CN117462687A - 一种用于制备预防或治疗骨转移癌药物的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种用于制备预防或治疗骨转移癌药物的组合物及其应用，该组合物包括双膦酸盐化合物和/或地舒单抗以及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂。通过磷酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂联用，不仅能够避免在骨转移早期聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂对骨转移癌的促进作用，还能对于骨转移癌有显著的预防效果，即在骨转移早期或未出现骨转移时，联合用药，可以预防骨转移癌的发生；而且对于已经发生骨转移的患者，也具有较强的治疗效果，显著降低骨转移的病症程度；还能够大大降低患者对于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的耐药性，能够发挥最大的抗癌效果。

Description

一种用于制备预防或治疗骨转移癌药物的组合物及其应用

技术领域

本申请涉及骨转移癌技术领域，具体涉及一种用于制备预防或治疗骨转移癌药物的组合物及其应用。

技术背景

骨骼是继肺和肝以外，第三大最常见的癌症转移部位。基本上所有癌种都有发生骨转移的可能。据统计，骨转移的发病率占全身转移癌的15％～20％。且易发生骨转移癌的常见恶性肿瘤有乳腺癌、肺癌、前列腺癌等，在肺癌和乳腺癌这两类常见的癌症当中，晚期患者骨转移的比例分别为大约35％和大约70％。和其他部位的转移灶相比，骨转移会产生独特的后果，骨痛、骨损伤、骨相关事件(skeletal related events,SREs)及生活质量降低是骨转移常见的并发症。骨相关事件是指在恶性肿瘤骨转移或骨病患者中，由于疾病进展带来的一系列骨骼并发症总和，包括以下四种：病理性骨折、骨髓压迫、骨骼手术和骨骼放射性治疗。骨相关事件还会引发并发症，如骨痛加剧或出现新的骨痛、病理性骨折、高钙血等症状，有些脊椎转移甚至还可能导致骨髓压迫乃至截瘫。从现阶段来看，骨转移后骨相关事件发生率较高。据统计，骨转移骨相关事件(SREs)在乳腺癌和前列腺癌患者中非常常见，发生率高达65％～80％。另外，在肺癌患者中，仍有40％～50％的患者可能会遭受SREs的折磨。骨相关事件不仅降低患者的生活质量、限制行动能力，同时还可能增加治疗费用，严重的情况还会增加死亡风险，缩短生存时间，对患者情绪和生活质量带来极大的影响。

ESMO(欧洲肿瘤学会虚拟会议)指南工作组建议在骨转移诊断后应立即开始骨改良药物治疗，以延缓骨转移引发的首次和随后的骨相关事件。目前主要推荐的骨改良药物主要有地舒单抗和双膦酸盐。双膦酸盐药物为骨吸收抑制剂，临床用于骨质疏松症、高钙血症、骨痛及骨相关事件等；地舒单抗是目前首个且唯一的骨靶向药，可用于骨转移引起的骨相关事件。但是就目前来讲，地舒单抗和双膦酸盐仅仅是治疗骨转移引起的并发症即骨相关事件，缓解骨转移带来的骨折等问题，在一定程度上能够减轻骨转移带给患者的痛苦，并不能真正减少骨转移的发生率，不能显著延长患者的存活时间，并且存在增加软组织转移发生率的副作用。目前还没有出现针对骨转移本身的治疗药物。

另外，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂(PARP抑制剂)，如奥拉帕利、鲁卡帕利、尼拉帕利以及他拉唑帕利等在癌症治疗中获得较大关注，其主要应用于乳腺癌和卵巢癌等，具有较好的治疗效果。但是这类靶向药均会产生耐药性，即使是国内唯一批准的奥拉帕利，也大约在八个月左右产生了耐药性。并且上述药物也只是针对原发性癌的治疗，是否能够对于骨转移有较好的治疗效果，现在还未知。根据本申请的研究数据显示，奥拉帕尼在早期的骨转移治疗中，不仅不能治疗骨转移，还会促进骨转移的发生。

鉴于骨转移导致的骨相关事件对于患者造成的极大痛苦以及目前药物只能缓解骨相关事件，不能真正治疗骨转移癌以及延长患者的生存时间，不是针对骨转移癌进行的预防或治疗。因此，急需开发出一种药物，不仅能够解决骨痛等骨相关事件，更能够预防或治疗骨转移癌，即能够避免骨转移的发生，达到预防骨转移的效果；或者在骨转移发生后有效治疗骨转移，对骨转移癌本身实现治疗。

发明内容

针对上述存在的技术局限性，本申请提出了一种用于制备预防或治疗骨转移癌药物的组合物，原创性地提出将双膦酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂联合使用的治疗方案。通过磷酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂联用，不仅能够避免在骨转移早期聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂对骨转移癌的促进作用，还能对于骨转移癌有显著的预防效果，即在骨转移早期或未出现骨转移时，联合用药，可以预防癌症向骨组织中转移，降低骨转移癌的发生率；而且对于已经发生骨转移的患者，也具有较强的治疗效果，显著降低骨转移的病症程度；还能够大大降低患者对于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的耐药性，能够发挥最大的抗癌效果。

为实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的发明点是提供了一种用于制备预防或治疗骨转移癌药物的组合物，包括双膦酸盐化合物和/或地舒单抗以及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂。

双膦酸盐化合物和地舒单抗最初是用来治疗骨质疏松，骨质疏松症是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。由于晚期癌症能够形成骨转移，且骨转移会引起骨相关事件，与骨质疏松有着类似的病症，因此，双膦酸盐化合物和地舒单抗在治疗骨相关事件中有一定的缓解效果，但是不能预防或治疗骨转移，不能显著延长患者的生存时间。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂简称PARP抑制剂，其主要是利用在BRCA突变的病人中PARP抑制剂可以引起DNA双链断裂并无法进行同源重组修复而最终导致肿瘤细胞死亡。但是患者服用该类靶向药一段时间后，会在体内产生较强的耐药性，体内的癌细胞能逃逸该类药物对其造成的损伤，使得治疗癌症的效果大大降低。

本申请通过研究发现，将上述两种药物联用，二者相互配合，在预防骨转移癌时，能够预防癌症向骨组织中转移，大大降低骨转移癌的发生概率；当用于治疗骨转移癌时，能够显著降低骨转移的病症程度，提高PARP抑制剂杀死癌细胞的效果，同时也显著降低了骨转移癌对于PARP抑制剂的耐药性。

可选地，所述聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂包括奥拉帕尼、尼拉帕尼、卢卡帕尼、氟唑帕尼、帕米帕尼、微利帕尼、他拉唑帕尼中的至少一种。

优选地，所述聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂为奥拉帕尼或其药学上可接受的盐。

可选地，所述双膦酸盐化合物包括帕米膦酸、奈立膦酸、奥帕膦酸、阿仑膦酸、英卡膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸、唑来膦酸、依替膦酸、氯膦酸、替鲁膦酸中的至少一种。

可选地，所述双膦酸盐化合物还可以为其药学上可接受的盐，进一步可包括帕米膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、阿仑膦酸盐、英卡膦酸盐、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐、唑来膦酸盐、依替膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐中的至少一种。

可选地，所述双膦酸盐化合物包括氯膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、伊班膦酸中的至少一种。

优选地，所述双膦酸盐化合物为唑来膦酸或唑来膦酸盐。

可选地，双膦酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的质量比为(2～50):(1～100)。

实际操作中，上述药的计量方式还需要依据患者个人身高及体重调整。

可选地，双膦酸盐化合物和/或地舒单抗的用量：

地舒单抗，皮下注射120～180mg每次，地舒单抗是2mg/kg，每4周～12周一次。

唑来磷酸，静脉注射4mg每次，每4周1次。假定成人75kg的话就是50ug/kg，可根据肌酐清除率调整用药浓度50+mL/min正常用药，<50mL/min考虑使用正常浓度的50～75％。

可选地，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的用量：

奥拉帕尼，片剂：每片100～150mg，一次两片，每日两次。

可选地，双膦酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的质量比为(2～30):(1～50)。双膦酸盐化合物和/或地舒单抗可以为2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份、20份、21份、22份、23份、24份、25份、26份、27份、28份、29份、30份或任意两个数值之间的任意数值；聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂可以为1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份、20份、21份、22份、23份、24份、25份、26份、27份、28份、29份、30份、31份、32份、33份、34份、35份、36份、37份、38份、39份、40份、41份、42份、43份、44份、45份、46份、47份、48份、49份、50份或任意两个数值之间的任意数值。。

在该配比范围内，组合物各物质之间能相互配合，发挥最大的联合作用。当该比值较高时，即双膦酸盐化合物和/或地舒单抗含量较多时，相对于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂，存在过多的双膦酸盐化合物和/或地舒单抗，会使得破骨细胞大量减少，破坏破骨细胞和成骨细胞数量的平衡，增加骨质增生等问题；当该比值较低时，即双膦酸盐化合物和/或地舒单抗含量较少时，会使得对于破骨细胞的抑制不够，不能发挥最好的相互配合的功效。

可选地，双膦酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的质量比为2:50。

本申请的另一个发明点是提供了一种骨转移癌药物，包括以上任一所述的组合物或该组合物和药学上可接受的辅料的混合。

可选地，所述骨转移药物的制剂包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、汤剂、丸剂、口服液、酊剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂、注射剂中的至少一种。

奥拉帕尼优选为片剂，便于口服，需每天服用；唑来膦酸绝大多数都是注射剂；静脉滴注，不需要长期口服，避免了口服药对胃肠道的一些副作用。

本申请的又一个发明点是提供了以上任一项所述的骨转移癌药物在预防或治疗骨转移中的应用。

可选地，骨转移癌药物的服用方法包括：

将组合物的各成分按照一定的比例分别服用，包括按时间顺序或同时服用，按时间顺序进行服用时，间隔时间不超过12个月；或按照一定的比例将组合物的各成分混合，得到混合物，后将混合物进行服用。

该骨转移癌药物可在骨转移之前或之后或期间进行服用；优选地，该骨转移癌药物在骨转移发生之前即可开始服用，可用于预防骨转移癌的发生，直接切断骨转移的路径，减少骨转移癌的生成，避免了后续癌症造成的骨转移带来的一系列并发症，提高癌症患者的治愈率和生活水平。

即在病人没有确诊到明显骨转移时，如若病人服用奥拉帕尼时，建议同时服用唑来膦酸，可以预防或减少骨转移的发生；即我们推荐只要病人(无论是否已经发生骨转移)服用奥拉帕尼，都可同时或提前服用唑来膦酸。奥拉帕尼需每天持续服用，唑来膦酸可间隔一段时间注射一次，不必每天服用，具体剂量和间隔时间需后期临床测试。

可选地，所述骨转移癌为溶骨性或混合性骨转移癌。

可选地，所述溶骨性骨转移癌包括乳腺癌骨转移癌、肺癌骨转移癌、胰腺癌骨转移癌、前列腺骨转移癌中的至少一种。

与现有技术相对比，本申请具有以下优点：

本申请通过将双膦酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂联用，得到用于制备预防或治疗骨转移癌药物的组合物。该组合物中，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂可以对骨转移的癌细胞进行DNA损伤，限制癌细胞修复受损DNA的能力；双膦酸盐化合物和/或地舒单抗能够通过抑制破骨细胞的活性以及其分化增殖等，两者相互配合可以达到预防或治疗骨转移癌的效果。

(1)预防效果：在发现癌症之后、还未发现骨转移癌前，就通过本申请的组合物，即双膦酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂联用，可以大大降低骨转移，相比于安慰剂，骨转移减少了97.1％；而单独给药(聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂或双膦酸盐化合物)分别下降了73.43％(与安慰剂组比没有显著性差异)和51.61％，且本申请的组合物用药相对于双膦酸盐化合物降低了89％以上；并且本申请的组合物明显改善了聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂对于骨转移早期的促进作用；即，本申请的组合物能够显著降低骨转移的发生，具有单独给药远远达不到的优异效果，从而进一步从根本上抑制骨转移的发生，提高癌症患者的预后治愈率，大大减轻患者的痛苦。另外，本申请的组合物还提升了患者的生存率，相比于安慰剂组和单药组，小鼠的生存率最高且出现死亡小鼠时间最晚，而且双药联合组中没有发生无骨转移的小鼠占比最高。

(2)治疗效果：在发生骨转移之后，再使用本申请的组合物，也可以达到较好的治疗效果，相比于安慰剂组和单独给药，均具有显著性差异，且骨转移降低了95％左右，至治疗后期，几乎观察不到骨转移的存在，表明本申请的组合物在骨转移发生后也有相当好的治疗效果，能从根本上控制骨转移癌的数量，进而避免了骨转移癌对于骨组织的溶解等问题；并且在终点结束时，仍未观察到联合用药的耐药性时间点，表明本申请组合物可大大提升单独服用奥拉帕尼或唑来膦酸的耐药性时间。

附图说明

图1为本申请一实施例中心内注射肿瘤细胞后产生骨转移的部分小鼠的生物荧光成像图；

图2为本申请一实施例中奥拉帕尼组和安慰剂组对于小鼠治疗的时间节点示意图(a)和对于骨转移的治疗效果图(b)；横坐标为天数，单位为天；纵坐标为骨转移肿瘤细胞的相对生物荧光强度(用于表征骨转移强度)，无单位；

图3为本申请一实施例中奥拉帕尼组和安慰剂组对于骨转移小鼠的治疗效果图；(a)为奥拉帕尼组(四只)和安慰剂组(四只)小鼠模型的生物荧光成像图；(b)图中包括三幅子图，分别为奥拉帕尼组(一只)和安慰剂组(一只)的μCT成像图；奥拉帕尼组(一只)和安慰剂组(一只)的苏木精和伊红染色(H&E)图；奥拉帕尼组(一只)和安慰剂组(一只)的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色图；其中H&E与TRAP染色图的比例尺：100μm；

图4为本申请一实施例中在奥拉帕尼对于体外破骨细胞形成的效果图；(a)TRAP染色图：在没有奥拉帕尼和有奥拉帕尼的情况下，破骨细胞形成的情况；(b)奥拉帕尼对于成熟破骨细胞形成的效果图；横坐标为没有奥拉帕尼和有奥拉帕尼，纵坐标为成熟破骨细胞数量，单位为个；

图5为本申请一实施例中在奥拉帕尼对于体内破骨细胞的效果图；(a)为μCT成像；(b)为H&E染色图和TRAP染色图；(c)为不同组别的破骨细胞的数量图；横坐标为安慰剂组和奥拉帕尼组，纵坐标为每个视野内破骨细胞的数量，单位为个；H&E与TRAP染色图的比例尺：50μm；

图6为本申请一实施例中在奥拉帕尼或顺铂治疗4T1.2细胞(a)或SCP28细胞(b)期间加入巨噬细胞条件性培养基或破骨细胞条件性培养基的效果图；横坐标为奥拉帕尼组和顺铂组，无单位；纵坐标为相对存活率，无单位；

图7为本申请一实施例中对于小鼠用药的时间节点示意图；

图8为本申请一实施例中安慰剂组、奥拉帕尼组、唑来膦酸组以及奥拉帕尼和唑来膦酸联合用药组对于骨转移小鼠的预防效果图；横坐标为天数，单位为天；纵坐标为骨转移肿瘤细胞的相对生物荧光强度，无单位；

图9为本申请一实施例中安慰剂组、奥拉帕尼组、唑来膦酸组以及奥拉帕尼和唑来膦酸联合用药对于骨转移小鼠预防的生物荧光成像图；

图10为本申请一实施例中安慰剂组、奥拉帕尼组、唑来膦酸组以及奥拉帕尼和唑来膦酸联合用药对于骨转移小鼠预防的关节μCT图；

图11为本申请一实施例中安慰剂组、奥拉帕尼组、唑来膦酸组以及奥拉帕尼和唑来膦酸联合用药对于骨转移治疗的H&E染色图和TRAP染色图；H&E与TRAP染色图的比例尺：100μm；

图12为本申请一实施例中安慰剂组、奥拉帕尼组、唑来膦酸组和联合用药对于骨转移小鼠预防的骨体积的统计图；横坐标为不同组别，纵坐标为骨组织剩余体积与骨组织总体积的比值，单位为％；

图13为本申请一实施例中安慰剂组、奥拉帕尼组、唑来膦酸组和联合用药组对于骨转移小鼠预防的破骨细胞数目的统计图；横坐标为不同组别，纵坐标为破骨细胞数目，单位为个；

图14为本申请一实施例中安慰剂组、奥拉帕尼组、唑来膦酸组和联合用药组对于骨转移小鼠预防后的效果图；(a)小鼠存活率的统计图；横坐标为天数，单位为天；纵坐标为活着的小鼠占全部小鼠的比率即存活率，单位为％；(b)没有发生骨转移的统计图；横坐标为天数，单位为天；纵坐标为没有发生骨转移的小鼠占全部小鼠的比率即无骨转移率，单位为％；

图15为本申请一实施例中对于小鼠用药的时间节点示意图；

图16为本申请一实施例中安慰剂组、奥拉帕尼组、唑来膦酸组和联合用药组对于骨转移小鼠的治疗效果图；横坐标为天数，单位为天；纵坐标为骨转移肿瘤细胞的相对生物荧光强度，无单位；

图17为本申请一实施例中各试验例和对比例对于骨转移小鼠的治疗效果图；横坐标为试验例1、试验例2、试验例3、试验例4、试验例5、试验例6、试验例7、对比例1和对比例2，无单位；纵坐标为骨转移肿瘤细胞细胞数目的降低率，无单位。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本申请进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本申请，并不用于限制本申请的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本申请。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。

为了进一步了解本申请，下面结合最佳实施例对本申请作进一步的详细说明。

所有涉及小鼠的程序和实验方案均得到了清华大学机构动物保护和使用委员会(IACUC)的批准。

实施例1

本实施例公开了一种用于制备预防或治疗骨转移癌药物的组合物，包括双膦酸盐化合物和/或地舒单抗以及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂。

可选地，所述双膦酸盐化合物包括帕米膦酸、奈立膦酸、奥帕膦酸、阿仑膦酸、英卡膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸、唑来膦酸、依替膦酸、氯膦酸、替鲁膦酸中的至少一种，优选为氯膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、伊班膦酸中的至少一种，更优选为唑来膦酸。

可选地，所述双膦酸盐化合物还可以为其药学上可接受的盐，进一步可包括帕米膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、阿仑膦酸盐、英卡膦酸盐、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐、唑来膦酸盐、依替膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐中的至少一种，优选为唑来膦酸盐。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂包括奥拉帕尼、尼拉帕尼、卢卡帕尼、氟唑帕尼、帕米帕尼、微利帕尼、他拉唑帕尼或以上任意药物在药学上可接受的盐中的至少一种；优选为奥拉帕尼或其药学上可接受的盐。

双膦酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的质量比为(2～50):(1～100)，例如质量比可以为2:1、2:10、2:20、2:30、2:40、2:50、2:60、2:70、2:80、2:90、2:100、10:1、10:10、10:20、10:30、10:40、10:50、10:60、10:70、10:80、10:90、10:100、20:1、20:10、20:20、20:30、20:40、20:50、20:60、20:70、20:80、20:90、20:100、30:1、30:10、30:20、30:30、30:40、30:50、30:60、30:70、30:80、30:90、30:100、40:1、40:10、40:20、40:30、40:40、40:50、40:60、40:70、40:80、40:90、40:100、50:1、50:10、50:20、50:30、50:40、50:50、50:60、50:70、50:80、50:90、50:100或任意两个比值之间的任意比值；优选为(2～30):(1～50)；更优选为2:50。

实际操作中，上述药的计量方式还需要依据患者个人身高及体重调整。

可选地，双膦酸盐化合物和/或地舒单抗的用量：

地舒单抗，皮下注射120～180mg每次，地舒单抗是2mg/kg，每4周～12周一次。

唑来磷酸，静脉注射4mg每次，每4周1次。假定成人75kg的话就是50ug/kg，可根据肌酐清除率调整用药浓度50+mL/min正常用药，<50mL/min考虑使用正常浓度的50～75％。

可选地，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的用量：

奥拉帕尼，片剂：每片100～150mg，一次两片，每日两次。

实施例2

本实施例提供了一种骨转移癌药物，包括以上任一所述的组合物或该组合物和药学上可接受的辅料的混合。

辅料包括枸橼酸钠、甘露醇、注射用水/麦芽糊精、L-阿拉伯糖、甜菊糖苷、硬脂酸镁、果粉、山梨糖醇、交联羧甲基纤、维素钠、二氧化硅中的至少一种。

骨转移癌药物的制剂包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、汤剂、丸剂、口服液、酊剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂、注射剂中的至少一种。

当辅料为枸橼酸钠、甘露醇、注射用水时，双膦酸盐化合物和/或地舒单抗为注射剂，可进行直接静脉注射。由于双膦酸盐化合物一般通过肾脏进行代谢，尤其是唑来膦酸，因此建议注射剂。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的辅料可以为片剂，其辅料为聚维酮、润滑剂、崩解剂和稀释剂等，可根据具体选择进行搭配。由于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂部分药物已上市，尤其是奥拉帕尼，在最近上市，其目前的制剂为片剂，故本申请中也采用片剂。

本实施例所提供的骨转移癌药物，其具体施用方式为：

双膦酸盐化合物和/或地舒单抗：静脉注射给药量为5μg～50mg，可选择为5μg、10μg、30μg、50μg、100μg、500μg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg，优选为2～10mg，按照2mg/kg计算给药量，给药方式为静脉滴注(无需预防用药)，每次输注大于15min，可选择为20min、30min、40min、50min、60min，优选为30min，双膦酸盐半年给药一次，具体情况可根据实际情况有所调整；地舒单抗每4周～12周一次，具体情况可根据实际情况有所调整。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂：口服，饭前饭后均可；给药量为40～2000mg，整片吞咽，不要咀嚼、压碎、溶解或分割药片；每日1次，每天连续服药或可用药五天停药两天，具体情况可根据实际情况有所调整。

实施例3

本实施例提供了以上任一项所述的骨转移癌药物在预防或治疗骨转移中的应用。

可选地，骨转移癌药物的服用方法包括：将组合物的各成分按照一定的比例分别服用，包括按时间顺序或同时服用，按时间顺序进行服用时，间隔时间不超过12个月；或按照一定的比例将组合物的各成分混合，得到混合物，后将混合物进行服用。

该骨转移癌药物可在骨转移之前或之后或期间进行服用；优选地，该骨转移药物在骨转移发生之前即可开始服用，可用于预防骨转移的发生，直接切断骨转移的路径，减少骨转移的生成，避免了后续癌症造成的骨转移带来的一系列并发症，提高癌症患者的治愈率和生活水平。

可选地，所述骨转移为溶骨性癌或混合性骨转移癌。

可选地，所述溶骨性骨转移包括乳腺癌骨转移癌、肺癌骨转移癌、胰腺癌骨转移癌、前列腺癌中的至少一种。

实施例4

根据本申请的内容，对实施例1、实施例2和实施例3进行了具体说明，具体描述如下所示。

1、奥拉帕尼在治疗骨转移癌中的效果

2021年，首个PARP抑制剂奥拉帕尼(Olaparib)(又称奥拉帕利)【商品名利普卓(Lynparza)】正式上市。奥拉帕尼是中国上市的第一个卵巢癌靶向新药，在国内获批用于铂敏感复发性卵巢癌的维持治疗。这意味着使用奥拉帕尼做辅助治疗的患者无进展生存期将延长了近2倍，疾病进展或死亡风险下降了65％。

而70％的乳腺癌中会发生骨转移，因此，本申请首先对乳腺癌的靶向药在骨转移的治疗效果进行了检测，具体方式如下：

原位原发肿瘤形成：麻醉雌性BALB/c小鼠(4-6周龄)，并做一个小切口显示乳腺；将荧光素酶标记的4T1.2肿瘤细胞悬浮于PBS中，直接注射5×104个该肿瘤细胞到乳腺脂肪垫中；采用μCT技术观察自发性骨转移情况。

自发性骨转移实验：(1)采用心脏内(IC)注射；从亚融合细胞培养中提取肿瘤细胞，用PBS(PBS缓冲液，磷酸缓冲盐溶液)洗涤并重悬细胞，浓度为1×106个/ml；将50只小鼠在注射前用等效法麻醉；IC注射时，用26G针将4-6周龄雌鼠无胸腺裸鼠左心室0.1ml细胞注射到左心室；通过每周的BLI和最终时间点的μCT成像来监测骨转移情况；通过第0天的BLI成像图，如图1所示，图1只展示了部分小鼠(十只)的生物荧光成像图，图中小鼠全身生物发光信号的均匀分布，证实了心脏注射的成功。

(2)在IC注射的第11天对小鼠进行治疗，分别设置安慰剂组(安慰剂：4％DMSO二甲基亚砜+30％PEG-300+双蒸水)和奥拉帕尼组，每组小鼠12只，其剂量均为50mg/kg，每周连续5天。7周后对小鼠安乐死，之后进行骨组织学分析，并进行骨样本的μCT成像、H&E和TRAP切片染色分析。结果见图2和图3。其中，PEG-300为聚乙二醇PEG-300。

如图2所示，奥拉帕尼组中骨转移的肿瘤细胞数少于安慰剂组，但是与安慰剂组相比，并没有显著性差别，表明奥拉帕尼对于骨转移的治疗效果并不突出；根据图3所示，安慰剂组和奥拉帕尼组的小鼠在腿部均出现了较为严重的骨转移；通过小鼠关节处的μCT成像可以看出，安慰剂组小鼠关节的骨损伤较为严重，奥拉帕尼组相对于安慰剂组的骨溶解较少，但是对于关节也产生了较大的破坏；通过对小鼠关节进行切片染色得到苏木精伊红染色(H&E染色)图和抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)图，表明安慰剂组和奥拉帕尼组小鼠关节处均存在较多的癌细胞，但是安慰剂组中破骨细胞的数量更多，更活跃。并且可以从图中看出，在前期(28天前)奥拉帕尼对骨转移肿瘤细胞有明显的杀伤治疗效果，但随着时间的推移，治疗效果逐渐减弱，逐渐出现耐药性，时间节点28天左右。

2、奥拉帕尼对于破骨细胞成熟的效果

为了研究奥拉帕尼是否促进破骨细胞的成熟分化，我们从巨噬细胞诱导破骨细胞，具体过程如下：我们从6-8周龄的C57BL/6野生型小鼠的后腿的骨腔冲洗出骨髓细胞，通过70μm滤网过滤，用0.64％的氯化铵裂红之后，用含有10％胎牛血清的α-MEM中过夜培养。第二天，将未贴壁的细胞收集并计数，把2×106细胞重新铺于12孔板的一个孔中，用正常培养基(DMEM高糖培养基，培养基中添加10％热灭活胎牛血清(FBS，Gemini)、1％青霉素/链霉素(Invitrogen))并添加50ng/ml M-CSF培养2天，之后加入100ng/ml RANKL进行破骨细胞诱导。在巨噬细胞融合形成“小泡”样细胞时，分别加入DMSO二甲基亚砜或Olaparib奥拉帕尼处理，直至安慰剂组有成熟较大的多核破骨细胞出现为止。对上述两组细胞采用38A-1KT试剂盒(Sigma)进行TRAP染色，TRAP阳性和多核细胞被认为是成熟的破骨细胞。结果见图4中的(a)。

从图4中的(a)中，可以观察到，在奥拉帕尼处理组，仅有少量或较小的成熟破骨细胞形成(每组重复3次，只放了两张图片)；而没有奥拉帕尼组，有较多或较大的成熟破骨细胞形成(每组重复3次，只放了两张图片)；接着，又对细胞中破骨细胞的数量进行了统计，结果如图4中的(b)所示，可以明显看出，不添加奥拉帕尼组破骨细胞的数量是添加奥拉帕尼组的破骨细胞的5倍以上，表明正常情况下，破骨细胞的数量是要逐渐增多的，但是奥拉帕尼的存在却使得破骨细胞的数量维持在较低水平，说明奥拉帕尼确实能够抑制体外破骨细胞的生成。

此外，我们仅用奥拉帕尼(不注射肿瘤细胞)治疗小鼠。分别设置安慰剂组(安慰剂：4％DMSO二甲基亚砜+30％PEG-300+双蒸水)和奥拉帕尼组，每组小鼠10只，其剂量均为50mg/kg，每周连续5天，持续3到4周。接着取出小鼠腿骨，甲醛固定、脱钙2周；之后对小鼠的腿骨进行了μCT和骨切片染色分析(H&E和TRAP染色)。结果见图5。

如图5所示，与奥拉帕尼在体外显著抑制破骨细胞的作用相比，在体内给药奥拉帕尼对成熟破骨细胞的形成几乎没有抑制作用。苏木精和伊红(H&E)染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色显示奥拉帕尼处理后的关节形貌和骨中破骨细胞数量有轻微或几乎没有差异；对TRAP染色后破骨细胞的数量统计显示奥拉帕尼处理对体内破骨细胞的有极其轻微的抑制作用或者说几乎没有影响(两组间的p值为0.0408)。μCT分析也证实奥拉帕尼治疗后没有出现骨退化，小梁骨密度无明显差异，显示奥拉帕尼处理的骨损伤及骨密度与安慰剂组相比并没有差异。这些结果说明奥拉帕尼对破骨细胞的成熟并无明显的促进作用。

3、奥拉帕尼在治疗癌细胞期间破骨细胞的作用

为了验证在奥拉帕尼在治疗期间，破骨细胞发挥的作用，设计了如下试验：

(1)巨噬细胞诱导分化破骨细胞：从6周龄C57/BL6野生型小鼠胫骨冲洗出的骨髓细胞中分离出巨噬细胞，通过70μm细胞过滤器过滤，在含有10％胎牛血清的α-MEM中过夜培养。第二天，将没贴壁细胞统计计数，把2×106细胞重新铺于12孔板的一个孔中，用正常培养基(DMEM高糖培养基，培养基中添加10％热灭活胎牛血清(FBS，Gemini)、1％青霉素/链霉素(Invitrogen))并添加50ng/ml M-CSF培养2天，之后加入100ng/ml RANKL进行破骨细胞诱导。每2天更换一次培养基(从第5天起每天更换2次)。对成熟的破骨细胞采用38A-1KTSigma进行TRAP染色，TRAP阳性和多核细胞被认为是成熟的破骨细胞。

(2)细胞培养：将4T1.2细胞和SCP28细胞用正常培养基(DMEM高糖培养基，培养基中添加10％热灭活胎牛血清(FBS，Gemini)、1％青霉素/链霉素(Invitrogen))培养。为了生成稳定的细胞系，本申请使用了基于的慢病毒载体的PLKO.1或Lenti-CRISPR v2，其中，用HEK293T细胞包装慢病毒。在转染后的第2天和第3天，收集这些含有病毒的包装细胞的条件培养基。用上述收集的含有病毒的培养基与正常培养基1:1混合，感染受体细胞24小时，并添加8g/mL聚烯(ploybrene)。再换成正常培养基恢复培养一天，用嘌呤霉素药杀筛选受感染的细胞，生成稳定表达的细胞系。4T1.2是鼠源细胞系；SCP28是人源细胞系。

(3)将4T1.2或SCP28癌细胞分别放置于巨噬细胞条件性培养基和后期生成破骨细胞的条件性培养基中，再加入奥拉帕尼(Olaparib)或顺铂(Cisplatin)进行杀伤，观察癌细胞的存活率。结果见图6。

如图6所示，在奥拉帕尼治疗期间，使用破骨细胞的条件性培养基相对于巨噬细胞的条件性培养基可提高SCP28和4T1.2细胞的肿瘤细胞存活率。同样，破骨细胞的条件性培养基也可在较小程度上帮助顺铂治疗中的肿瘤细胞存活。而这表明，破骨细胞的条件性培养基增强了癌细胞对奥拉帕尼或顺铂的耐药性。

4、在骨转移发生前，奥拉帕尼和唑来膦酸联合使用对于骨转移的预防效果

为了验证奥拉帕尼和唑来膦酸联合使用的预防效果，设计了如下试验：

自发性骨转移实验：(1)采用心脏内(IC)注射；从亚融合细胞培养中提取肿瘤细胞，用PBS(PBS缓冲液，磷酸缓冲盐溶液)洗涤并重悬细胞，浓度为1×10⁶个/ml；小鼠在注射前用等效法麻醉；IC注射时，用26G针将4-6周龄雌鼠无胸腺裸鼠左心室0.1ml细胞注射到左心室。

(2)在IC注射的第4天对小鼠进行治疗，分别设置安慰剂组(安慰剂：4％DMSO二甲基亚砜+30％PEG-300+双蒸水)、奥拉帕尼(Olaparib)组、唑来膦酸(Zoledronate)组和联合组(试验例1，Olaparib+Zoledronate，简写为Ola+Zol)，每组12只小鼠，其中，奥拉帕尼组剂量为：50mg/kg，每周连续5天，停药2天；唑来膦酸组为：2mg/kg，每周2次；联合组：奥拉帕尼50mg/kg，每周连续5天，唑来膦酸2mg/kg，每周2次。5周后对小鼠安乐死，之后进行骨组织学分析，并进行骨样本μCT成像、H&E和TRAP切片染色分析。结果见图7～图10。

如图7所示，是在小鼠IC注射的三天后进行周期性的治疗，这时骨转移还未形成或即使存在也检测不到，这模拟了使用奥拉帕尼时未发现骨转移(或者说不确定是否发生了骨转移)的早期乳腺癌患者的临床治疗；通过这种早期治疗，检测联合用药的效果。治疗为期1个月左右。

如图8所示，奥拉帕尼单药治疗表现出较强的耐药性，但对杀伤肿瘤细胞的效果甚微(骨转移仅降低了51.61％)，且与安慰剂组没有显著性差异。值得注意的是，单独使用奥拉帕尼在早期时间点显著促进骨转移进展，在后期时间点对化疗的耐药性降低。

单药唑来膦酸可使骨转移负担减少73.43％，具有一定的效果，且与安慰剂组有显著性差异。但是，与安慰剂组相比，当小鼠同时服用奥拉帕尼和唑来膦酸盐时，观察到骨转移减少97.1％，与安慰剂组数据具有极显著性差异；另外该组数据与单药唑来膦酸组、单独使用奥拉帕尼组的数据也具有极显著性差异。

如图9所示，通过对小鼠的生物荧光成像图可知，单药奥拉帕尼组和唑来膦酸盐组相较于安慰剂组，骨转移减少；而联合用药奥拉帕尼和唑来膦酸盐组中发生骨转移的更少，相比于安慰剂组甚至是单药奥拉帕尼组和唑来膦酸盐组，均有明显的差别。接着对于小鼠的关节处进行μCT成像，观察图10可知，联合用药奥拉帕尼和唑来膦酸盐组中发生骨溶解的现象大大降低，关节处几乎没有溶骨，皮质骨区骨密度较高；而单药奥拉帕尼组和唑来膦酸盐组均能明显看到部分的骨溶解，安慰剂组更是出现了骨溶解造成的空洞。接着，对于小鼠膝关节附近进行切片染色，得到图11，通过图11的H&E图，可以看出联合用药组中的膝关节骨组织面积占比比较大，且较为完整，肿瘤细胞较少；而单药奥拉帕尼组和唑来膦酸盐组中膝关节骨组织出现部分溶解，且癌细胞相对于联合用药组增多；安慰剂组中，膝关节骨组织的面积大大减少，几乎不存在，表明骨组织已经大部分被溶解，并且图片中肿瘤细胞几乎占据整张图片，表明癌细胞的数量非常之多。又通过对切片进行TRAP染色，得到图11，可以看到安慰剂组、单药奥拉帕尼组和唑来膦酸盐组均含有较多的破骨细胞，且盘踞于膝关节的周围和内部；而联合用药组中的破骨细胞数量大大减少，属于正常的范围内，并没有如其他三组那般异常活跃。

又分别对图11的H&E图和图11的TRAP图进行定量分析，得到图12和图13。在图12中，计算了四组关节处的骨组织剩余体积与骨组织总体积的比值，并绘制了柱状图(图中黑色线条表示的是每组的平均值，条形柱状的高低表示的该组数值的最大值到最小值，是每只只小鼠关节处的骨组织剩余体积与骨组织总体积的具体数值组成的范围)，可以看出，安慰剂组和奥拉帕尼组的比值范围几乎相同，且没有显著性差异；单药唑来膦酸组的比值范围在30％左右，相较于安慰剂组，有了明显提高，且具有显著性差异；而联合用药组的比值范围在35％左右，相较于其他三组，比值最高，表明联合用药组中骨溶解的体积最少。

图13中，奥拉帕尼组和安慰剂组的破骨细胞数目都较多，且差别不大；而唑来膦酸组和联合用药组的破骨细胞数目几乎只有安慰剂组的一半，大致在50～60左右，均处于较低水平，且跟安慰剂组均有显著性差异。

图14为对上述实验的总体生存率分析及无骨转移生存率分析。图14a为总体生产率率(存活小鼠数/所有小鼠数)，对比各组可发现，随时间增加，安慰剂组总体生存率最低，出现死亡小鼠时间最早，单药奥拉帕尼或单药唑来膦酸组生存率居中，出现死亡小鼠时间也居中，而双药联合用药组小鼠生存率最高，出现死亡小鼠时间最晚。图14b为无骨转移发生率(未发生可探测骨转移灶小鼠数/所有小鼠数)，对比各组可发现，安慰剂组，单药奥拉帕尼和单药唑来膦酸组出现骨转移时间早于双药联合用药组，而安慰剂组小鼠无骨转移发生率更低，单药奥拉帕尼和单药唑来膦酸组无骨转移发生率居中，双药联合组无骨转移发生率最高。

综上所述，这些结果表明奥拉帕尼和唑来膦酸盐联合治疗在减少骨转移方面具有强大的协同作用。

5、在骨转移发生后，奥拉帕尼和唑来膦酸联合使用对于骨转移的治疗效果

与上述“在骨转移发生前，奥拉帕尼和唑来膦酸联合使用对于骨转移的预防效果”的试验过程大体一致，只是将“(2)在IC注射的第4天对小鼠进行治疗”改为“(2)在IC注射的第11天对小鼠进行治疗”，一般来说，对小鼠进行肿瘤细胞IC注射七天，就会产生骨转移，如图15所示的治疗过程，这模拟了使用奥拉帕尼时已经发生骨转移的中晚期乳腺癌患者的临床治疗。治疗为期1个月左右。结果见图16和图17。

如图16所示，在第49天时，联合用药组的生物荧光相对强度为32，相比于安慰剂组(安慰剂组为724.07)降低了95.58％，具有显著性差异；该数据表明联合用药组可以大大降低骨转移癌的数目，进而控制骨转移癌对于骨的破坏；单药唑来膦酸为181.02，奥拉帕尼为388.02，相对于安慰剂组分别降低了75％和46.41％，远远低于联合用药组；并且在终点时，单药奥拉帕尼组与安慰剂组没有显著性差异，在35天左右时，奥拉帕尼杀伤效果较之前减弱(与安慰剂组之间的差距减小),表明其对于骨转移肿瘤细胞没有良好的杀伤或抑制作用。

6、不同配比的奥拉帕尼和唑来膦酸联合使用的抗癌效果

将聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂与双膦酸盐化合物和/或地舒单抗和药物分别改为如表1所示，具体过程与“在骨转移发生后，奥拉帕尼和唑来膦酸联合使用对于骨转移的治疗效果”的过程相同，只是将药物进行改变，之后进行生物荧光成像，得到其抗癌效果。

骨转移肿瘤细胞数目的降低率＝(安慰剂组的骨转移肿瘤细胞的相对生物荧光强度-试验例组或对比例组的骨转移肿瘤细胞的相对生物荧光强度)/安慰剂组的骨转移肿瘤细胞的相对生物荧光强度。

通过图17可知，本申请中的双膦酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂能够发挥联合作用，显著提高了对于骨转移癌的治疗和预防效果，相对于安慰剂组(图16中的安慰剂组)，对于骨转移癌细胞数目的降低率均在85％以上；而对比例1～3中的药物均只是发挥各自的作用，并没有产生联合的作用，即紫杉醇和唑来膦酸、奥拉帕尼和雷洛昔芬没有产生效果上的提升，其在治疗骨转移癌时，并不能进行相互配合，达到联合用药的效果。尤其是这是由于紫杉醇靶向性差而导致的骨髓抑制作用限制了其治疗骨转移的疗效，即使搭配上唑来膦酸，两者仍不能发挥较好的抗骨转移癌的作用，反而进一步降低了效果。试验例2中的雷洛昔芬通常用于治疗骨质疏松，其具有致癌性的副作用；与奥拉帕尼联用可能没有协同杀伤的作用，有时也会出现拮抗的效果。

另外，在试验例中，唑来膦酸和奥拉帕尼的效果数据最好，奥拉帕尼对PARP蛋白的捕获能力适中且可适用于乳腺癌的骨转移，并且唑来膦酸是第3代具有杂环结构的含氮双膦酸盐，作用强度和疗效比其他双磷酸盐进一步提高；综上，奥拉帕尼和唑来膦酸的组合是相对来说最优组合，效果最好，两者之间相对于其他试验例具有更好的相互配合关系，从而能够达到更优的治疗效果。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种用于制备预防骨转移癌药物的组合物，其特征在于，包括双膦酸盐化合物和/或地舒单抗以及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂包括奥拉帕尼、尼拉帕尼、卢卡帕尼、氟唑帕尼、帕米帕尼、微利帕尼、他拉唑帕尼中的至少一种；

所述双膦酸盐化合物包括帕米膦酸、奈立膦酸、奥帕膦酸、阿仑膦酸、英卡膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸、唑来膦酸、依替膦酸、氯膦酸、替鲁膦酸中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂为奥拉帕尼或其药学上可接受的盐；所述双膦酸盐化合物为唑来膦酸或其药学上可接受的盐。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，双膦酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的质量比为(2～50):(1～100)。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，双膦酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的质量比为(2～30):(1～50)。

6.一种用于制备治疗骨转移癌药物的组合物，其特征在于，包括双膦酸盐化合物和/或地舒单抗以及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂包括奥拉帕尼、尼拉帕利、卢卡帕利、氟唑帕利、帕米帕利、微利帕利、他拉唑帕尼中的至少一种；

所述双膦酸盐化合物包括帕米膦酸、奈立膦酸、奥帕膦酸、阿仑膦酸、英卡膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸、唑来膦酸、依替膦酸、氯膦酸、替鲁膦酸中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂为奥拉帕尼或其药学上可接受的盐；所述双膦酸盐化合物为唑来膦酸或其药学上可接受的盐。

9.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，双膦酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的质量比为(2～50):(1～100)。

10.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，双膦酸盐化合物和/或地舒单抗与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的质量比为(2～30):(1～50)。

11.一种骨转移癌药物，其特征在于，包括权利要求1～10任一所述的组合物或该组合物和药学上可接受的辅料的混合。

12.根据权利要求11所述的骨转移癌药物，其特征在于，所述骨转移癌药物的制剂包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、汤剂、丸剂、口服液、酊剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂、注射剂中的至少一种。

13.权利要求11～12任一项所述的骨转移癌药物在预防或治疗骨转移癌中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述骨转移癌为溶骨性或混合性骨转移癌。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述溶骨性骨转移癌包括乳腺癌骨转移癌、肺癌骨转移癌、胰腺癌骨转移癌、前列腺骨转移癌中的至少一种。