CN117460516A - 用于治疗艰难梭菌感染的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于治疗艰难梭菌感染的免疫原性组合物。

Description

用于治疗艰难梭菌感染的方法和组合物
交叉引用
本申请要求2021年4月2日提交的美国临时申请第63/170,250号的权益，其内容通过引用整体并入本文。
序列表
本申请含有已以ASCII格式电子提交的序列表，并通过引用整体并入于此。ASCII副本创建于2022年4月1日，名为51744-701.601_SL.txt，大小为114,688字节。
背景技术
艰难梭菌(Clostridiodes difficile，C.difficile)感染(CDI)是一种由产孢细菌艰难梭菌引起的症状性感染。CDI占抗生素相关腹泻病例的约20％，并且能够在结肠中引起危及生命的炎症。需要引发针对CDI的免疫应答的有效方法。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地表明通过引用并入。
发明内容
本文公开了一种组合物，该组合物包含来自艰难梭菌的细胞表面多糖，其中细胞表面多糖是从艰难梭菌富集的PSII抗原，其中组合物的总碳水化合物重量百分比为至少约40％，并且其中从艰难梭菌富集的PSII抗原占总碳水化合物百分比的至少90％。
本文公开了一种组合物，该组合物包含：(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及(b)包含载体蛋白的第一多肽；
其中载体蛋白和艰难梭菌的细胞表面多糖以小于约10∶1至约1∶3的比率存在于组合物中。本文公开了一种组合物，该组合物包含：(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及(b)包含来源于除艰难梭菌之外的生物体的载体蛋白的第一多肽；其中载体蛋白和细胞表面多糖以约10∶1至约1∶10的比率存在于组合物中。
本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)从艰难梭菌富集的细胞表面多糖；(b)第一多肽或编码第一多肽的第一多核苷酸，其中第一多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段；(c)第二多肽或编码第二多肽的第二多核苷酸，其中第二多肽包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段；以及(d)药学上可接受的载体；其中药物组合物具有总碳水化合物百分比，其中总碳水化合物百分比的至少约90％是PSII。
本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)从艰难梭菌富集的细胞表面多糖；(b)包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段的第一多肽；(c)包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段的第二多肽；以及(d)药学上可接受的载体；其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖不与第一多肽或第二多肽缀合。
本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及(b)第一多肽或编码第一多肽的多核苷酸，其中多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段，该类毒素是灭活毒素；其中除艰难梭菌灭活毒素之外，药物组合物包含按重量计小于约5％的艰难梭菌蛋白。
本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)来自艰难梭菌的细胞表面多糖；(b)第一多肽或编码第一多肽的第一多核苷酸，其中第一多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段；(c)第二多肽或编码第二多肽的第二多核苷酸，其中第二多肽包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段；以及(d)药学上可接受的载体；其中第一类毒素是全长毒素A类毒素，并且第二类毒素是全长毒素B类毒素。
本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及(b)第一多肽或编码第一多肽的多核苷酸，其中第一多肽包含艰难梭菌的第一灭活毒素或其片段，其中除艰难梭菌灭活毒素之外，药物组合物包含按重量计小于约5％的艰难梭菌蛋白。本文还公开了一种药物组合物，该药物组合物包含与载体蛋白缀合的艰难梭菌的细胞表面多糖；其中艰难梭菌的细胞表面多糖经由包含1个碳至10个碳原子的化学接头与载体蛋白缀合。
本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)与载体蛋白缀合的来自艰难梭菌的细胞表面多糖；(b)包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段的第一多肽；(c)包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段的第二多肽；以及(d)药学上可接受的载体；其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖经由包含硫代琥珀酰亚胺或硫酯的化学接头与载体蛋白缀合。
本文公开了一种药物组合物，该药物组合物基本上由以下组成：(a)与药学上可接受的载体缀合的来自艰难梭菌的细胞表面多糖；(b)第一多肽或编码第一多肽的第一多核苷酸，其中第一多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段；(c)第二多肽或编码第二多肽的第二多核苷酸，其中第二多肽包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段；以及(d)佐剂。
本文公开了一种治疗、预防或抑制感染的表现或症状的方法，该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本公开的组合物或药物组合物。
本文公开了一种治疗感染的方法，该方法包括：(a)向有需要的对象施用治疗有效量的本公开的组合物或药物组合物；其中感染是艰难梭菌感染；(b)在施用药物组合物之后，收集对象的粪便样品；以及(c)分析粪便样品并确定粪便中艰难梭菌菌落形成单位(CFU)/mg的变化，其是感染的标志。
本文公开了一种治疗感染的方法，该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含：(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及(b)多肽或编码多肽的多核苷酸，其中多肽包含艰难梭菌的类毒素或其片段；其中施用是每周一次或每两周一次，并且其中感染由艰难梭菌引起。
本文公开了一种方法，该方法包括：(a)从以下组中选择对象：(i)第一对象，其中第一对象大于55岁；(ii)第二对象，其中第二对象在6个月内具有艰难梭菌感染的病史；以及(iii)第三对象，其中第三对象具有阳性艰难梭菌菌落形成单位(CFU)/mg计数；以及(b)施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含艰难梭菌的细胞表面多糖；和多肽或编码多肽的多核苷酸，其中多肽包含艰难梭菌的类毒素或其片段。
本文公开了一种治疗感染的方法，该方法包括：(a)鉴定获自对象的生物样品的遗传序列信息，以确定感染的存在，其中感染是艰难梭菌感染；以及(b)向对象施用治疗有效量的包含艰难梭菌的细胞表面多糖的药物组合物。
本文公开了一种治疗感染的方法，该方法包括向有需要的对象施用：(a)治疗有效量的本公开的药物组合物；以及(b)治疗剂；其中感染由艰难梭菌引起。
本文公开了一种治疗感染的方法，该方法包括施用包含艰难梭菌的细胞表面多糖的药物组合物，其中施用导致对细胞表面多糖特异的免疫球蛋白M(IgM)与不存在药物组合物时相比增加至少约250倍。
本文公开了一种富集艰难梭菌的细胞表面多糖的方法，该方法包括：(a)获得一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物(CSE)，和(b)富集来自CSE的艰难梭菌的细胞表面多糖，从而获得富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖；其中富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含按重量计小于约5％的艰难梭菌杂质。
附图说明
图1示出了通过所述过程纯化的PSII的SEC MALS分析和相应参数。
图2示出了TEMPO、CDAP和氨氧基缀合化学方案的概述以及所得的“晶格”样和“星形”样缀合物结构。
图3上图示出了用TEMPO/EDC化学合成的PSII-CRM197缀合物的SEC MALS迹线。下图示出了TEMPO/EDC/PSII-CRM197缀合物的分析总结。
图4上图示出了通过SEC-HPLC分离的用CDAP化学合成的CRM-马来酰亚胺和PSII-CRM197缀合物在280nm(A280)处的吸光度迹线。中间图示出了PSII-CRM197 CDAP缀合物的SEC-MALS迹线和相应确定的组分的MW。下图示出了用于分析PSII-CRM197 CDAP缀合物的SECMALS参数。
图5中的图A示出了SEC分离后的用末端连接的硫醇化学合成的PSII-CRM197缀合物和CRM-马来酰亚胺A280迹线。图B示出了PSII-CRM的SEC-MAL迹线。图C示出了SEC MALS分析、OD280(A280)和间苯二酚测定的分析参数。
图6概述了使用脱氧胆酸钠(DOC)剥离艰难梭菌细胞用于PSII纯化的步骤。
图7概述了PSII纯化的20％乙醇提取阶段的程序。
图8概述了用于纯化PSII的20％乙醇提取材料的第一次TCA沉淀的程序。
图9概述了在第一次TCA沉淀之后超滤/渗滤(UFDF 1)PSII并加入硫酸铵以准备在苯基-琼脂糖凝胶柱上进行疏水作用色谱阶段的程序。
图10概述了将UFDF 1材料施加至苯基-琼脂糖凝胶柱上、收集流穿液和洗涤级分的程序。
图11概述了来自苯基-琼脂糖凝胶柱的合并级分的第二次UFDF(UFDF-2)步骤的程序，以准备在Q-琼脂糖凝胶柱上通过阴离子交换色谱进行分离。
图12概述了将UFDF-2材料施加在Q-琼脂糖凝胶柱上并使用含有300mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(15％的缓冲液B)洗脱PSII的程序。
图13概述了Q-琼脂糖凝胶柱洗脱液的第二次TCA沉淀的程序。
图14概述了第二次TCA沉淀至水中后PSII的超滤/渗滤(UFDF-3)的程序。
图15概述了在3kDa MW截留旋转过滤器上浓缩来自UFDF-3的材料的程序。
图16示出了CDI的预防性免疫和攻击小鼠模型的一般示意图。
图17中的图A示出了各个粪便样品的孢子攻击时间线、免疫时间表和粪便收集时间点。图B示出了治疗性免疫后的艰难梭菌生长，免疫前第0天标准化为基线CFU。
图18示出了从第0天基线CFU开始的艰难梭菌生长％。
图19中的图A示出了用于获得抗PSII IgG数据的免疫时间表。图B示出了在第14天第一次免疫治疗之后2周确定的粪便定殖(CFU/mg粪便)。
图20示出了当用单独的PSII、PSII-CRM197缀合物和PBS对照治疗时，预防性PSII-CRM197缀合物免疫保护小鼠免于体重减轻和症状。
图21A-D示出了来自三个末端连接的PSII-CRM197缀合物的分析的SEC-MALS色谱图数据。图21A示出了3xPSII-CRM197缀合物的SECS-MALS色谱图数据。图21B示出了6xPSII-CRM197缀合物的SECS-MALS色谱图数据。图21C示出了10xPSII-CRM197缀合物的SECS-MALS色谱图数据。图21D示出了3x、6x和10x PSII-CRM197缀合物的SECS-MALS色谱图数据。
图22示出了在用有和无类毒素A和B的PSII-CRM197缀合物免疫后针对CDI的保护。
图23A示出了末端连接的6xPSII-CRM197缀合物的摩尔质量vs体积(mL)数据。图23B比较了样品的缀合物质量、CRM197质量和PSII质量。
图24示出了代表性分析图(6xPSII-CRM)，其在30min处具有PSII-缀合物信号，在38min附近具有PSII和PSII硫醇峰。
图25A-25D示出了缀合物信号中CRM197蛋白和PSII的详细组分的最终SEC MALS分析结果以及组合组分的分析。
图26示出了用PSII-CRM197末端连接的缀合物、PSII-CRM197 CDAP缀合物和媒介物治疗的小鼠在预防性免疫和孢子攻击后的几何平均体重减轻。
图27A-27D示出了艰难梭菌孢子攻击后与CDI相关的体重减轻。图27A示出了小鼠CDI后的体重减轻；图27B示出了与孢子第0天相比，用3∶1的PSII∶CRM197治疗的小鼠第1-14天的体重变化百分比；图27C示出了与孢子第0天相比，用6∶1的PSII∶CRM197治疗的小鼠第1-14天的体重变化百分比；图27D示出了与孢子第0天相比，用10∶1的PSII∶CRM197治疗的小鼠第1-14天的体重变化百分比。
图28示出了用于确定不同佐剂作用的研究时间线。
图29示出了在感染之后前9天孢子感染后的CDI几何平均体重减轻。
图30示出了在感染之后前30天孢子感染后的CDI几何平均体重减轻。
图31A-C示出了在第14天(图31A)、第27天(图31B)和第41天(图31C)用类毒素A和B(AlOH)、PSII-CRM197末端连接+类毒素A和B+AlPO4、PSII-CRM197末端连接+类毒素A和B+AlOH、PSII-CRM197末端连接+类毒素A和B+Advax2以及无菌盐水(AlPO4)治疗的组中的抗TcdA倒数滴度。图31D示出了在整个研究期间用PSII-CRM197、类毒素A和B(AlOH)、PSII-CRM197末端连接+类毒素A和B+AlPO4、PSII-CRM197末端连接+类毒素A和B+AlOH、PSII-CRM197末端连接+类毒素A和B+Advax2以及无菌盐水(AlPO4)治疗的组的抗TxdA ELISA滴度。
具体实施方式
艰难梭菌感染(CDI)是一种由产孢细菌艰难梭菌引起的症状性感染。CDI由粪便中发现的细菌孢子传播。感染的风险因素包括抗生素或质子泵抑制剂的使用、住院治疗或较大年龄。通过粪便培养或测试细菌的DNA或毒素进行诊断。如果一个人测试为CDI阳性但无症状，则该病况称为艰难梭菌定殖。艰难梭菌可以定殖于人结肠，但无症状。约2-5％的成人是携带者，并且定殖风险与不相关的腹泻疾病(例如，由于沙门氏菌病或霍乱弧菌感染引起的泻药滥用和食物中毒)病史有关。CDI的并发症包括假膜性结肠炎、中毒性巨结肠、结肠穿孔和败血症。停用抗生素可以导致约20％的感染患者在3天内症状消退。据报道，人的复发率高达25％。
梭菌是厌氧活动细菌，在自然界中普遍存在，特别是在土壤中普遍存在。梭菌具有长且不规则(鼓槌形或纺锤形)的细胞，在末端具有凸起。艰难梭菌细胞是革兰氏阳性的，并且在人体温度、缺氧的情况下在血琼脂上显示出最佳生长。当受到应激时，细菌产生孢子，该孢子可以耐受活性细菌不能耐受的极端条件。
艰难梭菌通过粪-口途径传播。生物体形成耐热孢子，该耐热孢子不会被含酒精洗手液或常规表面清洁杀死。表面会被孢子污染，并且细菌孢子可以通过接触进一步传播。孢子在临床环境中长期存活。一旦孢子被摄取，则耐酸性允许孢子通过胃。在暴露于胆汁酸时，孢子在结肠中萌发并繁殖成营养细胞。无抗生素使用引起的胃肠紊乱或腹泻疾病病史的人不太可能被艰难梭菌定殖。
全身性抗生素(包括广谱青霉素、头孢菌素、氟喹诺酮和克林霉素)的使用会引起肠的正常微生物群发生改变。当抗生素杀死肠中的其他细菌时，剩余的细菌对空间和营养物的竞争就会减少。净效应允许其他细菌更广泛地生长，例如艰难梭菌。
致病性艰难梭菌菌株产生多种毒素，包括肠毒素(毒素A)、细胞毒素(毒素B)和二元毒素。艰难梭菌通过释放毒素A和B对胃肠(GI)道发挥其作用，毒素A和B可以结合并损伤肠上皮。毒素A和毒素B都可以在感染的人中导致腹泻和炎症。毒素A和B是靶向并灭活GTP酶Rho家族的葡糖基转移酶。毒素A与胃肠道中的液体分泌和广义炎症相关。毒素B通过与低分子质量GTP结合Rho蛋白的ADP-核糖基化减少相关的机制诱导肌动蛋白解聚。毒素B被认为是复发性CDI毒力的主要决定因素，并且与结肠的更严重损伤相关。艰难梭菌具有第三种毒素，其是二元毒素。
症状包括水样腹泻、发热、恶心和腹痛。CDI可以引起严重的危及生命的结肠炎症。CDI占抗生素相关腹泻病例的约20％。在成人中，严重腹泻(即，每24小时周期新发超过三次部分形成或水样粪便)、最近的抗生素暴露、腹痛、发热(高达40.5℃)和类似马粪的粪便特有气味用作CDI的临床预测工具。在住院人群中，先前的抗生素治疗和腹泻或腹痛用作CDI的指标。在儿童中，CDI的最普遍症状是水样腹泻，每天至少三次排便，持续两天或更多天，其可以伴随发热、食欲不振和/或腹痛。严重感染的患者可以出现结肠炎症，但无腹泻。
在一些实施方式中，本公开的方法和组合物可以靶向艰难梭菌毒素和细菌细胞表面抗原，以减少CDI的定殖和复发。
抗原
本公开的药物组合物包含艰难梭菌的至少一种抗原。在一些实施方式中，抗原是艰难梭菌的细胞表面多糖。艰难梭菌表达三种多糖PSI、PSII和PSIII。PSI由支化五糖基磷酸酯重复单元组成。PSII是六糖基磷酸酯重复单元的聚合物。PSII是存在于艰难梭菌的细胞表面和生物膜上的保守抗原。PSII包含六糖基重复结构，并且是～10kDa的低分子量聚合物。PSII是表面暴露的，并且在CDI患者的粪便样品中可以检测到PSII的抗体。PSIII是由二糖基磷酸酯主链与甘油酸侧链组成的脂质连接的多糖，并且是艰难梭菌的脂磷壁酸。
在一些实施方式中，细胞表面多糖是来自艰难梭菌的天然细胞表面多糖。在一些实施方式中，来自艰难梭菌的细胞表面多糖是非合成的。在一些实施方式中，来自艰难梭菌的细胞表面多糖是从一种或多种艰难梭菌菌株纯化的。在一些实施方式中，来自艰难梭菌的细胞表面多糖是来自一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物。在一些实施方式中，细胞表面多糖是PSII。在一些实施方式中，细胞表面多糖具有下式：
其中n是1和100之间的整数，或其药学上可接受的盐。
细胞表面多糖的平均分子量可以为约5kDa至约100kDa。在一些实施方式中，细胞表面多糖的平均分子量可以为约5kDa至约50kDa。在一些实施方式中，细胞表面多糖的平均分子量可以为约5kDa至约25kDa。在一些实施方式中，细胞表面多糖的平均分子量可以为约5kDa至约10kDa。在一些实施方式中，细胞表面多糖的平均分子量可以为约5kDa、约6kDa、约7kDa、约8kDa、约9kDa、约10kDa、约11kDa、约12kDa、约13kDa、约14kDa、约15kDa、约16kDa、约17kDa、约18kDa、约19kDa或约20kDa。在一些实施方式中，细胞表面多糖的平均分子量可以为约5kDa。在一些实施方式中，细胞表面多糖的平均分子量可以为约8.8kDa。在一些实施方式中，细胞表面多糖的平均分子量可以为约10kDa。
本文的细胞表面多糖可以经纯化。本文的化合物可以是至少1％纯、至少2％纯、至少3％纯、至少4％纯、至少5％纯、至少6％纯、至少7％纯、至少8％纯、至少9％纯、至少10％纯、至少11％纯、至少12％纯、至少13％纯、至少14％纯、至少15％纯、至少16％纯、至少17％纯、至少18％纯、至少19％纯、至少20％纯、至少21％纯、至少22％纯、至少23％纯、至少24％纯、至少25％纯、至少26％纯、至少27％纯、至少28％纯、至少29％纯、至少30％纯、至少31％纯、至少32％纯、至少33％纯、至少34％纯、至少35％纯、至少36％纯、至少37％纯、至少38％纯、至少39％纯、至少40％纯、至少41％纯、至少42％纯、至少43％纯、至少44％纯、至少45％纯、至少46％纯、至少47％纯、至少48％纯、至少49％纯、至少50％纯、至少51％纯、至少52％纯、至少53％纯、至少54％纯、至少55％纯、至少56％纯、至少57％纯、至少58％纯、至少59％纯、至少60％纯、至少61％纯、至少62％纯、至少63％纯、至少64％纯、至少65％纯、至少66％纯、至少67％纯、至少68％纯、至少69％纯、至少70％纯、至少71％纯、至少72％纯、至少73％纯、至少74％纯、至少75％纯、至少76％纯、至少77％纯、至少78％纯、至少79％纯、至少80％纯、至少81％纯、至少82％纯、至少83％纯、至少84％纯、至少85％纯、至少86％纯、至少87％纯、至少88％纯、至少89％纯、至少90％纯、至少91％纯、至少92％纯、至少93％纯、至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％纯、至少99.1％纯、至少99.2％纯、至少99.3％纯、至少99.4％纯、至少99.5％纯、至少99.6％纯、至少99.7％纯、至少99.8％纯或至少99.9％纯。
药学上可接受的盐
本发明提供了本文所述的任何治疗性化合物的药学上可接受的盐的用途。药学上可接受的盐包括例如酸加成盐和碱加成盐。加入至化合物中以形成酸加成盐的酸可以是有机酸或无机酸。加入至化合物中以形成碱加成盐的碱可以是有机碱或无机碱。在一些实施方式中，药学上可接受的盐是金属盐。在一些实施方式中，药学上可接受的盐是铵盐。
金属盐可以通过向本发明化合物中加入无机碱产生。无机碱由与碱性抗衡离子配对的金属阳离子组成，例如，氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或磷酸盐。金属可以是碱金属、碱土金属、过渡金属或主族金属。在一些实施方式中，金属是锂、钠、钾、铯、铈、镁、锰、铁、钙、锶、钴、钛、铝、铜、镉或锌。
在一些实施方式中，金属盐是锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、铈盐、镁盐、锰盐、铁盐、钙盐、锶盐、钴盐、钛盐、铝盐、铜盐、镉盐或锌盐。
铵盐可以通过向本发明化合物中加入氨或有机胺产生。在一些实施方式中，有机胺是三乙胺、二异丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、吗啉、N-甲基吗啉、哌啶、N-甲基哌啶、N-乙基哌啶、二苄胺、哌嗪、吡啶、吡唑、哌吡唑(pipyrrazole)、咪唑、吡嗪或哌吡嗪(pipyrazine)。
在一些实施方式中，铵盐是三乙胺盐、二异丙胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、吗啉盐、N-甲基吗啉盐、哌啶盐、N-甲基哌啶盐、N-乙基哌啶盐、二苄胺盐、哌嗪盐、吡啶盐、吡唑盐、哌吡唑盐、咪唑盐、吡嗪盐或哌吡嗪盐。
酸加成盐可以通过向本发明化合物中加入酸产生。在一些实施方式中，酸是有机酸。在一些实施方式中，酸是无机酸。在一些实施方式中，酸是盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、亚硝酸、硫酸、亚硫酸、磷酸、异烟酸、乳酸、水杨酸、酒石酸、抗坏血酸、龙胆酸、葡糖酸、葡糖醛酸、葡糖二酸、甲酸、苯甲酸、谷氨酸、泛酸、乙酸、丙酸、丁酸、富马酸、琥珀酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、草酸或马来酸。
在一些实施方式中，盐是盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酒石酸盐、抗坏血酸盐、龙胆酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、葡糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、泛酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、草酸盐或马来酸盐。
纯化艰难梭菌抗原的方法
本公开的疫苗组合物的艰难梭菌细胞表面多糖抗原可以获自灭活的细胞或一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物的多糖抗原可以获自灭活的艰难梭菌细胞。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物的多糖抗原可以获自艰难梭菌的CSE。
在一些实施方式中，用于获得纯化的细胞表面多糖抗原的艰难梭菌菌株是核糖型001、003、027、106、012、014、036、087或078。在一些实施方式中，艰难梭菌菌株可以经工程化以具有增加量的内源基因产物。在一些实施方式中，艰难梭菌菌株可以经工程化以具有减少量的内源基因产物。在一些实施方式中，艰难梭菌菌株可以经工程化以表达外源产物。
本公开的方法可以从1、2、3、4或5种艰难梭菌菌株中获得纯化的细胞表面多糖。在一些实施方式中，本公开的方法可以从一种艰难梭菌菌株中获得纯化的细胞表面多糖。在一些实施方式中，本公开的方法可以从两种艰难梭菌菌株中获得纯化的细胞表面多糖。在一些实施方式中，本公开的方法可以从三种艰难梭菌菌株中获得纯化的细胞表面多糖。在一些实施方式中，本公开的方法可以从四种艰难梭菌菌株中获得纯化的细胞表面多糖。在一些实施方式中，本公开的方法可以从艰难梭菌菌株VPI 10463的灭活细胞中获得纯化的细胞表面多糖。在一些实施方式中，本公开的方法可以从艰难梭菌菌株BI/NAP1/027的灭活细胞中获得纯化的细胞表面多糖。在一些实施方式中，本公开的方法可以从艰难梭菌菌株VPI 10463和BI/NAP1/027的灭活细胞中获得纯化的细胞表面多糖。
在一些实施方式中，本文公开了一种富集艰难梭菌的细胞表面多糖的方法，该方法包括：(a)获得一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物(CSE)，和(b)富集来自CSE的艰难梭菌的细胞表面多糖，从而获得富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖；其中富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含按重量计小于约5％的艰难梭菌杂质。在一些实施方式中，艰难梭菌的细胞表面多糖是PSII。
在一些实施方式中，该方法包括：富集来自CSE的PSII，从而获得富集的PSII样品；其中富集的PSII样品包含PSII和(a)相对于PSII的总重量按重量计小于5％肽聚糖的肽聚糖污染水平；(b)相对于PSII的总重量按重量计小于5％蛋白质的蛋白质污染水平；或(c)相对于PSII的总重量按重量计小于5％的核酸污染水平。
在一些实施方式中，获得包括剥离一种或多种艰难梭菌菌株。在一些实施方式中，富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含按重量计小于约5％的艰难梭菌蛋白。在一些实施方式中，艰难梭菌的细胞表面多糖选自PSI、PSII、PSIII、其药学上可接受的盐及其免疫原性片段。在一些实施方式中，艰难梭菌的细胞表面多糖包含磷酸酯部分。在一些实施方式中，艰难梭菌的细胞表面多糖是PSII、其药学上可接受的盐或其免疫原性片段。
在一些实施方式中，富集包括乙醇沉淀步骤。在一些实施方式中，富集包括一个或多个TCA沉淀步骤。在一些实施方式中，富集包括超滤/渗滤(UFDF)步骤。在一些实施方式中，富集包括离子交换色谱步骤。在一些实施方式中，富集包括在离子交换色谱步骤之后的一个或多个TCA沉淀步骤。在一些实施方式中，富集包括在TCA沉淀步骤之后和/或在离子交换色谱步骤之后的一个或多个超滤/渗滤(UFDF)步骤。
在一些实施方式中，富集包括过滤步骤。在一些实施方式中，过滤步骤包括切向流过滤或通过具有截留分子量的过滤器离心。在一些实施方式中，过滤器的截留分子量为3kDa或更小。在一些实施方式中，过滤器的截留分子量为10kDa或更大。在一些实施方式中，该方法还包括冻干。
在一些实施方式中，富集的PSII样品包含PSII和根据NMR相对于PSII的总重量按重量计小于5％肽聚糖的肽聚糖污染水平。在一些实施方式中，富集的PSII样品包含PSII和根据NMR相对于PSII的总重量按重量计小于5％蛋白质的蛋白质污染水平。在一些实施方式中，富集的PSII样品包含PSII和根据NMR相对于PSII的总重量按重量计小于5％核酸的核酸污染水平。
PSII-载体缀合物
本公开的艰难梭菌细胞表面多糖可以与载体分子缀合。在一些实施方式中，载体分子是蛋白质。在一些实施方式中，载体分子是牛血清白蛋白(BSA)。在一些实施方式中，载体分子是交叉反应性分子，例如，CRM197。在一些实施方式中，载体分子是主要免疫增强蛋白(MIEP)。在一些实施方式中，载体分子是白喉类毒素。在一些实施方式中，载体分子是破伤风类毒素。在一些实施方式中，载体分子是来源于博德特氏菌的蛋白质。在一些实施方式中，载体分子是来自艰难梭菌的脱毒形式的全长毒素A和/或毒素B，或毒素A和/或毒素B的非产毒片段。
本公开的艰难梭菌细胞表面多糖可以通过化学键与载体分子缀合。在一些实施方式中，本公开的艰难梭菌细胞表面多糖可以通过将多糖的羟基与载体分子连接而与载体分子缀合。在一些实施方式中，本公开的艰难梭菌细胞表面多糖可以通过将多糖的伯羟基与载体分子连接而与载体分子缀合。在一些实施方式中，本公开的艰难梭菌细胞表面多糖可以通过将多糖的无规羟基与载体分子连接而与载体分子缀合。在一些实施方式中，本公开的艰难梭菌细胞表面多糖可以通过将多糖的还原末端与载体分子连接而与载体分子缀合。在一些实施方式中，本公开的艰难梭菌细胞表面多糖可以通过将多糖的羧基与载体分子连接而与载体分子缀合。在一些实施方式中，艰难梭菌细胞表面多糖可以用接头衍生化以引入官能团来缀合载体蛋白。
在一些实施方式中，本公开的细胞表面多糖可以与酰肼衍生的载体蛋白缀合。在一些实施方式中，本公开的细胞表面多糖可以与马来酰亚胺衍生的载体蛋白缀合。在一些实施方式中，本公开的细胞表面多糖可以通过将无规羟基衍生化为硫醇基并将硫醇化多糖与马来酰亚胺衍生的载体蛋白缀合而缀合。在一些实施方式中，本公开的细胞表面多糖可以通过将伯羟基氧化为羧基并将羧化多糖与酰肼衍生的载体蛋白缀合而与载体蛋白缀合。在一些实施方式中，本公开的细胞表面多糖可以通过硫醇化还原末端并将硫醇化多糖与马来酰亚胺衍生的载体蛋白缀合而与载体蛋白缀合。
在一些实施方式中，载体蛋白可以与多于一个细胞表面多糖缀合。在一些实施方式中，载体蛋白可以在遍及细胞表面多糖的随机位置处与多于一个细胞表面多糖缀合，以形成晶格样结构。在一些实施方式中，载体蛋白可以在遍及细胞表面多糖的伯羟基位置处与多于一个细胞表面多糖缀合，以形成晶格样结构。在一些实施方式中，载体蛋白可以在每个细胞表面多糖部分的还原末端与多于一个细胞表面多糖缀合，以形成星形样结构(例如，一个载体蛋白在中心具有多个向外突出的多糖链)。
在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约10∶1至约5∶1、约5∶1至约1∶1、约1∶1至约1∶5、约1∶5至约1∶10的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约8∶1至约5∶1的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约5∶1至约3∶1的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约1∶5至约1∶7的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约1∶8至约1∶10的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。
在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约6∶1、约5∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1、约1∶1、约1∶2、约1∶3、、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9、约1∶10的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。
在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约10∶1的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约5∶1的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约3∶1的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约1∶1的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约1∶3的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约1∶4的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约1∶5的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约1∶6的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约1∶7的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约1∶8的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约1∶9的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。在一些实施方式中，载体蛋白和细胞表面多糖可以以约1∶10的载体蛋白∶细胞表面多糖比率缀合。
毒素
致病性艰难梭菌菌株产生多种毒素，包括肠毒素(毒素A；TcdA)和细胞毒素(毒素B；TcdB)。毒素A和毒素B都可以在感染的人中导致腹泻和炎症。毒素A和B是靶向并灭活GTP酶Rho家族的葡糖基转移酶。毒素B通过与低分子质量GTP结合Rho蛋白的ADP-核糖基化减少相关的机制诱导肌动蛋白解聚。艰难梭菌具有第三种毒素，其是二元毒素。
毒素A(也称为TcdA)与胃肠道中的液体分泌和广义炎症相关。毒素B(也称为TcdB)被认为是复发性CDI毒力的主要决定因素，并且与结肠的更严重损伤相关。毒素B具有两个同工型：来自历史或非强毒力株的毒素B(毒素BHIST)，例如VPI 10463(TcdB1)；以及来自强毒力株的毒素B(毒素BHV)，例如BI/NAP1/027(TcdB2)。在强毒力株中，毒素BHV在基于细胞的测定中的细胞毒性是毒素BHIST的约10倍，并且在鼠毒素攻击模型中的致死性是毒素BHIST的至少4倍。毒素BHV的毒性增加是由于C-末端区域(即，从第1651位至C-末端第2366位的氨基酸跨度)的氨基酸序列的差异。
表1示出了艰难梭菌菌株的核糖型列表，并且指出表达了哪些毒素。
表1
用于本公开的疫苗组合物的毒素可以在免疫对象中引发中和毒素A或毒素B的抗体的产生。本公开的疫苗组合物包含至少一种多肽，该多肽包含类毒素或艰难梭菌毒素的无毒免疫原性多肽片段，其可以引发结合至少一种艰难梭菌毒素的保护性抗体的产生。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物包含毒素A或其无毒免疫原性片段。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物包含毒素B或其无毒免疫原性片段。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物包含毒素A或毒素A的无毒免疫原性片段；以及毒素B或毒素B的无毒免疫原性片段。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以引发结合艰难梭菌毒素A的保护性抗体的产生。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以引发结合艰难梭菌毒素B的保护性抗体的产生。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以引发结合艰难梭菌毒素A和毒素B的保护性抗体的产生。
在一些实施方式中，艰难梭菌毒素多肽可以是无毒但保持足以在对象中诱导抗体应答的免疫原性特性的全长毒素A或全长毒素B。在一些实施方式中，本公开的艰难梭菌毒素多肽可以经处理(例如，甲醛处理)以获得无毒形式的毒素多肽。
在一些实施方式中，疫苗组合物的多肽可以是全长艰难梭菌毒素A或全长艰难梭菌毒素B。在一些实施方式中，疫苗组合物的多肽可以是脱毒形式的全长艰难梭菌毒素A或全长艰难梭菌毒素B。在一些实施方式中，疫苗组合物的多肽可以是全长艰难梭菌毒素A或脱毒形式的全长艰难梭菌毒素B。在一些实施方式中，疫苗组合物的多肽可以是脱毒形式的全长艰难梭菌毒素A或脱毒形式的全长艰难梭菌毒素B。在一些实施方式中，疫苗组合物可以包含全长艰难梭菌毒素A和全长艰难梭菌毒素B。在一些实施方式中，全长艰难梭菌毒素A或全长艰难梭菌毒素B可以经化学处理以产生保持免疫原性的毒素A或毒素B的无毒片段。在一些实施方式中，全长艰难梭菌毒素A或全长艰难梭菌毒素B可以经甲醛处理以产生保持免疫原性的毒素A或毒素B的无毒片段。在一些实施方式中，毒素A或毒素B的无毒片段是缺乏在毒素N-末端编码的葡糖基转移酶活性的片段。
在一些实施方式中，多肽与毒素A或毒素B(例如SEQ ID NO:1-40)有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性。
在一些实施方式中，多肽由艰难梭菌毒素B的C-末端结构域制备，含有组合的重复寡肽(CROP)。在一些实施方式中，艰难梭菌多肽包含毒素A的TcdA1649-2710。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:4-6中的任一个有至少约75％同一性。在一些实施方式中，多肽与SEQID NO:4-6中的任一个有至少约85％同一性。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:4-6中的任一个有至少约90％同一性。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:4-6中的任一个有至少约95％同一性。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:4-6中的任一个有至少约98％同一性。
在一些实施方式中，多肽包含艰难梭菌毒素B的所有C-末端716个氨基酸。在一些实施方式中，多肽包含艰难梭菌毒素B的C-末端716个氨基酸的一部分。在一些实施方式中，多肽包含艰难梭菌强毒株BI/NAP1/027的TcdB1651-2366。在一些实施方式中，多肽包含来自TcdB1834-2366的CROP区域。在一些实施方式中，多肽包含来自TcdA1832-2710的CROP区域。
在一些实施方式中，无毒多肽片段包含毒素B的一部分，其是抗毒素B抗体的表位。在一些实施方式中，包含抗毒素B抗体的表位的片段是SEQ ID NO:7-38中的任一个。在一些实施方式中，无毒多肽包含来自10463菌株的毒素B的氨基酸2152-2341(SEQ ID NO:39)。在一些实施方式中，无毒多肽片段包含来自BI/NAP1/027菌株的毒素B的氨基酸2152-2341(SEQ ID NO:40)。在一些实施方式中，多肽包含与SEQ ID NO:1-3或7-40具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约90％同一性的TcdB片段。在一些实施方式中，多肽包含与SEQ ID NO:1-3或7-40具有至少约75％同一性的TcdB片段。在一些实施方式中，多肽包含与SEQ ID NO:1-3或7-40具有至少约80％同一性的TcdB片段。在一些实施方式中，多肽包含与SEQ ID NO:1-3或7-40具有至少约90％同一性的TcdB片段。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:1-3或7-40中的任一个有至少约95％同一性。在一些实施方式中，多肽与SEQ ID NO:1-3或7-40中的任一个有至少约98％同一性。在一些实施方式中，通过葡糖基转移酶、丝氨酸蛋白酶或递送结构域中的一个或多个的突变，使包含TcdA、TcdB或其片段的无毒多肽脱毒。
在一些实施方式中，艰难梭菌毒素A的无毒多肽片段结合阿克托舒单抗。在一些实施方式中，艰难梭菌毒素A的无毒多肽片段在毒素ACROP结构域内的两个位点(氨基酸2162-2189和2410-2437)处结合阿克托舒单抗。在一些实施方式中，艰难梭菌毒素B的无毒多肽片段结合贝洛托舒单抗。在一些实施方式中，艰难梭菌毒素B的无毒多肽片段在跨越两个CROP单元的艰难梭菌菌株VPI 10463TcdB CROP结构域的两个位点(E1(氨基酸1806-1961内的不连续表位)和E2(氨基酸2007-2093内的不连续表位))处结合贝洛托舒单抗。
在一些实施方式中，本公开的艰难梭菌无毒多肽片段可以获自一种或多种菌株，选自艰难梭菌核糖型001、003、027、106、012、014、036、087或078。在一些实施方式中，艰难梭菌毒素多肽来自艰难梭菌的强毒株。在一些实施方式中，艰难梭菌多肽片段来自艰难梭菌BI/NAP1/027菌株的毒素B。在一些实施方式中，毒素B的无毒片段具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
表2列出了SEQ ID NO:1-40的氨基酸序列。
表2
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在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含两种或更多种艰难梭菌多肽的混合物。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种艰难梭菌多肽。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含2种艰难梭菌多肽。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含3种艰难梭菌多肽。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含4种艰难梭菌多肽。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含艰难梭菌毒素A类毒素、艰难梭菌毒素B类毒素、艰难梭菌毒素A的无毒片段、艰难梭菌毒素B的无毒片段或其任何组合中的至少一种。
在一些实施方式中，艰难梭菌毒素A或毒素B的多肽或多肽片段可以包含至少一个突变。在一些实施方式中，艰难梭菌毒素A或毒素B的多肽或多肽片段包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个突变。在一些实施方式中，突变是缺失。在一些实施方式中，突变是取代。在一些实施方式中，突变是插入。在一些实施方式中，突变是截短。
在一些实施方式中，艰难梭菌毒素A或毒素B的多肽或多肽片段在葡糖基转移酶结构域中包含至少一个突变。在一些实施方式中，葡糖基转移酶结构域中的突变在SEQ IDNO:4的氨基酸1-541处。在一些实施方式中，葡糖基转移酶结构域中的突变在SEQ ID NO:5的氨基酸1-541处。在一些实施方式中，葡糖基转移酶结构域中的突变在SEQ ID NO:1的氨基酸1-543处。在一些实施方式中，葡糖基转移酶结构域中的突变在SEQ ID NO:2的氨基酸1-543处。
在一些实施方式中，相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的野生型毒素B抗原序列，艰难梭菌毒素B的多肽或多肽片段可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个取代。在一些实施方式中，艰难梭菌毒素B的多肽或多肽片段可以包含对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸270、273、284、286或288的1、2、3、4或5个位置。在一些实施方式中，相对于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的野生型毒素A抗原序列，艰难梭菌毒素A的多肽或多肽片段可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个取代。在一些实施方式中，艰难梭菌毒素A的多肽或多肽片段可以在对应于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸283、285或287的1、2或3个位置处包含取代。
在一些实施方式中，艰难梭菌毒素A或毒素B的多肽或多肽片段在切割或半胱氨酸蛋白酶酶促结构域中包含至少一个突变。在一些实施方式中，切割或半胱氨酸蛋白酶酶促结构域在SEQ ID NO:4的氨基酸542-769、SEQ ID NO:5的氨基酸542-769、SEQ ID NO:1的氨基酸544-767或SEQ ID NO:2的氨基酸544-767处。在一些实施方式中，艰难梭菌毒素A或毒素B的多肽或多肽片段在易位结构域中包含至少一个突变。在一些实施方式中，易位结构域在SEQ ID NO:4的氨基酸770-1808、SEQ ID NO:5的氨基酸770-1808、SEQ ID NO:1的氨基酸768-1833或SEQ ID NO:2的氨基酸768-1833处。
在一些实施方式中，艰难梭菌毒素A或毒素B的多肽或多肽片段的最小长度为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600或2650个氨基酸。在一些实施方式中，多肽或多肽片段的最小长度为来自TcdA1649-2710、TcdB1651-2366、毒素A的CROP区域(TcdA1832-2710)或毒素B的CROP区域(TcdB1834-2366)的约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600或2650个氨基酸。
在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含两个或更多个毒素A、毒素B或其片段。在一些实施方式中，两个或更多个毒素A或毒素B片段是相同的。在一些实施方式中，两个或更多个毒素A或毒素B片段是不同的。在一些实施方式中，两个或更多个毒素A或毒素B片段是连续的。在一些实施方式中，两个或更多个毒素A或毒素B片段是不连续的。在一些实施方式中，两个或更多个毒素A或毒素B片段以任何顺序连接，例如，从N-末端至C-末端为A-A-B、A-B-A、B-A-A、B-B-A、B-A-B、A-B-A或A-B-B。
在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以以约90∶10、约80∶20、约70∶30、约60∶40、约50∶50、约40∶60、约30∶70、约20∶80或约10∶90的TcdA∶TcdB比率包含TcdA和TcdB。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以以约50∶50(即等量)的TcdA∶TcdB比率包含TcdA和TcdB。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以以约70∶30的TcdA∶TcdB比率包含TcdA和TcdB。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以以约30∶70的TcdA∶TcdB比率包含TcdA和TcdB。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以以约80：20的TcdA∶TcdB比率包含TcdA和TcdB。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以以约20∶80的TcdA∶TcdB比率包含TcdA和TcdB。
药物组合物
在一些实施方式中，本文公开了一种疫苗组合物，该疫苗组合物靶向艰难梭菌细菌和至少一种艰难梭菌肠毒素。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物靶向艰难梭菌细菌。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物靶向艰难梭菌细菌和一种艰难梭菌肠毒素，例如，毒素A或毒素B。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物靶向艰难梭菌细菌和两种艰难梭菌肠毒素，例如，毒素A和毒素B。
本发明的药物组合物可以是本文所述的任何化合物或药学上可接受的盐与其他化学组分(例如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、佐剂和/或赋形剂)的组合。本公开的药物组合物可以促进化合物向生物体的施用。药物组合物可以通过各种形式和途径以治疗有效量作为药物组合物施用，包括例如静脉内、皮下、肌内、口服、肠胃外、眼、皮下、透皮、鼻、阴道和局部施用。
药物组合物可以以局部方式施用，例如，经由将化合物直接注射至器官中，任选地在贮库或持续释放制剂或植入物中。药物组合物可以以快速释放制剂的形式、以延时释放制剂的形式或以中间释放制剂的形式提供。快速释放形式可以提供立即释放。延时释放制剂可以提供控制释放或持续延迟释放。
对于口服施用，药物组合物可以通过将活性化合物与药学上可接受的载体或赋形剂组合来配制。此类载体可以用于配制液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液或悬浮液，以供对象口服摄取。用于口服可溶性制剂的溶剂的非限制性实例可以包括水、乙醇、异丙醇、盐水、生理盐水、DMSO、二甲基甲酰胺、磷酸钾缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、磷酸钠缓冲液、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸缓冲液(MOPS)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)缓冲液(PIPES)和柠檬酸钠盐水缓冲液(SSC)。用于口服可溶解制剂的助溶剂的非限制性实例可以包括蔗糖、尿素、克列莫佛(cremaphor)、DMSO和磷酸钾缓冲液。
化合物还可以配制为直肠组合物，例如灌肠剂、直肠凝胶、直肠泡沫、直肠气溶胶、栓剂、胶冻栓剂或保留灌肠剂，该直肠组合物含有常规栓剂基质，例如可可脂或其他甘油酯，以及合成聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮和PEG。在栓剂形式的组合物中，可以熔化低熔点蜡，例如脂肪酸甘油酯的混合物，任选地与可可脂组合。
在实践本文提供的治疗方法或用途时，治疗有效量的本文所述的化合物以药物组合物形式向患有待治疗的疾病或病况的对象施用。在一些实施方式中，对象是哺乳动物，例如人。对象可以是例如老年人、成人、青少年、青春期前儿童、儿童、学步儿童、婴儿、新生儿和非人动物。在一些实施方式中，对象是患者。治疗有效量可以根据疾病的严重程度、对象的年龄和相对健康状况、所用化合物的功效和其他因素而广泛变化。化合物可以单独使用或作为混合物的组分与一种或多种治疗剂组合使用。
药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体来配制，该载体包括赋形剂和助剂，其促进活性化合物加工为可以药用的制剂。制剂可以根据所选择的施用途径而改变。包含本文所述的化合物的药物组合物可以例如通过混合、溶解、乳化、包封、包埋或压缩过程来制造。
本公开的药物组合物可以包括至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以及游离碱或药学上可接受的盐形式的本文所述的化合物。药物组合物可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲液和防腐剂。
制备包含本文所述化合物的组合物的方法包括将化合物与一种或多种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体一起配制，以形成固体、半固体或液体组合物。固体组合物包括例如粉末、片剂、可分散颗粒剂、胶囊剂和扁囊剂。液体组合物包括例如其中溶解有化合物的溶液、包含化合物的乳液，或含有脂质体、胶束或纳米颗粒的溶液，该脂质体、胶束或纳米颗粒包含如本文公开的化合物。半固体组合物包括例如凝胶、悬浮液和乳膏。组合物可以是液体溶液或悬浮液、适于在使用前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或作为乳液。这些组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和其他药学上可接受的添加剂。
适用于本发明的剂型的非限制性实例包括液体剂、粉剂、凝胶剂、纳米悬浮液、纳米颗粒、微凝胶、水性悬浮液或油性悬浮液、乳剂及其任何组合。
适用于本发明的药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括粘合剂、崩解剂、抗粘着剂、抗静电剂、表面活性剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、塑化剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、抗微生物剂、滚圆剂及其任何组合。
本公开的药物组合物可以包含佐剂。在一些实施方式中，当与本公开的抗原或化合物组合使用时，佐剂可以加速、延长或增强抗原特异性免疫应答。在一些实施方式中，佐剂可以刺激免疫系统更有力地对疫苗作出应答，并且提供针对感染的增加的免疫力。在一些实施方式中，佐剂是无机化合物和油、细菌产物、植物产物、细胞因子、有机物质或试剂的组合。
在一些实施方式中，佐剂是无机化合物。在一些实施方式中，无机化合物是钾明矾、硫酸铝钾、氢氧化铝、磷酸铝或羟基磷灰石。在一些实施方式中，佐剂是油。在一些实施方式中，油是石蜡油、佐剂65或花生油。在一些实施方式中，佐剂是细菌产物，例如，百日咳博德特氏菌、牛分枝杆菌的灭活细菌或类毒素。在一些实施方式中，佐剂是植物产物，例如，来自皂树、大豆或polysaga senega的植物皂苷。在一些实施方式中，佐剂是细胞因子，例如，IL-1、IL-2或IL-12。在一些实施方式中，佐剂是组合佐剂。在一些实施方式中，组合佐剂是弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。在一些实施方式中，佐剂是有机物质，例如，角鲨烯。
在一些实施方式中，佐剂是明矾、矿物油、植物油、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂或TLR激动剂(例如，CpG寡核苷酸)。在一些实施方式中，佐剂是AS04(即单磷酰脂质A和铝盐)。在一些实施方式中，佐剂是MF59(即具有角鲨烯的水包油乳液)。在一些实施方式中，佐剂是AS01B(即在脂质体制剂中组合的单磷酰脂质A和QS-21)。在一些实施方式中，佐剂是CpG1018(即胞嘧啶磷酸鸟嘌呤)。在一些实施方式中，佐剂是AlPO4。在一些实施方式中，佐剂是AlOH。在一些实施方式中，佐剂是AdvaxTM或Advax-2TM(δ菊粉微粒)。
在一些实施方式中，药物组合物包含一种佐剂。在一些实施方式中，药物组合物包含两种佐剂。在一些实施方式中，药物组合物包含三种佐剂。在一些实施方式中，药物组合物包含四种佐剂。在一些实施方式中，药物组合物包含五种佐剂。在一些实施方式中，药物组合物不包含佐剂。
在一些实施方式中，本文公开了一种组合物，该组合物包含来自艰难梭菌的细胞表面多糖，其中细胞表面多糖是从艰难梭菌富集的PSII抗原，其中组合物的总碳水化合物重量百分比为至少约40％，并且其中从艰难梭菌富集的PSII抗原占总碳水化合物百分比的至少90％。
在一些实施方式中，本文公开了一种组合物，该组合物包含：(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及(b)包含载体蛋白的第一多肽；其中载体蛋白和艰难梭菌的细胞表面多糖以小于约10∶1至约1∶3的比率存在于组合物中。本文公开了一种组合物，该组合物包含：(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及(b)包含来源于除艰难梭菌之外的生物体的载体蛋白的第一多肽；其中载体蛋白和细胞表面多糖以约10∶1至约1∶10的比率存在于组合物中。
在一些实施方式中，本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)从艰难梭菌富集的细胞表面多糖；(b)第一多肽或编码第一多肽的第一多核苷酸，其中第一多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段；(c)第二多肽或编码第二多肽的第二多核苷酸，其中第二多肽包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段；以及(d)药学上可接受的载体；其中药物组合物具有总碳水化合物百分比，其中总碳水化合物百分比的至少约90％是PSII。
在一些实施方式中，本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)从艰难梭菌富集的细胞表面多糖；(b)包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段的第一多肽；(c)包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段的第二多肽；以及(d)药学上可接受的载体；其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖不与第一多肽或第二多肽缀合。
在一些实施方式中，本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及(b)第一多肽或编码第一多肽的多核苷酸，其中多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段，该类毒素是灭活毒素；其中除艰难梭菌灭活毒素之外，药物组合物包含按重量计小于约5％的艰难梭菌蛋白。
在一些实施方式中，本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)来自艰难梭菌的细胞表面多糖；(b)第一多肽或编码第一多肽的第一多核苷酸，其中第一多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段；(c)第二多肽或编码第二多肽的第二多核苷酸，其中第二多肽包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段；以及(d)药学上可接受的载体；其中第一类毒素是全长毒素A类毒素，并且第二类毒素是全长毒素B类毒素。
在一些实施方式中，本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及(b)第一多肽或编码第一多肽的多核苷酸，其中第一多肽包含艰难梭菌的第一灭活毒素或其片段，其中除艰难梭菌灭活毒素之外，药物组合物包含按重量计小于约5％的艰难梭菌蛋白。本文还公开了一种药物组合物，该药物组合物包含与载体蛋白缀合的艰难梭菌的细胞表面多糖；其中艰难梭菌的细胞表面多糖经由包含1个碳至10个碳原子的化学接头与载体蛋白缀合。
在一些实施方式中，本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)与载体蛋白缀合的来自艰难梭菌的细胞表面多糖；(b)包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段的第一多肽；(c)包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段的第二多肽；以及(d)药学上可接受的载体；其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖经由选自硫醚、己二酸二酰肼、脲或胺的化学接头与载体蛋白缀合。
在一些实施方式中，本文公开了一种药物组合物，该药物组合物基本上由以下组成：(a)与药学上可接受的载体缀合的来自艰难梭菌的细胞表面多糖；(b)第一多肽或编码第一多肽的第一多核苷酸，其中第一多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段；(c)第二多肽或编码第二多肽的第二多核苷酸，其中第二多肽包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段；以及(d)佐剂。
在一些实施方式中，本文还公开了通过混合抗原或艰难梭菌的细胞表面多糖或细胞表面多糖的缀合物与毒素A、毒素B或其片段中的至少一种来制备免疫原性组合物的方法。在一些实施方式中，毒素A、毒素B或其片段是无毒免疫原性多肽。在一些实施方式中，免疫原性组合物可以通过促进与一种或多种艰难梭菌菌株反应的抗体和与一种或多种艰难梭菌毒素反应的抗体的产生而引发保护性免疫应答。在一些实施方式中，免疫原性组合物可以促进与艰难梭菌毒素A反应的抗体的产生。在一些实施方式中，免疫原性组合物可以促进与艰难梭菌毒素B反应的抗体的产生。在一些实施方式中，免疫原性组合物可以促进与艰难梭菌毒素A和毒素B反应的抗体的产生。
在一些实施方式中，无毒多肽或其片段是重组产生的多肽。
本公开的疫苗组合物的细胞表面多糖∶多肽比率可以为约100∶1、约80∶1、约60∶1、约40∶1、约20∶1、约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约6∶1、约5∶1、约4∶1、约3∶1、约2：1、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1：9、约1∶10、约1：20、约1∶40、约1∶60、约1∶80或约1∶100。在一些实施方式中，药物组合物的细胞表面多糖∶多肽比率可以为约10∶1。在一些实施方式中，药物组合物的细胞表面多糖∶多肽比率可以为约5∶1。在一些实施方式中，药物组合物的细胞表面多糖∶多肽比率可以为约1∶1。在一些实施方式中，多肽是类毒素A或其片段。在一些实施方式中，多肽是类毒素B或其片段。
本公开的疫苗组合物可以包含按重量计小于约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的来自艰难梭菌的多肽。在一些实施方式中，本公开的药物组合物可以包含按重量计小于约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的来自艰难梭菌的多肽。在一些实施方式中，本公开的药物组合物可以包含按重量计小于约20％的来自艰难梭菌的多肽。在一些实施方式中，本公开的药物组合物可以包含按重量计小于约10％的来自艰难梭菌的多肽。在一些实施方式中，本公开的药物组合物可以包含按重量计小于约5％的来自艰难梭菌的多肽。
本公开的药物组合物的总碳水化合物重量百分比可以为至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。在一些实施方式中，本公开的药物组合物的总碳水化合物重量百分比可以为至少约40％。在一些实施方式中，本公开的药物组合物的总碳水化合物重量百分比可以为至少约60％。在一些实施方式中，本公开的药物组合物的总碳水化合物重量百分比可以为至少约80％。
在一些实施方式中，本公开的药物组合物中存在的至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的糖类是本公开的细胞表面多糖，例如，PSII抗原。在一些实施方式中，药物组合物中存在的至少约80％的糖类是PSII抗原。在一些实施方式中，药物组合物中存在的至少约90％的糖类是PSII抗原。在一些实施方式中，药物组合物中存在的至少约95％的糖类是PSII抗原。
本公开的疫苗组合物可以包含按重量计至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的来自艰难梭菌的细胞表面多糖。在一些实施方式中，本公开的组合物可以包含按重量计至少约5％的来自艰难梭菌的细胞表面多糖。在一些实施方式中，本公开的组合物可以包含按重量计至少约15％的来自艰难梭菌的细胞表面多糖。在一些实施方式中，本公开的组合物可以包含按重量计至少约25％的来自艰难梭菌的细胞表面多糖。
本公开的疫苗组合物可以包含至少约75％的来自艰难梭菌的细胞表面多糖或其缀合物；至少约5％的艰难梭菌的第一类毒素多肽或其片段；以及至少约5％的艰难梭菌的第二类毒素多肽或其片段。本公开的疫苗组合物可以包含约82％的来自艰难梭菌的细胞表面多糖或其缀合物；至少约9％的艰难梭菌的第一类毒素多肽或其片段；以及至少约9％的艰难梭菌的第二类毒素多肽或其片段。本公开的疫苗组合物可以包含约82％的本公开的PSII-CRM197缀合物；至少约9％的艰难梭菌的TcdA或其片段；以及至少约9％的艰难梭菌的TcdB或其片段。
本公开的疫苗组合物可以包含小于约5％、约4.5％、约4％、约3.5％、约3％、约2.5％、约2％、约1.5％或约1％的污染物。在一些实施方式中，污染物是肽聚糖、蛋白质、核酸、糖类或其组合。在一些实施方式中，污染物来源于艰难梭菌的细胞表面提取物。
本公开的疫苗组合物可以包含小于约5％、约4.5％、约4％、约3.5％、约3％、约2.5％、约2％、约1.5％或约1％的肽聚糖污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的肽聚糖污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约5％的肽聚糖污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约1％的肽聚糖污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约0.5％的肽聚糖污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约0.3％的肽聚糖污染。在一些实施方式中，肽聚糖污染是相对于组合物中细胞表面多糖的总重量。
本公开的疫苗组合物可以包含小于约5％、约4.5％、约4％、约3.5％、约3％、约2.5％、约2％、约1.5％或约1％的蛋白质污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的蛋白质污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约5％的蛋白质污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约1％的蛋白质污染。在一些实施方式中，本公开的组合物可以包含小于约0.5％的蛋白质污染。在一些实施方式中，本公开的组合物可以包含小于约0.3％的蛋白质污染。在一些实施方式中，蛋白质污染是除艰难梭菌灭活毒素之外的艰难梭菌蛋白。在一些实施方式中，蛋白质污染是相对于组合物中细胞表面多糖的总重量。
本公开的疫苗组合物可以包含小于约5％、约4.5％、约4％、约3.5％、约3％、约2.5％、约2％、约1.5％或约1％的核酸污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的核酸污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约1％的核酸污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约0.5％的核酸污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约0.3％的核酸污染。在一些实施方式中，核酸污染是相对于组合物中细胞表面多糖的总重量。
本公开的疫苗组合物可以包含小于约5％、约4.5％、约4％、约3.5％、约3％、约2.5％、约2％、约1.5％或约1％的糖类污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的糖类污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约1％的糖类污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约0.5％的糖类污染。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含小于约0.3％的糖类污染。在一些实施方式中，糖类污染是相对于组合物中细胞表面多糖的总重量。
本公开的疫苗组合物可以包含内毒素水平小于约50EU/mg、约40EU/mg、约30EU/mg、约20EU/mg或约10EU/mg的纯化的PSII。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含内毒素水平小于约10EU/mg、约9EU/mg、约8EU/mg、约7EU/mg、约6EU/mg、约5EU/mg、约4EU/mg、约3EU/mg、约2EU/mg或约1EU/mg的纯化的PSII。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以包含内毒素水平小于10EU/mg的纯化的PSII。在一些实施方式中，本公开的组合物可以包含内毒素水平小于5EU/mg的纯化的PSII。
施用方法和给药
疫苗组合物的组分可以一起或分开施用。在一些实施方式中，包含细胞表面多糖或细胞表面多糖缀合物和至少一种艰难梭菌毒素的疫苗组合物以单位剂量形式配制。在一些实施方式中，细胞表面多糖或细胞表面多糖缀合物和至少一种艰难梭菌毒素通过相同施用途径施用。在一些实施方式中，细胞表面多糖或细胞表面多糖缀合物和至少一种艰难梭菌毒素分开施用。在一些实施方式中，细胞表面多糖或细胞表面多糖缀合物和至少一种艰难梭菌毒素通过不同施用途径施用。在一些实施方式中，细胞表面多糖或细胞表面多糖缀合物和至少一种艰难梭菌毒素同时施用。在一些实施方式中，细胞表面多糖或细胞表面多糖缀合物和至少一种艰难梭菌毒素依次施用。
在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物使用肠胃外途径(例如，腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)或皮下(s.c.)注射)、口服施用或粘膜(例如，鼻内(i.n.)、胃内(i.g.)、阴道内、直肠)施用来施用。在一些实施方式中，肠胃外施用本公开的疫苗组合物。在一些实施方式中，皮下施用本公开的疫苗组合物。在一些实施方式中，肌内施用本公开的疫苗组合物。
本公开的疫苗组合物可以按单剂量方案或多剂量方案施用。在一些实施方式中，多剂量的组分或疫苗组合物可以按初次免疫方案和加强免疫方案施用。在一些实施方式中，多剂量的组分可以一起施用。在一些实施方式中，多剂量的组分可以分开施用，例如，在不同时间或使用不同施用途径。在一些实施方式中，多剂量的组分可以使用不同施用途径来施用，例如，胃肠外初免和粘膜加强，或粘膜初免和胃肠外加强。
在一些实施方式中，通过肌内注射施用初次免疫。在一些实施方式中，通过肌内注射施用二次或加强免疫。在一些实施方式中，通过口服施用来施用二次或加强免疫。
在一些实施方式中，多剂量相隔至少约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周或约16周施用。在一些实施方式中，对象可以用一个剂量免疫。在一些实施方式中，对象可以用相隔约2周的两个剂量免疫。在一些实施方式中，对象可以用相隔约3周的两个剂量免疫。在一些实施方式中，对象可以用相隔约4周的两个剂量免疫。在一些实施方式中，对象可以用相隔约6周的两个剂量免疫。在一些实施方式中，对象可以用三个剂量免疫，其中每个剂量相隔约2周。在一些实施方式中，对象可以用三个剂量免疫，其中每个剂量相隔约3周。在一些实施方式中，对象可以用三个剂量免疫，其中每个剂量相隔约4周。
在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以经施用以用初次免疫初免对象的免疫系统。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以作为加强注射第二次施用至对象的“接触过抗原的”免疫系统。在一些实施方式中，加强剂量可以在感染期间的任何时间施用，例如，在检测或观察到CDI症状之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天。
在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以施用至对象，以将例如，在先前通过疫苗接种免疫或在治疗后从CDI恢复的对象中的免疫力恢复至保护性水平。在一些实施方式中，加强免疫可以在初始免疫或CDI治疗之后约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年、约12年、约13年、约14年、约15年、约16年、约17年、约18年、约19年或约20年施用。在一些实施方式中，加强免疫可以在初始免疫或CDI治疗后约3年施用。在一些实施方式中，加强免疫可以在初始免疫或CDI治疗后约5年施用。在一些实施方式中，加强免疫可以在初始免疫或CDI治疗后约7年施用。在一些实施方式中，加强免疫可以在初始免疫或CDI治疗后约10年施用。在一些实施方式中，加强免疫可以在初始免疫或CDI治疗后约15年施用。在一些实施方式中，加强免疫可以在初始免疫或CDI治疗后约20年施用。
本公开的疫苗组合物可以与第二种疫苗基本上同时预防性地施用至患者。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以与肺炎、麻疹、腮腺炎、风疹、MMR、水痘、MMRV、白喉、破伤风、百日咳、DTP、缀合的B型流感嗜血杆菌、灭活的脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒、脑膜炎球菌缀合物(例如，四价A-C-W135-Y疫苗)或呼吸道合胞病毒疫菌苗基本上同时施用。
本公开的药物组合物、多肽或抗原可以是适于单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，本公开的药物组合物、多肽或抗原可以分成含有适当量的一种或多种化合物的单位剂量。单位剂量可以是含有离散量的制剂的包装形式。非限制性实例是小瓶或安瓿中的液体。水性悬浮液组合物可以包装在单剂量不可再封闭的容器中。多剂量可再封闭的容器可以例如与防腐剂组合使用。用于肠胃外注射的制剂可以以单位剂型存在，例如，在安瓿或具有防腐剂的多剂量容器中。
在一些实施方式中，本公开的抗原(例如，PSI、PSII或PSIII)可以以约5μg至约50μg、约50μg至约100μg、约100μg至约150μg、约150μg至约200μg、约200μg至约250μg、约250μg至约300μg、约300μg至约350μg、约350μg至约400μg、约400μg至约450μg、约450μg至约500μg、约500μg至约600μg、或约600μg至约750μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的抗原(例如，PSI、PSII或PSIII)可以以约5μg至约250μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的抗原(例如，PSI、PSII或PSIII)可以以约5μg至约50μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的抗原(例如，PSI、PSII或PSIII)可以以约100μg至约250μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的抗原(例如，PSI、PSII或PSIII)可以以约250μg至约500μg的量施用至对象。
在一些实施方式中，本公开的抗原(例如，PSI、PSII或PSIII)可以以约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约120μg、约140μg、约160μg、约180μg或约200μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的抗原(例如，PSI、PSII或PSIII)可以以约200μg、约250μg、约300μg、约350μg、约400μg、约450μg、约500μg、约550μg、约600μg、约650μg、约700μg或约750μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的抗原(例如，PSI、PSII或PSIII)可以以约10μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的抗原(例如，PSI、PSII或PSIII)可以以约50μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的抗原(例如，PSI、PSII或PSIII)可以以约100μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的抗原(例如，PSI、PSII或PSIII)可以以约250μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的抗原(例如，PSI、PSII或PSIII)可以以约500μg的量施用至对象。
在一些实施方式中，本公开的类毒素A或其片段可以以约10μg至约50μg、约50μg至约100μg、约100μg至约150μg、约150μg至约200μg、约200μg至约250μg、约250μg至约300μg、约300μg至约350μg、约350μg至约400μg、约400μg至约450μg、或约450μg至约500μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的类毒素A或其片段可以以约10μg至约50μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的类毒素A或其片段可以以约50μg至约100μg的量施用至对象。
在一些实施方式中，本公开的类毒素A或其片段可以以约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约120μg、约140μg、约160μg、约180μg或约200μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的类毒素A或其片段可以以约30μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的类毒素A或其片段可以以约60μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的类毒素A或其片段可以以约90μg的量施用至对象。
在一些实施方式中，本公开的类毒素B或其片段可以以约10μg至约50μg、约50μg至约100μg、约100μg至约150μg、约150μg至约200μg、约200μg至约250μg、约250μg至约300μg、约300μg至约350μg、约350μg至约400μg、约400μg至约450μg、或约450μg至约500μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的类毒素B或其片段可以以约10μg至约50μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的类毒素B或其片段可以以约50μg至约100μg的量施用至对象。
在一些实施方式中，本公开的类毒素B或其片段可以以约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约120μg、约140μg、约160μg、约180μg或约200μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的类毒素B或其片段可以以约40μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的类毒素B或其片段可以以约40μg的量施用至对象。在一些实施方式中，本公开的类毒素B或其片段可以以约60μg的量施用至对象。
在一些实施方式中，向对象施用的本公开的疫苗组合物可以包含至少约5-200μg的来自艰难梭菌的细胞表面多糖或其缀合物；至少约1-100μg的艰难梭菌的第一类毒素多肽或其片段；以及至少约1-100μg的艰难梭菌的第二类毒素多肽或其片段。在一些实施方式中，向对象施用的本公开的疫苗组合物可以包含至少约50μg的来自艰难梭菌的细胞表面多糖或其缀合物；至少约5μg的艰难梭菌的第一类毒素多肽或其片段；以及至少约5μg的艰难梭菌的第二类毒素多肽或其片段。在一些实施方式中，向对象施用的本公开的疫苗组合物可以包含至少约100μg的来自艰难梭菌的细胞表面多糖或其缀合物；至少约10μg的艰难梭菌的第一类毒素多肽或其片段；以及至少约10μg的艰难梭菌的第二类毒素多肽或其片段。在一些实施方式中，向对象施用的本公开的疫苗组合物可以包含至少约200μg的来自艰难梭菌的细胞表面多糖或其缀合物；至少约20μg的艰难梭菌的第一类毒素多肽或其片段；以及至少约20μg的艰难梭菌的第二类毒素多肽或其片段。
使用方法
在一些实施方式中，本文公开了在对象中预防性地减少CDI的病理作用或预防CDI的方法，该方法包括向对象施用纯化的PSII细胞表面多糖或纯化的PSII细胞表面多糖缀合物以及至少一种包含毒素A、毒素B或其无毒免疫原性多肽片段的多肽。本公开的组合物靶向艰难梭菌细胞上呈递的两种细菌表面抗原和艰难梭菌细胞产生的细菌毒素。本公开的疫苗组合物可以用于预防CDI或防止CDI复发。在症状性CDI或无症状性艰难梭菌携带者的患者中发现了针对艰难梭菌表面组分的血清抗体。
在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以用于免疫对艰难梭菌免疫幼稚的对象，即以前没有接触过艰难梭菌的人。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以用于治疗性免疫，例如，以预防随后的CDI或复发性CDI。
在一些实施方式中，本文公开了在对象中引发针对艰难梭菌的免疫应答的方法，该方法包括向对象施用一定量的免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含纯化的PSII细胞表面多糖或纯化的PSII细胞表面多糖缀合物以及毒素A、毒素B或其片段中的至少一种。
在一些实施方式中，本公开的组合物和方法可以引发细胞介导的免疫应答。在一些实施方式中，本公开的组合物和方法可以引发体液免疫应答。在一些实施方式中，本公开的组合物和方法可以引发全身性免疫应答。在一些实施方式中，本公开的组合物和方法可以引发粘膜免疫应答。在一些实施方式中，本公开的组合物和方法可以引发增强的全身性免疫应答和增强的粘膜免疫应答。
在一些实施方式中，本文公开了一种治疗、预防或抑制感染的表现或症状的方法，该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本公开的组合物或药物组合物。
在一些实施方式中，本文公开了一种治疗感染的方法，该方法包括：(a)向有需要的对象施用治疗有效量的本公开的组合物或药物组合物；其中感染是艰难梭菌感染；(b)在施用药物组合物之后，收集对象的粪便样品；以及(c)分析粪便样品并确定粪便中艰难梭菌菌落形成单位(CFU)/mg的变化，其是感染的标志。
在一些实施方式中，公开了一种治疗感染的方法，该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含：(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及(b)多肽或编码多肽的多核苷酸，其中多肽包含艰难梭菌的类毒素或其片段；其中施用是每周一次或每两周一次，并且其中感染由艰难梭菌引起。
在一些实施方式中，本文公开了一种方法，该方法包括：(a)从以下组中选择对象：(i)第一对象，其中第一对象大于55岁；(ii)第二对象，其中第二对象在6个月内具有艰难梭菌感染的病史；以及(iii)第三对象，其中第三对象具有阳性艰难梭菌菌落形成单位(CFU)/mg计数；以及(b)施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含艰难梭菌的细胞表面多糖和多肽或编码多肽的多核苷酸，其中多肽包含艰难梭菌的类毒素或其片段。
在一些实施方式中，本文公开了一种治疗感染的方法，该方法包括：(a)鉴定获自对象的生物样品的遗传序列信息，以确定感染的存在，其中感染是艰难梭菌感染；以及(b)向对象施用治疗有效量的包含艰难梭菌的细胞表面多糖的药物组合物。
在一些实施方式中，本文公开了一种治疗感染的方法，该方法包括向有需要的对象施用：(a)治疗有效量的本公开的药物组合物；以及(b)治疗剂；其中感染由艰难梭菌引起。
在一些实施方式中，本文公开了一种治疗感染的方法，该方法包括施用包含艰难梭菌的细胞表面多糖的药物组合物，其中施用导致对细胞表面多糖特异的免疫球蛋白M(IgM)与不存在药物组合物时相比增加至少约250倍。
在一些实施方式中，本公开的组合物和方法可以引发增强的TH1免疫应答或TH2免疫应答。在一些实施方式中，增强的TH1应答可以包括CTL的增加、与TH1免疫应答相关的细胞因子的增加、活化巨噬细胞的增加、NK活性的增加或IgG2a产生的增加。在一些实施方式中，增强的TH1免疫应答增加细胞因子(例如，IL-2、IFN-γ和TNF-β)的水平。
在一些实施方式中，使用TH1佐剂引发TH1免疫应答。在一些实施方式中，相对于无TH1佐剂的抗原免疫，TH1佐剂可以引发IgG2a产生的水平增加。在一些实施方式中，TH1佐剂是皂苷制剂、病毒体、病毒样颗粒、肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物或免疫刺激性寡核苷酸(例如，包含CpG基序的寡核苷酸)。
在一些实施方式中，TH2免疫应答包括与TH2免疫应答相关的细胞因子的增加；或IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞产生的增加。在一些实施方式中，细胞因子是IL-4、IL-5、IL-6或IL-10。在一些实施方式中，增强的TH2免疫应答包括IgG1产生的增加。
在一些实施方式中，可以使用TH2佐剂引发TH2免疫应答。相对于无佐剂的抗原免疫，TH2佐剂可以引发IgG1产生的水平增加。在一些实施方式中，TH2佐剂是含矿物质的组合物、油乳剂或ADP-核糖基化毒素或其脱毒衍生物。在一些实施方式中，含矿物质的组合物是铝盐。
在一些实施方式中，本公开的组合物包含TH1佐剂和TH2佐剂，它们引发增强的TH1应答和增强的TH2应答。在一些实施方式中，包含TH1佐剂和TH2佐剂的组合物引发IgG1和IgG2a产生的增加。在一些实施方式中，相对于用单一佐剂免疫，例如，相对于单独用TH1佐剂免疫或单独用TH2佐剂免疫，包含TH1佐剂和TH2佐剂的本公开的组合物可以引发增加的TH1免疫应答或增加的TH2免疫应答。
在一些实施方式中，本公开的方法和组合物可以使对象的免疫应答(例如，抗PSIIIgG)增加约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约21倍、约22倍、约23倍、约24倍、约25倍、约26倍、约27倍、约28倍、约29倍、约30倍、约31倍、约32倍、约33倍、约34倍、约35倍、约36倍、约37倍、约38倍、约39倍、约40倍、约41倍、约42倍、约43倍、约44倍、约45倍、约46倍、约47倍、约48倍、约49倍或约50倍。
本公开的疫苗组合物可以治疗性施用。初级预防是对尚未发生的疾病的预防或抵抗力增加。二级预防是为了防止已经发生的疾病复发而采取的措施。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以施用至对象用于初级预防，例如，预防CDI或增加对CDI的抵抗力。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以施用至对象用于二级预防，例如，预防复发性CDI。
在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以预防CDI的症状。在一些实施方式中，本公开的疫苗组合物可以改善CDI的症状。在一些实施方式中，与未免疫的对象相比，本公开的疫苗组合物可以降低CDI的特征性症状(例如，腹泻、肠炎症、胃肠组织坏死、体重减轻或肠中液体积聚)的发病率或严重程度。
患者选择
在一些实施方式中，本文公开了一种治疗感染的方法，该方法包括：(a)从以下组中选择对象：(i)第一对象，其中第一对象大于55岁；(ii)第二对象，其中第二对象在6个月内具有艰难梭菌感染的病史；以及(iii)第三对象，其中第三对象具有阳性艰难梭菌菌落形成单位(CFU)/mg计数；以及(b)施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含艰难梭菌的细胞表面多糖或细胞表面多糖缀合物和包含艰难梭菌的类毒素或其片段的多肽。在一些实施方式中，对象处于感染CDI的高风险中，包括老年人、计划住院的成人、长期护理机构居住者和患有需要长期使用抗生素的共病的患者。
组合疗法
在一些实施方式中，本公开的组合物和方法可以与至少一种用于预防或治疗CDI的附加药剂组合施用。在一些实施方式中，至少一种附加药剂可以与组合物或疫苗同时施用。在一些实施方式中，至少一种附加药剂可以与组合物或疫苗依次施用。在一些实施方式中，附加药剂是抗生素，例如，万古霉素、非达霉素、甲硝唑或利福昔明。在一些实施方式中，抗生素是万古霉素。在一些实施方式中，抗生素是非达霉素。在一些实施方式中，抗生素是甲硝唑。在一些实施方式中，抗生素是利福昔明。
伴随诊断
在一些实施方式中，本文公开了一种治疗感染的方法，该方法包括：(a)对生物样品进行实时聚合酶链反应(RT-PCR)或核酸扩增测试(NAAT)，以确定感染的存在，其中感染是艰难梭菌感染；以及(b)向有需要的对象施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含艰难梭菌的细胞表面多糖或细胞表面多糖缀合物和包含艰难梭菌的类毒素的多肽。
用于确定CDI存在的各种方法和测定适用于本公开。测定的非限制性实例包括聚合酶链反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、实时PCR(RT-PCR)、Sanger测序、限制性片段长度多态性(RFLP)、微阵列、Southern印迹、northern印迹、western印迹、eastern印迹、H&E染色、肿瘤的显微镜评估、大规模平行测序(MPS)、下一代DNA测序(NGS)(例如，DNA的提取、纯化、定量和扩增、文库制备)、免疫组织化学(IHC)、蛋白质定量、显色原位杂交(CISH)和荧光原位杂交(FISH)。
试剂盒
本公开还提供了试剂盒。该试剂盒包括包装的本公开的疫苗组合物，以及书面材料，其可以包括使用说明书、临床研究讨论、副作用列表等。此类试剂盒还可以包括信息，例如科学参考文献、包装说明书材料、临床试验结果和/或这些的总结等，其指示或确立组合物的活性和/或优点，和/或描述了剂量、施用、副作用、药物相互作用或对医疗服务人员有用的其他信息。此类信息可以基于各种研究的结果，例如，使用涉及体内模型的实验动物的研究和基于人临床试验的研究。该试剂盒还可以含有另一种药剂。在一些实施方式中，本发明的疫苗组合物和药剂作为单独的组合物在试剂盒内的单独容器中提供。在一些实施方式中，本发明的疫苗组合物和药剂作为试剂盒中容器内的单一组合物提供。合适的包装和使用的附加物品(例如，用于液体制剂的量杯、最小化暴露于空气的箔包装纸等)是本领域已知的，并且可以包括在试剂盒中。本文所述的试剂盒可以提供、销售和/或推广给医疗服务提供者，包括医生、护士、药剂师、处方师(formulary officials)等。在一些实施方式中，试剂盒还可以直接销售给消费者。
实施例
实施例1：PSII多糖的纯化
步骤1，菌种培养：将2mL艰难梭菌菌株8271的冷冻甘油储备液解冻，并用于接种500mL带挡板烧瓶中的100mL PSII培养基。接种的培养物在37℃厌氧环境中孵育16-18小时，直到培养物的OD600达到3.5-4.5。
步骤2，发酵罐(接种)：使用30mL菌种培养物接种含有10L PSII培养基的发酵罐，该培养基已经用氮气鼓泡直到溶解氧水平为0％。
步骤3，发酵(生长)：将10L培养物在37℃±1.0℃下225rpm搅拌生长16-18小时，同时持续氮气鼓泡。当OD600达到4.0±0.5时收获细胞。
步骤4，收获：将细胞通过桶式离心在22℃下8000x g离心15min。在1X PBS中洗涤细胞，并在相同条件下再次旋转。然后将所得细胞糊状物在低于-20℃下冷冻。
步骤5，细胞剥离：将细胞糊状物在环境温度下解冻，并重悬于在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备的0.5％脱氧胆酸钠中的4mL/g湿细胞糊状物中。将重悬的材料在60±2℃下225rpm振荡孵育24小时。孵育后，通过在37℃下13,851x g离心15分钟除去不溶性材料并收集上清液。
步骤6，乙醇沉淀：将无水(100％)乙醇加入来自细胞剥离的上清液中，至最终浓度为20％。溶液在4℃下孵育60分钟，然后在4℃下15,000x g离心并收集上清液。
步骤7，三氯乙酸(TCA)沉淀1：将1体积的TCA(6.12M)加入4体积的乙醇沉淀中。溶液在4℃下孵育10min。溶液孵育之后，在4℃下20,000x g离心15分钟并收集上清液。通过0.45μm过滤器过滤上清液。
步骤8，超滤/渗滤(UFDF)1：使用1kDa分子量(MW)截留过滤器和10体积的10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)通过切向流过滤(TFF)渗滤来自TCA沉淀的上清液。
步骤9，在苯基-琼脂糖凝胶柱上进行疏水作用色谱：
在UFDF 1后将固体硫酸铵加入PSII中，至最终浓度为2M。将溶液的pH调节至7.0，并通过0.45μm过滤器过滤所得溶液。然后将材料上样至用10mM磷酸钠缓冲液和2M硫酸铵(pH 7.0)平衡的苯基-琼脂糖凝胶快速流动柱上。用3个柱体积的平衡缓冲液洗涤柱。合并柱流穿液和洗涤液。
步骤10，UFDF 2：使用1kDa Mw截留过滤器和10体积的10mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)通过TFF渗滤来自步骤9的合并的流穿液和洗涤液。
步骤11，在Q琼脂糖凝胶柱上进行阴离子交换色谱：
将来自步骤10的渗滤的PSII施加至用10mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)平衡的Q琼脂糖凝胶柱上。用5CV平衡缓冲液洗涤柱，然后用2.5CV的10mM磷酸钠缓冲液、300mM NaCl(pH8.0)洗脱。
步骤12，TCA沉淀2：将1体积的TCA(6.12M)加入4体积的Q-琼脂糖凝胶柱洗脱液中。溶液在4℃下孵育10min。溶液孵育之后，在4℃下20,000x g离心15分钟并收集上清液。通过0.45μm过滤器过滤上清液。
步骤13，UFDF 3：使用1kDa MW截留过滤器和10体积的水通过TFF渗滤来自步骤12的过滤的上清液。
步骤14，在3kDa过滤器上的最终浓度：将来自步骤13的PSII施加至3kDa MW截留旋转过滤器，并通过在4℃下8000x g离心30分钟来浓缩。保留的PSII通过重复离心步骤用水洗涤3次。将最终材料等分并储存在-20℃。
纯化的PSII中多糖含量的分析：通过比色测定(蒽酮或间苯二酚)确定PSII的多糖含量。
通过尺寸排阻色谱和多角度激光散射(SEC-MALS)确定MW：通过尺寸排阻色谱多角度光散射(SEC MALS)分析PSII的MW和多分散性。使用0.137的dn/dc，PSII的平均MW确定为8.8kDa，多分散性极低。将MW四舍五入至10kDa，以计算PSII∶CRM的摩尔比率。图1示出了PSII的SEC MALS分析和相应参数。
使用高性能阴离子交换与脉冲安培检测(HAPAE-PAD)确定酸水解后纯化的PSII的单糖组成。结果显示出葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖的比率为3∶2∶1，与PSII的已知组成一致。在分析中仅观察到少量的N-乙酰葡糖胺。
图6概述了使用脱氧胆酸钠(DOC)剥离艰难梭菌细胞用于PSII纯化的步骤。图7概述了PSII纯化的20％乙醇提取和沉淀阶段的程序。图8概述了用于纯化PSII的20％乙醇提取材料的第一次TCA沉淀的程序。图9概述了在第一次TCA沉淀之后超滤/渗滤(UFDF 1)PSII并加入硫酸铵以准备在苯基-琼脂糖凝胶柱上进行疏水作用色谱阶段的程序。图10概述了将UFDF 1材料施加至苯基-琼脂糖凝胶柱上、收集流穿液和洗涤级分的程序。图11概述了来自苯基-琼脂糖凝胶柱的合并级分的第二次UFDF(UFDF-2)步骤的程序，以准备在Q-琼脂糖凝胶柱上通过阴离子交换色谱进行分离。图12概述了将UFDF-2材料施加在Q-琼脂糖凝胶柱上并使用含有300mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(15％的缓冲液B)洗脱PSII的程序。图13概述了Q-琼脂糖凝胶柱洗脱液的第二次TCA沉淀的程序。图14概述了第二次TCA沉淀至水中后PSII的超滤/渗滤(UFDF-3)的程序。图15概述了在3kDa MW截留旋转过滤器上浓缩来自UFDF-3的材料的程序。表3概述了PSII纯化的程序。
表3
实施例2：PSII-缀合物的缀合化学
使用高碘酸盐介导的还原胺化化学(RedAm)、氰基化化学(CDAP)、TEMPO氧化-胺化化学(TEMPO)和末端连接的氨氧基硫醇点击化学(末端连接)制备四种不同的PSII-CRM197缀合物。用RedAm、CDAP和TEMPO化学，可以在PSII和CRM197之间制成多个附接点，产生形成“晶格”结构的高分子量缀合物(图2)。用末端连接化学，在PSII链和CRM197之间仅制成单个附接点，产生具有“星形”结构的缀合物(图2)。
衍生的CRM197的制备：CRM197用于所有缀合方法。根据缀合方案，使用酰肼或马来酰亚胺衍生的CRM197。
CRM197-ADH的制备：将10mg/mL的溶液用pH 6.0的0.1M MES缓冲液稀释至4mg/mL，并与等体积的0.5M己二酸二酰肼(ADH)在pH 6的0.1M MES中组合。然后将溶液从100mg/mL储备液制备成5mg/mL EDAC。2hr之后，将溶液的pH升高至8，并通过透析除去试剂。使用TNBS测定法确定酰肼比率，发现为6个ADH/CRM。获得所需产物，产率为约70％。CRM-ADH与其他ADH衍生的蛋白质一样，粘附在SEC HPLC柱上，不能提供干净的色谱图。SDS-PAGE分析显示出CRM-ADH的单一条带(数据未显示)。
CRM-马来酰亚胺的制备：将5mg/mL的用25x N-γ-马来酰亚胺基丁酰基-氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)在pH 7.2下标记1hr，使用Vivaflow 10kDa切向流过滤设备脱盐，并将缓冲液交换为pH 6.8的10mM磷酸钠/10mM EDTA+5％蔗糖。将CRM-马来酰亚胺产物等分并储存在-80℃，直到使用。通过测量半胱氨酸硫醇的反应确定马来酰亚胺比率，并平均为15个马来酰亚胺/CRM。反应的典型产率大于80％。
PSII多糖的制备：将PSII粗品溶解在DI水中，以制备50mg/mL溶液。使用3KDamicon ultra4旋转设备将PSII溶液的体积减少一半。使用DI水使溶液回到原始体积，并通过4000RPM旋转使体积再次减少一半。该过程重复4-5次，并将所得溶液冻干，以获得纯PSII。可替代地，用DI H2O制备100mg/mL的PSII粗品溶液。使用7KDa Zeba柱程序纯化并冻干溶解的PSII材料，以提供干净的产物。使用该方案收集的纯PSII的量在产率上在起始粗品质量的50-75％之间变化。
PSII-CRM197缀合物的合成：制备艰难梭菌PSII荚膜多糖与载体蛋白CRM197的缀合物。使用(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基(TEMPO)介导的氧化和1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)化学来使沿着聚合物链的重复单元官能化。TEMPO-氧化的PSII产生羧基，该羧基随后使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)与酰肼衍生的CRM197缀合。CDAP活化的PSII用胺衍生化、硫醇化，并与马来酰亚胺衍生的CRM197连接。第三种方法使用还原胺化化学来衍生具有单个硫醇基团的聚合物末端。然后将硫醇化的PSII与马来酰亚胺衍生的CRM197缀合。TEMPO和CDAP活化多个羟基并产生晶格缀合物。经由末端还原糖的第三种缀合方法不引起交联，产生较低MW的缀合物。图2示出了TEMPO、CDAP和氨氧基缀合化学方案的概述。
方案1
A)PSII TEMPO氧化/EDC缀合：方案1示出了PSII-CRM197缀合的TEMPO途径。将PSII以10mg/mL的浓度溶解在水中。每mL PSII溶液加入30μL的TEMPO(10mg/mL水溶液)，随后加入6.25μL NaBr(100mg/mL水溶液)。然后用0.1M NaOH将混合物的pH升高至9.0。将所得溶液冷却，每mL溶液加入2.5μL的14.5％次氯酸钠。将溶液的pH保持在9，持续1.5小时，每mL溶液加入25μL的乙醇。将所得混合物搅拌15min。用水稀释溶液，使用Amicon Ultra 4离心设备(3kDa截留)脱盐至水中，并冻干。通过EDAC胺化估计氧化程度，以获得每个PSII 3-4的胺∶PSII比率。
PSIICRM-ADH的EDAC缀合：PSII-COOH(10mg/mL)和CRM-ADH(～8.2mg/mL)以1.6∶1的比率混合。加入pH 6的1M MES缓冲液，以获得最终浓度为0.1M的pH 6MES缓冲液。将溶解在最少量水中的EDC加入溶液中，以使反应混合物的最终浓度为10mg/mL。反应混合物在室温下反应2hr，并在4℃下进一步反应过夜(15小时)。使用Superdex 200柱(1.6直径，60cm高)纯化缀合物。合并早期洗脱的级分，并使用具有30kDa膜的Amicon压力受感设备浓缩。通过测量280nm处的吸光度确定蛋白质浓度，并使用间苯二酚方法估计PSII的量。PSII的最终浓度为～1.2mg/mL，CRM197为2.1mg/mL，0.57mg PSII/mg CRM，PSII∶CRM197比率为3∶1至4∶1。通过SEC MALS分析所得缀合物，但在HPLC柱上显示出非常差的回收率。图3上图示出了TEMPO/EDC/CRM197缀合物的SEC MALS迹线。下图示出了TEMPO/EDC/CRM197缀合物的分析总结。
B)PSIICDAP硫醚缀合：方案2示出了使用CDAP缀合的PSII-CRM197缀合的概述。
方案2
PSII胺化：将PSII以20mg/mL的浓度溶解在盐水中。将200μL/mL的2.5M DMAP加入溶液中，并在冰浴中将溶液的pH调节至pH 9。使用100mg/mL乙腈储备溶液，通过每mL溶液加入100μL CDAP开始活化。使用0.1M NaOH将溶液的pH保持在9。10min之后，每mL溶液加入500μL的0.5M 1,6-己二胺。在4℃下1hr之后，使用Zeba柱将PSII溶液脱盐，并将洗脱液冻干。使用TNBS确定胺化程度，结果为每个PSII 3-4个胺。
PSII-NH2硫醇化：将PSII-NH2以3.5mg/mL的浓度溶解在pH 8的0.1M HEPES中。从用DMSO制备的0.1M储备溶液中过量加入SPDP。1.5hr之后，产物用TCEP脱保护并脱盐至pH6.8的PBS+5mM EDTA中。DTNB测定表明每个PSII存在～3-4个硫醇。反应产率为80％。
PSII-SH CRM-马来酰亚胺缀合：将PSII-SH和CRM-马来酰亚胺以1.3∶1的质量比率组合。在用PBS平衡的Superdex 200柱(1.6直径，60cm高)上纯化缀合物。使用具有30kDa膜的Amicon搅拌压力受感装置浓缩纯化的材料。通过SEC、SEC MALS、间苯二酚和OD 280分析缀合物。基于缀合物中的PSII质量计算的缀合产率为33％。图4上图示出了CRM-马来酰亚胺和PSII-CRM197 SEC MALS迹线。中间图示出了PSII-CRM197 CDAP缀合物的SEC迹线。下图示出了用于分析PSII-CRM197 CDAP缀合物的分析参数。
C)末端连接的PSII：方案3示出了经由还原胺化途径的PSII-CRM197缀合的概述。
方案3
PSII的还原胺化反应/末端硫醇化：将PSII以5mg/mL的浓度溶解在DMSO中。加入5当量的1-氨氧基-3-硫醇-丙烷，将所得溶液混合30min，然后加入6当量的三乙酰氧基硼氢化钠。反应在50℃下再搅拌18h。然后冷却所得混合物，并用乙醇沉淀PSII。通过离心收集沉淀物。将沉淀物重新溶解在水中，用Amicon Ultra-4 3kDa截留离心设备进一步纯化并冻干。反应产率为85％。
PSII末端连接的硫醇-马来酰亚胺-CRM197缀合：将PSII硫醇以约10mg/mL的浓度溶解在DI水中，并加入TCEP至最终浓度达到6mg/mL。在孵育1hr之后，用Amicon Ultra-4 3K离心设备纯化产物，随后在Zeba旋转柱(7kDa截留)上脱盐至pH 6.8的PBS+EDTA最终缓冲液中。用DTNB测定硫醇，其表明约1个硫醇/PSII聚合物。将5mg/mL浓度的CRM-马来酰亚胺(15个马来酰亚胺/CRM)与每CRM约8个硫醇组合。过夜反应之后，在用PBS平衡的Superdex200柱上纯化缀合物。使用具有10kDa膜的Amicon压力受感装置浓缩纯化的缀合物。通过SEC、SECMALS、间苯二酚和OD 280分析缀合物。图5中的图A示出了PSII-CRM197和CRM-马来酰亚胺SECM ALS迹线。图B示出了PSII-CRM的SEC迹线。图C示出了SEC MALS分析、OD280和间苯二酚测定的分析参数。
表4示出了PSII-CRM197缀合物特征的总结。
表4
化学 活化基团 活性基团数/PSII 缀合物形式
TEMPO/EDC 伯羟基 3-5个羧基 晶格
CDAP/硫醚 羟基 3-5个硫醇 晶格
还原氧化/硫醚 还原末端 1个硫醇 星形
碳水化合物分析：使用间苯二酚/硫酸方法测定碳水化合物部分。最初，将具有通过干重制备的标准溶液的纯化的PSII用于测定。由于制备PSII标准精确溶液的不确定性，仅评估了2∶2∶1(PSII重复组中发现的比例)的N-Ac-Gal∶Glu∶Man混合物和葡萄糖。2∶2∶1的N-Ac-Gal∶Glu∶Man混合物和葡萄糖产生类似的标准曲线。葡萄糖用作碳水化合物测定中的标准品。
胺和酰肼测定：2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)用于分别使用甘氨酸或己二酸二酰肼测量胺和酰肼。
硫醇测定：使用5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测量硫醇。
表5示出了使用三种不同化学制备的PSII缀合物。
表5
*间苯二酚测定，葡萄糖标准
**1.25x葡萄糖低估校正
***通过SEC MALS确定
实施例3：预防性免疫和用艰难梭菌攻击
使用实施例1的方法，用还原胺化(RedAM)、TEMPO或CDAP缀合化学制成PSII-CRM197缀合物。缀合物用于使用每两周一次共三次的(3-biweekly)剂量方案以20μg剂量水平免疫小鼠，随后用104菌落形成单位(CFU)的艰难梭菌孢子进行胃内(IG)攻击。在预防性免疫和攻击模型中，用CDAP缀合物免疫的5只小鼠中有3只死于艰难梭菌感染。在用TEMPO和RedAM缀合物免疫的组中没有小鼠死亡，但未观察到针对艰难梭菌攻击的明显保护。
血清样品收获：在第一次免疫前(免疫前)、第14天(第一次免疫之后约2周)、第28天(第二次免疫之后约2周)和第42天(第三次免疫之后约2周)，使用无菌Goldenrod动物刺血针经由下颌下静脉穿刺将小鼠血液收集至血清分离管中。在收集血清之前，将血液管在2-8℃下储存长达16-18小时。储存后，将血液升温至环境温度，然后在微量离心机中10,000rpm离心10分钟。将凝胶块上的血清收集至标记的微量离心管中。将合并的和单独的血清样品储存在-20℃，直到用于测定。
粪便颗粒收获：在指定时间点将粪便颗粒(1颗粒＝～25mg)收集至预称重的无菌Eppendorf管中。在均化之前，将500μL的无菌PBS+20％甘油加入每个粪便样品中。均化之后，将60μL的粪便浆液等分至2个无菌Eppendorf管中并冷冻，直到准备铺板。剩余的粪便浆液保持冷冻，直到样品准备用于粪便DNA提取。
CDI的艰难梭菌预防性免疫和攻击小鼠模型：用测试品以每两周一次的间隔肌内免疫小鼠3次。在每次免疫前收集血清样品，以评估免疫应答。在完成每两周一次共三次的剂量方案后，对小鼠施用卡那霉素(0.4mg/mL)、庆大霉素(0.035mg/mL)、粘菌素(850U/mL)、甲硝唑(0.215mg/mL)和万古霉素(0.045mg/mL)在饮用水中的抗生素混合物，持续5天。在治疗期间，还对动物IG施用1∶5稀释的抗生素混合物3次，以确保每只动物在攻击前接受了抗生素。在第五天，给小鼠定期饮水。艰难梭菌攻击的前一天，将小鼠称重，并将体重平均以制备克林霉素溶液，从而对每只小鼠IP施用10mg/kg克林霉素。第二天(攻击第0天)，将每只小鼠称重，收获粪便颗粒，并IG施用100μL PBS中的～104CFU艰难梭菌孢子。监测小鼠感染后的症状和体重减轻。定期收获粪便颗粒，用于评估随时间的CFU生长。在研究的最后一天，对所有剩余的动物进行末梢采血。图16示出了CDI的预防性免疫和攻击小鼠模型的一般示意图。表6示出了第42天的抗PSII IgG应答。数据显示出PSII-CRM197缀合物在艰难梭菌初免和幼稚的小鼠中引发抗PSII IgG抗体。
表6
实施例4：通过粪便定殖和抗体应答确定的二级预防
使用CDI的二级预防模型来确定由初级CDI初免的小鼠在用PSII缀合物疫苗接种时是否具有免疫应答增强。在通过口服管喂进行艰难梭菌感染前，用抗生素混合物治疗小鼠组。在2-3周内监测小鼠的发病率、死亡率、体重减轻和其他CDI症状。使感染小鼠或艰难梭菌初免的小鼠恢复，直到小鼠达到正常体重。然后，在开始每两周一次共三次的给药方案前，从每只小鼠获得基线采血、体重和粪便样品。
用RedAM或CDAP制成的PSII-CRM197缀合物用于使用每两周一次共三次的给药方案以20μg剂量水平免疫小鼠。每周收获粪便样品，并在每两周一次共三次的给药方案中的每次免疫前收集血液样品。主要研究终点是：1)第0天、第14天、第28天、第56天及以后的粪便CFU；以及2)第0天、第14天、第28天、第42天、第56天及以后的PSII IgG应答。如上述实施例3所述收获血清样品和粪便颗粒。
对小鼠施用卡那霉素(0.4mg/mL)、庆大霉素(0.035mg/mL)、粘菌素(850U/mL)、甲硝唑(0.215mg/mL)和万古霉素(0.045mg/mL)在饮用水中的抗生素混合物，持续5天。在治疗期间，对动物IG施用1∶5稀释的抗生素混合物3次，以确保每只动物在攻击前接受了抗生素。在第五天，小鼠恢复正常饮水。艰难梭菌攻击的前一天，将小鼠称重。将体重平均以制备克林霉素溶液，使得对每只小鼠通过IP途径施用10mg/kg克林霉素。第二天(攻击第0天)，将每只小鼠称重，收获粪便颗粒，并通过IG途径向每只小鼠施用100μL PBS中的～104CFU艰难梭菌孢子。监测小鼠感染后的发病率、死亡率、症状和体重减轻。定期收获粪便颗粒，用于评估CFU定殖。当小鼠在初次感染后恢复体重时，开始每两周一次共三次的给药方案，其中用测试品以每两周一次的间隔IM免疫小鼠3次。在每次免疫前收集血清样品以评估免疫应答，并在每次免疫前收集粪便颗粒以评估粪便定殖。
图17中的图A示出了各个粪便样品的孢子攻击时间线、免疫时间表和粪便收集时间点。图B示出了治疗性免疫后的艰难梭菌几何平均生长％，免疫前第0天标准化为基线CFU。图18示出了从第0天基线CFU开始的艰难梭菌几何平均生长％。数据显示出在艰难梭菌初免小鼠中，与媒介物对照相比，用两种PSII-CRM197缀合物疫苗接种控制了艰难梭菌的生长。
测试PSII-CRM197缀合物增强艰难梭菌初免小鼠抗体应答的能力。使用PSII-CRM197缀合物免疫幼稚小鼠和用艰难梭菌孢子“初免”的小鼠。用每两周一次共三次的肌内免疫治疗小鼠。在第二次免疫后2周(第28天)和第三次免疫后2周(第42天)确定血清中的抗PSIIIgG抗体水平。数据显示出与幼稚小鼠的应答相比，第二次免疫后2周(第28天)，PSII-CRM197缀合物在艰难梭菌初免小鼠中引发的抗PSII IgG抗体滴度增加8倍。在第42天(完成每两周一次共三次的给药方案后2周)，施用10μg剂量水平的PSII-CRM197缀合物的幼稚小鼠的应答比施用相同剂量水平的艰难梭菌初免小鼠低4倍。然而，施用25μg剂量水平的PSII-CRM197缀合物的幼稚小鼠的第42天抗PSII IgG抗体应答与由10μg或25μg剂量水平的艰难梭菌初免小鼠引发的抗PSII IgG应答相当。
表7
图19中的图A示出了用于获得抗PSII IgG数据的免疫时间表。图B示出了在第14天第一次免疫治疗之后2周确定的粪便定殖(CFU/mg粪便)。图20示出了预防性PSII-CRM197缀合物免疫保护小鼠免于体重减轻和症状。在PSII和PBS免疫的小鼠中，从T＝0开始观察到统计学上显著的体重减轻。用PSII-CRM197缀合物免疫的小鼠未观察到显著的体重变化。
实施例5：PSII-CRM197缀合物在小鼠中的免疫原性
在艰难梭菌感染(CDI)的鼠模型中评估用不同化学方法制备的PSII-CRM197缀合物的免疫原性和保护。进行一系列鼠研究，比较用CDAP、TEMPO和末端连接化学制备的缀合物的免疫原性和保护。基于CDI鼠模型的免疫原性和保护数据以及制造的容易性，选择末端连接化学用于进一步开发。
施用45μg末端连接的PSII-CRM197免疫(用1mg/mL AlPO4佐剂的无菌盐水溶液佐剂化)保护小鼠免于艰难梭菌孢子攻击造成的显著体重减轻。相反，20μg的CDAP PSII-CRM197免疫提供了针对艰难梭菌孢子攻击的部分保护。图26示出了预防性免疫和孢子攻击后的几何平均体重减轻。#表示CDAP免疫组在第2天vs第0天的显著体重减轻。*表示对照组在第3天和第6天的显著体重减轻。
表8示出了用测试品免疫后第0天开始的体重减轻％。表9示出了免疫第0天、第14天、第28天和第42天的抗PSII IgG ELISA滴度。
表8
表9
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表10示出了使用生物素化PSII ELISA-第42天合并血清滴度的PSII-CRM197缀合物在小鼠中的免疫原性。数据显示
表10
1每剂量用50ug铝胶佐剂化缀合物。
2在第0天、第14天和第28天肌内(IM)施用总共3次免疫。最后一次免疫后2周(第42天)收集血清样品，并通过PSII特异性ELISA进行测定。以上示出了每组的滴度。
*表示显示出针对孢子攻击的体内保护的组。
实施例6：PSII缀合物的剂量范围研究
研究了增加PSII缀合物剂量的效果。将雌性6周龄C57/BL6小鼠(n＝105)分成接受递增剂量水平的RedAM、TEMPO或CDAP PSII-CRM197缀合物的组，以每两周一次的间隔进行3次。然后用抗生素治疗小鼠，并用104CFU艰难梭菌孢子攻击。监测小鼠的体重减轻和CDI症状。收获血液样品用于免疫原性，并收获粪便颗粒以测试定殖终点。研究的主要终点是：1)在第0天、第1天、第2天、第3天、第6天、第9天和第14天攻击后的体重减轻或症状；2)研究第0天、第14天、第28天、第42天和结束时的PSII IgG应答。研究的次要终点是第0天、第6天和第14天的粪便CFU。
实施例7：末端连接的PSII-CRM197缀合物的合成和表征
合成末端连接的PSII-CRM197缀合物的一般方案示于方案4。
方案4
使用尺寸排阻色谱将缀合物与未缀合的PSII和CRM197分离，并使用多角度激光散射(SEC-MALS)估计分子量和缀合程度。图5示出了通过SEC-MALS对末端连接的PSII-CRM197缀合物的代表性分析。缀合物的分子量为111.8kDa，其对应于含有约6条PSII链(10kDa/链)的单个CRM197-马来酰亚胺分子(61.6kDa)。然而，可以通过改变衍生的PSII与CRM197-马来酰亚胺的比率来控制缀合程度。制备每个CRM197含有平均3、6和10个PSII链的末端连接的PSII-CRM197缀合物，以确定在CDI鼠模型中就免疫原性和保护而言最佳的PSII与CRM197比率。图21A-D示出了分析3种末端连接的PSII-CRM197缀合物的SEC-MALS色谱图数据。估计的分子量和缀合程度示于下表12中。
PSII的单官能化(步骤1)：在玻璃小瓶中，首先将75mg 3-氨氧基丙烷-1-硫醇HCl盐(相对于PSII为40摩尔当量)溶解在4mL 1.0M硼酸盐缓冲液(pH调节至8.5)中。然后，将5mL CPS20 PSII(19.8mg/mL水溶液)与3-氨氧基丙烷-1-硫醇溶液混合。所得溶液在50℃下孵育18h，然后冷却至室温。测量反应溶液的pH为8.79。通过SEC-MALS分析证实PSII的稳定性。
在室温下进行PSII肟的还原。首先将反应溶液的pH调节至8.5。以3个连续批次加入硼氢化钠固体(各50mg，总计150mg)。在还原过程期间，通过在60min内加入1N HCl溶液将反应溶液的pH保持在8.4-8.6之间。通过用1N HCl溶液将pH调节至6.8来淬灭反应。使所得溶液通过0.2μm过滤器(Whatman GD/X PES)，以除去不溶性颗粒，并使最终体积为15mL。SECMALS分析证实了PSII的完整性，并确定了浓度为6mg/mL。
使用5,5-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测定来评估所得PSII-NH2ORSSR的硫醇含量水平。将50μL的PSII-NH2ORSSR等分试样与100μL的三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液(6mgTCEP HCl盐的100mM乙酸钠缓冲液溶液，最终pH 6.0)混合。反应在室温下进行1h。然后使用5mM EDTA的5mM乙酸钠缓冲液溶液(pH 6.5)作为洗涤缓冲液，用3K Amicon超滤器(4,000rpm×25min)通过超速离心除去TCEP、过量的氨氧基硫醇和其他小分子。进行四轮离心。第4次离心之后的滤液在410nm处的OD低于检测限。硫醇浓度计算为0.087mM，导致在还原末端每个PSII分子(7.6KDa)掺入氨氧基硫醇的产率为77％。通过SEC-MALS分析证实PSII的稳定性。
PSII与CRM197-马来酰亚胺的缀合(步骤2和3)：修饰的PSII与CRM197-马来酰亚胺以PSII(7.6K)与CRM-马来酰亚胺的3×、6×或10×摩尔比率进行缀合。在室温下，将TCEP(6mg/mL)的100mM磷酸钠缓冲液溶液(pH 6.0，8mL)加入PSII-NH2ORSSR(6mg/mL，4mL)溶液中。1h之后，使用5mM EDTA的5mM磷酸钠缓冲液溶液(pH 6.6)作为洗涤缓冲液，用3K Amicon超滤器(4,000rpm×25min)通过超速离心除去TCEP、过量的氨氧基硫醇和其他小分子。进行五轮离心。通过DTNB测定确定作为渗余物的PSII游离硫醇。然后将所得PSII游离硫醇溶液与CRM197-马来酰亚胺(5mg/mL，在PBS和5mM EDTA中，pH 6.8)以不同比率混合(表11)。通过加入3mL缀合缓冲液(0.5M PBS、10mM EDTA，pH 7.5)促进缀合反应。将反应溶液在室温下放置2h，然后在4℃下放置16h。通过加入巯基乙醇溶液(0.5M水溶液，10μL)淬灭反应。表11示出了用于CRM197马来酰亚胺以3x、6x和9x比率缀合的PSII游离硫醇的量。
表11
通过SEC MALS分析证实了所有三个反应中PSII与CRM197马来酰亚胺的缀合。图24示出了代表性分析图(6xPSII-CRM)，其在30min处具有PSII-缀合物信号，在38min附近具有PSII和PSII硫醇峰。在24min处存在未知峰，没有可检测到的质量或UV吸光度，其可能是存在于所有三个反应中的可溶性颗粒。将所得缀合反应溶液用PBS稀释至12mL。通过用30KAmicon超滤器离心(4000RPM×15min)除去反应溶液中的PSII和溶液中的其他小分子，得到体积为约300μL的最终浓缩溶液。离心之后，通过SECM ALS分析未发现显著的质量损失。将获得的最终PSII-CRM197缀合物(各2.5-3.0mL)通过无菌0.22过滤器灭菌，并通过SEC MALS分析进行全面分析。
图25A-25D示出了具有缀合物信号中CRM197蛋白和PSII的详细组分的最终SECMALS分析结果以及组合组分的分析。表12示出了详细的质量单位和PSII缀合比率的确定。
表12
使用两种方法计算缀合物中PSII与CRM197的比率。第一种方法使用公式(MWconj-MWCRM)/7.6kDa。第二个值(括号中列出)使用MALS确定的缀合物的CRM197和PSII质量，具有公式：(PSII质量/CRM197质量)*62kDa/7.6kDa(CRM197马来酰亚胺为62kDa)。两种计算结果表明缀合物中PSII与CRM197的靶向比率一致。无菌PSII-CRM197缀合物溶液的最终浓度、体积和量为：1)PBS中的3×PSII-CRM197缀合物3.0mg/mL，2.2mL(6.6mg)；2)PBS中的6×PSII-CRM197缀合物3.4mg/mL，2.2mL(7.6mg)；以及3)PBS中的10×PSII-CRM197缀合物1.8mg/mL，2.7mL(4.9mg)。
实施例8：艰难梭菌疫苗佐剂的作用
终点是通过ELISA确定的抗类毒素A、抗类毒素B、抗PSII IgG应答。测量抗毒素A和抗毒素B中和抗体应答、CDI后的体重减轻和症状，以及粪便CFU。
六组小鼠接受了45μg的PSII缀合物、5μg的类毒素A和5μg的类毒素B、45μg的PSII缀合物、5μg的类毒素A和5μg的类毒素B，或无菌盐水。实验组还接受了不同的佐剂(AlPO4、AlOH或Advax2)。接受Advax2作为佐剂的第5组接受了两次100μL注射。
表13示出了实验的研究组、剂量施用、测试品、佐剂和注射体积。
表13
研究时间线。在第0天、第14天和第27天施用三次免疫，每两周一次。在第0天、第14天、第27天和第41天(最终免疫之后2周)进行采血用于ELISA。第三次免疫后约两周，施用抗生素方案，随后进行孢子攻击。监测动物约几周，包括粪便收集和分析。图28示出了用于确定不同佐剂作用的研究时间线。
组合物1包含45μg的PSII-CRM197末端连接的缀合物、5μg的类毒素A和5μg的类毒素B。图29示出了在感染之后前9天孢子感染后的CDI几何平均体重减轻。与盐水治疗的动物相比，治疗候选者表现出较少的体重减轻。大多数时候，与孢子第0天相比，用AlOH治疗的小鼠表现出比单独用类毒素组合治疗的小鼠更高的体重百分比。与盐水/孢子组相比，用疫苗组合物治疗的动物未表现出显著的体重减轻，特别是在第2-6天。在第2-6天，盐水/孢子组表现出显著的体重减轻。图29中盐水/孢子组的(*)指示与第0天相比，在感染后第2-6天存在统计上显著的体重减轻。盐水/孢子组(**)在感染后第3天有两只死亡小鼠。类毒素A/B曲线的(*)指示与第0天相比，在感染后第6天存在统计上显著的体重减轻。用疫苗组合物1(AlOH)治疗的组在感染后的任何时间点均未表现出统计学上显著的体重减轻。通过双向ANOVA(Dunnett多重比较测试)进行统计学分析。
图30示出了图29从第0天至第30天的图。表14示出了用疫苗组合物1免疫后的体重变化％，如表13中详述的。所有用类毒素A和B的治疗组均未表现出显著的体重减轻，并且接受组合物1的治疗组表现出最稳定的体重。用Advax或ALPO4佐剂化疫苗治疗的组在感染之后不久和感染后最多10天表现出软便。在整个研究期间，用AlOH治疗的组无症状，是恢复至正常体重的第一组。
表14
获得用组合物和不同佐剂治疗的组的最终滴度表。基于单独的滴度数据，与单独用其他佐剂或类毒素的其他治疗相比，用组合物1和AlPO4治疗的组表现出优异的免疫应答。所有样品在免疫第14天(第一次免疫之后两周)进行血清转化。表15和表16示出了单独用PSII-CRM197末端连接的缀合物、类毒素A和B，或缀合物、类毒素A和B以及作为佐剂的AlPO4、AlOH或advax治疗的治疗组和治疗组内的个体小鼠的TxdA IgG ELISA滴度总结数据。
表15
表16
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图31A-C示出了在第14天(图31A)、第27天(图31B)和第41天(图31C)用类毒素A和B(AlOH)、PSII-CRM197末端连接+类毒素A和B+AlPO4、PSII-CRM197末端连接+类毒素A和B+AlOH、PSII-CRM197末端连接+类毒素A和B+Advax2以及无菌盐水(AlPO4)治疗的组中的抗TcdA倒数滴度。图31D示出了在研究持续期间用PSII-CRM197、类毒素A和B(AlOH)、PSII-CRM197末端连接+类毒素A和B+AlPO4、PSII-CRM197末端连接+类毒素A和B+AlOH、PSII-CRM197末端连接+类毒素A和B+Advax2以及无菌盐水(AlPO4)治疗的组的抗TxdA ELISA滴度。
表17和表18示出了单独用PSII-CRM197末端连接的缀合物、类毒素A和B，或缀合物、类毒素A和B以及作为佐剂的AlPO4、AlOH或Advax治疗的治疗组和治疗组内的个体小鼠的TxdB IgG ELISA滴度总结数据。
表17
表18
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实施例9：末端连接的PSII-CRM197缀合物的免疫原性和保护
首先在还原末端通过肟形成用硫醇基团将PSII官能化，随后进行还原胺化。然后通过将游离硫醇加至CRM197马来酰亚胺上实现与CRM197的缀合。将最终的6×PSII-EcoCRM缀合物溶液灭菌，并通过SEC-MALS分析表征最终产物。
为了分析缀合物，用250μL PBS溶液稀释50μL的最终6xPSII-EcoCRM缀合物溶液。记录稀释样品在280nm处的UV吸光度，以建立CRM197浓度。通过SEC-MALS，用TOSOH TSKgelG4000PW柱分析一式两份的样品(50和100μL注射液)，随后用TSKgel G2000PWxL和含有0.02％叠氮化钠的PBS作为电泳缓冲液以0.5mL/min的流速进行分析。对于缀合物分析，PSII的dn/dc为0.137，UV系数为0；CRM197的dn/dc为0.185，UV系数为0.934。确定的PSII-CRM197缀合物的质量、浓度和比率总结于表19中。使用以下公式计算缀合物中PSII与CRM197的比率：(PSII质量/CRM197质量)*62kDa/7.6kDa(CRM197马来酰亚胺为62kDa)。代表性数据可以在图23A-23B中发现。
表19
产生70mg含有平均6条链的末端连接的PSII-CRM197，用于在CDI鼠模型中进一步评估。进行几项鼠研究以在2种CDI鼠模型中检查末端连接的PSII-CRM197缀合物的剂量水平对免疫原性的影响。第一种鼠模型评估了疫苗对原发性CDI的疾病症状的预防，如通过体重减轻所测量的。第二种模型是二级预防(定殖)模型，其中小鼠首先感染艰难梭菌，然后接种疫苗以确定疫苗接种对粪便中艰难梭菌CFU的影响。
将幼稚小鼠(N＝5-8)用45μg分别含或不含5μg类毒素A和B的PSII-CRM197末端连接的缀合物免疫3次，每两周一次。最后一次免疫之后两周，用107个艰难梭菌孢子IG接种小鼠。每天监测每只动物的体重，持续27天。将每个免疫组的体重减轻百分比的几何平均值作图。经发现，来自盐水免疫组的两只小鼠在孢子攻击后第3天死亡。在本实验中无其他死亡。鼠原代CDI模型的结果显示出PSII-CRM197缀合物对感染后初始体重减轻的影响很小至无影响，这主要通过艰难梭菌产生的2种主要毒素的作用介导。有一些证据表明接种疫苗的小鼠体重恢复速率提高(图22)。图22示出了在用有和无类毒素A和B的PSII-CRM197缀合物免疫后针对CDI的保护。(*)表示在孢子攻击后第3天发现来自盐水免疫组的两只小鼠死亡。
在小鼠中评估具有不同PSII链与CRM197比率的末端连接的PSII-CRM197缀合物的免疫原性。在小鼠中，具有平均6条PSII链的缀合物引发最高的抗PSII IgG滴度。所有缀合物均表现出一些免疫原性。
表20示出了缀合物比率研究设计。主要终点是：1)第0天、第14天、第28天和第42天(每次免疫后2周)的血清PSII IgG；以及2)攻击后的体重减轻。
表20
表21示出了具有不同PSII∶CRM197比率的末端连接的PSII-CRM197缀合物的免疫原性。6∶1比率表现出最理想的效果。
表21
1每剂量用50μg铝胶(AlOH)佐剂化缀合物。在第0天、第14天和第28天IM施用总共3次免疫。
2ND表示时间点样品仅作为合并组样品进行测定，而不是单独测定。
免疫原性数据表明在第一次免疫PSII缀合物疫苗前，艰难梭菌的感染在小鼠中引发更快且更强的血清抗PSII IgG滴度(表10)。尽管ELISA对抗PSII IgG水平的初始测量在水平和与保护数据的相关性方面不一致，但是包被抗原的变化产生更一致的滴度，其更好地与保护数据相关。表22示出了在幼稚小鼠或艰难梭菌感染初免小鼠中免疫后不同PSII∶CRM197比率的免疫原性。
表22
1Proph.(预防性免疫)：在第0天、第14天和第28天将幼稚小鼠组用PSII-CRM197缀合物免疫3次，每两周一次。在第一次免疫前和在第14天、第28天和第42天每次随后免疫后两周收集血清。通过PSII特异性ELISA测定血清，上文报告了滴度。
2第2次Proph.(二次预防性免疫)：用10^4个艰难梭菌孢子感染幼稚小鼠组，并从所有CDI症状中恢复。在感染后第23天，将小鼠分成8至10组，并以每两周一次的间隔IM施用PSII-CRM197缀合物3次。在第一次免疫前和在第14天、第28天和第42天每次随后免疫后两周收集血清样品。通过PSII特异性ELISA测定血清，上文报告了滴度。
图27A-27D示出了艰难梭菌孢子攻击后与CDI相关的体重减轻。图27A示出了小鼠CDI后的体重减轻；图27B示出了与孢子第0天相比，用3∶1的PSII∶CRM197治疗的小鼠第1-14天的体重变化百分比；图27C示出了与孢子第0天相比，用6∶1的PSII∶CRM197治疗的小鼠第1-14天的体重变化百分比；图27D示出了与孢子第0天相比，用10∶1的PSII∶CRM197治疗的小鼠第1-14天的体重变化百分比。对于无菌盐水组，无菌盐水对照组的一笼在第14天无水，数据排除在外(n＝4)。其余组n＝8。
实施例10：临床试验研究设计
1期试验：1期试验的目的是优化制剂并测试药物组合物的安全性、耐受性和免疫原性，该药物组合物包含艰难梭菌PSII抗原、毒素A的类毒素和毒素B的类毒素。1期临床试验是比较药物组合物和两种不同制剂(各自具有不同佐剂)的2-臂研究。1期试验的主要终点是类毒素A、类毒素B和PSII的Ab滴度；以及安全性概况。1期试验的次要终点包括粪便定殖、CDI发生率以及CDI的严重程度和持续时间。纳入和排除标准包括艰难梭菌定殖阳性和阴性的患者。检查对象的免疫原性差异。如果对象先前患有CDI，则在研究之前设置发生阈值。1期试验的样品量为位于美国的150-200名对象。
2期临床试验(主要剂量确定试验)：2期临床试验的目的是优化剂量，测试药物预防CDI的安全性、免疫原性和功效。对对象进行随访，以研究药物组合物对长期CDI的作用。2期临床试验是比较除标准护理(SOC)治疗之外的药物组合物的不同剂量和制剂的多臂研究。将用药物组合物治疗与仅用SOC治疗进行比较。主要终点包括CDI发生率、严重程度和持续时间以及安全性概况。次要终点包括类毒素A、类毒素B和PSII的Ab滴度；免疫应答的持久性；以及粪便定殖。纳入和排除标准包括按艰难梭菌定殖阳性和阴性划分的患者。如果对象先前患有CDI，则在研究之前设置发生阈值。其他参与因素包括计划入住医院或疗养院的对象、家属检测为艰难梭菌定殖阳性的对象，以及最近未使用抗生素的患者参与者。2期临床试验的样品量为位于美国的200-500名对象。根据需要增加欧洲的其他对象。
3期试验：3期临床试验的目的是确定药物组合物预防CDI的功效、免疫原性、安全性和比较数据，该药物组合物包含艰难梭菌PSII抗原、毒素A的类毒素和毒素B的类毒素。3期研究是比较药物组合物与PF-06425090(Pfizer)在初级预防CDI的作用，以及比较药物组合物与标准护理在二级预防或治疗CDI中的作用的2-臂研究。2期临床试验的纳入和排除标准用于3期试验。选择约2000名对象的样品量进行多国研究。
实施例11：临床试验的患者选择考虑
用于初级预防的老年风险患者：选择老年风险患者是因为老年患者(>55岁)的风险最大，例如居住疗养院的对象、最近住院的对象或患有艰难梭菌定殖的对象。选择老年患者作为患者组，因为对象易于识别(即，住在疗养院或辅助生活院、最近出院、先前使用广谱抗生素)。丰富的患者类型允许适度的研究规模和较低的成本。由于免疫衰老，老年患者可能需要强佐剂。对于3期临床研究，CDI发生率相对较低，因此进行了更大规模的研究。选择老年风险对象组的风险是研究能力不足以显示疾病发病率差异的风险；以及老年患者可能不会表现出强免疫应答。
具有艰难梭菌定殖和CDI风险的成人(初级和二级预防)：具有艰难梭菌定殖和CDI风险的成人包括具有预定阈值(例如，6个月)之前有发作的患者。其他风险患者包括患有炎性肠病(IBD)或其他GI病症的成人。先前患有CDI的成人具有1/5的复发可能性。对象组包括通过PCR或NAT确定的具有艰难梭菌定殖的成人，以及先前无CDI的高危成人。CDI降低的主要终点用作区分对象组的方法。
患有活动性疾病的成人(初级治疗)：患有活动性CDI的成人具有最高的未满足需求。暴发性感染具有约7％的适度死亡率。将用本公开的药物组合物治疗加入至标准护理治疗上以鼓励招募。对象表现出>25％的原发性CDI可能性，其高于复发性CDI。研究组需要快速免疫原性，并且仅需1或2个剂量即可在疾病过程中的数天内实现药物组合物的临床益处。必须快速诱导足够的免疫原性，因为CDI的第一次复发发生在最初发生的2-4周内。
实施方式
以下非限制性实施方式提供了本发明的说明性实施例，但不限制本发明的范围。
实施方式1.一种组合物，该组合物包含来自艰难梭菌的细胞表面多糖，其中细胞表面多糖是从艰难梭菌富集的PSII抗原，其中组合物的总碳水化合物重量百分比为至少约40％，并且其中从艰难梭菌富集的PSII抗原占总碳水化合物百分比的至少90％。
实施方式2.根据实施方式1的组合物，还包含第一多肽或编码第一多肽的第一多核苷酸，其中第一多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段。
实施方式3.根据实施方式2的组合物，其中第一多肽是艰难梭菌毒素A(TcdA)的类毒素或其片段。
实施方式4.根据实施方式2或3的组合物，其中第一多肽是艰难梭菌毒素A的全长类毒素。
实施方式5.根据实施方式2-4中任一项的组合物，还包含第二多肽或编码第二多肽的第二多核苷酸，其中第二多肽包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段。
实施方式6.根据实施方式5的组合物，其中第二多肽是艰难梭菌毒素B(TcdB)的类毒素或其片段。
实施方式7.根据实施方式6的组合物，其中第二多肽是毒素B的全长类毒素。
实施方式8.根据实施方式1-7中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是阴离子细胞表面多糖。
实施方式9.根据实施方式1-8中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是未取代或取代的。
实施方式10.根据实施方式1-9中任一项的组合物，其中第一多肽和第二多肽是融合的。
实施方式11.根据实施方式2-10中任一项的组合物，其中第一多肽与SEQ ID NO:4-6中的任一个具有至少80％序列同一性。
实施方式12.根据实施方式5-11中任一项的组合物，其中第二多肽与SEQ ID NO:1-3或7-40具有至少80％序列同一性。
实施方式13.根据实施方式2-12中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖与第一多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
实施方式14.根据实施方式5-13中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖与第二多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
实施方式15.根据实施方式1-14中任一项的组合物，其中PSII抗原是PSII、其药学上可接受的盐或免疫原性片段。
实施方式16.根据实施方式15的组合物，其中PSII、其药学上可接受的盐或免疫原性片段包含磷酸酯部分。
实施方式17.根据实施方式5-16中任一项的组合物，其中细胞表面多糖不与第一多肽或第二多肽缀合。
实施方式18.根据实施方式1-17中任一项的组合物，其中PSII是式(I)的多糖：
其中n是1至100的整数。
实施方式19.根据实施方式1-18中任一项的组合物，其中细胞表面多糖的分子量为约5kDa至约10kDa。
实施方式20.根据实施方式1-19中任一项的组合物，其中细胞表面多糖的分子量为约8.8kDa。
实施方式21.根据实施方式1-20中任一项的组合物，还包含佐剂。
实施方式22.根据实施方式21的组合物，其中佐剂包含铝基佐剂。
实施方式23.根据实施方式21的组合物，其中佐剂包含氢氧化铝。
实施方式24.根据实施方式21的组合物，其中佐剂包含磷酸铝。
实施方式25.根据实施方式21的组合物，其中佐剂包含δ菊粉微粒。
实施方式26.根据实施方式1-25中任一项的组合物，其中PSII抗原与药学上可接受的载体缀合。
实施方式27.根据实施方式26的组合物，其中药学上可接受的载体是白喉毒素的突变体。
实施方式28.根据实施方式26的组合物，其中药学上可接受的载体是CRM197。
实施方式29.根据实施方式26-28中任一项的组合物，其中PSII抗原通过化学接头与药学上可接受的载体缀合。
实施方式30.根据实施方式29的组合物，其中化学接头包含硫代琥珀酰亚胺。
实施方式31.根据实施方式29的组合物，其中化学接头包含硫酯。
实施方式32.根据实施方式1-31中任一项的组合物，其中PSII抗原与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约1000kDa。
实施方式33.根据实施方式1-31中任一项的组合物，其中PSII抗原与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约350kDa。
实施方式34.根据实施方式1-33中任一项的组合物，其中PSII抗原是来自艰难梭菌的天然细胞表面多糖。
实施方式35.根据实施方式1-34中任一项的组合物，其中PSII抗原是非合成的。
实施方式36.根据实施方式1-35中任一项的组合物，其中PSII抗原是从一种或多种艰难梭菌菌株纯化的。
实施方式37.根据实施方式1-36中任一项的组合物，其中PSII抗原来自一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物(CSE)。
实施方式38.根据实施方式1-37中任一项的组合物，其中组合物包含按重量计小于约20％的来自艰难梭菌的多肽。
实施方式39.根据实施方式1-38中任一项的组合物，其中艰难梭菌是核糖型001、003、012、014、027、036、106、MOH 900或MOH 718。
实施方式40.根据实施方式1-39中任一项的组合物，其中组合物是免疫原性组合物或疫苗。
实施方式41.根据实施方式40的组合物，其中组合物诱导针对PSII抗原的中和滴度。
实施方式42.根据实施方式40或41的组合物，其中组合物诱导针对艰难梭菌毒素A或艰难梭菌毒素B的中和滴度。
实施方式43.根据实施方式40或41的组合物，其中组合物诱导针对艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B的中和滴度。
实施方式44.根据实施方式1-43中任一项的组合物，其中组合物包含相对于PSII抗原的总重量按重量计小于约5％的杂质。
实施方式45.根据实施方式44的组合物，其中杂质是肽聚糖、蛋白质、核酸、糖类或其组合。
实施方式46.根据实施方式44或45的组合物，其中杂质是艰难梭菌杂质。
实施方式47.根据实施方式44-46中任一项的组合物，其中杂质是核酸。
实施方式48.根据实施方式44-46中任一项的组合物，其中杂质是糖类。
实施方式49.根据实施方式44-46中任一项的组合物，其中杂质来源于艰难梭菌的细胞表面提取物。
实施方式50.根据实施方式1-49中任一项的组合物，其中组合物包含相对于PSII抗原的总重量按重量计小于约5％的肽聚糖杂质。
实施方式51.根据实施方式1-50中任一项的组合物，其中组合物包含相对于PSII抗原的总重量按重量计小于约5％的蛋白质杂质。
实施方式52.根据实施方式1-51中任一项的组合物，其中组合物包含相对于PSII抗原的总重量按重量计小于约5％的核酸杂质。
实施方式53.根据实施方式1-52中任一项的组合物，其中组合物包含相对于PSII抗原的总重量按重量计小于约5％的糖类杂质。
实施方式54.根据实施方式1-53中任一项的组合物，其中组合物包含相对于PSII抗原的总重量按重量计小于约5％的杂质混合物，其中杂质混合物选自：
(a)相对于PSII抗原的总重量的核酸和蛋白质杂质混合物；
(b)相对于PSII抗原的总重量的核酸和肽聚糖杂质混合物；
(c)相对于PSII抗原的总重量的肽聚糖和蛋白质杂质混合物；
(d)相对于PSII抗原的总重量的糖类和蛋白质杂质混合物；
(e)肽聚糖和糖类杂质混合物；以及
(f)相对于PSII抗原的总重量的核酸和糖类杂质混合物。
实施方式55.根据实施方式1-54中任一项的组合物，其中组合物包含相对于PSII抗原的总重量按重量计小于约5％的杂质混合物，其中杂质混合物选自：
(a)相对于PSII抗原的总重量的核酸、蛋白质和肽聚糖杂质混合物；
(b)相对于PSII抗原的总重量的糖类、蛋白质和肽聚糖杂质混合物；
(c)相对于PSII抗原的总重量的核酸、蛋白质和糖类杂质混合物；以及
(d)相对于PSII抗原的总重量的核酸、肽聚糖和糖类杂质混合物。
实施方式56.根据实施方式1-55中任一项的组合物，包含相对于PSII抗原的总重量按重量计小于约5％的核酸、肽聚糖、糖类和蛋白质杂质混合物。
实施方式57.根据实施方式1-56中任一项的组合物，包含按重量计至少5％的PSII抗原。
实施方式58.一种组合物，该组合物包含：
(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及
(b)包含载体蛋白的第一多肽；
其中载体蛋白和艰难梭菌的细胞表面多糖以小于约10∶1至约1∶3的比率存在于组合物中。
实施方式59.根据实施方式58的组合物，还包含第二多肽或编码第二多肽的第一多核苷酸，其中第二多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段。
实施方式60.根据实施方式59的组合物，其中第二多肽是艰难梭菌毒素A(TcdA)的类毒素或其片段。
实施方式61.根据实施方式59或60的组合物，其中第二多肽是毒素A的全长类毒素。
实施方式62.根据实施方式58-61中任一项的组合物，还包含第三多肽或编码第三多肽的第二多核苷酸，其中第三多肽包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段。
实施方式63.根据实施方式62的组合物，其中第三多肽是艰难梭菌毒素B(TcdB)的类毒素或其片段。
实施方式64.根据实施方式62或63的组合物，其中第三多肽是毒素B的全长类毒素。
实施方式65.根据实施方式58-64中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是阴离子细胞表面多糖。
实施方式66.根据实施方式58-65中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是未取代或取代的。
实施方式67.根据实施方式62-66中任一项的组合物，其中第二多肽和第三多肽是融合的。
实施方式68.根据实施方式59-67中任一项的组合物，其中第二多肽与SEQ ID NO:4-6中的任一个具有至少80％序列同一性。
实施方式69.根据实施方式62-68中任一项的组合物，其中第三多肽与SEQ ID NO:1-3或7-40具有至少80％序列同一性。
实施方式70.根据实施方式59-69中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖与第二多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
实施方式71.根据实施方式62-70中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖与第三多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
实施方式72.根据实施方式58-71中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是PSII、其药学上可接受的盐或免疫原性片段。
实施方式73.根据实施方式72的组合物，其中PSII或其药学上可接受的盐或免疫原性片段包含磷酸酯部分。
实施方式74.根据实施方式62-73中任一项的组合物，其中细胞表面多糖是从艰难梭菌富集的，并且不与第二多肽或第三多肽缀合。
实施方式75.根据实施方式58-74中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是富集的来自艰难梭菌的细胞表面多糖。
实施方式76.根据实施方式72或73的组合物，其中PSII是式(I)的多糖：
其中n是1至100的整数。
实施方式77.根据实施方式58-76中任一项的组合物，其中细胞表面多糖的分子量为约5kDa至约10kDa。
实施方式78.根据实施方式58-77中任一项的组合物，其中细胞表面多糖的分子量为约8.8kDa。
实施方式79.根据实施方式58-78中任一项的组合物，还包含佐剂。
实施方式80.根据实施方式79的组合物，其中佐剂包含铝基佐剂。
实施方式81.根据实施方式79的组合物，其中佐剂包含氢氧化铝。
实施方式82.根据实施方式79的组合物，其中佐剂包含磷酸铝。
实施方式83.根据实施方式79的组合物，其中佐剂包含δ菊粉微粒。
实施方式84.根据实施方式58-83中任一项的组合物，其中艰难梭菌的细胞表面多糖与载体蛋白缀合。
实施方式85.根据实施方式84的组合物，其中载体蛋白是白喉毒素的突变体。
实施方式86.根据实施方式84的组合物，其中载体蛋白是CRM197。
实施方式87.根据实施方式84-86中任一项的组合物，其中艰难梭菌的细胞表面多糖通过化学接头与载体蛋白缀合。
实施方式88.根据实施方式87的组合物，其中化学接头包含硫代琥珀酰亚胺。
实施方式89.根据实施方式87的组合物，其中化学接头包含硫酯。
实施方式90.根据实施方式58-89中任一项的组合物，其中艰难梭菌的细胞表面多糖与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约1000kDa。
实施方式91.根据实施方式90的组合物，其中艰难梭菌的细胞表面多糖与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约350kDa。
实施方式92.根据实施方式58-91中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是来自艰难梭菌的天然细胞表面多糖。
实施方式93.根据实施方式58-92中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是非合成的。
实施方式94.根据实施方式58-93中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是从一种或多种艰难梭菌菌株纯化的。
实施方式95.根据实施方式58-94中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖来自一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物(CSE)。
实施方式96.根据实施方式58-95中任一项的组合物，其中组合物或药物组合物包含按重量计小于20％的来自艰难梭菌的多肽。
实施方式97.根据实施方式58-96中任一项的组合物，其中艰难梭菌是核糖型001、003、012、014、027、036、106、MOH 900或MOH 718。
实施方式98.根据实施方式58-97中任一项的组合物，其中组合物是免疫原性组合物或疫苗。
实施方式99.根据实施方式98的组合物，其中组合物诱导针对PSII抗原的中和滴度。
实施方式100.根据实施方式98或99的组合物，其中组合物诱导针对艰难梭菌毒素A和/或艰难梭菌毒素B的中和滴度。
实施方式101.根据实施方式58-100中任一项的组合物，其中组合物包含相对于艰难梭菌的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质。
实施方式102.根据实施方式101的组合物，其中杂质是肽聚糖、蛋白质、核酸、糖类或其组合。
实施方式103.根据实施方式101或102的组合物，其中杂质是艰难梭菌杂质。
实施方式104.根据实施方式101-103中任一项的组合物，其中杂质是核酸。
实施方式105.根据实施方式101-103中任一项的组合物，其中杂质是糖类。
实施方式106.根据实施方式101-103中任一项的组合物，其中杂质来源于艰难梭菌的细胞表面提取物。
实施方式107.根据实施方式58-102中任一项的组合物，其中组合物包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的肽聚糖杂质。
实施方式108.根据实施方式58-102中任一项的组合物，其中组合物包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的蛋白质杂质。
实施方式109.根据实施方式58-102中任一项的组合物，其中组合物包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的核酸杂质。
实施方式110.根据实施方式58-102中任一项的组合物，其中组合物包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的糖类杂质。
实施方式111.根据实施方式58-101中任一项的组合物，其中组合物包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质混合物，其中杂质混合物选自：
(a)相对于细胞表面多糖的总重量的核酸和蛋白质杂质混合物；
(b)相对于细胞表面多糖的总重量的核酸和肽聚糖杂质混合物；
(c)相对于细胞表面多糖的总重量的肽聚糖和蛋白质杂质混合物；
(d)相对于细胞表面多糖的总重量的糖类和蛋白质杂质混合物；
(e)肽聚糖和糖类杂质混合物；以及
(f)相对于细胞表面多糖的总重量的核酸和糖类杂质混合物。
实施方式112.根据实施方式58-101中任一项的组合物，其中组合物包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质混合物，其中杂质混合物选自：
(a)相对于细胞表面多糖的总重量的核酸、蛋白质和肽聚糖杂质混合物；
(b)相对于细胞表面多糖的总重量的糖类、蛋白质和肽聚糖杂质混合物；
(c)相对于细胞表面多糖的总重量的核酸、蛋白质和糖类杂质混合物；以及
(d)相对于细胞表面多糖的总重量的核酸、肽聚糖和糖类杂质混合物。
实施方式113.根据实施方式58-112中任一项的组合物，包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的核酸、肽聚糖、糖类和蛋白质杂质混合物。
实施方式114.根据实施方式58-113中任一项的组合物，包含按重量计至少5％的来自艰难梭菌的细胞表面多糖。
实施方式115.一种组合物，该组合物包含：
(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及
(b)包含来源于除艰难梭菌之外的生物体的载体蛋白的第一多肽；
其中载体蛋白和细胞表面多糖以约10∶1至约1∶10的比率存在于组合物中。
实施方式116.根据实施方式115的组合物，还包含第二多肽或编码第二多肽的第一多核苷酸，其中第二多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段。
实施方式117.根据实施方式116的组合物，其中第二多肽是艰难梭菌毒素A(TcdA)的类毒素或其片段。
实施方式118.根据实施方式116或117的组合物，其中第二多肽是毒素A的全长类毒素。
实施方式119.根据实施方式115-118中任一项的组合物，还包含第三多肽或编码第三多肽的第二多核苷酸，其中第三多肽包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段。
实施方式120.根据实施方式119的组合物，其中第三多肽是艰难梭菌毒素B(TcdB)的类毒素或其片段。
实施方式121.根据实施方式119或120的组合物，其中第三多肽是毒素B的全长类毒素。
实施方式122.根据实施方式115-121中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是阴离子细胞表面多糖。
实施方式123.根据实施方式115-122中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是未取代或取代的。
实施方式124.根据实施方式116-123中任一项的组合物，其中第二多肽和第三多肽是融合的。
实施方式125.根据实施方式116-124中任一项的组合物，其中第二多肽与SEQ IDNO:4-6中的任一个具有至少80％序列同一性。
实施方式126.根据实施方式116-125中任一项的组合物，其中第三多肽与SEQ IDNO:1-3或7-40具有至少80％序列同一性。
实施方式127.根据实施方式116-126中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖与第二多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
实施方式128.根据实施方式119-127中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖与第三多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
实施方式129.根据实施方式115-128中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是PSII、其药学上可接受的盐或免疫原性片段。
实施方式130.根据实施方式129的组合物，其中PSII或其药学上可接受的盐或免疫原性片段包含磷酸酯部分。
实施方式131.根据实施方式115-130中任一项的组合物，其中细胞表面多糖是从艰难梭菌富集的，并且不与第二多肽或第三多肽缀合。
实施方式132.根据实施方式115-131中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是富集的来自艰难梭菌的细胞表面多糖。
实施方式133.根据实施方式129或130的组合物，其中PSII是式(I)的多糖：
其中n是1至100的整数。
实施方式134.根据实施方式115-133中任一项的组合物，其中细胞表面多糖的分子量为约5kDa至约10kDa。
实施方式135.根据实施方式115-134中任一项的组合物，其中细胞表面多糖的分子量为约8.8kDa。
实施方式136.根据实施方式115-135中任一项的组合物，还包含佐剂。
实施方式137.根据实施方式136的组合物，其中佐剂包含铝基佐剂。
实施方式138.根据实施方式136的组合物，其中佐剂包含氢氧化铝。
实施方式139.根据实施方式136的组合物，其中佐剂包含磷酸铝。
实施方式140.根据实施方式136的组合物，其中佐剂包含δ菊粉微粒。
实施方式141.根据实施方式115-140中任一项的组合物，其中艰难梭菌的细胞表面多糖与载体蛋白缀合。
实施方式142.根据实施方式141的组合物，其中载体蛋白是白喉毒素的突变体。
实施方式143.根据实施方式141的组合物，其中载体蛋白是CRM197。
实施方式144.根据实施方式141-143中任一项的组合物，其中艰难梭菌的细胞表面多糖通过化学接头与载体蛋白缀合。
实施方式145.根据实施方式144的组合物，其中化学接头包含硫代琥珀酰亚胺。
实施方式146.根据实施方式144的组合物，其中化学接头包含硫酯。
实施方式147.根据实施方式115-146中任一项的组合物，其中艰难梭菌的细胞表面多糖与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约1000kDa。
实施方式148.根据实施方式147的组合物，其中艰难梭菌的细胞表面多糖与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约350kDa。
实施方式149.根据实施方式115-148中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是来自艰难梭菌的天然细胞表面多糖。
实施方式150.根据实施方式115-149中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是非合成的。
实施方式151.根据实施方式115-150中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是从一种或多种艰难梭菌菌株纯化的。
实施方式152.根据实施方式115-151中任一项的组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖来自一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物(CSE)。
实施方式153.根据实施方式115-152中任一项的组合物，其中组合物或药物组合物包含按重量计小于20％的来自艰难梭菌的多肽。
实施方式154.根据实施方式115-153中任一项的组合物，其中艰难梭菌是核糖型001、003、012、014、027、036、106、MOH 900或MOH 718。
实施方式155.根据实施方式115-154中任一项的组合物，其中组合物是免疫原性组合物或疫苗。
实施方式156.根据实施方式155的组合物，其中组合物诱导针对PSII抗原的中和滴度。
实施方式157.根据实施方式155或156的组合物，其中组合物诱导针对艰难梭菌毒素A和/或艰难梭菌毒素B的中和滴度。
实施方式158.根据实施方式115-157中任一项的组合物，其中组合物包含相对于艰难梭菌的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质。
实施方式159.根据实施方式158的组合物，其中杂质是肽聚糖、蛋白质、核酸、糖类或其组合。
实施方式160.根据实施方式158或159的组合物，其中杂质是艰难梭菌杂质。
实施方式161.根据实施方式158-160中任一项的组合物，其中杂质是核酸。
实施方式162.根据实施方式158-160中任一项的组合物，其中杂质是糖类。
实施方式163.根据实施方式158-160中任一项的组合物，其中杂质来源于艰难梭菌的细胞表面提取物。
实施方式164.根据实施方式115-163中任一项的组合物，其中组合物包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的肽聚糖杂质。
实施方式165.根据实施方式115-163中任一项的组合物，其中组合物包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的蛋白质杂质。
实施方式166.根据实施方式115-163中任一项的组合物，其中组合物包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的核酸杂质。
实施方式167.根据实施方式115-163中任一项的组合物，其中组合物包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的糖类杂质。
实施方式168.根据实施方式115-159中任一项的组合物，其中组合物包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质混合物，其中杂质混合物选自：
(a)相对于细胞表面多糖的总重量的核酸和蛋白质杂质混合物；
(b)相对于细胞表面多糖的总重量的核酸和肽聚糖杂质混合物；
(c)相对于细胞表面多糖的总重量的肽聚糖和蛋白质杂质混合物；
(d)相对于细胞表面多糖的总重量的糖类和蛋白质杂质混合物；
(e)肽聚糖和糖类杂质混合物；以及
(f)相对于细胞表面多糖的总重量的核酸和糖类杂质混合物。
实施方式169.根据实施方式115-159中任一项的组合物，其中组合物包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质混合物，其中杂质混合物选自：
(a)相对于细胞表面多糖的总重量的核酸、蛋白质和肽聚糖杂质
混合物；
(b)相对于细胞表面多糖的总重量的糖类、蛋白质和肽聚糖杂质
混合物；
(c)相对于细胞表面多糖的总重量的核酸、蛋白质和糖类杂质混
合物；以及
(d)相对于细胞表面多糖的总重量的核酸、肽聚糖和糖类杂质混合物。
实施方式170.根据实施方式115-169中任一项的组合物，包含相对于细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的核酸、肽聚糖、糖类和蛋白质杂质混合物。
实施方式171.根据实施方式115-170中任一项的组合物，包含按重量计至少5％的来自艰难梭菌的细胞表面多糖。
实施方式172.一种药物组合物，该药物组合物包含实施方式1-171中任一项的组合物。
实施方式173.一种药物组合物，该药物组合物包含：
(a)从艰难梭菌富集的细胞表面多糖；
(b)第一多肽或编码第一多肽的第一多核苷酸，其中第一多肽包
含艰难梭菌的第一类毒素或其片段；
(c)第二多肽或编码第二多肽的第二多核苷酸，其中第二多肽包
含艰难梭菌的第二类毒素或其片段；以及
(d)药学上可接受的载体；
其中药物组合物具有总碳水化合物百分比，其中总碳水化合物百分比的至少约90％是PSII。
实施方式174.根据实施方式173的药物组合物，其中第一多肽是艰难梭菌毒素A(TcdA)的类毒素或其片段。
实施方式175.根据实施方式173-174的药物组合物，其中第一多肽是艰难梭菌毒素A的全长类毒素。
实施方式176.根据实施方式173-175中任一项的药物组合物，其中第二多肽是艰难梭菌毒素B(TcdB)的类毒素或其片段。
实施方式177.根据实施方式173-176中任一项的药物组合物，其中第二多肽是毒素B的全长类毒素。
实施方式178.根据实施方式173-177中任一项的药物组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是阴离子细胞表面多糖。
实施方式179.根据实施方式173-178中任一项的药物组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是未取代或取代的。
实施方式180.根据实施方式173-179中任一项的药物组合物，其中第一多肽和第二多肽是融合的。
实施方式181.根据实施方式173-180中任一项的药物组合物，其中第一多肽与SEQID NO:4-6中的任一个具有至少80％序列同一性。
实施方式182.根据实施方式173-181中任一项的药物组合物，其中第二多肽与SEQID NO:1-3或7-40具有至少80％序列同一性。
实施方式183.根据实施方式173-182中任一项的药物组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖与第一多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
实施方式184.根据实施方式173-183中任一项的药物组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖与第二多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
实施方式185.根据实施方式173-184中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖是PSII、其药学上可接受的盐或免疫原性片段。
实施方式186.根据实施方式185的药物组合物，其中PSII、其药学上可接受的盐或免疫原性片段包含磷酸酯部分。
实施方式187.根据实施方式173-186中任一项的药物组合物，其中细胞表面多糖不与第一多肽或第二多肽缀合。
实施方式188.根据实施方式173-187中任一项的药物组合物，其中PSII是式(I)的多糖：
其中n是1至100的整数。
实施方式189.根据实施方式173-188中任一项的药物组合物，其中细胞表面多糖的分子量为约5kDa至约10kDa。
实施方式190.根据实施方式173-189中任一项的药物组合物，其中细胞表面多糖的分子量为约8.8kDa。
实施方式191.根据实施方式173-190中任一项的药物组合物，还包含佐剂。
实施方式192.根据实施方式191的药物组合物，其中佐剂包含铝基佐剂。
实施方式193.根据实施方式191的药物组合物，其中佐剂包含氢氧化铝。
实施方式194.根据实施方式191的药物组合物，其中佐剂包含磷酸铝。
实施方式195.根据实施方式191的药物组合物，其中佐剂包含δ菊粉微粒。
实施方式196.根据实施方式173-195中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖与药学上可接受的载体缀合。
实施方式197.根据实施方式196的药物组合物，其中药学上可接受的载体是白喉毒素的突变体。
实施方式198.根据实施方式196的药物组合物，其中药学上可接受的载体是CRM197。
实施方式199.根据实施方式196-198中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖通过化学接头与药学上可接受的载体缀合。
实施方式200.根据实施方式199的药物组合物，其中化学接头包含硫代琥珀酰亚胺。
实施方式201.根据实施方式199的药物组合物，其中化学接头包含硫酯。
实施方式202.根据实施方式173-201中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约1000kDa。
实施方式203.根据实施方式173-201中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约350kDa。
实施方式204.根据实施方式173-203中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖是来自艰难梭菌的天然细胞表面多糖。
实施方式205.根据实施方式173-204中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖是非合成的。
实施方式206.根据实施方式173-205中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖是从一种或多种艰难梭菌菌株纯化的。
实施方式207.根据实施方式173-206中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖来自一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物(CSE)。
实施方式208.根据实施方式173-207中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含按重量计小于约20％的来自艰难梭菌的多肽。
实施方式209.根据实施方式173-208中任一项的药物组合物，其中艰难梭菌是核糖型001、003、012、014、027、036、106、MOH 900或MOH 718。
实施方式210.根据实施方式173-209中任一项的药物组合物，其中药物组合物是免疫原性药物组合物或疫苗。
实施方式211.根据实施方式210的药物组合物，其中药物组合物诱导针对PSII抗原的中和滴度。
实施方式212.根据实施方式210或211的药物组合物，其中药物组合物诱导针对艰难梭菌毒素A或艰难梭菌毒素B的中和滴度。
实施方式213.根据实施方式210或211的药物组合物，其中药物组合物诱导针对艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B的中和滴度。
实施方式214.根据实施方式173-213中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质。
实施方式215.根据实施方式214的药物组合物，其中杂质是肽聚糖、蛋白质、核酸、糖类或其组合。
实施方式216.根据实施方式214或215的药物组合物，其中杂质是艰难梭菌杂质。
实施方式217.根据实施方式214-216中任一项的药物组合物，其中杂质是核酸。
实施方式218.根据实施方式214-216中任一项的药物组合物，其中杂质是糖类。
实施方式219.根据实施方式214-216中任一项的药物组合物，其中杂质来源于艰难梭菌的细胞表面提取物。
实施方式220.根据实施方式173-219中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的肽聚糖杂质。
实施方式221.根据实施方式173-220中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的蛋白质杂质。
实施方式222.根据实施方式173-221中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的核酸杂质。
实施方式223.根据实施方式173-222中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的糖类杂质。
实施方式224.根据实施方式173-215中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质混合物，其中杂质混合物选自：
(a)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸和蛋白质杂质混合物；
(b)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸和肽聚糖杂质混合物；
(c)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的肽聚糖和蛋白质杂质混合物；
(d)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的糖类和蛋白质杂质混合物；
(e)肽聚糖和糖类杂质混合物；以及
(f)相对于PSII抗原的总重量的核酸和糖类杂质混合物。
实施方式225.根据实施方式173-215中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质混合物，其中杂质混合物选自：
(a)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸、蛋白质和肽聚糖杂质混合物；
(b)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的糖类、蛋白质和肽聚糖杂质混合物；
(c)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸、蛋白质和糖类杂质混合物；以及
(d)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸、肽聚糖和糖类杂质混合物。
实施方式226.根据实施方式173-225中任一项的药物组合物，包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的核酸、肽聚糖、糖类和蛋白质杂质混合物。
实施方式227.根据实施方式173-226中任一项的药物组合物，包含按重量计至少5％的从艰难梭菌富集的细胞表面多糖。
实施方式228.一种药物组合物，该药物组合物包含：
(a)从艰难梭菌富集的细胞表面多糖；
(b)包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段的第一多肽；
(c)包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段的第二多肽；以及
(d)药学上可接受的载体；
其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖不与第一多肽或第二多肽缀合。
实施方式229.根据实施方式228的药物组合物，其中第一多肽是艰难梭菌毒素A(TcdA)的类毒素或其片段。
实施方式230.根据实施方式228或229的药物组合物，其中第一多肽是艰难梭菌毒素A的全长类毒素。
实施方式231.根据实施方式228-230中任一项的药物组合物，其中第二多肽是艰难梭菌毒素B(TcdB)的类毒素或其片段。
实施方式232.根据实施方式228-231中任一项的药物组合物，其中第二多肽是毒素B的全长类毒素。
实施方式233.根据实施方式228-232中任一项的药物组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是阴离子细胞表面多糖。
实施方式234.根据实施方式228-233中任一项的药物组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是未取代或取代的。
实施方式235.根据实施方式228-234中任一项的药物组合物，其中第一多肽和第二多肽是融合的。
实施方式236.根据实施方式228-235中任一项的药物组合物，其中第一多肽与SEQID NO:4-6中的任一个具有至少80％序列同一性。
实施方式237.根据实施方式228-236中任一项的药物组合物，其中第二多肽与SEQID NO:1-3或7-40具有至少80％序列同一性。
实施方式238.根据实施方式228-237中任一项的药物组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖与第一多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
实施方式239.根据实施方式228-238中任一项的药物组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖与第二多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
实施方式240.根据实施方式228-239中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖是PSII、其药学上可接受的盐或免疫原性片段。
实施方式241.根据实施方式240的药物组合物，其中PSII、其药学上可接受的盐或免疫原性片段包含磷酸酯部分。
实施方式242.根据实施方式228-241中任一项的药物组合物，其中PSII是式(I)的多糖：
其中n是1至100的整数。
实施方式243.根据实施方式228-242中任一项的药物组合物，其中细胞表面多糖的分子量为约5kDa至约10kDa。
实施方式244.根据实施方式228-243中任一项的药物组合物，其中细胞表面多糖的分子量为约8.8kDa。
实施方式245.根据实施方式228-244中任一项的药物组合物，还包含佐剂。
实施方式246.根据实施方式245的药物组合物，其中佐剂包含铝基佐剂。
实施方式247.根据实施方式245的药物组合物，其中佐剂包含氢氧化铝。
实施方式248.根据实施方式245的药物组合物，其中佐剂包含磷酸铝。
实施方式249.根据实施方式245的药物组合物，其中佐剂包含δ菊粉微粒。
实施方式250.根据实施方式228-249中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖与药学上可接受的载体缀合。
实施方式251.根据实施方式250的药物组合物，其中药学上可接受的载体是白喉毒素的突变体。
实施方式252.根据实施方式250的药物组合物，其中药学上可接受的载体是CRM197。
实施方式253.根据实施方式250-252中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖通过化学接头与药学上可接受的载体缀合。
实施方式254.根据实施方式253的药物组合物，其中化学接头包含硫代琥珀酰亚胺。
实施方式255.根据实施方式253的药物组合物，其中化学接头包含硫酯。
实施方式256.根据实施方式228-255中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约1000kDa。
实施方式257.根据实施方式228-256中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约350kDa。
实施方式258.根据实施方式228-257中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖是来自艰难梭菌的天然细胞表面多糖。
实施方式259.根据实施方式228-258中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖是非合成的。
实施方式260.根据实施方式228-259中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖是从一种或多种艰难梭菌菌株纯化的。
实施方式261.根据实施方式228-260中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖来自一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物(CSE)。
实施方式262.根据实施方式228-261中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含按重量计小于约20％的来自艰难梭菌的多肽。
实施方式263.根据实施方式228-262中任一项的药物组合物，其中艰难梭菌是核糖型001、003、012、014、027、036、106、MOH 900或MOH 718。
实施方式264.根据实施方式228-263中任一项的药物组合物，其中药物组合物是免疫原性药物组合物或疫苗。
实施方式265.根据实施方式264的药物组合物，其中药物组合物诱导针对从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的中和滴度。
实施方式266.根据实施方式264或265的药物组合物，其中药物组合物诱导针对艰难梭菌毒素A或艰难梭菌毒素B的中和滴度。
实施方式267.根据实施方式264或265的药物组合物，其中药物组合物诱导针对艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B的中和滴度。
实施方式268.根据实施方式228-267中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质。
实施方式269.根据实施方式268的药物组合物，其中杂质是肽聚糖、蛋白质、核酸、糖类或其组合。
实施方式270.根据实施方式268或269的药物组合物，其中杂质是艰难梭菌杂质。
实施方式271.根据实施方式268-270中任一项的药物组合物，其中杂质是核酸。
实施方式272.根据实施方式268-270中任一项的药物组合物，其中杂质是糖类。
实施方式273.根据实施方式268-270中任一项的药物组合物，其中杂质来源于艰难梭菌的细胞表面提取物。
实施方式274.根据实施方式228-273中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的肽聚糖杂质。
实施方式275.根据实施方式228-274中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的蛋白质杂质。
实施方式276.根据实施方式228-275中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的核酸杂质。
实施方式277.根据实施方式228-276中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的糖类杂质。
实施方式278.根据实施方式228-268中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质混合物，其中杂质混合物选自：
(a)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸和蛋
白质杂质混合物；
(b)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸和肽
聚糖杂质混合物；
(c)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的肽聚糖和
蛋白质杂质混合物；
(d)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的糖类和蛋白质杂质混合物；
(e)肽聚糖和糖类杂质混合物；以及
(f)相对于PSII抗原的总重量的核酸和糖类杂质混合物。
实施方式279.根据实施方式228-268中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质混合物，其中杂质混合物选自：
(a)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸、蛋白质和肽聚糖杂质混合物；
(b)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的糖类、蛋白质和肽聚糖杂质混合物；
(c)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸、蛋白质和糖类杂质混合物；以及
(d)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸、肽聚糖和糖类杂质混合物。
实施方式280.根据实施方式228-279中任一项的药物组合物，包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的核酸、肽聚糖、糖类和蛋白质杂质混合物。
实施方式281.根据实施方式228-280中任一项的药物组合物，包含按重量计至少5％的从艰难梭菌富集的细胞表面多糖。
实施方式282.一种药物组合物，该药物组合物基本上由以下组成：
(a)与药学上可接受的载体缀合的来自艰难梭菌的细胞表面多糖，
(b)第一多肽或编码第一多肽的第一多核苷酸，其中第一多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段，
(c)第二多肽或编码第二多肽的第二多核苷酸，其中第二多肽包
含艰难梭菌的第二类毒素或其片段；以及
(d)佐剂。
实施方式283.根据实施方式282的药物组合物，其中第一多肽是艰难梭菌毒素A(TcdA)的类毒素或其片段。
实施方式284.根据实施方式282或283的药物组合物，其中第一多肽是艰难梭菌毒素A的全长类毒素。
实施方式285.根据实施方式282-284中任一项的药物组合物，其中第二多肽是艰难梭菌毒素B(TcdB)的类毒素或其片段。
实施方式286.根据实施方式282-285中任一项的药物组合物，其中第二多肽是毒素B的全长类毒素。
实施方式287.根据实施方式282-286中任一项的药物组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是阴离子细胞表面多糖。
实施方式288.根据实施方式282-287中任一项的药物组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖是未取代或取代的。
实施方式289.根据实施方式282-288中任一项的药物组合物，其中第一多肽和第二多肽是融合的。
实施方式290.根据实施方式282-289中任一项的药物组合物，其中第一多肽与SEQID NO:4-6中的任一个具有至少80％序列同一性。
实施方式291.根据实施方式282-290中任一项的药物组合物，其中第二多肽与SEQID NO:1-3或7-40具有至少80％序列同一性。
实施方式292.根据实施方式282-291中任一项的药物组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖与第一多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
实施方式293.根据实施方式282-292中任一项的药物组合物，其中来自艰难梭菌的细胞表面多糖与第二多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
实施方式294.根据实施方式282-293中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖是PSII、其药学上可接受的盐或免疫原性片段。
实施方式295.根据实施方式294的药物组合物，其中PSII、其药学上可接受的盐或免疫原性片段包含磷酸酯部分。
实施方式296.根据实施方式295的药物组合物，其中PSII是式(I)的多糖：
其中n是1至100的整数。
实施方式297.根据实施方式282-296中任一项的药物组合物，其中细胞表面多糖的分子量为约5kDa至约10kDa。
实施方式298.根据实施方式282-297中任一项的药物组合物，其中细胞表面多糖的分子量为约8.8kDa。
实施方式299.根据实施方式282-298中任一项的药物组合物，其中佐剂包含铝基佐剂。
实施方式300.根据实施方式282-298中任一项的药物组合物，其中佐剂包含氢氧化铝。
实施方式301.根据实施方式282-298中任一项的药物组合物，其中佐剂包含磷酸铝。
实施方式302.根据实施方式282-298中任一项的药物组合物，其中佐剂包含δ菊粉微粒。
实施方式303.根据实施方式282-302中任一项的药物组合物，其中药学上可接受的载体是白喉毒素的突变体。
实施方式304.根据实施方式282-302中任一项的药物组合物，其中药学上可接受的载体是CRM197。
实施方式305.根据实施方式282-304中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖通过化学接头与药学上可接受的载体缀合。
实施方式306.根据实施方式305的药物组合物，其中化学接头包含硫代琥珀酰亚胺。
实施方式307.根据实施方式305的药物组合物，其中化学接头包含硫酯。
实施方式308.根据实施方式282-307中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约1000kDa。
实施方式309.根据实施方式282-308中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约350kDa。
实施方式310.根据实施方式282-309中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖是来自艰难梭菌的天然细胞表面多糖。
实施方式311.根据实施方式282-310中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖是非合成的。
实施方式312.根据实施方式282-311中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖是从一种或多种艰难梭菌菌株纯化的。
实施方式313.根据实施方式282-312中任一项的药物组合物，其中从艰难梭菌富集的细胞表面多糖来自一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物(CSE)。
实施方式314.根据实施方式282-313中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含按重量计小于约20％的来自艰难梭菌的多肽。
实施方式315.根据实施方式282-314中任一项的药物组合物，其中艰难梭菌是核糖型001、003、012、014、027、036、106、MOH 900或MOH 718。
实施方式316.根据实施方式282-315中任一项的药物组合物，其中药物组合物是免疫原性药物组合物或疫苗。
实施方式317.根据实施方式316的药物组合物，其中药物组合物诱导针对从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的中和滴度。
实施方式318.根据实施方式316或317的药物组合物，其中药物组合物诱导针对艰难梭菌毒素A或艰难梭菌毒素B的中和滴度。
实施方式319.根据实施方式316或317的药物组合物，其中药物组合物诱导针对艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B的中和滴度。
实施方式320.根据实施方式228-319中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质。
实施方式321.根据实施方式320的药物组合物，其中杂质是肽聚糖、蛋白质、核酸、糖类或其组合。
实施方式322.根据实施方式320或321的药物组合物，其中杂质是艰难梭菌杂质。
实施方式323.根据实施方式320-322中任一项的药物组合物，其中杂质是核酸。
实施方式324.根据实施方式320-322中任一项的药物组合物，其中杂质是糖类。
实施方式325.根据实施方式320-322中任一项的药物组合物，其中杂质来源于艰难梭菌的细胞表面提取物。
实施方式326.根据实施方式282-325中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的肽聚糖杂质。
实施方式327.根据实施方式282-326中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的蛋白质杂质。
实施方式328.根据实施方式282-327中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的核酸杂质。
实施方式329.根据实施方式282-328中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的糖类杂质。
实施方式330.根据实施方式282-320中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质混合物，其中杂质混合物选自：
(a)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸和蛋白质杂质混合物；
(b)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸和肽
聚糖杂质混合物；
(c)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的肽聚糖和
蛋白质杂质混合物；
(d)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的糖类和蛋白质杂质混合物；
(e)肽聚糖和糖类杂质混合物；以及
(f)相对于PSII抗原的总重量的核酸和糖类杂质混合物。
实施方式331.根据实施方式282-320中任一项的药物组合物，其中药物组合物包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质混合物，其中杂质混合物选自：
(a)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸、蛋白质和肽聚糖杂质混合物；
(b)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的糖类、蛋白质和肽聚糖杂质混合物；
(c)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸、蛋白质和糖类杂质混合物；以及
(d)相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量的核酸、肽聚糖和糖类杂质混合物。
实施方式332.根据实施方式282-331中任一项的药物组合物，包含相对于从艰难梭菌富集的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的核酸、肽聚糖、糖类和蛋白质杂质混合物。
实施方式333.根据实施方式282-332中任一项的药物组合物，包含按重量计至少5％的从艰难梭菌富集的细胞表面多糖。
实施方式334.一种治疗感染的方法，该方法包括：
(a)向有需要的对象施用治疗有效量的实施方式1-171中任一项的组合物或实施方式172-333中任一项的药物组合物；其中感染是艰难梭菌感染；
(b)在施用所述药物组合物之后，收集对象的粪便样品；以及
(c)分析粪便样品并确定粪便中艰难梭菌菌落形成单位(CFU)/mg的变化，其是感染的标志。
实施方式335.根据实施方式334的方法，其中对象未表现出艰难梭菌感染的症状。。
实施方式336.根据实施方式334或335的方法，其中施用是胃肠外施用。
实施方式337.根据实施方式334或335的方法，其中施用是静脉内施用。
实施方式338.根据实施方式334或335的方法，其中施用是肌内施用。
实施方式339.根据实施方式334-338中任一项的方法，其中粪便样品的收集在施用组合物或药物组合物之后至少1天进行。
实施方式340.根据实施方式339的方法，其中粪便样品的收集在施用组合物或药物组合物之后至少6天进行。
实施方式341.根据实施方式339的方法，其中粪便样品的收集在施用组合物或药物组合物之后至少9天进行。
实施方式342.根据实施方式339的方法，其中粪便样品的收集在施用组合物或药物组合物之后至少14天进行。
实施方式343.根据实施方式334-342中任一项的方法，其中分析包括铺板和qPCR分析。
实施方式344.根据实施方式334-343中任一项的方法，其中方法包括测量粪便中艰难梭菌的CFU/mg粪便的减少百分比，并调节剂量/治疗。
实施方式345.根据实施方式344的方法，其中减少百分比是与不存在治疗有效量的药物组合物相比，艰难梭菌的CFU/mg减少至少60％。
实施方式346.根据实施方式334-345中任一项的方法，其中如果与不施用药物组合物的粪便样品相比，粪便样品的CFU/mg增加，则施用第二治疗有效量的药物组合物，其中第二治疗有效量大于药物组合物的治疗有效量。
实施方式347.根据实施方式334的方法，其中如果与不施用药物组合物的粪便样品相比，粪便样品的CFU/mg减少，则施用第三治疗有效量的药物组合物，其中第三治疗有效量小于药物组合物的治疗有效量。
实施方式348.根据实施方式334-347中任一项的方法，其中施用是每周一次。
实施方式349.根据实施方式334-347中任一项的方法，其中施用是每周一次，持续两周。
实施方式350.根据实施方式334-347中任一项的方法，其中施用是每两周一次。
实施方式351.根据实施方式334-347中任一项的方法，其中施用是每两周一次，持续一个月。
实施方式352.根据实施方式334-351中任一项的方法，其中对象住在疗养院。
实施方式353.根据实施方式334-352中任一项的方法，其中对象具有艰难梭菌感染的病史。
实施方式354.根据实施方式334-353中任一项的方法，其中对象具有阳性艰难梭菌CFU/mg计数。
实施方式355.根据实施方式334-354中任一项的方法，还包括治疗剂。
实施方式356.根据实施方式355的方法，其中治疗剂是抗生素。
实施方式357.根据实施方式356的方法，其中抗生素是万古霉素。
实施方式358.根据实施方式356的方法，其中抗生素是非达霉素。
实施方式359.一种治疗感染的方法，该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含
(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及
(b)多肽或编码多肽的多核苷酸，其中多肽包含艰难梭菌的类毒素或其片段；
其中施用是每周一次或每两周一次，并且
其中感染由艰难梭菌引起。
实施方式360.根据实施方式359的方法，其中药物组合物是实施方案172-333中任一项的药物组合物。
实施方式361.根据实施方式359或360的方法，其中对象未表现出艰难梭菌感染的症状。
实施方式362.根据实施方式359-361中任一项的方法，其中施用是胃肠外施用。
实施方式363.根据实施方式359-361中任一项的方法，其中施用是静脉内施用。
实施方式364.根据实施方式359-361中任一项的方法，其中施用是肌内施用。
实施方式365.根据实施方式359-364中任一项的方法，其中方法包括测量粪便中艰难梭菌的CFU/mg粪便的减少百分比，并调节剂量/治疗。
实施方式366.根据实施方式365的方法，其中减少百分比是与不存在治疗有效量的药物组合物相比，艰难梭菌的CFU/mg减少至少60％。
实施方式367.根据实施方式359-366中任一项的方法，其中如果与不施用药物组合物的粪便样品相比，获自对象的粪便样品的CFU/mg增加，则施用第二治疗有效量的药物组合物，其中第二治疗有效量大于药物组合物的治疗有效量。
实施方式368.根据实施方式367的方法，其中如果与不施用药物组合物的粪便样品相比，粪便样品的CFU/mg减少，则施用第三治疗有效量的药物组合物，其中第三治疗有效量小于药物组合物的治疗有效量。
实施方式369.根据实施方式359-368中任一项的方法，其中施用是每周一次，持续两周。
实施方式370.根据实施方式359-368中任一项的方法，其中施用是每两周一次。
实施方式371.根据实施方式359-368中任一项的方法，其中施用是每两周一次，持续一个月。
实施方式372.根据实施方式359-371中任一项的方法，其中对象住在疗养院。
实施方式373.根据实施方式359-372中任一项的方法，其中对象具有艰难梭菌感染的病史。
实施方式374.根据实施方式359-373中任一项的方法，其中对象具有阳性艰难梭菌CFU/mg计数。
实施方式375.根据实施方式359-374中任一项的方法，还包括治疗剂。
实施方式376.根据实施方式375的方法，其中治疗剂是抗生素。
实施方式377.根据实施方式375的方法，其中抗生素是万古霉素。
实施方式378.根据实施方式375的方法，其中抗生素是非达霉素。
实施方式379.一种方法，其包括：
(a)从以下组中选择对象：
(i)第一对象，其中第一对象大于55岁；
(ii)第二对象，其中第二对象在6个月内具有艰难梭菌感染的病史；以及
(iii)第三对象，其中第三对象具有阳性艰难梭菌菌落形成单位(CFU)/mg计数；以及
(b)施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含艰难梭菌的细胞表面多糖和多肽或编码多肽的多核苷酸，其中多肽包含艰难梭菌的类毒素或其片段。
实施方式380.根据实施方式379的方法，其中药物组合物是实施方案172-333中任一项的药物组合物。
实施方式381.根据实施方式379的方法，其中第一对象住在疗养院。
实施方式382.根据实施方式379的方法，其中第一对象具有艰难梭菌感染的病史。
实施方式383.根据实施方式379的方法，其中第一对象具有广谱抗生素治疗病史。
实施方式384.根据实施方式379的方法，其中第二对象具有阳性艰难梭菌CFU/mg计数。
实施方式385.一种治疗感染的方法，该方法包括：
(a)鉴定获自对象的生物样品的遗传序列信息，以确定感染的存在，其中感染是艰难梭菌感染；以及
(b)向对象施用治疗有效量的包含艰难梭菌的细胞表面多糖的药物组合物。
实施方式386.根据实施方式385的方法，其中药物组合物是实施方案172-333中任一项的药物组合物。
实施方式387.根据实施方式385的方法，其中方法包括进行测定，其中测定是实时聚合酶链反应(RT-PCR)或核酸扩增测试(NAAT)。
实施方式388.根据实施方式385的方法，其中对来自对象的粪便样品进行测定。
实施方式389.根据实施方式388的方法，其中测定确定粪便样品中艰难梭菌的CFU/mg。
实施方式390.一种富集艰难梭菌的细胞表面多糖的方法，该方法包括：
(a)获得一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物(CSE)，和
(b)富集来自CSE的艰难梭菌的细胞表面多糖，从而获得富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖；
其中富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含按重量计小于约5％的艰难梭菌杂质。
实施方式391.根据实施方式390的方法，其中方法包括：从CSE富集PSII，从而获得富集的PSII样品；
(a)其中富集的PSII样品包含PSII和(a)相对于PSII的总重量
按重量计小于5％肽聚糖的肽聚糖污染水平；
(b)相对于PSII的总重量按重量计小于5％蛋白质的蛋白质污染水平；或
(c)相对于PSII的总重量按重量计小于5％核酸的核酸污染水平。
实施方式392.根据实施方式390的方法，其中获得包括剥离一种或多种艰难梭菌菌株。
实施方式393.根据实施方式392的方法，其中一种或多种艰难梭菌菌株是核糖型001、003、012、014、027、036、106、MOH 900或MOH 718。
实施方式394.根据实施方式390-393中任一项的方法，其中富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含按重量计小于约5％的艰难梭菌蛋白。
实施方式395.根据实施方式390-394中任一项的方法，其中艰难梭菌的细胞表面多糖选自PSI、PSII、PSIII、其药学上可接受的盐及其免疫原性片段。
实施方式396.根据实施方式390-395中任一项的方法，其中艰难梭菌的细胞表面多糖包含磷酸酯部分。
实施方式397.根据实施方式390-396中任一项的方法，其中艰难梭菌的细胞表面多糖是PSII。
实施方式398.根据实施方式390-397中任一项的方法，其中富集包括乙醇沉淀步骤。
实施方式399.根据实施方式390-398中任一项的方法，其中富集包括一个或多个TCA沉淀步骤。
实施方式400.根据实施方式390-399中任一项的方法，其中富集包括超滤/渗滤(UFDF)步骤。
实施方式401.根据实施方式390-400中任一项的方法，其中富集包括离子交换色谱步骤。
实施方式402.根据实施方式401的方法，其中富集包括在离子交换色谱步骤之后的一个或多个TCA沉淀步骤。
实施方式403.根据实施方式401或402的方法，其中富集包括在TCA沉淀步骤之后和/或在离子交换色谱步骤之后的一个或多个超滤/渗滤(UFDF)步骤。
实施方式404.根据实施方式401-403中任一项的方法，其中富集包括过滤步骤。
实施方式405.根据实施方式404的方法，其中过滤步骤包括切向流过滤或通过具有截留分子量的过滤器离心。
实施方式406.根据实施方式405的方法，其中过滤器的截留分子量为3kDa或更小。
实施方式407.根据实施方式405的方法，其中过滤器的截留分子量为10kDa或更大。
实施方式408.根据实施方式390-407中任一项的方法，其中方法还包括冻干。
实施方式409.根据实施方式391-407中任一项的方法，其中富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含PSII和根据NMR相对于PSII的总重量按重量计小于5％肽聚糖的肽聚糖污染水平。
实施方式410.根据实施方式391-409中任一项的方法，其中富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含PSII和根据NMR相对于PSII的总重量按重量计小于5％蛋白质的蛋白质污染水平。
实施方式411.根据实施方式391-410中任一项的方法，其中富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含PSII和根据NMR相对于PSII的总重量按重量计小于5％核酸的核酸污染水平。
序列表
<110> 马特里瓦克斯公司
<120> 用于治疗艰难梭菌感染的方法和组合物
<130> 51744-701601
<140>
<141>
<150> 63/170,250
<151> 2021-04-02
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2366
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 1
Met Ser Leu Val Asn Arg Lys Gln Leu Glu Lys Met Ala Asn Val Arg
1 5 10 15
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Val Val Glu Ser Ala Ile Asn Asp Thr Leu Glu Ser Phe Arg Glu Asn
145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Arg Phe Asp Tyr Asn Lys Phe Phe Arg Lys Arg Met
165 170 175
Glu Ile Ile Tyr Asp Lys Gln Lys Asn Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ala
180 185 190
Gln Arg Glu Glu Asn Pro Glu Leu Ile Ile Asp Asp Ile Val Lys Thr
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210 215 220
Ile Glu Glu Ser Leu Asn Lys Ile Thr Gln Asn Ser Gly Asn Asp Val
225 230 235 240
Arg Asn Phe Glu Glu Phe Lys Asn Gly Glu Ser Phe Asn Leu Tyr Glu
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Gln Glu Leu Val Glu Arg Trp Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Leu
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Arg Ile Ser Ala Leu Lys Glu Ile Gly Gly Met Tyr Leu Asp Val Asp
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305 310 315 320
Met Lys Tyr Lys Glu Tyr Ile Pro Glu Tyr Thr Ser Glu His Phe Asp
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Met Leu Asp Glu Glu Val Gln Ser Ser Phe Glu Ser Val Leu Ala Ser
340 345 350
Lys Ser Asp Lys Ser Glu Ile Phe Ser Ser Leu Gly Asp Met Glu Ala
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Ser Pro Leu Glu Val Lys Ile Ala Phe Asn Ser Lys Gly Ile Ile Asn
370 375 380
Gln Gly Leu Ile Ser Val Lys Asp Ser Tyr Cys Ser Asn Leu Ile Val
385 390 395 400
Lys Gln Ile Glu Asn Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Asn Ser Leu Asn Pro
405 410 415
Ala Ile Ser Glu Asp Asn Asp Phe Asn Thr Thr Thr Asn Thr Phe Ile
420 425 430
Asp Ser Ile Met Ala Glu Ala Asn Ala Asp Asn Gly Arg Phe Met Met
435 440 445
Glu Leu Gly Lys Tyr Leu Arg Val Gly Phe Phe Pro Asp Val Lys Thr
450 455 460
Thr Ile Asn Leu Ser Gly Pro Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Tyr Gln Asp
465 470 475 480
Leu Leu Met Phe Lys Glu Gly Ser Met Asn Ile His Leu Ile Glu Ala
485 490 495
Asp Leu Arg Asn Phe Glu Ile Ser Lys Thr Asn Ile Ser Gln Ser Thr
500 505 510
Glu Gln Glu Met Ala Ser Leu Trp Ser Phe Asp Asp Ala Arg Ala Lys
515 520 525
Ala Gln Phe Glu Glu Tyr Lys Arg Asn Tyr Phe Glu Gly Ser Leu Gly
530 535 540
Glu Asp Asp Asn Leu Asp Phe Ser Gln Asn Ile Val Val Asp Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Leu Leu Glu Lys Ile Ser Ser Leu Ala Arg Ser Ser Glu Arg Gly
565 570 575
Tyr Ile His Tyr Ile Val Gln Leu Gln Gly Asp Lys Ile Ser Tyr Glu
580 585 590
Ala Ala Cys Asn Leu Phe Ala Lys Thr Pro Tyr Asp Ser Val Leu Phe
595 600 605
Gln Lys Asn Ile Glu Asp Ser Glu Ile Ala Tyr Tyr Tyr Asn Pro Gly
610 615 620
Asp Gly Glu Ile Gln Glu Ile Asp Lys Tyr Lys Ile Pro Ser Ile Ile
625 630 635 640
Ser Asp Arg Pro Lys Ile Lys Leu Thr Phe Ile Gly His Gly Lys Asp
645 650 655
Glu Phe Asn Thr Asp Ile Phe Ala Gly Phe Asp Val Asp Ser Leu Ser
660 665 670
Thr Glu Ile Glu Ala Ala Ile Asp Leu Ala Lys Glu Asp Ile Ser Pro
675 680 685
Lys Ser Ile Glu Ile Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser Tyr Ser
690 695 700
Ile Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Lys Val Lys
705 710 715 720
Asp Lys Ile Ser Glu Leu Met Pro Ser Ile Ser Gln Asp Ser Ile Ile
725 730 735
Val Ser Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly Arg Arg
740 745 750
Glu Leu Leu Asp His Ser Gly Glu Trp Ile Asn Lys Glu Glu Ser Ile
755 760 765
Ile Lys Asp Ile Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Ser Phe Asn Pro Lys Glu
770 775 780
Asn Lys Ile Thr Val Lys Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu Ser Thr Leu
785 790 795 800
Leu Gln Glu Ile Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asp Ile Glu Leu Glu
805 810 815
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820 825 830
Asp Thr Gln Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Glu Ala Lys Asn Leu Thr
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Ser Asp Ser Ile Asn Tyr Ile Lys Asp Glu Phe Lys Leu Ile Glu Ser
850 855 860
Ile Ser Asp Ala Leu Cys Asp Leu Lys Gln Gln Asn Glu Leu Glu Asp
865 870 875 880
Ser His Phe Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Glu Thr Asp Glu Gly Phe
885 890 895
Ser Ile Arg Phe Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu Ser Ile Phe Val Glu
900 905 910
Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ser Glu Tyr Ala Asn His Ile Thr Glu Glu
915 920 925
Ile Ser Lys Ile Lys Gly Thr Ile Phe Asp Thr Val Asn Gly Lys Leu
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Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Thr Thr His Glu Val Asn Thr Leu Asn
945 950 955 960
Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Glu Tyr Asn Ser Ser Lys Glu
965 970 975
Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys Val Gln Val Tyr Ala Gln
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Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Thr Asp Ala Ala Lys Val Val
995 1000 1005
Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp Glu Thr Ile Asp Leu Leu Pro
1010 1015 1020
Thr Leu Ser Glu Gly Leu Pro Ile Ile Ala Thr Ile Ile Asp Gly
1025 1030 1035
Val Ser Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp
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Pro Leu Leu Arg Gln Glu Ile Glu Ala Lys Ile Gly Ile Met Ala
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Gly Ile Ala Ser Gly Phe Ser Ile Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly
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Lys Leu Leu Asp Arg Ile Arg Asp Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr
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Trp Arg Tyr Phe Ala Phe Ile Ala Asp Ala Leu Ile Thr Thr Leu
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Ala Leu Ser Leu Ser Gln Tyr Asn Met Gly Ile Asn Ile Glu Leu
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Pro Ser Phe Gly Tyr Tyr Ser Asn Asn Leu Lys Asp Val Lys Val
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Thr Ile Lys Leu Asn Ser Val His Leu Asp Glu Ser Gly Val Ala
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Asn Phe Ile Ile Ser Gly Thr Thr Ser Ile Gly Gln Phe Glu Phe
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Asn Thr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Val Gly Asn Arg Gln
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Ile Asp Ser Cys Val Asn Lys Val Val Ile Ser Pro Asn Ile Tyr
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Asn Asp Gly Asn Asp Phe Ile Leu Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn
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Lys Val Ser Gln Val Lys Ile Arg Phe Val Asn Val Phe Lys Asp
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Tyr Glu Asp Gly Leu Ile Gly Tyr Asp Leu Gly Leu Val Ser Leu
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Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro
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Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly
1955 1960 1965
Leu Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly
1970 1975 1980
Val Met Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr
1985 1990 1995
Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp
2000 2005 2010
Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly
2015 2020 2025
Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn
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Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly
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Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe
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Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr
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Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu
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Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp
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Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr
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Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn
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Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe
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Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu
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<210> 2
<211> 2366
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 2
Met Ser Leu Val Asn Arg Lys Gln Leu Glu Lys Met Ala Asn Val Arg
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Phe Arg Val Gln Glu Asp Glu Tyr Val Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu
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Glu Tyr His Asn Met Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Lys Tyr Leu Lys
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Asn Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Gln Ile Asn Asp Thr Ala Ile
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Asn Tyr Ile Asn Gln Trp Lys Asp Val Asn Ser Asp Tyr Asn Val Asn
115 120 125
Val Phe Tyr Asp Ser Asn Ala Phe Leu Ile Asn Thr Leu Lys Lys Thr
130 135 140
Ile Val Glu Ser Ala Thr Asn Asp Thr Leu Glu Ser Phe Arg Glu Asn
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Leu Asn Asp Pro Arg Phe Asp Tyr Asn Lys Phe Tyr Arg Lys Arg Met
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Glu Ile Ile Tyr Asp Lys Gln Lys Asn Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Thr
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Tyr Ile His Tyr Ile Val Gln Leu Gln Gly Asp Lys Ile Ser Tyr Glu
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Ala Ala Cys Asn Leu Phe Ala Lys Thr Pro Tyr Asp Ser Val Leu Phe
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Ser Asp Arg Pro Lys Ile Lys Leu Thr Phe Ile Gly His Gly Lys Asp
645 650 655
Glu Phe Asn Thr Asp Ile Phe Ala Gly Leu Asp Val Asp Ser Leu Ser
660 665 670
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675 680 685
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Val Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Arg Val Lys
705 710 715 720
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725 730 735
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Leu Ala Glu Ser Glu Gly Ala Phe Thr Ser Leu Asp Asp Lys Ile
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Asn Asn Ser Ile Thr Leu Gly Lys Cys Glu Ile Trp Arg Met Glu
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Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Asp Asp Ile Asp His Phe Phe
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Ser Ala Pro Ser Ile Thr Tyr Arg Glu Pro His Leu Ser Ile Tyr
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Ser Phe Asn Lys Met Ser Ile Asp Phe Lys Asp Ile Lys Lys Leu
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Asn Glu Leu Asp Arg Asp His Leu Gly Phe Lys Ile Ile Asp Asn
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Lys Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Asp Ser Lys Leu Val Lys Gly Leu
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Ile Asn Ile Asn Asn Ser Leu Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu Phe
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Asn Leu Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr
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Phe Asp Ile Asn Thr Gly Ala Ala Leu Thr Ser Tyr Lys Ile Ile
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Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Asn Asp Gly Val Met Gln Leu
1880 1885 1890
Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala
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2465 2470 2475
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<211> 2710
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<210> 6
<211> 879
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 6
Gly Leu Ile Asn Ile Asn Asn Ser Leu Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr
20 25 30
Phe Asp Ile Asn Thr Gly Ala Ala Ser Thr Ser Tyr Lys Ile Ile Asn
35 40 45
Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Asn Asn Gly Val Met Gln Leu Gly Val
50 55 60
Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Gln
65 70 75 80
Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Ser Lys Phe Leu
85 90 95
Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val
100 105 110
Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Glu Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn
115 120 125
Asn Ala Ile Ala Ala Val Gly Leu Gln Val Ile Asp Asn Asn Lys Tyr
130 135 140
Tyr Phe Asn Pro Asp Thr Ala Ile Ile Ser Lys Gly Trp Gln Thr Val
145 150 155 160
Asn Gly Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Thr Asp Thr Ala Ile Ala Phe Asn
165 170 175
Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Gly Lys His Phe Tyr Phe Asp Ser Asp Cys
180 185 190
Val Val Lys Ile Gly Val Phe Ser Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe
195 200 205
Ala Pro Ala Asn Thr Tyr Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val
210 215 220
Tyr Gln Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp
225 230 235 240
Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Ser Lys Lys
245 250 255
Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr
260 265 270
Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala Ala
275 280 285
Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn
290 295 300
Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Asn Gly Lys Tyr Phe
305 310 315 320
Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Val Pro
325 330 335
Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile
340 345 350
Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly
355 360 365
Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Ile Thr Gly Trp Gln
370 375 380
Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala
385 390 395 400
Ala Thr His Leu Cys Thr Ile Asn Asn Asp Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr
405 410 415
Asp Gly Ile Leu Gln Asn Gly Tyr Ile Thr Ile Glu Arg Asn Asn Phe
420 425 430
Tyr Phe Asp Ala Asn Asn Glu Ser Lys Met Val Thr Gly Val Phe Lys
435 440 445
Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn
450 455 460
Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu
465 470 475 480
Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly
485 490 495
Trp Gln Thr Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala
500 505 510
Val Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Glu Lys Tyr Tyr Phe
515 520 525
Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly
530 535 540
Lys Arg Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Tyr Ile Ala Ser Thr Gly Tyr
545 550 555 560
Thr Ile Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met
565 570 575
Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro
580 585 590
Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln
595 600 605
Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp
610 615 620
Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr
625 630 635 640
Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn
645 650 655
Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Tyr Ile Ala Ser Thr Gly
660 665 670
Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile
675 680 685
Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala
690 695 700
Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr
705 710 715 720
Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn
725 730 735
Asp Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Ala Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr
740 745 750
Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile
755 760 765
Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val
770 775 780
Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp
785 790 795 800
Ala Asn Asn Ile Asp Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu
805 810 815
His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val
820 825 830
Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Ser Lys Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp
835 840 845
Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile
850 855 860
Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly
865 870 875
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 7
Ser Pro Asn Ile Tyr Thr Asp Glu Ile Asn Ile Thr Pro Val Tyr Glu
1 5 10 15
Thr Asn
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 8
Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu Asp Ala Asn Tyr Ile Asn Glu Lys Ile
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 9
Thr Val Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly
1 5 10 15
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 10
Ala Ser Ile Gly Glu Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Gln Ser
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 11
Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn
1 5 10 15
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 12
Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 13
Ala Ile Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu
1 5 10
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 14
Asn Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 15
His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 16
Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met
1 5 10
<210> 17
<211> 22
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 17
His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn
1 5 10 15
Thr Glu Asp Gly Phe Lys
20
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 18
Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln Val
1 5 10 15
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 19
Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr Gly
1 5 10 15
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 20
Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 21
Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr
1 5 10 15
Ile Asn Ile
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 22
Gln Asn Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr
1 5 10 15
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 23
Ser Pro Asn Ile Tyr Thr Asp Glu Ile Asn Ile Thr Pro Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Ala Asn
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 24
Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu Asp Thr Asn Tyr Ile Ser Glu Lys Ile
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 25
Thr Ile Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Asn Gly Gly
1 5 10 15
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 26
Ala Ser Val Gly Glu Thr Ile Ile Asp Gly Lys Asn Tyr Tyr Phe Ser
1 5 10 15
Gln Asn
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 27
Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asp Thr Leu Asp Glu Asn
1 5 10 15
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 28
Pro Ala Asp Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu
1 5 10
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 29
Ala Ile Asp Phe Thr Gly Lys Leu Thr Ile Asp Glu
1 5 10
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 30
Asn Val Tyr Tyr Phe Gly Asp Asn Tyr Arg Ala Ala Ile Glu
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 31
Tyr Tyr Phe Ser Thr Asp Thr Gly Arg Ala Phe Lys
1 5 10
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 32
Ile Gly Asp Asp Lys Phe Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Ile Met
1 5 10
<210> 33
<211> 22
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 33
Tyr Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn
1 5 10 15
Thr Ala Asp Gly Phe Lys
20
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 34
Ile Asn Asp Gly Lys Tyr Tyr Phe Asn Asp Ser Gly Ile Met Gln Ile
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 35
Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 36
Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asp Pro Glu Thr Lys Lys Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 19
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 37
Asp Asn His Tyr Tyr Phe Asn Glu Asp Gly Ile Met Gln Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Leu Asn Ile
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 38
Gln Asn Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr
1 5 10 15
<210> 39
<211> 190
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 39
Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr Gly
20 25 30
Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val Tyr
35 40 45
Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met
50 55 60
Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala
65 70 75 80
Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu
85 90 95
Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr
100 105 110
Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu
115 120 125
Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val
130 135 140
Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu
145 150 155 160
Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp
165 170 175
Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala
180 185 190
<210> 40
<211> 190
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 40
Asp Glu Asn Gly Leu Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr Gly
20 25 30
Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val Tyr
35 40 45
Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met
50 55 60
Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asp Pro Glu Thr Lys Lys Ala
65 70 75 80
Tyr Lys Gly Ile Asn Val Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu
85 90 95
Asn Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Thr Phe Glu Asp Asn His Tyr
100 105 110
Tyr Phe Asn Glu Asp Gly Ile Met Gln Tyr Gly Tyr Leu Asn Ile Glu
115 120 125
Asp Lys Thr Phe Tyr Phe Ser Glu Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val
130 135 140
Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu
145 150 155 160
Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp
165 170 175
Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala
180 185 190

Claims (95)

1.一种组合物，所述组合物包含：
(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及
(b)包含来源于除艰难梭菌之外的生物体的载体蛋白的第一多肽；
其中所述载体蛋白和所述细胞表面多糖以约10∶1至约1∶10的比率存在于所述组合物中。
2.根据权利要求1所述的组合物，还包含第二多肽或编码所述第二多肽的第一多核苷酸，其中所述第二多肽包含艰难梭菌的第一类毒素或其片段。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述第二多肽是艰难梭菌毒素A(TcdA)的类毒素或其片段。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述第二多肽是毒素A的全长类毒素。
5.根据权利要求2所述的组合物，还包含第三多肽或编码所述第三多肽的第二多核苷酸，其中所述第三多肽包含艰难梭菌的第二类毒素或其片段。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述第三多肽是艰难梭菌毒素B(TcdB)的类毒素或其片段。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述第三多肽是毒素B的全长类毒素。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述来自艰难梭菌的细胞表面多糖是阴离子细胞表面多糖。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述来自艰难梭菌的细胞表面多糖是未取代或取代的。
10.根据权利要求5所述的组合物，其中所述第二多肽和所述第三多肽是融合的。
11.根据权利要求2所述的组合物，其中所述第二多肽与SEQ IDNO:4-6中的任一个具有至少80％序列同一性。
12.根据权利要求5所述的组合物，其中所述第三多肽与SEQ ID NO:1-3或7-40具有至少80％序列同一性。
13.根据权利要求2所述的组合物，其中所述来自艰难梭菌的细胞表面多糖与所述第二多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
14.根据权利要求5所述的组合物，其中所述来自艰难梭菌的细胞表面多糖与所述第三多肽的比率为约10∶1至约1∶10。
15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述来自艰难梭菌的细胞表面多糖是PSII、其药学上可接受的盐或免疫原性片段。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述PSII或其药学上可接受的盐或免疫原性片段包含磷酸酯部分。
17.根据权利要求5所述的组合物，其中所述细胞表面多糖是从艰难梭菌富集的，并且不与所述第二多肽或所述第三多肽缀合。
18.根据权利要求1所述的组合物，其中所述来自艰难梭菌的细胞表面多糖是富集的来自艰难梭菌的细胞表面多糖。
19.根据权利要求15所述的组合物，其中所述PSII是式(I)的多糖：
其中n是1至100的整数。
20.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞表面多糖的分子量为约5kDa至约10kDa。
21.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞表面多糖的分子量为约8.8kDa。
22.根据权利要求1所述的组合物，还包含佐剂。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述佐剂包含铝基佐剂。
24.根据权利要求22所述的组合物，其中所述佐剂包含氢氧化铝。
25.根据权利要求22所述的组合物，其中所述佐剂包含磷酸铝。
26.根据权利要求22所述的组合物，其中所述佐剂包含δ菊粉微粒。
27.根据权利要求1所述的组合物，其中所述艰难梭菌的细胞表面多糖与所述载体蛋白缀合。
28.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体蛋白是白喉毒素的突变体。
29.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体蛋白是CRM197。
30.根据权利要求1所述的组合物，其中所述艰难梭菌的细胞表面多糖通过化学接头与所述载体蛋白缀合。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述化学接头包含硫代琥珀酰亚胺。
32.根据权利要求30所述的组合物，其中所述化学接头包含硫酯。
33.根据权利要求1所述的组合物，其中所述艰难梭菌的细胞表面多糖与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约1000kDa。
34.根据权利要求1所述的组合物，其中所述艰难梭菌的细胞表面多糖与CRM197缀合，并且分子量为约100kDa至约350kDa。
35.根据权利要求1所述的组合物，其中所述来自艰难梭菌的细胞表面多糖是来自艰难梭菌的天然细胞表面多糖。
36.根据权利要求1所述的组合物，其中所述来自艰难梭菌的细胞表面多糖是从一种或多种艰难梭菌菌株纯化的。
37.根据权利要求1所述的组合物，其中所述来自艰难梭菌的细胞表面多糖来自一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物(CSE)。
38.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物或药物组合物包含按重量计小于20％的来自艰难梭菌的多肽。
39.根据权利要求1所述的组合物，其中所述艰难梭菌是核糖型001、003、012、014、027、036、106、MOH 900或MOH 718。
40.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是免疫原性组合物或疫苗。
41.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物诱导针对PSII抗原的中和滴度。
42.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物诱导针对艰难梭菌毒素A或艰难梭菌毒素B的中和滴度。
43.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物诱导针对艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B的中和滴度。
44.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含相对于所述艰难梭菌的细胞表面多糖的总重量按重量计小于约5％的杂质。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述杂质是肽聚糖、蛋白质、核酸、糖类或其组合。
46.根据权利要求44所述的组合物，其中所述杂质是艰难梭菌杂质。
47.根据权利要求44所述的组合物，其中所述杂质是核酸。
48.根据权利要求44所述的组合物，其中所述杂质是糖类。
49.根据权利要求44所述的组合物，其中所述杂质来源于艰难梭菌的细胞表面提取物。
50.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-49中任一项所述的组合物。
51.一种治疗感染的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含
(a)艰难梭菌的细胞表面多糖；以及
(b)多肽或编码所述多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含艰难梭菌的类毒素或其片段；
其中所述施用是每周一次或每两周一次，并且
其中所述感染由艰难梭菌引起。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述药物组合物是权利要求50所述的药物组合物。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述对象未表现出所述艰难梭菌感染的症状。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述施用是静脉内施用。
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述施用是肌内施用。
56.根据权利要求51所述的方法，其中所述方法包括测量粪便中艰难梭菌的CFU/mg粪便的减少百分比，并调节剂量/治疗。
57.根据权利要求51所述的方法，其中所述减少百分比是与不存在所述治疗有效量的所述药物组合物相比，艰难梭菌的CFU/mg减少至少60％。
58.根据权利要求51所述的方法，其中如果与不施用所述药物组合物的粪便样品相比，获自所述对象的粪便样品的CFU/mg增加，则施用第二治疗有效量的所述药物组合物，其中所述第二治疗有效量大于所述药物组合物的所述治疗有效量。
59.根据权利要求58所述的方法，其中如果与不施用所述药物组合物的粪便样品相比，所述粪便样品的CFU/mg减少，则施用第三治疗有效量的所述药物组合物，其中所述第三治疗有效量小于所述药物组合物的所述治疗有效量。
60.根据权利要求51所述的方法，其中所述施用是每周一次，持续两周。
61.根据权利要求51所述的方法，其中所述施用是每两周一次。
62.根据权利要求51所述的方法，其中所述施用是每两周一次，持续一个月。
63.根据权利要求51所述的方法，其中所述对象住在疗养院。
64.根据权利要求51所述的方法，其中所述对象具有艰难梭菌感染的病史。
65.根据权利要求51所述的方法，其中所述对象具有阳性艰难梭菌CFU/mg计数。
66.根据权利要求51所述的方法，还包括治疗剂。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述治疗剂是抗生素。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述抗生素是万古霉素。
69.根据权利要求66所述的方法，其中所述抗生素是非达霉素。
70.一种治疗感染的方法，包括：
(a)鉴定获自对象的生物样品的遗传序列信息，以确定所述感染的存在，其中所述感染是艰难梭菌感染；以及
(b)向所述对象施用治疗有效量的包含艰难梭菌的细胞表面多糖的药物组合物。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述药物组合物是权利要求50所述的药物组合物。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述方法包括进行测定，其中所述测定是实时聚合酶链反应(RT-PCR)或核酸扩增测试(NAAT)。
73.根据权利要求72所述的方法，其中对来自所述对象的粪便样品进行所述测定。
74.根据权利要求72所述的方法，其中所述测定确定所述粪便样品中艰难梭菌的CFU/mg。
75.一种富集艰难梭菌的细胞表面多糖的方法，所述方法包括：
(a)获得一种或多种艰难梭菌菌株的细胞表面提取物(CSE)，以及
(b)富集来自所述CSE的艰难梭菌的细胞表面多糖，从而获得富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖；
其中所述富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含按重量计小于约5％的艰难梭菌杂质。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述方法包括：从所述CSE富集PSII，从而获得富集的PSII样品；
其中所述富集的PSII样品包含PSII和(a)相对于所述PSII的总重量按重量计小于5％肽聚糖的肽聚糖污染水平；(b)相对于所述PSII的所述总重量按重量计小于5％蛋白质的蛋白质污染水平；或(c)相对于所述PSII的所述总重量按重量计小于5％核酸的核酸污染水平。
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述获得包括剥离一种或多种艰难梭菌菌株。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述一种或多种艰难梭菌菌株是核糖型001、003、012、014、027、036、106、MOH 900或MOH 718。
79.根据权利要求75所述的方法，其中所述富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含按重量计小于约5％的艰难梭菌蛋白。
80.根据权利要求75所述的方法，其中所述艰难梭菌的细胞表面多糖选自PSI、PSII、PSIII、其药学上可接受的盐及其免疫原性片段。
81.根据权利要求75所述的方法，其中所述艰难梭菌的细胞表面多糖是PSII。
82.根据权利要求75所述的方法，其中所述富集包括乙醇沉淀步骤。
83.根据权利要求75所述的方法，其中所述富集包括一个或多个TCA沉淀步骤。
84.根据权利要求75所述的方法，其中所述富集包括超滤/渗滤(UFDF)步骤。
85.根据权利要求75所述的方法，其中所述富集包括离子交换色谱步骤。
86.根据权利要求75所述的方法，其中所述富集包括在所述离子交换色谱步骤之后的一个或多个TCA沉淀步骤。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述富集包括在所述TCA沉淀步骤之后和/或在所述离子交换色谱步骤之后的一个或多个超滤/渗滤(UFDF)步骤。
88.根据权利要求75所述的方法，其中所述富集包括过滤步骤。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述过滤步骤包括切向流过滤或通过具有截留分子量的过滤器离心。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述过滤器的截留分子量为3kDa或更小。
91.根据权利要求89所述的方法，其中所述过滤器的截留分子量为10kDa或更大。
92.根据权利要求75所述的方法，其中所述方法还包括冻干。
93.根据权利要求75所述的方法，其中所述富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含PSII和根据NMR相对于所述PSII的总重量按重量计小于5％肽聚糖的肽聚糖污染水平。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含PSII和根据NMR相对于所述PSII的所述总重量按重量计小于5％蛋白质的蛋白质污染水平。
95.根据权利要求75所述的方法，其中所述富集的艰难梭菌样品的细胞表面多糖包含PSII和根据NMR相对于所述PSII的总重量按重量计小于5％核酸的核酸污染水平。
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