CN117460834A

CN117460834A - 抗微生物肽

Info

Publication number: CN117460834A
Application number: CN202280036635.XA
Authority: CN
Inventors: J·M·杰恩斯; C·C·亚特斯
Original assignee: Ginor Co
Current assignee: Ginor Co
Priority date: 2021-03-23
Filing date: 2022-03-22
Publication date: 2024-01-26
Also published as: WO2022204079A1; US20220307048A1; BR112023019519A2; CA3213018A1

Abstract

本发明包括由SEQ ID NO：1‑20中的至少一个组成、基本上由SEQ ID NO：1‑20中的至少一个组成或包含SEQ ID NO：1‑20中的至少一个的抗微生物肽，编码所述肽的核酸，使用所述抗微生物肽产生植物的方法，所述植物表达足以赋予所述植物对病原细菌和真菌的抗性的肽，所述核酸通过细胞生产，诸如发酵，或(多种)抗微生物肽的植物生产系统来生产肽的用途，和在喷雾或其它混合物中分离的(多种)抗微生物肽处理植物以保护它们免患疾病的用途。

Description

抗微生物肽

发明的技术领域

本发明总体上涉及抗微生物肽领域，并且更具体地涉及针对宽范围的植物病原细菌和真菌具有高生物活性、对非目标物种具有降低的毒性的抗微生物肽。

联邦政府资助的研究的声明

不适用。

通过引用并入以光盘提交的材料

本申请包括已经以ASCII格式经由EFS-Web提交的序列表，并且在此通过引用以其整体并入。ASCII副本创建于2022年3月9日，被命名为GEVN2000WO ST25.txt，并且其大小是5785字节。

发明的背景

在不限制本发明的范围的情况下，就抗微生物肽描述其背景。

人类的福祉与植物的有效栽培有着密不可分的紧密联系。植物疾病是破坏性的，并且有时候是灾难性事件。例如，晚疫病，一种由真菌病原体感染引发的疾病，因其对马铃薯作物的毁坏而造成一百万人饿死并且迫使另外两百万人移民到北美洲(1845-60年的臭名昭著的爱尔兰马铃薯饥荒)。明显地，植物疾病的经济和社会影响可以是巨大的。据估计，多达三分之一的人类的作物损失总量可以直接归因于植物疾病。

发明概述

在一个实施方案中，本发明包括抗微生物肽，其由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成、基本上由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成或者包含SEQ ID NO：1-20中的至少一个。一方面，抗微生物肽与肽或多肽融合。另一方面，其它肽是标签、信号肽或抗原决定簇。另一方面，抗微生物肽经由接头与肽或多肽融合。

在另一个实施方案中，本发明包括核酸分子，其编码一种或多种肽，所述肽由SEQID NO：1-20中的至少一个组成、基本上由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成或者包含SEQID NO：1-20中的至少一个。

在另一个实施方案中，本发明包括表达载体，其包含编码肽的核酸分子，所述肽由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成、基本上由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成或者包含SEQ ID NO：1-20中的至少一个。

在另一个实施方案中，本发明包括包含载体的可以在细胞培养中生长的宿主细胞，所述载体包含编码肽的核酸分子，所述肽由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成、基本上由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成或者包含SEQ ID NO：1-20中的至少一个。

在另一个实施方案中，本发明包括生产抗微生物肽的方法，所述抗微生物肽由SEQID NO：1-20中的至少一个组成、基本上由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成或者包含SEQID NO：1-20中的至少一个，所述方法包括培养宿主细胞和收集所产生的肽。另一方面，宿主细胞是细菌、真菌、植物或昆虫细胞。

在另一个实施方案中，本发明包括处理植物的方法，其包括使植物接触足以预防或治疗传染病的量的SEQ ID NO：1-20中至少一个的肽。另一方面，所述传染病由细菌或真菌感染引起。另一方面，所述传染病是葡萄孢属(Botrytis sp.)、棒状杆菌属(Clavibaceter sp.)、炭疽菌属(Colletotrichum sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、黄单胞菌属(Xanthomas sp.)、丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、轮枝菌属(Verticillium sp.)、亚隔孢壳属(Didymella sp.)或镰刀菌属(Fusarium sp.)。另一方面，被处理的植物选自玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或小米。另一方面，通过喷洒在植株、叶片、根、嫩枝或土壤上来处理植物。

在另一个实施方案中，本发明包括试剂盒，其包含抗微生物肽，所述抗微生物肽由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成、基本上由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成或者包含SEQ ID NO：1-20中的至少一个。

在另一个实施方案中，本发明包括重组表达盒，其包含可操作地连接至启动子的核酸分子，所述核酸分子具有编码肽的核酸分子的多核苷酸序列，所述肽由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成、基本上由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成或者包含SEQ ID NO：1-20中的至少一个。

在另一个实施方案中，本发明包括包含重组表达盒的宿主细胞，所述重组表达盒包含可操作地连接至启动子的核酸分子，所述核酸分子具有编码肽的核酸分子的多核苷酸序列，所述肽由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成、基本上由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成或者包含SEQ ID NO：1-20中的至少一个。

在另一个实施方案中，本发明包括包含重组表达盒的转基因植物细胞，所述重组表达盒包含可操作地连接至启动子的核酸分子，所述核酸分子具有编码肽的核酸分子的多核苷酸序列，所述肽由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成、基本上由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成或者包含的SEQ ID NO：1-20中的至少一个。

在另一个实施方案中，本发明包括包含重组表达盒的转基因植物，所述重组表达盒包含可操作地连接至启动子的核酸分子，所述核酸分子具有编码肽的核酸分子的多核苷酸序列，所述肽由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成、基本上由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成或者包含SEQ ID NO：1-20中的至少一个。另一方面，转基因植物是玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或小米。

在另一个实施方案中，本发明包括来自转基因植物的转基因种子，其中所述转基因植物是玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或小米。

附图简述

为了更完整的理解本发明的特征和优点，现在连同附图参考本发明的详细描述，并且其中：

图1显示本发明的肽对不同微生物物种的活性。

发明详述

虽然下面详细讨论了本发明的各种实施方案的形成和使用，但是应当理解的是，本发明提供了能够体现在很多具体上下文中的很多可应用的发明构思。本文讨论的具体实施方案仅仅是对形成和使用发明的具体方式的说明，并非界定发明的范围。

为了便于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有在本发明相关领域中的普通技术人员通常理解的含义。术语，诸如“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”并非旨在仅指单一实体，而是包括可以使用具体实例进行说明的一大类。本文的技术术语用于描述发明的具体实施方案，但是它们的使用并非界定发明，权利要求中概述的除外。

在本发明的过程中，这些肽已经通过实验证实发挥期望的效果，并且因此提供了要求保护的发明的广泛的示例性基础。在一个实施方案中，本发明的肽与其它肽或多肽融合。

通过将本发明的肽与其它肽或多肽融合，形成了融合肽或融合多肽，即包含本发明的肽的至少两部分分子。融合肽或融合多肽可以超出如上定义的肽的长度，即形成超过30个氨基酸的氨基酸序列，其被定义为根据本发明的多肽，该术语与术语“蛋白”可互换地使用。优选地，其它肽不具有抗微生物或抗病毒活性。供选择地，其它肽显示抗微生物或抗病毒活性。因此，根据本发明可想到是，两个本发明的肽形成融合肽或融合多肽。本发明的融合肽或融合多肽能够根据本文描述的用于生产本发明的肽的方法来生产和分离。

在一个实施方案中，其它肽是标签、信号肽、抗原决定簇或者治疗活性肽，诸如细胞因子。能够与本发明的肽融合的合适的多肽是可以例如提高本发明的肽的溶解度和/或促进其纯化的多肽。如果肽是通过重组方法生产的，那么标签可以用于纯化的目的。在该方面，示例性的标签是本身本领域已知的6xHis-标签、HA-标签或FLAG-标签。另一方面，标签也可以用于将本发明的肽靶向器官或组织，其中细胞表达标签结合的特定抗原。因此，标签可以是例如受体的肽配体。抗原决定簇实现经由抗体亲和柱纯化融合肽。信号肽是能够将它们连接的肽或蛋白引导到不同细胞区室或者引导到细胞外空间的短氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本发明的肽经由接头与其它肽或多肽融合。与本发明有关的接头用于将本发明的肽与其它肽或与多肽连接。接头用于在物理上分开本发明的肽和其它肽或多肽，并且确保本发明的肽和其它(多种)肽或(多种)多肽都不因为彼此接近而在其功能上受到限制。取决于其它肽或多肽，接头可以是肽键、氨基酸、合适长度的肽或者提供期望的特征的不同分子。技术人员基于他/她的公知常识知晓如何设计合适的接头分子，特别是接头肽。例如，肽接头可以从LIP(Loops in Proteins)数据库(Michalsky等人，2003)选择。接头可以添加到N-末端或C-末端，或者，如果认为合适，也可以添加到除本发明的肽的末端氨基酸以外的氨基酸。接头优选位于N-末端。在一个实施方案中，接头是赖氨酸、甘氨酸、丝氨酸、醚、酯或二硫化物。

在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的肽或融合肽(与另一种肽或多肽融合)的核酸分子。

如本文使用的，术语“核酸分子”或“多核苷酸”是指DNA，诸如cDNA或基因组DNA，和RNA。还包括本领域已知的核酸模拟分子，诸如DNA或RNA的合成的或半合成的衍生物，和混合聚合物。这样的根据本发明的核酸模拟分子或核酸衍生物包括硫代磷酸核酸、磷酰胺核酸、2’-O-甲氧基乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(HNA)和锁核酸(LNA)(参见Braasch和Corey，Chem Biol 2001，8：1)。LNA是其中核糖环被2’-氧和4’-碳之间的亚甲基键限制的RNA衍生物。如本领域技术人员将容易理解的，它们可以包括另外的非天然的或衍生的核苷酸碱基。

技术人员将容易理解的是，由于遗传密码的简并性，超过一种或多种核酸可以编码本发明的肽。因为由四个碱基组成的三联体碱基密码标示20种蛋白氨基酸中的每一种和一个终止密码子，造成简并性。三联体中碱基的可能的4³种可能性产生64种可能的密码子，意味着一些简并性必然存在。因此，一些氨基酸由超过一个的三联体，即由至多六个三联体编码。简并性主要是由三联体中第三位置的变化引起的。这意味着具有不同序列、但仍编码相同多肽的核酸分子在本发明的范围内。

本发明还包括表达载体，其包含编码本文中的肽的本发明的核酸分子。表达载体包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者例如在分子生物学工程中常规使用的另外的载体。

本发明的(多种)核酸分子可以被插入到若干市售载体中。非限制性的实例包括原核质粒载体，诸如pUC-系列、pBluescript(Stratagene)、pET-系列的表达载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)、lambda gt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1和与哺乳动物细胞中的表达相容的载体，如pREP(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)、pSPORT1(GIBCOBRL)、pGEMHE(Promega)、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(EdgeBiosystems)pTriEx-Hygro(Novagen)和pClNeo(Promega)。适合于毕赤酵母(Pichiapastoris)的质粒载体的实例包括例如质粒pAO815、pPIC9Kh和pPIC3.5K(都购自Invitrogen)。

本发明的核酸分子也可以被插入到载体中，以便产生与另一核酸分子的转译融合。其它核酸分子可以编码蛋白，所述蛋白可以例如提高本发明的核酸分子编码的蛋白的溶解度和/或促进其纯化。非限制性的实例包括pET32、pET41、pET43。此外，其它核酸分子可以编码肽或蛋白，所述肽或蛋白能够抵消本发明的抗微生物肽的毒性，否则所述毒性会伤害或杀死宿主细胞。

载体也可以包含另外的可表达的多核苷酸，其编码一种或多种分子伴侣，以促进正确的蛋白折叠。合适的细菌表达宿主包括例如衍生自BL21的菌株(诸如BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)PRARE)或对于载体修饰技术，参见Sambrook和Russel(2001)。通常，载体可以包含用于克隆或表达的一个或多个复制起点(ori)和遗传系统，用于在宿主中筛选的一种或多种标志物，例如抗生素耐药性，和一个或多个表达盒。合适的复制起点包括例如Col E1、SV40病毒和M13复制起点。

插入载体的编码序列可以例如通过标准方法合成或者从天然来源分离。将编码序列连接到转录调控元件和/或连接到其它氨基酸编码序列可以使用已建立的方法来实现。确保在原核细胞或真核细胞中表达的转录调控元件(表达盒的部分)是本领域技术人员已知的。这些元件包括确保转录起始的调控序列(例如，翻译起始密码子、启动子、增强子和/或绝缘子)、内部核糖体进入位点(IRES)(Owens等人，2001)和任选地确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。另外的调控元件可以包括转录增强子以及翻译增强子，和/或天然相关的或异源启动子区。优选地，本发明的核酸分子可操作地连接到这样的实现在原核细胞或真核细胞中表达的表达控制序列。载体可以进一步包括编码信号肽的核苷酸序列作为其它调控元件。这样的序列是本领域技术人员熟知的。此外，取决于使用的表达系统，能够将表达的多肽引导到细胞区室的前导序列可以被添加到本发明的核酸分子的编码序列。这样的前导序列是本领域熟知的。本发明还包括实现DNA在不同宿主，诸如细菌-真菌细胞或细菌-动物细胞之间穿梭的载体。

根据本发明的表达载体能够指导本发明的核酸分子和由其编码的肽、融合肽或融合多肽的复制和表达。合适的表达载体如上所述。

如本文上述的本发明的核酸分子可以被设计为直接导入细胞或者经由脂质体、噬菌体载体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)导入细胞。另外，杆状病毒系统或者基于痘苗病毒或塞姆利基森林病毒的系统能够用作本发明核酸分子的真核表达系统中的载体。源自病毒，诸如逆转录病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可以用于将多核苷酸或载体递送到目标细胞群。本领域技术人员熟知的方法可以用来构建重组病毒载体；参见，例如，Sambrook，2001和Ausubel，2001中描述的技术。

合适的原核宿主细胞包括例如埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)或芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌。值得注意的是，对于使用原核宿主细胞的情况，如果单独表达的肽会对原核细胞有毒，则本发明的载体包含本发明的融合肽或融合多肽。

本发明也能够在真核细胞中表达。合适的真核宿主细胞是例如酵母，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。适合于表达的昆虫细胞是例如果蝇(Drosophila)S2细胞或夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞。为了能够以足够的量表达本发明的肽，如果单独表达本发明的肽会对宿主细胞有毒，则通常由本发明的载体编码融合肽或融合多肽。这能够由技术人员使用常规生物技术方法，诸如测试表达而容易地确定。

本发明已经设计了新的一类抗微生物肽(表1)，其针对宽范围的植物致病细菌和真菌具有高生物活性的优越性质，对非目标物种具有降低的毒性。

表1.抗微生物肽

方法学.最小杀细菌(杀真菌)浓度

MBC值代表完全杀死菌群的最低浓度，致使MBC平板中无生长。结果将在24至96小时孵育之后从测试面板通过目测评分确定。为了确定最小杀细菌浓度(MBC)值，检查MBC平板的孔中的浊度(目测)。另外，用微量滴定板读数器获得在595nm处的光密度测量值(OD595)。透明的孔(OD595＜0.1)是合适的孵育期之后杀细菌活性的证据。

MBC手工接种测试：

按照每种菌株每次实验一次重复进行以下过程。最小杀细菌浓度(MBC)结果的周转时间需要24-72小时。

接种物制备：推荐将浊度标准技术用于细菌菌株的直接接种。

使用低温储存物(在-70℃下)，将上面列出的细菌生物体的第一代传代培养物划线接种在生物体特异性培养基(OSM)上，如4.0节所规定的。

在生物体特定温度下孵育如4.0节所述的所需的孵育时间，并且将封口膜包裹的平板储存于4±1℃下。

将来自第一代传代培养物的第二代传代培养物划线接种在OSA上。在生物体特定温度下孵育所需的孵育时间。第二代传代培养物应当在其首次从孵育中移出的时间起32小时之内使用。

对于细菌菌株：

从OSA上的继代培养物中选择大约4-5个大的或5-10个小的、充分分离的菌落。

在无菌玻璃试管中的3mL无菌蒸馏去离子水中进行乳化，并且充分混合。如果需要，进行调整以达到相当于0.5麦克法兰标准悬浮液的浊度，以提供每mL 1.5x10⁸个细胞的期望接种物密度。供选择地，在分光光度计中在625nm波长处测量吸光度，采用水作为空白。进行调整以达到0.08-0.13之间的吸光度。

用移液管将30μL的标准悬浮液移至3mL的在磷酸盐缓冲液中阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤中，并且充分混合。该混合物应当提供1x10⁶CFU/mL的接种物密度。连续稀释并点板(spot plate)以确认细胞密度并查明接种物是否满足CLSI要求。

对于丝状真菌：

使用无菌镊子或刀片从琼脂平板取一部分真菌，并且放入含有至少50mL OSB的培养瓶中。进行涡旋以破碎一些接种物片段。

在菌株特定温度下放置在110RPM+的振荡器上，以确保良好通风进行快速生长达到7天。

一旦观察到足够量的生长，将肉汤培养物移到离心管并以3000x g快速旋转10分钟，缓慢倒入并重新悬浮于OSB中直至达到容器总体积的～2/3。

使用无菌均质机将探针插入重新悬浮的培养物中并且进行均质化直至其形成均匀悬浮液。

如果需要，稀释悬浮液以在攻击培养基(challenge media)中实现目标接种物浓度。

通过检查点板到非选择性培养基上的生长对照结果来进行纯度检查。在16-20小时孵育之后，如果琼脂平板上存在混合培养物，那么有必要重新测试。

抗生素平板的接种：

用20μL的接种物(来自步骤6.1.6)接种至除无菌对照孔之外的每个孔中。用移液管将200μL的生物体攻击培养基OCM移至阴性对照孔中。该步骤应当在从步骤6.1.6制备接种物之后30分钟之内完成。

用盖子覆盖平板。

在室温22±2℃保温箱中将接种的抗微生物组(panel)孵育4小时。

通过连续稀释和点板确定MBC：

在规定的接触时间(2和4小时)之后，将来自攻击平板(challenge plate)的每个孔的100μL放入96孔微量滴定板的第一行。

将180μL的无菌生理盐水放入其余的行中。

通过向8行的每一行逐行转移20μL来准备连续稀释(100-10-7)。

从每个孔取出10μL并且将其在4.0节列出的准备好的OSA平板上点板。

接种的平板在37±2℃下孵育16-24小时，或者在25±2℃下孵育72-120小时，并且在合适的孵育时间之后对菌落的数目进行计数。

将数据评价为每孔回收的总CFU。

MBC的确定：

在规定的接触时间之后，从攻击平板的每个孔移出20μL并将其放入含有180μLOSM的新的96孔Nunc平板的对应孔中。这将在合适的条件下(24或72小时；4.0节)进行孵育。通过基于孔的浊度对生长计分+/-来确定MBC结果。

可以预期的是，就本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物而言，本说明书中讨论的任何实施方案都能够实施，并且反之亦然。此外，本发明的组合物能够用来实现本发明的方法。

应理解的是，本文中描述的具体实施方案通过举例说明的方式显示并且不作为对本发明的限制。本发明的主要特征能够在不脱离本发明的范围的情况下以各种实施方案被运用。本领域技术人员将认识到或者仅使用常规的实验就能够确定本文描述的具体过程的众多等同方案。这样的等同方案被认为是在本发明的范围之内并且被权利要求所涵盖。

本说明书中提到的所有出版物和专利申请都表示本发明所属领域中的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，其程度如同与每个单独的出版物或专利申请被明确地且单独地指明通过引用并入。

使用的词语“一(a)”和“一(an)”当与权利要求和/或说明书中的术语“包括(comprising)”一起使用时可以是指“一”，但是其也与“一或多”、“至少一”和“一或多于一”的意思一致。权利要求中术语“或”的使用用于指“和/或”，除非明确指示仅指代供选择的方案或供选择的方案相互排斥，尽管本公开内容支持仅指代供选择的方案和“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“约”用来表示数值包括用于确定数值的装置、方法的误差的固有变化，或者研究对象之间存在的变化。

如本说明书和(多项)权利要求书中使用的，词语“包含(comprising)”(和包含的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has))、“包括(including)”(和包括的任何形式，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和含有的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。在本文提供的组合物和方法中的任何一个的实施方案中，“包含”可以被“基本上由......组成”或“由......组成”替换。如本文使用的，短语“基本上由......组成”要求指定的(多个)整体或步骤以及不会实质地影响要求保护的发明的特征或功能的那些。如本文使用的，术语“组成(consisting)”用来表示只存在列举的整体(例如，特征、要素、特性、性质、方法/过程步骤或限制)或者整体的组(例如，(多个)特征、(多个)要素、(多个)特性、(多个)性质、方法/过程步骤或(多个)限制)。

如本文使用的术语“或其组合”是指术语前面列出的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括如下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在具体上下文中顺序是重要的，那么还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是包含一个或多个项目或术语的重复的组合，诸如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB和诸如此类。技术人员将理解，通常，在任何组合中，对项目或术语的数量都没有限制，除非另外从上下文中显而易见。

如本文使用的，近似词语，诸如但不限于，“约(about)”、“基本的(substantial)”或“基本上(substantially)”是指当如此修饰时，被理解为未必是绝对的或完全的，但将被认为对本领域普通技术人员而言足够接近以保证指定条件为存在的条件。描述可以变化的程度将取决于能够做出多大的改变，并且仍然使本领域普通技术人员认识到修饰后的特征仍然具有未修饰特征的所需的特性和能力。一般来说，但受限于前述讨论，本文中通过诸如“约”的近似词语修饰的数值可以由所述值变化至少±1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、10％、12％或15％。

另外，本文提供的章节标题是为了与37CFR 1.77中的建议保持一致，或以其它方式提供组织线索。这些标题不应限制或表征可以从本公开内容中得出的任何权利要求中提出的(多个)发明。具体地并且通过示例的方式，尽管标题是指“发明领域”，但这样的权利要求不应受到该标题下描述所谓技术领域的语言的限制。此外，“发明的背景”部分中的技术描述不应被解释为承认技术是本公开内容中任何(多个)发明的现有技术。“概述”也不应被认为是发布的权利要求中提出的(多个)发明的特征。此外，本公开内容中任何以单数形式对“发明”的提及都不应被用来主张本公开内容中只有单个新颖之处。根据本公开内容发布的多项权利要求的限制，可以提出多个发明，并且这样的权利要求相应地定义了由此被保护的(多个)发明及其等同方案。在所有情况下，这样的权利要求的范围应根据本公开内容的本身优点进行考虑，但不应受到本文陈述的标题的限制。

本文中公开和要求保护的所有组合物和/或方法能够在没有过度实验的情况下根据本公开内容而被做出和实施。虽然本发明的组合物和方法已经就优选实施方案进行了描述，但是对本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对本文描述的组合物和/或方法和在方法的步骤中或在步骤顺序中进行变化。对本领域技术人员显而易见的所有这样类似的替代和修改被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和构思内。

为了帮助专利局和基于本申请发布的任何专利的任何读者解释所附的权利要求，申请人希望注意，他们不打算因为35U.S.C.§112的第6段、U.S.C.§112第(f)段，或等同内容在本申请提交之日存在，就让所附的任何权利要求对其援引，除非在具体权利要求中明确使用了词语“用于......的手段”或“用于......的步骤”。

对于权利要求的每一项，只要在先权利要求为权利要求的术语或要素提供了适当的引用基础，那么每项从属权利要求就能够从属于独立权利要求和每项权利要求的先前从属权利要求中的每一项。

序列表

<110> 吉诺尔公司

J·M·杰恩斯

C·C·亚特斯

<120> 抗微生物的肽

<130> FIC23210099P

<150> US 63/164,832

<151> 2021-03-23

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV155

<400> 1

Phe Lys Leu Arg Ala Lys Val Lys Ile Arg Leu Arg Ala Lys Ile Lys

1 5 10 15

Leu

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV176

<400> 2

Phe Lys Ile Lys Ala Arg Leu Arg Val Lys Ile Lys Ala Arg Leu Lys

1 5 10 15

Leu

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV178

<400> 3

Phe Arg Ile Arg Ala Lys Val Lys Leu Arg Ile Arg Ala Lys Val Arg

1 5 10 15

Leu

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV179

<400> 4

Phe Arg Val Lys Ala Arg Ile Arg Leu Lys Val Lys Ala Arg Ile Arg

1 5 10 15

Leu

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV181

<400> 5

Lys Ala Arg Leu Lys Phe Cys Phe Lys Gly Leu Cys Ile Lys Ile Lys

1 5 10 15

Val Arg

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV182

<400> 6

Lys Ile Lys Ala Arg Leu Cys Leu Gly Lys Phe Cys Ile Lys Ala Arg

1 5 10 15

Leu Lys

<210> 7

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV183

<400> 7

Lys Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Lys Phe Lys Lys Ala Cys Phe Lys

1 5 10 15

Gly Leu Cys Ala Lys Lys Phe Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys

20 25 30

<210> 8

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV184

<400> 8

Lys Phe Ala Lys Lys Phe Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Cys Phe Lys

1 5 10 15

Gly Leu Cys Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Lys Phe Lys Lys Ala Phe

20 25 30

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV185

<400> 9

Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Lys Lys Cys

1 5 10 15

Arg

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV186

<400> 10

Arg Cys Lys Lys Tyr Cys Ile Gly Arg Tyr Cys Val Arg Phe Cys Trp

1 5 10 15

Lys

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV187

<400> 11

Lys Phe Cys Trp Arg Val Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Phe Lys Lys Cys

1 5 10 15

Arg

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV188

<400> 12

Arg Cys Lys Lys Phe Cys Ile Gly Arg Tyr Cys Val Arg Trp Cys Phe

1 5 10 15

Lys

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV189

<400> 13

Arg Phe Cys Phe Lys Val Cys Phe Lys Gly Ile Cys Tyr Lys Lys Cys

1 5 10 15

Lys

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV190

<400> 14

Lys Cys Lys Lys Tyr Cys Ile Gly Lys Phe Cys Val Lys Phe Cys Phe

1 5 10 15

Arg

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV191

<400> 15

Arg Phe Cys Phe Lys Val Cys Phe Lys Gly Ile Cys Phe Lys Lys Cys

1 5 10 15

Lys

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV192

<400> 16

Lys Cys Lys Lys Phe Cys Ile Gly Lys Phe Cys Val Lys Phe Cys Phe

1 5 10 15

Arg

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV193

<400> 17

Lys Phe Cys Phe Arg Val Cys Arg Arg Gly Ile Cys Phe Arg Arg Cys

1 5 10 15

Arg

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV194

<400> 18

Lys Phe Cys Phe Arg Val Cys Phe Arg Arg Ile Cys Phe Arg Arg Cys

1 5 10 15

Arg

<210> 19

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV195

<400> 19

Arg Gly Gly Lys Leu Cys Tyr Cys Arg Lys Arg Phe Cys Val Cys Val

1 5 10 15

Gly Lys

<210> 20

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的（Synthetic）: GV196

<400> 20

Lys Gly Val Cys Val Cys Phe Arg Lys Arg Cys Tyr Cys Leu Lys Gly

1 5 10 15

Gly Arg

Claims

1.一种抗微生物肽，其由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成、基本上由SEQ ID NO：1-20中的至少一个组成或者包含SEQ ID NO：1-20中的至少一个。

2.权利要求1所述的抗微生物肽，其与其它肽或多肽融合。

3.权利要求2所述的抗微生物肽，其中所述其它肽是标签、信号肽或抗原决定簇。

4.权利要求2所述的抗微生物肽，其经由接头与所述其它肽或多肽融合。

5.一种核酸分子，其编码一种或多种权利要求1所述的肽。

6.一种表达载体，其包含权利要求5所述的核酸分子。

7.一种可以在细胞培养中生长的宿主细胞，其包含权利要求6所述的载体。

8.一种生产权利要求1所述的肽的方法，其包括培养权利要求7所述的宿主细胞和收集所产生的肽。

9.权利要求8所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌、真菌、植物或昆虫细胞。

10.一种处理植物的方法，其包括使植物接触足以预防或治疗传染病的量的SEQ IDNO：1-20中的至少一个的肽。

11.权利要求10所述的方法，其中所述传染病由细菌或真菌感染引起。

12.权利要求10所述的方法，其中所述传染病是葡萄孢属(Botrytis sp.)、棒状杆菌属(Clavibaceter sp.)、炭疽菌属(Colletotrichum sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、黄单胞菌属(Xanthomas sp.)、丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、轮枝菌属(Verticillium sp.)、亚隔孢壳属(Didymella sp.)或镰刀菌属(Fusarium sp.)。

13.权利要求10所述的方法，其中被处理的植物选自玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或小米。

14.权利要求10所述的方法，其中通过喷洒在植株、叶、根、嫩枝或土壤上来处理所述植物。

15.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的肽或融合肽。

16.一种重组表达盒，其包含可操作地连接至启动子的核酸分子，所述核酸分子具有权利要求5所述的核酸的多核苷酸序列。

17.一种宿主细胞，其包含权利要求16所述的重组表达盒。

18.一种转基因植物细胞，其包含权利要求16所述的重组表达盒。

19.一种转基因植物，其包含权利要求16所述的重组表达盒。

20.权利要求6所述的转基因植物，其中所述植物是玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或小米。

21.一种转基因种子，其来自权利要求19所述的转基因植物。