CN117480177A - 新型fgf21变体的开发及其生产技术和用途 - Google Patents

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郑艺恩
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丁宝京
郑然朱
姜府炅
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尹韶姸
李廷贤
任亨淳
李卿源
安泳俊
权改劲
姜成均
李贤淑
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Abstract

涉及一种新型FGF21变体的开发及其生产方法或纯化方法。根据本申请一具体实施例的新型FGF21变体的信号传递活性能相比于野生型增加了约6倍，并且所述变体可以被评估为作为生物改良剂(biobetter)的有价值的药物候选物质。

Description

新型FGF21变体的开发及其生产技术和用途
技术领域
本申请要求于2021年6月10日提交的韩国专利申请No.10-2021-0075460的优先权，并且上述说明书的全部内容为本申请的参考文献。
涉及一种新型FGF21变体的开发及其生产方法或纯化方法。
背景技术
源自哺乳动物的成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)是通过与细胞膜上存在的受体的胞外域(ectodomain)结合来激活细胞质中存在的相应受体的酪氨酸激酶结构域(tyrosine kinase domain)，从而调节糖/脂质代谢、细胞分化和增殖等的蛋白。FGF家族由结构相似的22种蛋白构成，并分为7个亚家族。
其中，属于5个亚家族(FGF1、FGF4、FGF7、FGF8和FGF9亚家族)的FGF在与受体结合时需要肝素或硫酸乙酰肝素。在细胞表面或细胞外基质上存在的肝素/硫酸乙酰肝素是一种属于糖胺聚糖(GAG)家族的带(-)电荷的多糖类，其通过与各种蛋白进行相互作用来调节其功能。具有对于肝素/硫酸乙酰肝素的高结合力的FGF作用为停留在分泌细胞附近并发挥生理活性的旁分泌(paracrine)。
FGF21是在哺乳类中由FGF21基因编码的蛋白，其属于包括FGF23和FGF15/19的内分泌亚家族。FGF21是由共受体FGF受体1c和β-Klotho构成的FGF21受体的主要内源性激动剂(agonist)。
FGF21最近作为各种治疗剂的有效成分而被广泛研究。具体地，在2019年7月，柳韩洋行与德国的跨国制药公司即勃林格殷格翰签署许可协议，目的在于开发非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)治疗剂，所述治疗剂是设计为其中FGF21和胰高糖素样肽-1(GLP-1，glucagon like peptide-1)融合的双重激动剂(dual agonist)。目前，已知该物质的非临床毒性试验研究已经完成，并以进入临床试验的目标正在进行共同研究。另外，作为跨国制药公司的Merck&Co.,Inc.也以NASH治疗的目的正在开发在β-Klotho/FGFR1c复合物中作用的单克隆抗体治疗剂MK-3655，已知FGF21作为糖尿病和NASH治疗剂的新药候选物质在国内外制药行业市场中备受注目。
此外，正在研究FGF21施用对脑、骨、胰腺、肝脏等的各种药理效果，使用FGF21作为有效成分的治疗剂的应用范围有望逐渐扩大。
因此，本发明人努力不懈以开发具有改善的活性的FGF21变体，结果开发出相比于野生型其信号传递活性能增加了约6倍的变体，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
一方面涉及一种新型FGF21变体及其生产方法。
然而，本申请要解决的问题不限于上述问题，
并且普通技术人员可以从以下的描述明确地理解未提及的其他问题。
技术方案
一发明提供一种包括FGF21变体的多肽，其特征在于，所述变体为在野生型FGF21中包括一个或多个突变。
另一方面提供一种生产FGF21变体的方法，其包括培养生产FGF21变体的转化基因生物的步骤、以及将所述转化基因生物或培养液加热至40℃或更高温度的步骤。
另一方面提供一种FGF21变体的纯化方法，其包括将包括FGF21变体和杂质的混合物加热至40℃或更高的温度的步骤。
另一方面提供一种由上述方法制造的FGF21变体。
另一方面提供一种用于治疗代谢障碍或心血管障碍的药物组合物，其包括所述FGF21变体。
另一方面提供一种治疗代谢障碍或心血管障碍的方法，其包括将所述药物组合物施用于个体中的步骤。
另一方面提供一种所述药物组合物在治疗代谢障碍或心血管障碍中的用途。
有益效果
根据一实施例的新型FGF21变体的信号传递活性能相比于野生型增加了约6倍，并且所述变体可以被评估为作为生物改良剂(biobetter)的有价值的药物候选物质。
附图说明
图1为示出hFGF21和wFGF21的序列比较分析结果的图，其中，阴影表示两个序列的C-末端尾部中具有特异差异的序列。
图2为示出hFGF21CT和β-Klotho复合物的X射线结晶结构(PDB代码：5VAQ)分析结果的图，其放大显示在hFGF21CT结构中对应于变体设计策略①、②的序列。
图3为示出FGF21野生型序列和变体序列的图。
图4为示出在对过表达Trx-FGF21变体的上清液进行热处理前后的SDS-PAGE分析结果(左)以及对于最终纯化的FGF21变体③进行的SDS-PAGE分析结果(右)的图。
图5为示出对市售FGF21野生型和经热处理且纯化的FGF21 N4的活性进行比较的数据的图。
图6为示出FGF21野生型和变体①、②和③对3T3L1脂肪细胞的体外细胞测定(invitro cell assay)数据的图。
图7为示出根据FGF21野生型和变体①、②和③的浓度的FGFR1c激活实验数据的图。
具体实施方式
在下文中，将参照附图对本申请的实施例进行详细描述，以使本申请所属技术领域中的普通技术人员可以容易地实施。然而，本申请可以实现为各种不同的形式，并不限于在此描述的实施例。并且，为了在附图中明确地说明本申请，省略了与说明无关的部分，并且在整个说明书中，类似的部分被赋予类似的附图标记。
在整个说明书中，当某部分被称为与另一部分“连接”时，这不仅包括“直接连接”的情况，还包括中间具有其他接头等的物质的“间接连接”的情况。
在整个说明书中，当某部分被称为“包括”某构成要素时，除非有相反的明确说明，这意味着还可以包括其他构成要素，而不是排除其他构成要素。在整个说明书中所使用的程度术语“约”、“实际上”等用于表示当提出数值中固有的制造和物质容忍公差时等于该数值或接近该数值的意义，并且用于防止不合理的侵权者不当地使用其中提及有用于帮助理解本申请的精确或绝对的数值的公开内容。在整个说明书中所使用的程度术语“～(进行的)步骤”或“～的步骤”并不是指“用于～的步骤”。
在整个说明书中，马库什式表示中所包括的术语“其组合”是指选自由马库什式表示中记载的构成要素组成的组中的一个或多个混合或组合，其指包括选自由所述构成要素组成的组中的一个或多个。
在整个说明书中，“和/或B”的记载是指“或B、或A和B”。
在下文中，将参照附图详细地说明本申请的具体实施例和实施例。然而，本申请可以不限于这些具体实施例、实施例和附图。
一发明提供一种包括FGF21变体的多肽，其特征在于，所述变体为在野生型FGF21中包括一个或多个突变。
在整个说明书中所使用的术语“成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growthfactor 21，FGF21)”是由209个氨基酸组成的蛋白，在其中信
号肽(1-28aa)被去除的成熟形式(29-209aa)的情况下，具有与旁分泌FGF
蛋白相比对肝素/硫酸乙酰肝素的低结合力，因此能够远离分泌细胞附近而沿着血液移动。由于这些特性，FGF21用作通过到达远距离靶标来发挥生理活性的内分泌(endocrine)激素。FGF21与作为在细胞表面上存在的FGF受体之一的FGFR1c和辅因子β-Klotho蛋白同时作用在复合物中。肝素/硫酸乙酰肝素存在于所有细胞中，相反β-Klotho主要分布在脂肪组织、肝脏和胰腺中。因此，FGF21通过影响表达FGFR1c和β-Klotho的细胞的活性来调节葡萄糖和脂质代谢。例如，FGF21被报道具有改善诸如2型糖尿病和脂肪肝等的代谢性疾病的效果，特别地，FGF21已显现为在开发诸如非酒精性脂肪肝疾病和非酒精性脂肪性肝炎的脂质代谢异常疾病的治疗剂中作为重要候选物质。
在整个说明书中所使用的术语“FGF21变体”是指包括在野生型(wild type)FGF21的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失或添加的形式的改变的变体。在本说明书中，“FGF21变体”可以与“FGF变体蛋白”互换使用。
在一具体实施例中，所述多肽可以包括FGF21变体，具体地，可以由FGF21变体构成。
在一具体实施例中，所述野生型FGF21蛋白可以是其中信号肽已被去除的成熟形式(mature form)，具体地，可以是其中在由SEQ ID NO：1构成的FGF21蛋白中去除作为信号肽的第1个至第28个的氨基酸，并由第29个至第209个氨基酸构成的，更具体地，可以包括SEQ ID NO：2的氨基酸。
在一具体实施例中，所述FGF21变体可以是其中N-末端的1至4个氨基酸被缺失的。
在一具体实施例中，所述FGF21变体可以是其中选自由Q184、S195、P199、S200、Q201和A208组成的组中的一个或多个氨基酸被另一氨基酸取代的，具体地，可以被20个氨基酸(Q、E、G、A、S、T、C、V、L、I、M、P、F、Y、W、D、N、H、K、和R)中的一个取代。
在一具体实施例中，所述FGF21变体可以被选自由Q184E、S195G、P199G、S200G、Q201H和A208T组成的组中的一个或多个取代，具体地，可以被S195G、P199G、S200G、Q201H和A208T取代。
在一具体实施例中，S195G取代可以是SEQ ID NO：2的第167个氨基酸(丝氨酸)被甘氨酸取代，P199G取代可以是SEQ ID NO：2的第171个氨基酸(脯氨酸)被甘氨酸取代，S200G取代可以是SEQ ID NO：2的第172个氨基酸(丝氨酸)被甘氨酸取代，Q201H取代可以是SEQ ID NO：2的第173个氨基酸(谷氨酰胺)被组氨酸取代，且A208T取代可以是SEQ ID NO：2的第180个氨基酸(丙氨酸)被苏氨酸取代。
在一具体实施例中，所述FGF21变体可以是SEQ ID NO：3至6的氨基酸序列中的一个。
在一具体实施例中，所述FGF21变体可以具有相比于野生型改善的活性，具体地，其信号传递活性能可以相比于野生型提升了约6倍。
另一方面提供一种生产FGF21变体的方法，其包括培养生产FGF21变体的转化基因生物的步骤、以及将所述转化基因生物或培养液加热至40℃或更高温度的步骤。与包括所述FGF21变体的多肽重复的内容同样适用于所述FGF21变体的生产方法。
在一具体实施例中，所述FGF21变体可以包括含有SEQ ID NO：3至6的氨基酸序列中的一个或多个的多肽，具体地，可以包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
根据一实施例，不仅包括由FGF21第41个至第173个氨基酸序列组成的β-三叶主体结构的野生型FGF21，而且预测包括所述β-三叶主体结构的各种变体在40℃至100℃或更高的温度中不会变性或沉淀，确认了其在热处理后重新冷却时保持了原本的蛋白结构，并确认了在这样的重新冷却后，FGF21的生理活性也被保持，因此可以得知其具有优异的热稳定性/热弹性。
在一具体实施例中，所述转化基因生物可以包括编码FGF21变体的多核苷酸，具体地，可以包括基因构建体或重组载体，其包括编码FGF21变体的多核苷酸。
在一具体实施例中，生产所述FGF21变体的转化基因生物包括基因构建体或重组载体，其包括编码FGF21的多核苷酸，从而可以表达FGF21变体。
在整个说明书中所使用的术语“重组载体(recombinant vector)”是指可以表达由插入载体的异源核酸编码的肽或蛋白的载体，优选地，其是指制造成包括编码FGF21蛋白的多核苷酸的载体。所述“载体”是指用于将碱基导入和/或转移到试管中、活体内或体内宿主细胞中的任何媒介物，其可以是通过与另一DNA片段结合来可以造成所结合的片段的复制的复制(replicon)单位，“复制单位”是指在活体内用作DNA复制的自主单位，即能够在自己的控制下进行复制的任意基因单位(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、和病毒等)。
所述重组载体或重组表达载体可以优选地包括作为其中与RNA聚合酶结合的转录起始因子的启动子(promoter)、用于调节转录的任意操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和调节转录和翻译终止的序列、和终止子等，更优选地可以进一步包括用于增加蛋白的合成量的M17的5'UTR位点基因、和用于最小化蛋白降解以使得蛋白可以稳定地维持在内质网中的HDEL基因等，更优选地可以进一步包括用于增加重组蛋白的生产量的标签用基因、用于维持重组蛋白的结构稳定性的标签用基因、用于容易分离重组蛋白的标签用基因、和用于选择转化基因生物的抗生素抗性基因等的选择用标记基因等，用于容易分离的标签可以代表性地包括Avi标签、钙调蛋白(Calmodulin)标签、聚谷氨酸(polyglutamate)标签、E标签、、FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、IgC-Fc标签、CTB标签、Softag 1标签、Softag 3标签、Strep标签、TC标签、V5标签、VSV标签、和Xpress标签等，所述选择用标记基因可以代表性地包括诸如草甘膦(glyphosate)或草丁膦(phosphinothricin)的除草剂抗性基因、诸如卡那霉素(kanamycin)、G418、博莱霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、和氯霉素(chloramphenicol)的抗生素抗性基因、以及aadA基因等，所述启动子可以代表性地包括pEMU启动子、MAS启动子、组蛋白启动子、Clp启动子、源自花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的35S启动子、源自花椰菜花叶病毒的19S RNA启动子、植物肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子、猿猴病毒40(Simian virus 40，SV40)启动子、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)启动子、和人延长因子-1α(Elongationfactor-1alpha，EF-1α)启动子等，所述终止子可以代表性是胭脂碱合酶(NOS)、米淀粉酶RAmy1 A终止子、菜豆蛋白终止子、根癌农杆菌的蟑肉碱(Octopine)基因的终止子、和大肠杆菌的rrnB1/B2终止子等，添加的基因的类型没有限制，只要是已经用于生产重组蛋白的类型即可。
在整个说明书中所使用的术语“转化(transformation)”是指通过所注射的DNA改变生物的基因性质的统称，“转化基因生物(transgenic organism)”是指通过分子基因学方法注入外源基因来制造的生物体，优选地是通过本发明的重组表达载体转化的生物体。只要所述生物体是诸如微生物、真核细胞、昆虫、动物、植物等活的生物体，则没有限制，优选地，可以是大肠杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、酵母、动物细胞、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、马、牛、根癌农杆菌、植物等，但不限于此。所述转化基因生物可以通过转化(transformation)、转染(transfection)、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、粒子枪轰击(particle gunbombardment)、超声处理法(sonication)、电穿孔法(electroporation)、聚乙二醇(PEG，Polyethylene glycol)介导的转化等方法来制造，但只要是可以注入载体的方法，则没有限制。
在一具体实施例中，所述FGF21变体可以具有热稳定性或热弹性。
在整个说明书中所使用的术语“热稳定性(Heat-Stability)”是指在热处理条件下，尽管施加一定程度或更高的热量，蛋白质不发生变性、沉淀等，且其原有的特征/功能保持与热处理前相同/相似的特性，例如蛋白质的生物活性功能不下降或改变等。
根据一实施例，当对FGF21变体蛋白进行热处理时，可以确认，尽管在100℃或更高的温度下进行热处理，其不发生变性和沉淀，并且维持了诸如FGFR1c受体激活能力等的生理活性功能，从而可以得知FGF21蛋白具有热稳定性的特性。
在整个说明书中所使用的术语“热弹性(Heat-Elasticity)”是指在热处理条件下施加一定水平或更多的热量后，在重新冷却时恢复与热处理前相同/相似的蛋白原本的特性/功能。
在一具体实施例中，所述FGF21变体蛋白可以具有β-三叶(βtrefoil)结构。
在整个说明书中所使用的术语“β-三叶(β或“β-三叶折叠”)结构是指由六个β发夹组成的蛋白折叠结构，其中每个发夹由两条β链形成。所述结构形成含有由三个发夹组成的三角形“盖(cap)”的β-桶，且所述结构具有大概三重对称的结构。
在一具体实施例中，所述方法可以包括将转化基因生物或培养液加热至蛋白可以变性的温度或更高的温度，具体地，所述温度可以是40℃或更高、45℃或更高、50℃或更高、55℃或更高、60℃或更高、65℃或更高、70℃或更高、75℃或更高、80℃或更高、85℃或更高、90℃或更高、95℃或更高、或100℃，更具体地，40℃或更高至300℃或更低、40℃或更高至250℃或更低、40℃或更高至200℃或更低、40℃或更高至150℃或更低、40℃或更高至120℃或更低、50℃或更高至300℃或更低、50℃或更高至250℃或更低、50℃或更高至200℃或更低、50℃或更高至150℃或更低、50℃或更高至120℃或更低、60℃或更高至300℃或更低、60℃或更高至250℃或更低、60℃或更高至200℃或更低、60℃或更高至150℃或更低、60℃或更高至120℃或更低、70℃或更高至300℃或更低、70℃或更高至250℃或更低、70℃或更高至200℃或更低、70℃或更高至150℃或更低、70℃或更高至120℃或更低、80℃或更高至300℃或更低、80℃或更高至250℃或更低、80℃或更高至200℃或更低、80℃或更高至150℃或更低、80℃或更高至120℃或更低、90℃或更高至300℃或更低、90℃或更高至250℃或更低、90℃或更高至200℃或更低、90℃或更高至150℃或更低、90℃或更高至120℃或更低，但不限于此。
在一具体实施例中，所述FGF21变体蛋白可以额外结合有热稳定性蛋白标签(tag)。
在一具体实施例中，所述热稳定性蛋白标签可以连接至所述FGF21变体蛋白的N-末端或C-末端，并且，只要在不影响所述FGF21变体蛋白的特性/功能等的情况下可以提高所述蛋白的生产/纯化率，则不限于此。
在一具体实施例中，所述热稳定性蛋白标签是一种在加热时也不变性的耐热蛋白标签，且可以是选自由诸如源自高温性生物体的蛋白、硫氧还
蛋白(Thioredoxin，Trx)和DnaK等的具有热稳定性的蛋白组成的组中的一种或多种。
在一具体实施例中，所述FGF21变体蛋白和蛋白标签可以直接连接或通过接头连接。只要不影响连接至所述FGF21变体蛋白或蛋白标签的融合蛋白的特性/性能等，对于所述接头则没有特别限制，例如，可以由核酸或肽等组成。
在一具体实施例中，所述接头可以在细胞内或外部工艺中通过诸如酶作用等的各种生物学和化学作用来被截断或分解。具体地，所述接头可以通过使用烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus，TEV)蛋白酶或诸如凝血酶、因子Xa等蛋白酶所识别的特征序列作为接头来被截断，或者可以使用由天冬酰胺-甘氨酸(Asn-Gly)组成的接头来通过利用羟胺羟胺(NH2OH)的热处理(40℃至42℃，3小时)而被截断。
在一具体实施例中，所述培养转化基因生物的步骤可以通过已知的分批培养方法、连续培养方法、和补料分批培养等来执行，但不特别限于此。此时，对于培养条件，可以通过使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)来调节适当的pH(例如，pH 5至9，具体地，pH 6至8，最具体地，pH 6.8)，但不特别限于此，并且可以通过将氧气或含氧气的气体混合物导入至培养物中来维持好氧条件。培养温度可以维持在20℃至45℃，具体地，25℃至40℃，并且可以培养约10小时至160小时。通过所述培养而生产的FGF21变体蛋白可以分泌到培养基中或残留在转化基因生物中。
此外，作为所使用的培养用培养基，可以单独使用或混合使用糖和碳水化合物(例如：
葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)作为碳源、油脂和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油、和椰子油)、脂肪酸(例如：棕榈酸、硬脂酸、和亚油酸)、醇(例如：甘油、和乙醇)、以及有机酸(例如：乙酸)等，但不限于此。作为氮源，可以单独使用或混合使用含氮有机化合物(例如：蛋白胨、酵母提取液、肉汁、麦芽提取液、玉米浸液、大豆粕和尿素)或无机化合物(例如：硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、和硝酸铵)等，但不限于此。作为磷源，可以单独使用或混合使用磷酸二氢二钾和磷酸氢二钾，但不限于此，并且可以包括其他金属盐(例如：硫酸镁或硫酸铁)、诸如氨基酸和维生素的必需的生长促进物质。
在一具体实施例中，所述方法可以进一步包括去除通过热处理而变性的蛋白的步骤。
在一具体实施例中，所述去除通过热处理而变性的蛋白的步骤可以通过离心等沉淀通过热处理而变性的蛋白，具体地源自转化基因生物的蛋白，然后去除沉淀物。当使用所述步骤时，即使经热处理也不变性的FGF21变体蛋白在离心后存在于上清液部分，因此可以容易地获得。
在一具体实施例中，所述方法可以进一步包括回收所生产的FGF21变体蛋白的步骤。该回收步骤可以是从培养的细胞或其上清液中执行回收的步骤，并且本领域技术人员可以选择适合于回收的过程。回收在所述培养步骤中生产的FGF21蛋白的方法可以根据培养方法，例如分批培养、连续培养、补料分批培养方法等使用本领域已知的合适方法来从培养液中收集期望的产物。
在一具体实施例中，所述回收FGF21变体蛋白的步骤可以通过离心等去除经热处理而变性并沉淀的FGF21变体蛋白之外的蛋白(源自转化基因生物的蛋白)，并且仅获得由于其热稳定性(热弹性)而未被热处理变性的FGF21变体蛋白。
提供一种FGF21变体蛋白的纯化方法，其包括将包括FGF21变体蛋白和杂质的混合物加热至40℃或更高的温度的步骤。
在一具体实施例中，所述杂质包括在FGF21变体蛋白生产工艺中发生的除FGF21变体蛋白之外的蛋白等，具体地，可以包括源自生产FGF21变体蛋白的转化基因生物的蛋白等。
在一具体实施例中，所述纯化FGF21变体蛋白的步骤可以通过使用离心等去除经热处理变性而沉淀的杂质(源自转化基因生物的蛋白)，并且仅获得由于其热稳定性(热弹性)而未被热处理变性的FGF21变体蛋白。
另一方面提供一种新型的FGF21变体。
另一方面提供一种于治疗代谢障碍或心血管障碍的组合物，其包括新型的FGF21变体。
在一具体实施例中，所述代谢障碍或心血管障碍可以选自高胆固醇血症、血脂异常症、高甘油三酯血症、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、2型糖尿病和肥胖。
在一具体实施例中，所述代谢障碍或心血管障碍的治疗、预防、或管理可以包括减少对象的体重、肝脏脂肪含量、上升的LDL-C、总C、甘油三酯、和Apo B数值中的一个或多个。
在一具体实施例中，所述代谢障碍或心血管障碍可以是血脂异常症、选择性地混合的血脂异常症、高甘油三酯血症、选择性地严重的高甘油三酯血症或高胆固醇血症、选择性地原发性高胆固醇血症。
在一具体实施例中，所述组合物可以是药物组合物、保健功能食品组合物、和饲料组合物中的一个或多个。
所述药物组合物可以进一步包括通常用于制造药物组合物的合适的载体、赋形剂或稀释剂。包括药学上可接受的载体的组合物可以是经口服或肠胃外的各种剂型。在制剂化时，可以通过使用通常使用的如填充剂、膨胀剂、增量剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来制剂。用于口服施用的固型制剂可以包括片剂丸剂、散剂、颗粒剂、和胶囊剂等，并且可以通过将至少一种或多种的赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)、明胶等混合至一种或多种化合物中来制剂。
另外，除了简单的赋形剂外，还可以使用如硬脂酸镁、滑石粉等的润滑剂。作为用于口服施用的液相制剂，可以包括悬浮剂、内容液剂、乳剂、糖浆剂等，并且除了常用的简单稀释剂即水和液体石蜡之外，可以包括各种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、和防腐剂等。用于肠胃外施用的制剂可以包括经灭菌的水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干剂、和栓剂。作为非水溶剂和悬浮溶剂，可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、和如橄榄油的植物油等。作为栓剂的基剂，可以使用witepsol、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可纸、月桂林纸、甘油明胶等。
另外，所述药物组合物可以具有选自由片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂、内容液剂、乳剂、糖浆剂、经灭菌的水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干剂、和栓剂组成的组中的任何一个。
另一方面提供一种治疗代谢障碍或心血管障碍的方法，其包括将所述药物组合物施用于个体中的步骤。
所述药物组合物以药学上有效量施用。
在整个说明书中所使用的术语“施用”是指通过任何合适的方法向对象导入本发明的药物组合物，并且对于施用途径，只要能到达靶组织即可，可以是通过口服或肠胃外的各种途径来施用。
本发明的药物组合物可以基于目的或需要根据本领域中使用的常规方法、施用途径、和施用量来适当地施用于个体。施用途径的实例包括通过口服、肠胃外、皮下、腹腔内、肺内和鼻腔内施用，并且肠胃外注入包括肌内、静脉内、动脉内、腹腔内或皮下施用。
另外，可以根据本领域已知的方法选择合适的施用量和施用次数，并且实际上施用的本发明的药物组合物的量和施用次数可以通过诸如待治疗的症状类型、施用途径、性别、健康状态、饮食、个体的年龄和体重、以及疾病的严重程度的各种因素而适当确定。
本发明中的术语“药学上有效量”是指足以以适用于医学用途的合理效益/风险比率抑制或缓和代谢障碍或心血管障碍的量，并且有效用量水平可以根据包括个体类型和严重程度、年龄、性别、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排放率、治疗期间、同时使用的药物的要素或医学范围中已知的其他因素而确定。
在整个说明书中所使用的术语“个体”是指已发病或可能发病代谢障碍或心血管障碍的包括人类的所有动物，并且通过向个体施用本发明的药物组合物，可以有效地治疗代谢障碍或心血管障碍。
另一提供一种所述药物组合物在治疗代谢障碍或心血管障碍中的用途。
所述保健功能食品组合物可以通过将有效成分直接添加到食品中或与其他食品或食品成分一起使用，并且可以根据常规方法适当地使用。所述保健功能食品组合物除了以指示的比率含有所述有效成分作为必需成分之外，对于其他成分没有特别限制，并可以含有诸如普通饮料的几种香味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。上述的天然碳水化合物的实例是单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；以及多糖，例如糊精、环糊精等的普通糖；以及糖醇，例如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。对于除了上述之外的香味剂，可以有利地使用天然香味剂(奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草酸等))和合成香味剂(例如糖精、阿斯巴甜等)。所述天然碳水化合物的比率可以由本领域技术人员的选择适当地确定。
除上述之外，保健功能食品组合物可以含有各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、诸如合成调味剂和天然调味剂等的调味剂、着色剂和增粘剂(酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定化剂、防腐剂、甘油、酒精、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这样的成分可以单独或组合使用。这些添加剂的比率也可以由本领域技术人员适当地选择。
在下文中，通过本申请的实施例对本发明进行更详细的说明，但以下实施例仅为帮助理解本申请而是示例性的，且本申请的内容不限于以下的实施例。
实施例
实施例1：FGF21的新型变体的设计和发掘
FGF21作为肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，以下简称NASH)治疗剂候补物质而受到全世界各个制药公司的关注。FGF21是一种通过影响大脑、肝脏、胰脏、肉和脂肪组织等的细胞活性来调节糖脂代谢的蛋白质，并可以同时与靶器官细胞表面上存在的FGFR1c和β-Klotho形成三元复合物(ternarycomplex)，通过激活FGFR1c的胞浆结构域即酪氨酸激酶结构域，可以诱发细胞内磷酸酶的信号传递。
所述FGF21蛋白由209个氨基酸组成，并基于在其中去除了信号肽(1-28aa)的成熟形式(29-209aa)中去除了N末端的四个氨基酸的状态来设计新型的变体。为了开发新型的FGF21变体，以如下的策略设计FGF21变体。
作为第一个策略，应用了“正交比较(Ortholog comparison)”法。具体地，通过各种哺乳动物基因分析选择针对源自北太平洋小须鲸的FGF21(wFGF21)的序列，并与源自人的FGF21(hFGF21)序列进行比较分析。结果，确认了图1中以阴影表示的3个序列(Gln184&Gln201&Ala208)存在特异差异。另外，针对hFGF21CT的部分(186-209aa)和β-Klotho的复合物结晶结构(PDB代码：5VAQ)进行了分析。结果，判断了在将wFGF21的相同部位序列即His200和Thr207导入在图2中的hFGF21的Gln201和Ala208位置时，与β-Klotho的相互作用将得到加强。因此，开发了其中hFGF21CT的三个位点被wFGF21CT序列取代的突变①(Gln184Glu&Gln201His&Ala208Thr)。
作为第二个策略，通过分析针对hFGF21CT和β复合物的结晶结构的分析，选定了工程位置。基于结构分析，可以在FGF21CT序列中特定其中残基不参与与β-Klotho的相互作用的三个部分(Ser195&Pro199&Ser200)。因此，为了增强FGF21的活性并改善其稳定性，开发了所有都导入了甘氨酸的突变②(Ser195Gly&Pro199Gly&Ser200Gly)。这是一种旨在同时帮助与β-Klotho的相互作用并增强对蛋白酶(protease)攻击的抵抗性而设计的基于蛋白结构的工程策略。
通过上述两种策略，当变体①和②结合时，可以期待协同效应，因此将结合两种策略的FGF21变体③开发成新型的FGF21变体(图3)。
实施例2：FGF21变体的制作和纯化
为了制造和纯化在所述实施例1中设计的FGF21变体，基于先前的研究结果，作用利用热弹性的纯化技术。
具体地，使用诸如硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)或DnaK等的易
于表达并耐热的蛋白作为标签，并且过表达其中Trx融合至FGF21变体的Trx-FGF21的大肠杆菌通过超声处理(sonication)来破碎后，进行离心。将包括Trx-FGF21的上清液溶液在高温下(50℃至100℃)培养10分钟，然后通过离心分离在高温下变性的蛋白和Trx-FGF21(图4，左)。
另外，为了确保去除了Trx的纯FGF21变体，必须在标签和FGF21变体之间插入可截断的接头。由诸如源自烟草蚀纹病毒(Tobaccoetch virus，TEV)的蛋白酶或凝血酶和因子Xa等的蛋白酶识别的特定序列可用作接头。另外，如果在标签和FGF21变体之间插入由天冬酰胺-甘氨酸(Asn-Gly)组成的接头，则可以通过利用羟胺(Hydroxylamine，NH2OH)的热处理(40℃至42℃，3小时)来截断接头。因此，可以通过蛋白酶将FGF21与标签分离，然后可以通过两种或更少的色谱法将FGF21纯化至90％或更高的高纯度(图4，右)。
实施例3：FGF21变体的活性确认
3.1：FGF21的N-末端截断变体的活性确认
通过热处理而生产其中进一步去除了FGF21的信号肽(1-28aa)和N-末端的四个氨基酸(29-32aa)的FGF21(FGF21△N4，33-209aa)，然后将其活性与市售的FGF21(29-209aa)进行比较。FGF21与作为共受体的β-Klotho一起结合到FGF受体，并通过激活作为FGF受体中之一的FGFR1c，从而显示各种生理效果。因此，通过使用表达FGFR1c和β-Klotho并具有可以确认FGFR1c激活程度的报告系统的HEK293细胞来确认通过FGF21的FGF水受体激活能力。
结果，可以确认通过热处理纯化的FGF21ΔN4与市售FGF21(commercial FGF21)的活性相似(图5)，并且可以得知，即使通过上述方法去除第29至33位氨基酸或经热处理生产，FGF21激活FGFR1c的功能也不受影响。
3.2：FGF21氨基酸取代变体的活性确认
通过体外细胞测定(in vitro cell assay)测量在所述实施例2中纯化至高纯度的FGF21变体①、②和③的细胞活性改善效果。首先，通过使用3T3L1脂肪细胞，以蛋白质印迹(western blot)确认通过FGF21野生型和变体的脂肪细胞中的FGFR信号传导。ERK是根据FGFR激活的细胞内信号传递系统中代表性信号递质者中之一，其根据FGFR激活被磷酸化(pERK)。作为确认通过FGF21蛋白的pERK的水平的结果，确认了与野生型相比，通过变体增加约1.4至1.7倍，并确认变体②比①更有效。相反，变体②和③之间没有观察到显着差异(图6)。
接下来，确认了根据FGF21野生型和变体浓度的FGFR1的激活效果。这是使用都表达FGFR1c和β-Klotho并制作成根据FGFR1c激活水平来表达荧光素酶的HEK293细胞的方法。这是设计成可以更精确地确定激活水平的实验。作为分析各蛋白质的EC50的结果，已确认与野生型相比，变体①、②和③分别增加了1.73倍、4.38倍和6.03倍(图7)。
综合上述实验结果，本发明开发的新型的FGF21变体即变体3具有优异的活性，因此可以选为FGF21生物改良剂(biobetter)。
上述的本申请描述是为了例示，本申请所属技术领域的技术人员将理解，在不改变本申请的技术思想或必须特征的情况下，可以容易地修改为其他具体形式。因此，上述实施例在所有方面都应当被理解为示例性，而非限制性的。例如，以单一形式描述的各构成要素也可以以分布式的方式实现，类似地，以分布式描述的构成要素也可以以组合的形式实现。
本申请的范围由下面描述的权利要求而不是上述的详细说明来表示，从权利要求的意义和范围以及其等同概念导出的所有变化或修改形式均应被解释为包括在本申请的范围内。
<110> 多尔可韩国股份有限公司
<120> 新型FGF21变体的开发及其生产技术和用途
<130> PX068205CN
<150> KR 2021/0075460
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<170> KoPatentIn 3.0
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Ser

Claims (17)

1.一种包括FGF21变体的多肽，其特征在于，所述变体为在野生型FGF21蛋白中包括一个或多个突变。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述突变是氨基酸的缺失、取代和添加中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述野生型FGF21蛋白是其中已去除信号肽的成熟形式。
4.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述野生型FGF21蛋白包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述FGF21变体缺失N-末端中的1至4个氨基酸。
6.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述FGF21变体被选自由Q184E、S195G、P199G、S200G、Q201H和A208T组成的组中的一个或多个取代。
7.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述FGF21变体被S195G、P199G、S200G、Q201H和A208T取代。
8.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述FGF21变体是SEQ ID NO：3至6的氨基酸序列中的一个。
9.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述FGF21变体具有相比于野生型提升的活性。
10.一种FGF21变体蛋白的生产方法，包括：
培养生产FGF21变体蛋白的转化基因生物；以及
将所述转化基因生物或培养液加热至40℃或更高温度。
11.根据权利要求10所述的FGF21变体蛋白的生产方法，其中，所述FGF21变异蛋白具有热稳定性或热弹性。
12.根据权利要求10所述的FGF21变体蛋白的生产方法，其中，所述FGF21变体蛋白包括β-三叶结构。
13.根据权利要求10所述的FGF21变体蛋白的生产方法，其中，所述FGF21变体蛋白额外地结合到热稳定性蛋白标签。
14.根据权利要求10所述的FGF21变体蛋白的生产方法，进一步包括：
去除通过热处理而变性的蛋白。
15.一种FGF21变体蛋白的纯化方法，包括将包括FGF21变体蛋白和杂质的混合物加热至40℃或更高的温度。
16.根据权利要求15所述的FGF21变体蛋白的纯化方法，进一步包括：
去除通过热处理而变性的蛋白。
17.一种用于治疗代谢障碍或心血管障碍的药物组合物，其包括FGF21变体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201315742A (zh) * 2011-09-26 2013-04-16 Novartis Ag 治療代謝病症之雙功能蛋白質
TWI513705B (zh) * 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
MX2017007458A (es) * 2014-12-23 2017-08-10 Novo Nordisk As Derivados del factor 21 de crecimiento de fibroblastos (fgf21) y sus usos.
TW201731867A (zh) * 2015-12-02 2017-09-16 賽諾菲公司 Ｆｇｆ２１變異體
CA3086649A1 (en) * 2017-12-22 2019-06-27 Novartis Ag Methods of treating metabolic disorders with fgf21 variants
KR20210075460A (ko) 2019-12-13 2021-06-23 주식회사 피티지 고토크 다상 ipm bldc 모터 제어장치
KR102495299B1 (ko) * 2020-11-03 2023-02-06 토드제약 주식회사 Fgf21의 열탄력성을 이용한 fgf21 생산 방법

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