。通过与单克隆抗αSMA抗体(克隆1A4,Sigma-Aldrich，德国施泰因海姆)一起孵育，在来自上背部的石蜡包埋载玻片中检测到αSMA阳性的成纤维细胞。用辣根过氧化物酶标记的二抗和3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)(Sigma-Aldrich)将表达可视化。单克隆小鼠IgG抗体(Calbiochem，美国加利福尼亚州圣地亚哥)用于对照。由不知情的评审员评价每个样品四个切片中的成肌纤维细胞来进行分析。
羟脯氨酸测定
经由羟脯氨酸测定来测定皮肤样品中胶原蛋白的量。在120℃下在6M HCl中消化来自上背部的全皮厚度穿孔活检物三小时后，用6M NaOH将样品的pH调节至6。然后，向每个样品中添加0.06M氯胺T，并在室温下孵育20min。接下来，添加3.15M高氯酸和20％对二甲氨基苯甲醛，并将样品在60℃下再孵育20min。用Spectra MAX 190微板分光光度计测定在557nm处的吸光度。
统计数据
所有数据表示为平均值±SEM，并使用graph pad 8通过单因素方差分析检验来测试各组之间的差异的统计学显著性。P值小于0.05被认为是显著的。P值表示如下：0.05>p>0.01为*；0.01>p>0.001为**；p<0.001为***，与用NaCl注射6周的对照小鼠相比。0.05>p>0.01为#；0.01>p>0.001为##；p<0.001为###，与注射博来霉素3周后再注射NaCl 3周的小鼠相比。
结果
真皮纤维化小鼠模型
在用博来霉素激发后，小鼠出现显著的真皮纤维化，其中与用博来霉素激发3周，然后再注射博来霉素溶剂NaCl 3周的小鼠相比，用博来霉素激发6周的小鼠的纤维化变化更显著。用NaCl注射6周的小鼠作为对照。
一般耐受性
用抗S100A4抗体AX-202处理是良好耐受的，且在临床检查、肉眼尸检或组织学上没有明显的毒性迹象。
功效结果
与用博来霉素注射6周的对照小鼠相比，用AX-202处理显著减少真皮增厚、成肌纤维细胞计数和羟脯氨酸含量(参见图1)。效应是剂量依赖性的，且在腹膜内16mg/kg和每周一次静脉内24mg/kg的剂量下观察到最显著的效应(参见图1A-图1C)。然而，每三天腹膜内8mg/kg也观察到AX-202的统计学显著效应。在腹膜内16mg/kg和静脉内24mg/kg的剂量下，与仅注射博来霉素三周的小鼠相比，AX-202还诱导纤维化消退以及真皮厚度和成肌纤维细胞计数的统计学上显著的变化。
结论
AX-202处理在耐受良好的剂量下显著改善了博来霉素诱导的皮肤纤维化、真皮增厚、成肌纤维细胞计数和羟脯氨酸。
实施例4-对体外S100A4诱导的细胞因子释放的影响
材料和方法
通过FicollPaque PLUS(GE Healthcare；11778538)密度离心从健康供体分离外周血单个核细胞(PBMC)，并且使用单核细胞分离试剂盒(StemCell Technologies；19359)分离单核细胞。
将单核细胞铺板(100,000个细胞/孔)到96孔板中并在以下物质的存在下培养6小时：
·培养基，
·媒介物1(0.074％ TBS)，
·LPS(1.0ng/ml；Invivogen；tlrl-b5lps)，
·S100A4(2.0μg/ml)，
·S100A4(2.0μg/ml)+媒介物2(3.2％ PBS)，
·媒介物1+小鼠IgG1(Biolegend；401407)，
·媒介物1+人IgG4(Biolegend；403701)，
·媒介物1+AX-202或6B12(各为32μg/ml)，
·S100A4(2.0μg/ml)+小鼠IgG1(8.0、16或32μg/ml)，
·S100A4(2.0μg/ml)+人IgG4(8.0、16或32μg/ml)，
·S100A4(2.0μg/ml)+AX-202(8.0、16或32μg/ml)，或
·S100A4(2.0μg/ml)+6B12(8.0、16或32μg/ml)。
6B12：如实施例1所述的小鼠单克隆IgG1抗S100A4抗体
AX-202：如实施例3所述的人源化单克隆IgG4抗S100A4抗体
培养6小时后，收集细胞培养上清液并在-20℃下储存以用于随后的细胞因子分析。根据制造商的说明书(R&D systems；LXSAHM-03)通过Luminex测定来量化上清液中细胞因子(IL-6、TNF-α和IL-10)的水平。
结果
与媒介物对照相比，用LPS(1.0ng/ml；阳性对照)或S100A4(2.0μg/ml)刺激单核细胞导致细胞培养上清液中测量的IL-6、TNFα和IL-10水平增加(参见图2和图3)。与同种型对照相比，在所有测试浓度下，AX-202或6B12降低了S100A4引起的IL-6和IL-10的增加(参见图2C-图2D和图3C-图3D)。与媒介物对照相比，小鼠IgG1或人IgG4同种型对照未增加S100A4诱导的TNFα水平(参见图4A-图4B)，然而6B12而不是AX-202显著增加S100A4诱导的TNFα水平，并且由6B12诱导的增加显示剂量依赖性趋势(参见图4C-图4D)。
结论
如所预期的，S100A4引起IL-6、TNFα和IL-10水平增加(参见图2-图4)。AX-202和6B12均降低了S100A4引起的IL-6和IL-10释放(参见图2C-图2D和图3C-图3D)。
重要的是，与单独S100A4相比，小鼠IgG1对照、人IgG4对照或AX-202与S100A4的组合没有导致TNFα水平的显著增加(参见图4A-图4B)。相比之下，通过用6B12抗体处理以剂量依赖性方式增加S100A4诱导的促炎性细胞因子TNFα的水平而增加(参见图4C和图4D)。
这表明，出人意料地，与小鼠抗S100A4抗体6B12相比，人源化抗S100A4 IgG4抗体不增加S100A4诱导的促炎性TNFα水平。
尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和实施例的方式详细地描述了前述发明，但是描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。
上述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本公开文本。然而应理解的是，不管文本中显现以上所述如何详细，仍可以以许多方式来实现本公开文本，并且应该根据所附权利要求及其任何等同物来解释本公开文本。
实施例5-人源化抗S100A4抗体显示对其他S100家族成员无交叉反应性并且对来 自多个物种的S100A4具有特异性
通过蛋白质印迹测试了不同人源化变体(VH1_40Phe:VL3、VH1:VL3_Leu44和VH1_40Phe:VL3_Leu44)选择性地与S100A4反应的能力。所有变体均检测到小鼠和人S100A4蛋白，并且未与其他S100家族成员发生交叉反应(参见图5)。
为了确认相同的人变体识别S100A4蛋白的特异性并且排除变体不与随机细胞蛋白发生交叉反应，使用野生型(wt)和S100A4敲除(ko)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行荧光显微镜实验。IF染色表明6B12的所有三个人源化变体(Phe40、Leu44和Phe40/Leu44)均不与ko-成纤维细胞的蛋白质发生交叉反应，而wt MEF示出S100A4的典型核周细胞质染色(参见图6)。
此结果与显示6B12仅识别S100A4的早期结果(等人，2012)一致。此外，未观察到对与表位序列具有最高同源性的S100A2和与所有S100家族成员具有最高整体同源性的S100A5的交叉反应性。
如实施例3所述，AX-202还显示在4个不同物种(猴子、大鼠、人和小鼠)中以相似的亲和力与S100A4结合。
实施例6-人源化抗S100A4抗体减少S100A4诱导的炎症途径激活
将HEK-Blue hTLR4(InvivoGen，#hkb-htlr4)细胞在HEK-Blue检测培养基(InvivoGen，#hb-det2)中孵育，并且用渐增浓度的重组人S100A4多聚体或1.25ng/ml LPS-EK超纯(阳性对照；InvivoGen，#tlrl-peklps)刺激。孵育20h后，通过读取在620nm处的OD来确定NF-kB诱导的分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平。S100A4显示以浓度依赖性方式清楚地激活HEKBlue hTLR4细胞中的NF-kB报告基因(参见图7A)。
将HEK-Blue hTLR4和HEK-Blue Null2(对照，InvivoGen，#hkb-null2)细胞在HEK-Blue检测培养基中孵育，并且用1.25ng/ml LPS-EK超纯(InvivoGen，#tlrl-peklps)、1.25或2.5μg/ml S100A4刺激。将用50ng/ml TNF-α(InvivoGen，#rcyc-htnfa)处理的细胞用作HEK-Blue Null2细胞激活的阳性对照。NF-kB报告基因的S100A4激活显示为依赖于TLR4，因为即使添加了S100A4，报告基因的激活在Null2细胞中也被完全消除(参见图7B)。
将HEK-Blue hTLR4细胞在HEK-Blue检测培养基中孵育，并且用仅1.25μg/mlS100A4和渐增浓度的S100A4中和抗体AX-202刺激(描述在实施例3中)。报告基因的LPS激活不受AX-202的影响，然而AX-202显示以浓度依赖性方式抑制S100A4诱导的TLR4激活(参见图7C)。
实施例7-通过人源化抗体的IgG亚类转换改变FcR介导的效应子功能
我们对亚类转换是否会影响FcγRIIa激活(这可能会影响治疗功效)特别感兴趣。FcγRIIa是对单个“单体”IgG分子具有低亲和力但对含IgG的IC具有高亲合力的活化FcγR(Arman等人，2015)。
在白细胞中，FcγRIIA的接合启动了对免疫和炎症反应而言关键的强效应子功能(包括细胞因子释放和ADCC(抗体依赖性细胞毒性))，这可能会对抗体-药物的安全性特征产生负面影响。此外，在人血小板上，FcγRIIa在肝素诱导的血小板减少症中起作用，这是一种充分证明的促血栓不良药物作用(Sun等人，2013)。
此项研究旨在研究从亲本6B12抗体的小鼠IgG1到AX-202的人IgG4的亚类转变是否影响对FcγRIIa的结合亲和力。抗体-免疫复合物对FcγRIIA的结合亲和力更低可表明安全性特征更好。
材料和方法
FcYRIIA报告物测定
在测定缓冲液中制备3倍最终抗原(S100A4)浓度和3倍最终抗体浓度，并且将各自25μl添加到96孔板中的适当孔中，并且在37℃下孵育15-25分钟。解冻适当数量的细胞并且将其转移到测定缓冲液中。在25μl测定缓冲液中，每孔接种50000个细胞，以具有75μl/孔的最终体积。将板用盖子覆盖并且在37℃和5％ CO2下孵育18小时。孵育后，将测定板从孵育器中取出并且平衡至环境温度(22℃-25℃)持续15分钟。将50μl的Bio-GloTM试剂添加至每个测定板中，然后在室温下孵育15分钟。使用发光读板仪测量发光(参见方案章节10.01)。
结果分析
数据点被导入到Prism Graph Pad(版本是9.1.0)中，并且使用非配对t检验(双尾)分析。当基于n＝3的P<0.05时，星号展示显著的相关性。
生物活性
所有测定均使用阴性和阳性对照细胞进行，以比较受体激活。所有阳性和阴性对照均显示出预期的结果。
结果
通过IgG亚类转换改变FcR介导的效应子功能
先前获得的结果已显示，鼠IgG1 6B12和具有其人IgG4支架的AX-202可以抑制单核细胞中S100A4诱导的细胞因子释放。用S100A4刺激单核细胞诱导细胞培养上清液中的IL-6、TNFα和IL-10的水平。AX-202和6B12二者都阻断S100A4刺激的IL-6和IL-10增加，但是引发了TNFα的反常增加。这可表明由寡聚S100A4和抗体(6B12)构成的免疫复合物通过FcγR触发TNFα释放。
因此，IgG亚类的选择会对不需要的细胞因子释放产生重大影响。为了测试这种可能性，我们进行了FcγRIIA报告物测定，并且评估了不同抗体诱导FcγR依赖性启动子活性的强烈程度。
从人IgG1到IgG4的IgG类转换显著减少抗原特异性FcγRIIa激活
采用来自Promega的FcγRIIa-H ADCP报告物生物测定测量Ab-Ag复合物激活FcγRIIa在效力方面的抗体亚型差异。该测定由稳定表达人FcγRIIa-H(高亲和力H131变体)的人Jurkat细胞和NFAT诱导的萤光素酶组成。这项研究包括两种不同的携带来自1类或4类的hIgG的AX-202抗体。此外，研究包括亲本小鼠抗体6B12 IgG1。结果描绘在图8中。通过将抗体与二聚体(A)或多聚体S100A4蛋白(B)混合形成免疫复合物(IC)。
与AX-202hIgG4相比，AX-202hIgG1的受体簇集显著更高，在S100A4-D和S100A4-M的情况下的受体激活倍数差异分别为5.00和3.83(参见图8)。具有小鼠IgG1支架的6B12与其人对应物(AX-202hIgG1)相比具有更低的诱导IC依赖性FcγRIIa的效力。然而，与AX-202hIgG4相比，6B12仍然显示出3.23倍(二聚体)和2.87倍(多聚体)的激活。IgG1和IgG4对照抗体均不介导受体簇集，表明Ab-Ag IC的形成对于FcγRIIa簇集和激活很重要。
结论
最近发现抗体通过诱导细胞分化、激活和细胞因子释放来介导炎症和免疫调节(Avan Erp等人，2019)。这会导致不需要的促炎性途径激活并且抵消治疗性S100A4抗体的作用模式。在这里，我们发现具有IgG4支架的S100A4中和抗体与具有人IgG1支架的相同抗体相比具有更好的安全性特征，诱导FcγR激活的效力为大约三分之一。
序列概述
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参考文献
本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用以其全文并入。
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<211> 6
<212> PRT
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
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Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
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65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
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Lys Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Arg Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Val Thr Ser Met Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
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Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Ile Ala His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
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Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
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Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
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Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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<400> 21
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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<220>
<221> 尚未归类的特征
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<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(101)
<223> 人S100A4 （蛋白）氨基酸 1 至 101
<400> 23
Met Ala Cys Pro Leu Glu Lys Ala Leu Asp Val Met Val Ser Thr Phe
1 5 10 15
His Lys Tyr Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys Phe Lys Leu Asn Lys Ser
20 25 30
Glu Leu Lys Glu Leu Leu Thr Arg Glu Leu Pro Ser Phe Leu Gly Lys
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Arg Thr Asp Glu Ala Ala Phe Gln Lys Leu Met Ser Asn Leu Asp Ser
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Asn Arg Asp Asn Glu Val Asp Phe Gln Glu Tyr Cys Val Phe Leu Ser
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Cys Ile Ala Met Met Cys Asn Glu Phe Phe Glu Gly Phe Pro Asp Lys
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100
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Leu Ser Met Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp
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Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
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Lys Asn Arg Leu Ser Met Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 26
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Leu Ser Met Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2_H40Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Arg Asn Gln Phe Ser
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Leu Lys Val Thr Ser Met Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2_H43Ser
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp
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Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
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Lys Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Arg Asn Gln Phe Ser
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Leu Lys Val Thr Ser Met Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2_H44Lys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp
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Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
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115 120
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH3_H40Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH3_H43Ser
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH3_H44Lys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 32
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH4_H40Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH4_H43Ser
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 34
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH4_H44Lys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH5_H40Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH5_H43Ser
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 38
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH5_H44Lys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(120)
<223> 抗体区
<400> 38
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1_L42Gly
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gly Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1_L43Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL1_L44Leu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Leu Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2_L42Gly
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2_L43Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2_L44Leu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Leu Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL3_L42Gly
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL3_L43Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL3_L44Leu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Leu Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL4_L42Gly
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 48
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL4_L43Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 49
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL4_L44Leu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 50
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Leu Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL5_L42Gly
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL5_L43Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL5_L44Leu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> 抗体区
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Leu Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH区6B12单克隆抗体（氨基酸序列）前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(18)
<223> 前导序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (49)..(54)
<223> CDR1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (69)..(84)
<223> CDR2
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (117)..(127)
<223> CDR3
<400> 54
Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile
1 5 10 15
Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
20 25 30
Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Phe Thr
35 40 45
Asn Asp Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Ser Lys Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Phe Leu Arg Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130 135
<210> 55
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL区6B12单克隆抗体（氨基酸序列）前导序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(20)
<223> 前导序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (44)..(54)
<223> CDR1
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (70)..(76)
<223> CDR2
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (109)..(117)
<223> CDR3
<400> 55
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gly Thr Leu
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
100 105 110
Ser Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 56
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(326)
<223> IgG4 CH
<400> 56
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(107)
<223> k 轻链恒定区 (CL)
<400> 57
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 58
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AX-202 完整重链
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(446)
<223> 抗体区
<400> 58
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Phe Thr Asn Asp
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly His Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Leu Ser Met Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 59
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AX-202 完整轻链
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(214)
<223> 抗体区
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Leu Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (51)

1.一种分离的抗体，所述分离的抗体包含：
a)重链可变(VH)区，所述重链可变区包含：
i.重链互补决定区1(CDR-H1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成；
ii.重链互补决定区2(CDR-H2)，所述重链互补决定区2包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成；和
iii.重链互补决定区3(CDR-H3)，所述重链互补决定区3包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:6的氨基酸序列或由其组成；
以及
b)轻链可变(VL)区，所述轻链可变区包含：
i.CDR-L1，所述CDR-L1包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成；
ii.CDR-L2，所述CDR-L2包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成；和
iii.CDR-L3，所述CDR-L3包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成；
其中，所述VH区包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:13至17中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中不是如SEQ ID NO:1至6所定义的CDR序列的部分的任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变，
和/或其中，所述VL区包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:18至22中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中不是如SEQ ID NO:7至12所定义的CDR序列的部分的任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述重链可变(VH)区包含：
(a)重链互补决定区1(CDR-H1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成；
(b)重链互补决定区2(CDR-H2)，所述重链互补决定区2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成；和
(c)重链互补决定区3(CDR-H3)，所述重链互补决定区3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成；
并且其中包含轻链可变(VL)区的轻链可变(VL)区包含：
i.轻链互补决定区1(CDR-L1)，所述轻链互补决定区1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成；
ii.轻链互补决定区2(CDR-L2)，所述轻链互补决定区2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成；和
iii.轻链互补决定区3(CDR-L3)，所述轻链互补决定区3包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述重链可变(VH)区包含：
(a)重链互补决定区1(CDR-H1)，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成；
(b)重链互补决定区2(CDR-H2)，所述重链互补决定区2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成；和
(c)重链互补决定区3(CDR-H3)，所述重链互补决定区3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成；
并且其中包含轻链可变(VL)区的轻链可变(VL)区包含：
i.轻链互补决定区1(CDR-L1)，所述轻链互补决定区1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成；
ii.轻链互补决定区2(CDR-L2)，所述轻链互补决定区2包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成；和
iii.轻链互补决定区3(CDR-L3)，所述轻链互补决定区3包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成。
4.一种分离的抗体，所述分离的抗体包含：
(a)重链可变(VH)区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:13至17中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变，以及
(b)轻链可变(VL)区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:18至22中任一个的变体的氨基酸序列或由其组成，其中任一个氨基酸已改变为另一个氨基酸，条件是不多于5个氨基酸已如此改变，例如其中每个氨基酸序列中有5、4、3、2或1个氨基酸已如此改变。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体选自全长抗体、Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、scFv、双抗体和三抗体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是选自人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4的免疫球蛋白亚类抗体。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人IgG4免疫球蛋白亚类抗体。
9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述抗体包含人重链恒定(CH)区和人轻链恒定(CL)区，所述人重链恒定区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:56中所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的所述序列的变体，所述人轻链恒定区包含以下或由以下组成：SEQID NO:57中所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的所述序列的变体。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含具有突变的人IgG恒定区的Fc结构域。
11.根据权利要求10所述的抗体，其中所述抗体包含突变体人IgG4重链恒定区。
12.根据权利要求11所述的抗体，其中所述突变体人IgG4重链恒定区包含根据EU编号进行编号的S228P取代。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
(a)在SEQ ID NO:13至17中任一个的VH区的位置40处的氨基酸变为苯丙氨酸的氨基酸取代，在SEQ ID NO:13至17中任一个的VH区的位置43处的氨基酸变为丝氨酸的氨基酸取代，和/或在SEQ ID NO:13至17中任一个的VH区的位置44处的氨基酸变为赖氨酸的氨基酸取代；和/或
(b)在SEQ ID NO:18至22中任一个的VL区的位置42处的氨基酸变为甘氨酸的氨基酸取代，在SEQ ID NO:18至22中任一个的VL区的位置43处的氨基酸变为苏氨酸的氨基酸取代，和/或在SEQ ID NO:18至22中任一个的VL区的位置44处的氨基酸变为亮氨酸的氨基酸取代。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述VH区包含选自SEQ ID NO:24至38的VH区或由其组成。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述VL区包含选自SEQ ID NO:39至53的VL区或由其组成。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:24(VH1_H40Phe)或由其组成，并且所述VL区包含SEQ ID NO:47(VL3_L44Leu)或由其组成。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:24(VH1_H40Phe)或由其组成，并且所述VL区包含SEQ ID NO:20(VL3)或由其组成。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:26(VH1_H44Lys)或由其组成，并且所述VL区包含SEQ ID NO:20(VL3)或由其组成。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:13(VH1)或由其组成，并且所述VL区包含SEQ ID NO:47(VL3_L44Leu)或由其组成。
20.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:13(VH1)或由其组成，并且所述VL区包含SEQ ID NO:20(VL3)或由其组成。
21.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是聚乙二醇化的。
22.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够结合天然构象S100A4蛋白。
23.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够结合S100A4蛋白的二聚体、寡聚体和/或多聚体形式。
24.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够结合与如SEQ ID NO:23中所示的氨基酸1至101具有至少80％序列同一性的多肽。
25.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够结合SEQ ID NO:23的人S100A4多肽。
26.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中向受试者施用所述抗体导致减少的或没有S100A4依赖性的FcγIIaR簇集和激活。
27.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中向受试者施用所述抗体导致TNFα减少或不增加。
28.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够减少S100A4介导的纤维化。
29.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够中和S100A4的生物活性。
30.根据权利要求29所述的抗体，其中S100A4的所述生物活性是促进肿瘤进展和/或诱导肿瘤转移。
31.根据权利要求30所述的抗体，其中所述抗体能够抑制S100A4在促进肿瘤进展和/或诱导肿瘤转移和/或炎症方面的生物活性。
32.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够抑制由S100A4介导的T细胞募集。
33.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够抑制由S100A4介导的巨噬细胞募集和/或浸润。
34.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够抑制S100A4蛋白在刺激细胞侵袭中的生物活性。
35.根据权利要求34所述的抗体，其中在3D Matrigel基质测定或T细胞侵袭测定中测定S100A4蛋白在刺激细胞侵袭方面的生物活性，其中S100A4刺激T细胞浸润至成纤维细胞单层中，或其中在体内小鼠异种移植模型中测定S100A4在诱导肿瘤转移方面的生物活性。
36.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据权利要求1至35中任一项所述的抗体。
37.根据权利要求36所述的核酸分子，其中将所述核酸分子针对表达细胞进行密码子优化。
38.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求36或37所述的编码抗S100A4抗体分子的核酸分子。
39.根据权利要求38所述的表达载体，其中所述核酸分子可操作地连接至控制序列以指导其表达。
40.一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含根据权利要求36所述的分离的核酸分子或根据权利要求38或39中任一项所述的表达载体。
41.根据权利要求40所述的分离的宿主细胞，其中所述细胞是人细胞。
42.根据权利要求40所述的分离的宿主细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
43.一种产生抗S100A4抗体分子的方法，所述方法包括在其中表达所述抗体的条件下培养根据权利要求40至42中任一项所述的宿主细胞。
44.根据权利要求43所述的方法，所述方法进一步包括纯化所述抗体并且分离由此产生的所述抗S100A4抗体。
45.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至35中任一项所述的抗体、根据权利要求36或37所述的核酸分子、根据权利要求38或39所述的表达载体和/或根据权利要求40至42中任一项所述的宿主细胞，以及药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂。
46.一种治疗患有S100A4介导的病症的个体的方法，所述方法包括向有需要的个体施用根据权利要求1至35中任一项所述的抗体、根据权利要求36至39中任一项所述的核酸或表达载体、或根据权利要求40至42中任一项所述的宿主细胞。
47.根据权利要求46所述的治疗方法，其中所述S100A4介导的病症是癌症或炎性病症。
48.根据权利要求47所述的治疗方法，其中所述癌症是转移性癌症或所述炎性病症是银屑病、类风湿性关节炎或炎性肌病。
49.根据权利要求47或48所述的治疗方法，其中所述癌症是胃癌、胰腺癌、结直肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌(包括多形性胶质母细胞瘤)、肾细胞癌(包括透明细胞肾癌)、黑色素瘤、淋巴瘤、浆细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、白血病、结肠癌、食道癌、卵巢癌、宫颈癌或肝癌。
50.一种用于对个体的S100A4相关病症进行诊断或预后的方法，所述方法包括
(a)使来自所述个体的生物样品与能够结合所述样品中存在的S100A4多肽的根据权利要求1至35中任一项所述的抗S100A4抗体接触；并且
(b)确定所述抗体分子与所述S100A4多肽之间形成的复合物的存在和/或量。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述生物样品是血液、血浆、血清、组织样品、间质组织液、脑脊液、滑膜或唾液。
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