CN117448327A - 一种prmt2基因突变体及罗非鱼抗菌品系的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学和水产育种，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术敲除获得prmt2基因突变体，以及建立prmt2基因敲除的罗非鱼抗菌品系。通过敲除该基因，可获得抗无乳链球菌的罗非鱼品系。通过感染实验发现，与野生型相比，敲除prmt2基因的罗非鱼具有更强的抗菌能力。本发明为罗非鱼抗病育种提供重要的模型，也为创建更多鱼类的抗病品系和品种提供了基因靶标和新的研究方向。

Description

一种prmt2基因突变体及罗非鱼抗菌品系的构建方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域和水产育种，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术敲除获得prmt2基因突变体，以及建立prmt2基因敲除的罗非鱼抗菌品系。通过敲除该基因，可获得抗无乳链球菌的罗非鱼品系。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)，是鲈形目，丽鱼科，罗非鱼属的一种中小型鱼类，又名越南鲫、越南鱼、南洋鲫、金凤鱼、吴郭鱼，在广东还被称为福寿鱼。而罗非鱼原产自非洲，与另一种常见的淡水鱼鲫鱼长得又十分相像，所以又有“非洲鲫”的别称。罗非鱼本身刺少，肉质也较为紧实肥美，蛋白质含量高，富含人体所必需的氨基酸，营养价值较高，符合欧美朋友的口味，因此被誉为“白肉三文鱼”和“21世纪之鱼”，是世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一，近年已成为养殖，加工，出口的热点之一。

罗非鱼属于热带性鱼类，主要生活于广东，海南，广西，福建等地，近年来，由于大规模集约化养殖的盛兴，加之生活于热带环境，导致罗非鱼链球菌病连年爆发，该病传染性强、致死率高，危害范围广，给罗非鱼产业造成了严重的经济损失。尽管抗菌素类药物等防病措施有一定效果，但存在药物残留、耐药性及环境污染等缺点，且难以满足水产养殖绿色可持续发展的需求，因此培育罗非鱼抗病品种迫在眉睫。

基于鱼类遗传学及基因组学的发展，目前鱼类育种技术主要包括家系与群体选育、分子标记辅助选育和全基因组选育等，也成功运用于多种养殖鱼类。然而，对于鱼类抗病育种主要采用逐代染病基于表型进行筛选，该方法存在育种周期长、效果不稳定等缺陷。因此，寻找一种高效且稳定的选育技术对于推动我国养殖鱼类抗病品种的培育具有关键作用。

2013年，Cell、Science、Nature Biotechnology等杂志几乎同时报道了一种新型的基因组编辑手段：CRISPR/Cas9技术(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats—CRISPR associated system)。与传统的基因编辑技术相比，该系统具有良好的靶向性、构建简单、可同时操作多条基因等优点。

近年来发展起来的基因组定点编辑技术CRISPR/Cas9，该项技术具有以下这些突出特点：直接阻滞DNA转录，阻滞级别更高、更准确；可对多个靶点同时编辑；能够实现可逆性基因沉默；沉默效率较高，载体构建简单，只需设计目的基因的sgRNA。

这些明显的优势使该技术为人类医学、动物研究以及植物的改良育种等各方面的发展带来了一项强有力的工具，是基因功能研究的利器。近年来，CRISPR/Cas9技术在模式动物斑马鱼中具有广泛的应用以研究相关科学问题，然而由于养殖鱼类成熟周期长，不宜操作的原因，基因编辑技术在养殖鱼类中的应用较少，CRISPR/Cas9基因编辑技术为鱼类育种开辟了新的方向。

精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferase,PRMT)家族蛋白及其介导的精氨酸甲基化修饰与疾病的发生发展密切相关。蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)家族介导的精氨酸甲基化是真核生物广泛存在的翻译后修饰，在转录、细胞信号、mRNA前剪接和DNA损伤信号等诸多生物学过程中发挥着关键作用。PRMT以s-腺苷-蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到蛋白质精氨酸侧链的氮原子上，生成s-腺苷-l-同型半胱氨酸和甲基精氨酸。PRMT2是PRMT家族的关键成员，包含一个高度保守的催化Ado-Met结合结构域和一个独特的Src同源结构域，可以结合富含脯氨酸基元的蛋白质。PRMT2通过甲基化组蛋白和非组蛋白在调控细胞信号和基因表达方面发挥重要作用。已有研究显示prmt家族成员(如prmt3,prmt6,prmt7)具有负调控抗病免疫反应，同时prmt2可以通过抑制traf6的激活来减弱斑马鱼的抗病毒先天免疫反应，敲除prmt2基因后，斑马鱼对鲤春病毒血症病毒的抵抗能力显著提升。

prmt2基因对于鱼类抗细菌感染是否有相关性，是否为选育靶基因，还未有相关研究。

发明内容

本发明目的在于提供prmt2基因的应用，通过对prmt2基因敲除和编辑，获得一种具有抗病能力的罗非鱼品系。

本发明另一个目的在于通过优化和改良CRISPR/Cas9技术，提供一种prmt2基因敲除的罗非鱼抗病模型的构建方法及应用。本发明通过CRISPR/Cas9技术，获得sgRNA和Cas9蛋白构建稳定敲除prmt2基因罗非鱼模型，稳定敲除prmt2基因的罗非鱼显示出良好的抗病能力。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

prmt2基因可用于构建罗非鱼抗菌品系，尤其是抗链球菌感染品系。

本发明的另一个技术方案为，一种prmt2基因的特异性靶位点sgRNA，以prmt2基因外显子1中SEQ ID No.1所示的序列为靶点。

SEQ ID No.1：GGTGGTGGGCAGAGCTGCAG

进一步，所述prmt2基因的特异性靶位点sgRNA，其特征在于，含有SEQ ID No.5所示核苷酸序列。

SEQ ID No.5：GGUGGUGGGCAGAGCUGCAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

优选的，所述prmt2基因的特异性靶位点sgRNA核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

一种prmt2基因突变体，其外显子1位置上第209-228位核苷酸发生基因编辑。

进一步，所述prmt2基因突变体的外显子1删除第224和225位的t和g碱基。

优选的，所述prmt2基因突变体的外显子1的序列如SEQ ID No.6所示。

SEQ ID No.6：ATGATGCGTCCTGTGAGGAGTATGTTGCCCGGTCAGATTTCACTGGAAGTGGCACCGATCAGGTCAGAGAGACCCGCAAACCTCAGAGATCCTAACCTTAAAACGGGAGGTGGGGGTATCAGCAATAACCGTGTGACTTGTTTTGTCTCACAGCTTAGTTTCAGCAGAGGGGACAGACTGCTTGTACACGCCAAGCCCTCCTCAGAGTGGTGGTGGGCAGAGCCAGGGGGTCATAGGTTATGTCCCTGCCGGCTACCTGAGCCAGGATGCTGCAGGGGAGGAGGAGGAGGACCCCTCAATAGAAGACCCGTGGCAAGATGAAGAATACTTTGGCAATTATGGAACGCTG。

上述prmt2基因的特异性靶位点sgRNA或者prmt2基因突变体可用于培育罗非鱼抗菌品系，尤其是抗链球菌感染的罗非鱼品系。

敲除了prmt2基因，尤其是在prmt2基因外显子1上发生了突变的罗非鱼，具有更好的抗细菌感染能力。具体的，在prmt2基因外显子1第209-228位核苷酸发生突变的罗非鱼，具有抗细菌感染能力。

在本发明的一个优选方式中，敲除了prmt2基因的罗非鱼，具体为prmt2基因外显子1上删除第224和225位的t和g碱基的罗非鱼(即prmt2基因外显子1序列如SEQ ID No.6所示)具有抗细菌感染能力，尤其是抗链球菌感染。在感染后不仅存活率显著提高，同时体内细菌载量也显著降低。

一种罗非鱼抗菌品系的构建方法，包括如下步骤：

(1)基于CRISPR/Cas9基因敲除技术，将上述prmt2基因的特异性靶位点sgRNA和Cas9蛋白显微注射入罗非鱼胚胎，对prmt2基因外显子1位置上第209-228位核苷酸进行编辑；胚胎培育后筛选阳性罗非鱼，得到F0代阳性罗非鱼；

(2)将F0代阳性罗非鱼与野生型罗非鱼交配获得F1代杂合子罗非鱼；

(3)将F1代杂合子罗非鱼杂交获得F2代罗非鱼，筛选F2代纯合子罗非鱼，即建立了罗非鱼抗菌品系。

优选的，所述的罗非鱼抗菌品系为抗链球菌品系。

步骤(1)-(3)中，用PCR扩增并测序筛选F0代阳性罗非鱼、F1代杂合子罗非鱼和F2代纯合子罗非鱼。

PCR扩增测序所使用上下游序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。

SEQ ID No.7：GAGAGACCCGCAAACCTCAG(prmt2-seq-F)

SEQ ID No.8：TCTTCATCTTGCCACGGGTC(prmt2-seq-R)

优选的，所述的阳性F0代罗非鱼prmt2基因删除了位于外显子1第224和225位的2个碱基。具体的，删除了第224和225位的t和g碱基。

优选的，所述F2代纯合子罗非鱼基因组测序结果如SEQ ID No.12。

优选的，步骤(1)中，F0代阳性罗非鱼的PCR产物在300bp左右的位置出现两条条带；野生型则为单一条带。

优选的，步骤(3)还可以用T7E1酶切法筛选F2代纯合子罗非鱼。具体的，用SEQ IDNo.9和SEQ ID No.10所的引物扩增，并用T7E1酶切PCR产物。F2代纯合子罗非鱼的PCR酶切产物出现三个条带。

SEQ ID No.9：TGCGTCCTGTGAGGAGTATG(prmt2-T7E1-F)

SEQ ID No.10：GGGTGATGCATTAAAGAAAAGGC(prmt2-T7E1-R)

prmt2基因敲除的罗非鱼还可以用于构建鱼类抗病育种。

本发明的有益效果和优点在于：

本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除技术，构建prmt2基因敲除罗非鱼模型的sgRNA，并敲除了罗非鱼prmt2基因。通过敲除该基因，可获得抗菌尤其是抗无乳链球菌的罗非鱼品系。

本发明首次构建成功prmt2基因敲除的罗非鱼养殖鱼类模型，为罗非鱼抗病育种提供重要的模型。通过感染实验发现，prmt2敲除的罗非鱼，具有抗细菌感染能力，尤其是抗链球菌感染的能力。基于prmt2功能的保守性，本发明为进一步研究prmt2的功能奠定了良好的基础，可为鱼类分子抗病品系和品种提供了基因靶标和新的研究方向。

附图说明

图1为prmt2基因敲除罗非鱼构建方案示意图；

图2为实施例4中，T7E1_PCR凝胶电泳结果；

图3为实施例4中prmt2-F2代_T7E1酶切结果；

图4为实施例2中，F0代阳性罗非鱼prmt2基因敲除位点和峰图；

图5为实施例4，F2代纯合子罗非鱼(prmt2-/-)与野生型罗非鱼prmt2基因(prmt2+/+)敲除位点和峰图以及表达的蛋白长度；

图6为实施例5无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染后的野生型(infected-WT)及prmt2敲除的罗非鱼(infected-PRMT2^-/-)生存曲线，WT和PRMT2^-/-为未感染的野生型及prmt2敲除的罗非鱼；

图7为实施例5中，F2代纯合子腹腔注射链球菌后，脾脏(spleen)中细菌载量的统计；

图8为实施例5中，F2代纯合子腹腔注射链球菌后肝脏(liver)中细菌载量的统计。

具体实施方式

本次突变品系为单靶点敲除获得，下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实验所需材料：

1)PCR所用的酶：(sgRNA合成用的)2×Accurate taq master Mix(艾科瑞生物公司)；

2)PCR产物纯化：QIAquick@PCR Purification Kit(QIAGEN公司)；

3)体外转录：MAXIscript^TMSP6/T7转录试剂盒(Thermo公司)；

4)Cas9蛋白：GenCrispr NLS-Cas9-NLS Nuclease(金斯瑞)；

5)T7E1酶：T7 Endonuclease I(碧云天)；

6)T7E1_PCR用的酶：2*Taq Plus Master Mix II(Dye plus)(Vazyme)

prmt2基因敲除罗非鱼的构建方案和实验步骤如图1所示，包括构建sgRNA并与Cas蛋白注射到罗非鱼胚胎中，培育并筛选得到F0代阳性罗非鱼；F0代阳性罗非鱼与野生型罗非鱼杂交，得到F1代杂合子罗非鱼；用雌性和雄性F1代杂合子罗非鱼杂交，筛选F2代纯合子罗非鱼，并用无乳链球菌(S.agalactiae)感染验证。

实施例1 prmt2基因敲除罗非鱼

(1)构建针对prmt2基因的特异性靶点sgRNA。

所述prmt2的sgRNA靶点序列SEQ ID NO.1如表1所示，位于prmt2外显子的第209-228位。

其中crRNA和tracrRNA引物序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3如表2所示：

线性化及纯化DNA并与Cas9蛋白在体外转录。

表1：prmt2的sgRNA靶点序列(SEQ ID NO.1)

sgRNA名称	序列(5’-3’)
		Prmt2-sgRNA-靶点序列	GGTGGTGGGCAGAGCTGCAG(SEQ ID NO.1)

表2：crRNA和tracrRNA引物序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3

以SEQ ID No.4的DNA片段为模板，体外转录得到sgRNA序列。

GATCACTAATACGACTCACTATAGGTGGTGGGCAGAGCTGCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT(SEQ ID NO.4)

模板包括转录crRNA和tracerRNA的DNA片段(SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)。

转录crRNA的DNA片段如SEQ ID No.2所示，包括T7启动子序列、靶点序列(SEQ IDNO.1)以及与tracrRNA互补的序列，转录tracerRNA的DNA片段如SEQ ID No.3所示，其中包含与crRNA互补的序列。

用MAXIscript^TMSP6/T7转录试剂盒进行体外转录，纯化并得到转录所得sgRNA序列：

GGUGGUGGGCAGAGCUGCAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO.5)

(2)精心培育性成熟的罗非鱼，直至其产卵并体外受精获得优良的细胞期的胚胎，将步骤(1)所述的纯化sgRNA与Cas9蛋白体外转录，显微注射到罗非鱼胚胎中。

取注射后存活的胚胎，精心培育至破膜存活，即为F0代罗非鱼。

实施例2阳性F0代罗非鱼PCR鉴定方法及结果

待F0代罗非鱼出生20-30天之后剪尾鳍提取DNA，PCR扩增并将产物送测序。引物信息、PCR反应体系及PCR反应程序如表3-5。

对F0代罗非鱼用引物prmt2-seq-F+prmt2-seq-R(SEQ ID NO.7、8)进行PCR检测，扩增的片段大小为260bp。

对F0罗非鱼进行T7E1酶切检测编辑效率：通过扩增PCR产物并对其进行酶切。

1)T7E1_PCR扩增：

T7E1_PCR的扩增引物如SEQ ID No.9和10，扩增的PCR产物片段大小为740bp；T7E1_PCR反应体系、T7E1_PCR反应程序及如表6和7。T7E1_PCR产物凝胶电泳结果如图2。通过图2可看到PCR产物条带单一，可进行下步实验。

prmt2-T7E1-F TGCGTCCTGTGAGGAGTATG(SEQ ID NO.9)

prmt2-T7E1-R GGGTGATGCATTAAAGAAAAGGC(SEQ ID NO.10)

表6 反应体系

成分	体积
		2xTaq Plus Master MixⅡ(Dye plus)	5μl
prmt2-T7E1-F(10μmol/μl)	0.5μl
		prmt2-T7E1-R(10μmol/μl)	0.5μl
ddH20	3μl
		DNA模板	1μl
Total	10μl

表7 PCR反应程序

2)T7E1酶切

上述PCR产物置于PCR仪进行退火，退火反应体系和反应条件如表8、9。反应结束后加入T7E1酶0.25μl，金属浴30min，加入0.75μl 0.5M EDTA终止酶切反应。

表8 PCR退火反应体系

成分	体积
		PCR产物	5μl
ddH20	4μl
		Buffer	1μl
Total	10l

表9 PCR退火反应程序

反应温度	反应时间
		95℃	5min
85℃	10s
		25℃	10min
12℃	～

酶切产物电泳结果如图3所示。左边5个单一条带为WT或KO，无重叠峰；右边5个有2条带的为有重叠峰的，即杂合子。

对以上罗非鱼进行基因测序，部分基因测序结果如图4。测序结果与野生型罗非鱼(prmt2)的测序比对证明，F0代突变体罗非鱼prmt2基因在外显子1(Exon1)部分发生了碱基删除，敲除了第224和225位的t和g。

SEQ ID No.1所示的靶点序列中，下划线为发生突变的位点：GGTGGTGGGCAGAGCTGCAG。

表3 PCR反应引物信息表

表4 PCR反应体系

成分	体积
		2x Accurate Taq Master Mix	10μl
prmt2-seq-F(10μmol/μl)	1μl
		prmt2-seq-R(10μmol/μl)	1μl
ddH20	7μl
		DNA模板	1μl
Total	20μl

表5 PCR反应程序

实施例3 F1代罗非鱼获得及基因型鉴定

选取阳性的F0代突变体罗非鱼与野生型罗非鱼交配，筛选获得的F1代杂合子罗非鱼。

PCR扩增产物测序，观察重叠峰筛选杂合子。PCR扩增引物、反应体系及反应程序同实施例2。

F1代杂合子罗非鱼PCR扩增序列如SEQ ID NO.11：

CCCCTCCTTACGGGAGGTGGGGGTATCAGCAATAACCGTGTGACTTGTTTTGTCTCACAGCTTAGTTTCAGCAGAGGAGACAGACTGCTTGTACACGCCAAGCCCTCCTCAGAGTGGTGGTGGGCAGAGCTGCGGGGGCATATGTGATGTGCCTGTGCCCTACCTGTGCCCCGAGGCGGTGCGGGAGGAGGAGAAGGAGACCTCTCTATAAAACACCCGGGGAGATAAAAAAAA

实施例4F2代纯合子罗非鱼获得及基因型鉴定

将实施例3筛选到的F1代杂合子罗非鱼杂交，筛选获得F2代纯合子罗非鱼，即为prmt2基因敲除罗非鱼模型。

F2代纯合子罗非鱼的鉴定方法为，经T7E1_PCR电泳鉴定出的一条条带(图3)的PCR产物直接测序，比对序列筛选WT和KO；PCR扩增引物、反应体系及反应程序同实施例2。

PCR扩增，Sanger法对F2代纯合子罗非鱼进行测序，结果如SEQ ID NO.12，为纯合子。

SEQ ID NO.12：

ACGGTCGTTAACGGGGAGGTGGGGGTATCAGCAATAACCGTGTGACTTGTTTTGTCTCACAGCTTAGTTTCAGCAGAGGAGACAGACTGCTTGTACACGCCAAGCCCTCCTCAGAGTGGTGGTGGGCAGAGCCAGGGGGTCATAGGTTATGTCCCTGCCGGCTACCTGAGCCAGGATGCTGCAGGGGAGGAGGAGGAGGACCCCTCAATAGAAGACCCGTGGCAAGATGAAGAA

如图5，测序结果与野生型罗非鱼(prmt2+/+)的比对显示，F2代纯合子(prmt2-/-)的prmt2基因在外显子1(E1)部分发生了碱基删除，敲除了第224和225位的t和g。prmt2+/+表达的蛋白长度443个氨基酸，(prmt2-/-)表达的蛋白长度为106个氨基酸。

实施例5 F2代纯合子罗非鱼抗链球菌的检测

利用2x10⁷cfu/ml的无乳链球菌分别腹腔注射感染F2代纯合子罗非鱼和野生型罗非鱼，注射量100μL，检测感染后罗非鱼的存活率及体内组织细菌载量，以未感染的F2代纯合子罗非鱼和野生型罗非鱼为对照。

生存曲线如图6所示，与野生型罗非鱼相比，F2代纯合子在受链球菌感染的存活率显著提高。

同时F2代纯合子体内细菌载量也显著降低，如图7和8所示，腹腔注射链球菌后，F2代纯合子的脾脏和肝脏中的细菌载量比野生型有显著降低。

以上实验初步表明F2代纯合子罗非鱼具有抗链球菌感染的能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种prmt2基因的特异性靶位点sgRNA，其特征在于，以prmt2基因外显子1中SEQ IDNo.1所示的序列为靶点。

2.根据权利要求1所述prmt2基因的特异性靶位点sgRNA，其特征在于，含有SEQ IDNo.5所示核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述prmt2基因的特异性靶位点sgRNA，其特征在于，其核苷酸序列列如SEQ ID No.5所示。

4.prmt2基因、权利要求1-3任一项所述prmt2基因的特异性靶位点sgRNA在构建罗非鱼抗菌品系方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的罗非鱼抗菌品系为抗链球菌感染品系。

6.一种罗非鱼抗菌品系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)对prmt2基因进行敲除；胚胎培育后筛选阳性罗非鱼，得到F0代阳性罗非鱼；

(2)将阳性F0代罗非鱼与野生型罗非鱼交配获得F1代杂合子罗非鱼；

(3)将F1代杂合子罗非鱼杂交获得F2代罗非鱼，筛选F2代纯合子罗非鱼，即为抗细菌感染的罗非鱼。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将Cas9蛋白和权利要求1-3任一项所述prmt2基因的特异性靶位点sgRNA显微注射入罗非鱼胚胎，对prmt2基因外显子1进行编辑。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，删除prmt2基因外显子1的第224和225位的碱基。

9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)-(3)中，用PCR扩增并测序筛选F0代阳性罗非鱼、F1代杂合子罗非鱼和F2代纯合子罗非鱼。

10.一种prmt2基因突变体，其特征在于，其外显子1位置上第209-228位核苷酸发生基因编辑。