CN117431334A - 一种检测小麦粒重基因的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测小麦粒重基因的分子标记及其应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了一种检测小麦粒重基因的分子标记，所述分子标记位于小麦TaRSR1‑1B基因编码区序列第2592bp位点，且多态性为C/T。在本发明中，若碱基为C时，为高粒重小麦。本发明通过对所述分子标记的检测可以实现对小麦粒重的快速检测。本发明所述分子标记便于检测和筛选具有高千粒重的小麦品种或品系，可大大加快小麦高产品种的选育进程。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种检测小麦粒重基因的分子标记及其应用。
背景技术
小麦是仅次于水稻和玉米的第三大粮食作物，在小麦种植面积难以显著增加的情况下，提高小麦单位面积产量是保障粮食安全的一个有效策略。
小麦单产主要由亩穗数、穗粒数和粒重共同决定，其中粒重受环境影响小，对我国小麦产量增加贡献最大。淀粉是谷物胚乳中主要的储存碳水化合物，约占籽粒重的65％～70％，且提供人们所消耗80％的能量，是决定籽粒产量和相关品质的关键因素，故提高小麦籽粒充实度与粒重的根本途径在于提高其淀粉合成能力。
淀粉的生物合成是一个复杂过程，由一系列淀粉合成相关酶基因所控制。由于参与淀粉合成的同工酶基因数目与类型不同(Nougué et al.2014)，不同物种的淀粉含量和特性存在一定差异。目前在小麦、水稻和玉米基因组内分别发现有26个、29个和32个同工酶基因编码上述淀粉合成相关酶(Ohdan et al.2005；Yan et al.,2009；Kang et al.2013)。目前，关于小麦淀粉调控产量相关基因的分子标记开发还很匮乏，与小麦淀粉含量直接相关性状包括小麦粒重的性状，开发小麦粒重相关分子标记的研究对于小麦优良性状的选择和小麦育种具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的提供一种检测小麦粒重基因的分子标记，能够快速筛选出高千粒重小麦品系。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种检测小麦粒重基因的分子标记，所述分子标记位于小麦TaRSR1-1B基因编码区序列第2592bp位点，且多态性为C/T。
优选的，所述TaRSR1-1B基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种用于扩增上述技术方案所述分子标记的引物组，包括上游引物CAPS-F和下游引物CAPS-R；所述上游引物CAPS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述下游引物CAPS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了一种检测小麦粒重基因的试剂盒，包括上述技术方案所述引物组。
优选的，所述试剂盒还包括PCR反应试剂。
本发明提供了一种检测小麦粒重的方法，包括以下步骤：
利用上述技术方案所述引物组对待测材料的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
用限制性内切酶Pac I对PCR扩增产物进行酶切，对酶切产物进行电泳检测；
若电泳检测结果出现两个片段，则为低千粒重小麦；
若电泳检测结果为一个片段，则为高千粒重小麦。
优选的，所述PCR扩增使用的反应体系以50μL计包括：2×KOD OneTM PCR MasterMix 25μL，10μM上游引物CAPS-F 0.3μL，10μM下游引物CAPS-R 0.3μL，200ng DNA模板，补充ddH2O至总体积50μL。
优选的，PCR扩增反应的程序为：第一阶段94℃预变性3min；第二阶段98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸3min，32个循环；第三阶段：68℃终延伸5min。
本发明提供了上述技术方案所述分子标记、上述技术方案所述引物组、上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述方法在不同小麦粒重比较中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述分子标记、上述技术方案所述引物组、上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述方法在小麦育种和/或辅助小麦育种中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种检测小麦粒重基因的分子标记，所述分子标记位于小麦TaRSR1-1B基因编码区第2592bp位点，且多态性为C/T。本发明通过对所述分子标记的检测可以实现对小麦粒重的快速检测。便于检测和筛选具有高千粒重的小麦品种或品系，可大大加快小麦高产品种的选育进程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为TaRSR1-1B编码区与启动子的PCR扩增结果图；
图2为TaRSR1-1B启动子与编码区序列在普通六倍体小麦中变异位点与形成的三种单倍型图；
图3为TaRSR1-1B在三种单倍型小麦品种中的千粒重分析；
图4为TaRSR1-1B编码序列单倍型CAPS分子标记的开发图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测小麦粒重基因的分子标记，所述分子标记位于小麦TaRSR1-1B基因编码区序列第2592bp位点，且多态性为C/T。在本发明中，若位于小麦TaRSR1-1B基因编码区序列第2592bp位点的碱基为C时，所述小麦为高千粒重小麦。
在本发明中，所述分子标记的SNP位点位于小麦TaRSR1-1B基因编码区序列第2592bp位点，所述位点上存在C/T碱基突变，与小麦粒重性状具有显著的相关性。在本发明中，所述小麦粒重优选采用小麦千粒重进行表征。
本发明所述TaRSR1-1B基因编码区序列在小麦基因组基因库中的登录号为TraesCS1B02G076300。在本发明中，所述TaRSR1-1B基因编码区的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，具体如下：
5’-ATGGAGCTGGATCTGAACGTGGAGGAGAAGCCGGCGGCGGTGGCGCGGAGCGACTCCGGGACGTCGGAGTCGTCGGTGCTGAACGCGGAGGCGTCCTGCGGCGGGGGCGCCGCGCCGGCCGAGGAGGCCTCCAGCTCGACGCGCCAGCCGGCGCCGGCGCCGCGGGCGGTGCTCGAGTTCAGCATCCTGAGGAGCTCGGCGTCCGCCGAGGGCGAGAACGACGTCGGCGCCGACGACGACGAGGAGGAGGCCACTCCCTCGCCTCCACCTCCGCCGACGCGGCACTACCACCAGCACCTGCTGCAGCCGCAACAACTCGTCACCCAAGAGCTGTTCCCCGCCGCGGCCACCGCCGGCGGTCCGCCGCCGATGTCCGTGCCGCAGCATTGGGCCGAGCTCGGCTTCTTCCGCCCCGCGGCGCCGCCTCCGGACATGAGGATCCTGCAGATGCAGCAGCAGCAGCTGCAGGTGCACGCGCAGCCCCCGCCGCCGCCGGCGGCCCAGCCGCCGGTGGCCAAGAAGAGCCGCCGCGGCCCGCGCTCCCGCAGCTCGCAGTACCGCGGCGTGACCTTCTACCGCCGCACCGGCCGCTGGGAATCCCATATCTGGTCCGTACACAAATCCCTCCAACCACCCCCAAAAAGAAACCCAATTTTTTTCCTCAAATATCACCAACTGATTGTTTCAGTTCTTACAAATTTTCTTGCTCCTGTTCATCGCTAAATGCAGGGATTGCGGCAAGCAGGTGTACTTGGGTGGATTTGACACTGCACATGCTGCTGCAAGGTACAAATTTAATTAAGCAGGAGTACATAATTGTGATGTGATCATCACCTGAACTACCTGTACTGAAACCCTCAAGTCATGTCATTTCACCGTGCCAAATTGACCTTGGGATGTTCCGCAGGGCGTACGATCGAGCGGCGATCAAGTTCCGTGGCGTCGACGCCGACATAAACTTCAACCTCAGCGACTACGAGGACGACATGAAGCAGGTGATCGGCAAAGCCACCAACCAGTGTTCCTCATCCAACCAAATAGTTCAGATGCAGAGTGCATTAGTACTGTTGTTGAAACTGATGAACTGAAGAAATTCTGACTGTGTGTTGTTTGGTGGATGATCTGGATCAGATGAAGGGCCTGTCCAAGGAGGAGTTCGTGCACGTGCTGCGGCGGCAGAGCACCGGCTTCTCGCGGGGCAGCTCCAAGTACAGAGGCGTCACCCTGCACAAGTGCGGCCGGTGGGAGGCGCGCATGGGCCAGTTCCTCGGCAAGAAGTAAGAACAAATTCCCCTTTCCATTTTGAACCGATTTTTCATTTCTTACTTCATGGCATGTTGCACTGAATGCACTTGTGAAGTTAACATATGCATCTCTGGATGTGATTGTGCTGCTGCCTATCTGATCTGAATCTGAATCTCGTAAGAGAGAGTCATGATCAGATCAAACAAGATCCCATGATCCATTAGGAATGTATTTTTAAGCAGTAGTTCATAGGTTGAAAATACTAAGATGCATAGATCAGGAAAAATAAAATGAAATAGTAGTAGGCAGTGGATAGGGAGTTCCTCAAACGACATGTTTGGGTGCAGGTACATATATCTTGGGCTATTCGACAATGAAGTAGAGGCTGCAAGGTTCCTGAGCTTGGATTCTGCCCATTGATGCACAATAAAAAAGTTGTTTCTTTTTTCTCCATCAACCGAAGTACCGACTCGAATCTCTTCTCTTTGTTTCTCTTCTTCTTTTTCTTGTCCGGAAAAATCAGGGCTTACGACAAGGCGGCGATCAAATGCAACGGTAGGGAGGCCGTGACGAACTTCGAGCCGAGCACCTATGATGCGGAGCTGCTCAGTGAGGTTGCTGCTGAAGGTAACAACACGATGAGAATTTTGATTGAATTTATTTTTCATGTTTGCATCTGTGATTTGGCAAAAATTCTGCGTTGGAGATTAGCTGATGAACTTGAATTTGATTATGACGATTGGCAGGCGCAGATGTCGACCTCAACTTGAGCATATCTCAACCAACTTCACAAAGTCCCAAAAGGGATAAGAGCAGCCTTGGCCTGCAACTCCACCATGGATCATATGAAGGCTCTGAACTAAAGAGACCAAAGGCAAGTACAAATGCTTTCTTTAAAAGATTTGGCAACCAGTCCAATTTCACTGCTGGATTTGTATGGCTACCTGATCCACTATGTGATTAATAATTGAATTTCACTATCACCATGCTAGTGACTGCAGTATGATGCCCTATCGTAGCAAAGTCTTTTTCCTAGTTTACTTCATAGGAACTTCTACAGCTATTGTCTAAATTAAATTTCACCGTCGCCTGACCCACCGCCCAAATTATATTCACCACACAGTAACATGCTTACTTTTCCTGCCTGACTATGGTTGTCTATCTATTTTTCATTCAGAAATTAAATAGATTGAGAAGATTATTAGTTGACATTCAACTGGAAAATATCGTTTGCGTGTTATGCAGGTCGATGCGCCCCCTGAGATGGTCGCAATCCCTCATCGATACCCCCTTCTGACCGAGCATCCACCAATCTGGCATGGCCAATCATATCCCATCTTTTTAAATAATGAGGTGAGGTGATACTAAATTTTAAAGCTCCTTTCACCTAAAATTTTCAAGGTGGCTCTGATGACGCCCGATATGGATCGGACCGTACATATTGAGCATGTCGACGCCACTCTGTTTTGCAATCAGGACTGACTGATGCAGACTGATAATGCCCTTGCAGCTGTTACTGTTGTACTTAGCGTCACTTAAGCATTTTCCTGTGTGGCTGCAGTTATAGCTCAAGTTGGCCTGATTTTCATAGTCCACCCGTTCCATGTCGAGTTCAGAGTCATTAATTCCTAGCACAATTTTCATATGCAGGATCTTGAGTCCTCACAAACTGTCTAATTGAGTTCAGAGTCGTAGGATATGTATAGTATAAATATGCTGATTTTTTTCCTCCTAAAGGAACATCCTAGAGAGTTGACGATTTAGATTTAGCCCACTCCAATAATTTGGTCAATATTCCTTCATGTGGCTAAGAACGTTTTGGTGTTCTATTTTGTATGGTATGACCACTATTCAGAGGTTTTATTTATTTATAGCGAGAAAAGAGATCTGGATCGTACCAATACTATTTTAATAGTATGAGTACGGCTCACAGCTTTACTTGGAAGCAAAAGAAAGCTAGCAAGTCGGCACCTTATAGTAATAGGATTAGTACGCAGTTTGCCATTTGGTTTGAAAACCCAAAATTGGTTTGCCATTCCTTTTCTTAAATTATCCTCTCAGATTCCTCAACTACTAAACTTCAAGAGTATCTTCACATGTGTCATTTTCTTATTTTATTTTTCCTGGAAAGCAAGTTCAGCTGGACATATCTACCTCACCTTTATGTCGATCAAAGCGATAGGAATTAGACCAATTGTACAAAAGAAACAAAGAACAATCCAATTTCTGCCAATTTTCTTGAGTTTATCCTACATGAGCATGCTAAATTATTCTTCATTTATATATGCAGGATGCAGCCAGAGATCATAGCAGGAGGCCAGAGGTGGCCACAGGGGGTGTTCCAACCTGGGCATGGAGTGTGAGCCACCCTCCTCCAACACAACCCATGCCACTCTTCTCGTCGTCATCGTCCGCTGCAGCATCATCAGGATTCTCCAAAACCGCCGCGGCAGCTGCCCCCGGCGCCCCATCGGCCTCATTCCGGTTCGACCCGATGGCGCCATCATCATCGTCAAGCAACCAACACCACCACCACCCCCGCTGAAAAAGAAGCCATACTGTAAATTTTCTGGGAAGCCAGTATCTTTTTGCCCCTCCGGCGTTTCAGCGTTTTCGGTCTTGCGCCGGGGCGGTTTCAGGTAGTGGATTGGATTCATGACTGTATTTCCCATGCTGCCCAAAGTGAAATGTCACTTCTTTTCTGCGCTCTCTGCAGCATTGGTCCCATAATTCTTGATGTCAGATACTAACGTCAGCTCATCTCACCATCTGAGATGGATTTATACCATTGTTGTAGACAAACTTGTCACTGAAATTCAGCAGTACCGATACCATAAGATAAGAGGAACCTTTACTTTGGGAATTATTCCAGCCCCTTTTCTTGGATGTCAGTTGGCCCTTGTTTTTGCTCTAC-3’。
本发明所述分子标记的多态性位点位于TaRSR1-1B基因编码区第2592bp位点处，且多态性为C/T。通过对所述分子标记的SNP位点进行鉴定分型可确定待测小麦千粒重性能：当所述位点为C碱基时，所述小麦粒重性状为高粒重；当所述位点为T碱基时，所述小麦粒重性状为低粒重。
本发明提供了一种用于扩增上述技术方案所述分子标记的引物组，包括上游引物CAPS-F和下游引物CAPS-R；所述上游引物CAPS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-GTTTGCATCTGTGAT-3’；所述下游引物CAPS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：5’-ATAGTATTGGTACGA-3’。
本发明利用所述分子标记引物组能够检测小麦中与粒重相关的TaRSR1-1B基因的等位变异，检测和筛选具有高粒重的小麦品种或品系，可大大加快小麦高产品种的选育进程。本发明优选可以通过对扩增产物的测序，筛选高粒重小麦或者可以通过与限制性内切酶结合筛选高粒重小麦。本发明通过与限制性内切酶结合筛选高粒重小麦时，所述限制性内切酶优选为限制性内切酶Pac I。
本发明提供了一种碱性小麦粒重基因的试剂盒，包括上述技术方案所述引物组。在本发明中，所述试剂盒优选还包括PCR反应试剂。在本发明中，所述PCR反应试剂优选包括KOD OneTM PCR Master Mix。在本发明中，所述试剂盒中优选还包括灭菌双蒸水。
本发明提供了一种检测小麦粒重的方法，包括以下步骤：
利用上述技术方案所述引物组对待测材料的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
用限制性内切酶Pac I对PCR扩增产物进行酶切，对酶切产物进行电泳检测；
若电泳检测结果出现两个片段，则为低千粒重小麦；
若电泳检测结果为一个片段，则为高千粒重小麦。
本发明利用上述技术方案所述引物组对待测材料的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
在本发明中，所述待测材料优选为小麦。本发明对待测材料的基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规基因组DNA提取方法均可。在本发明中，所述待测材料的基因组DNA优选采用CTAB法提取。本发明对CTAB法提取DNA的方法没有特殊限定，采用本领域常规方法均可。得到待测材料的基因组DNA后，本发明采用上述技术方案所述引物组对待测材料的基因组DNA进行PCR扩增。本发明所述PCR扩增使用的反应体系优选以50μL计，包括：2×KOD OneTM PCR Master Mix 25μL，10μM上游引物CAPS-F 0.3μL，10μM下游引物CAPS-R 0.3μL，200ng DNA模板，补充ddH2O至总体积50μL。本发明所述KOD OneTM PCRMaster Mix购买自东洋纺生物公司。本发明所述PCR扩增反应的程序为：第一阶段94℃预变性3min；第二阶段98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸3min，32个循环；第三阶段：68℃终延伸5min。PCR反应完成后，本发明得到PCR产物。本发明利用所述引物组能够扩增不同单倍型小麦中的TaRSR1-1B基因片段，即TaRSR1-1B基因编码区的1914bp～3152bp。PCR扩增反应所得PCR扩增产物中含有分子标记的SNP位点。
得到PCR产物后，本发明使用限制性内切酶Pac I对PCR扩增产物进行酶切，对酶切产物进行电泳检测。本发明对所述酶切的条件和反应的体系没有特殊限定，采用本领域常规酶切条件和反应的体系均可。在本发明中，所述酶切体系优选包括1μL Pac I内切酶；2μL10×Buffer；7μL PCR产物；补充ddH2O至总体积为20μL，所述酶切条件优选为37℃处理1h。在本发明中，所述Pac I内切酶购自TAKALA公司。
酶切完成后，本发明优选得到酶切产物。得到酶切产物后，本发明对酶切产物进行电泳检测。在本发明中，所述电泳包括琼脂糖凝胶电泳。本发明对所述电泳的方法没有特殊限定，采用本领域常规电泳方法均可。本发明优选对电泳结果进行分析，进而判断酶切产物的多态性，从而根据检测结果判断小麦中TaRSR1-1B基因的等位变异类型，进而判定小麦粒重性状。在本发明中，所述电泳结果优选包括片段的大小和片段的条数。在本发明中，当所述酶切产物包括包括679bp和559bp两个短片段时，等位基因变异类型为TaRSR1-1B-T，鉴定为低粒重小麦；当所述酶切产物没有短片度，仅含有一个长片段1239bp时，等位基因变异类型为TaRSR1-1B-C，鉴定为高粒重小麦。
本发明提供了上述技术方案所述分子标记、上述技术方案所述引物组、上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述方法在不同小麦粒重比较中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述分子标记、上述技术方案所述引物组、上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述方法在小麦育种和/或辅助小麦育种中的应用。
本发明提供的检测小麦粒重基因的分子标记能够实现小麦粒重基因TaRSR1-1B的快速检测。扩增所述分子标记的引物组或试剂盒能够在小麦生长初期有效筛选出含有TaRSR1-1B-C基因的小麦株系，节约实验成本，能够快速筛选出高千粒重小麦株系，提高选择效率，加速高产小麦分子育种进程。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.材料
本研究选用241份普通小麦品种，详细信息见表2。用于PCR扩增的高保真PCR酶KODOneTM PCR Master Mix购自东洋纺生物公司，平末端克隆载体ZT4-Blunt购自庄盟生物公司，Pac I限制性内切酶购自大连宝生物公司，其他药品均为国产分析纯。
2.引物设计
首先根据TaRSR1基因的三拷贝1A(TraesCS1A02G058400)、1B(TraesCS1B02G076300)、1D(TraesCS1D02G059200)在小麦基因组数据库(https://plants.ensembl.org/index.html)中的序列差异，设计TaRSR1-1B特异的启动子扩增引物TaRSR1-1B-Promoter-F和TaRSR1-1B-Promoter-R，以及以ATG起始的DNA序列引物TaRSR1-1B-F1及TaRSR1-1B-R1和TaRSR1-1B-F2及TaRSR1-1B-R2。引物合成与测序由河南尚亚生物技术公司完成。
上述引物的具体序列信息如表1所示。
表1引物信息
3.小麦基因组DNA的提取
采用CTAB法提取小麦基因组DNA。首先将小麦叶片在液氮中速冻研磨，加入1mL预热的CTAB抽提液，65℃水浴1h。然后12,000g离心后，取上清至另一干净1.5mL离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，氯仿和异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，轻微振荡。12,000g离心10min，将上清转移至新1.5mL离心管，加入2倍体积无水乙醇混匀，-20℃静置30min。离心去上清，用75％乙醇洗涤2～3遍，晾干后，加入100μL无菌水溶解DNA。
4.TaRSR1-1B基因启动子与编码序列的扩增与测序
利用高保真PCR酶KOD OneTM PCR Master Mix和表1中的引物扩增241个六倍体小麦品种基因组DNA中的TaRSR1-1B启动子与编码序列目的片段。
PCR体系中具体组成为：25μL KOD OneTM PCR Master Mix(2×)，上下游引物各0.3μL(10μM)，200ng DNA模板，补充ddH2O至总体积50μL。
PCR反应程序为：第一步，94℃3min；第二步，98℃10s，56℃30s，68℃3min，32个循环；第三步，68℃5min。
PCR反应完成后，得到PCR产物。对PCR产物进行电泳，电泳检测结果如图1所示。其中以TaRSR1-1B-Promoter-F/R扩增得到的TaRSR1-1B的启动子扩增片段为1903bp；以TaRSR1-1B-F1/R1和TaRSR1-1B-F2/R2扩增得到的ATG起始的DNA序列分段扩增片段长度分别为2119bp和2040bp。
分别回收PCR扩增目的片段，并与ZT4-Blunt克隆载体连接，转化大肠杆菌(DH5α)，挑取三个以上阳性克隆，进行菌落PCR，菌落PCR使用通用引物T7-F/R测序验证。其中T7-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；T7-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’。
使用DNAMAN软件(http://www.lynnon.com)对测序结果进行拼接，测序结果得到TaRSR1-1B基因启动子对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，具体为：
5’-AGCTGGAAAGATTGGCCGGTTAAGATTATGGCCTTAGATTTCGTGGGGTTGGGCTTTCTAAAGGCCACATCAGCAAATGTTAATACTATTTTCAAGAACATGATAGCTTAATTGGGTTCGAATAAATCGACCGATCCGTTGGATCGCCAAGCACACAAAGCTAGTGAGCTAGAAGGATTGACCCTTATGATTATAGCCTTAGGTTTAGCAGGGCCAGCCTTTCTAAAGGTCTGATAGGTAAATGTCTTTTCTATTTTTAAGAACATGAAAGCTTAATTGATTTCGGATAAATAGGGCCGAGCTAGGGCGTTATCCACCCATCATCTACTTAATGCGCCTCTTAATGTTCTTCCATCTTCAAAAGATGGATAAAAACTAGATTGGCTTTGGCTCGCCAAGCACGCTAAGCTAATGAGCTGCAAAGATTGATCCATTACAATTCTAGCCTTTGGTTTAGTGGGTCGGGCTTTCTAAAGGCCTTATCGGTATATGTCTCTTTTATTTTTAAGAACGTGAAATCTTAATTGAGTTCGAATAAATTGATCTGAGCTAGCTCGTTATCCACTCATCGTCTACTTAATTCACCTCTTAATGTTCTTCCATCTTCTAAGTGAGGATAAGAACATAGACGGGTTTTGGCTAGCCCAAAACGACAAGCTGATGAGCTGGAAAGATTGGTCCGTTACGATTATAGCCTTAGGTTAAGTGGGTTCATGCTTTCTAAATGCCATAGCGACAATTGTCTCTTATTTTTTTTACGAAAATGGGAGCTGAATTGGGTTCGAATAAATCTATCTAAGCTAGCTCGTTATCCACCCATCGCCTACTCAATTCGCCTCTTAATGTTCTTCCATCTAATTGTGGATAAGAACGTAGACGGGTTTTGGCTCGCCAAACACGATAAGCAGATGAGCTGGAAAGATTGTCCGTTACGATTATAGCCCTAAAGACCCGGTGAAAAGTAAACAAAAGGCGAATTGCGCAGACAACCAAAAAAACCTCGTCGCTAGCCAGCGTCGCAATGCACGAGTATCCGCAGGGAATGCCTCTGTATTCTTTTCATCTAATAATTAATTTTTTATTATTTTCTCAAGCAAAATCCTAGGAGTGTTCAATAGAACCATAAAAATGTGGTGGTGATCTATCAGTAAAAAATAACCACCTGTCCTCAAAATTCTTGAAAACATCATCGAAATTACATAGTTTATGTATACTATAATTTTTACTGAAGCAGTAGATAGTTTGAAATAATTGACTTTCTTTTGTTTGCTCCTTATAATTTGCCCCCAACAAAAATACCAAATAAAGCTAGGCGACTTGAGATAACAAAAGGAAGAAAAAAAGGACGCCCAAATGCGGAATGGTTTTAAGGATAACCGGCTGCCACCGGCTACTTCCGGCGACCCCGCTTTCTATATATACGGGCCTCTTTTTCCACCCTCTCCACACACCCTCTCTACTCCGCCCTTTCGTCCCCGTCTCCGGCCGTTTCCCACCGCCGCTCGCCGGAGCTAGCCAAGCTTTTGTTGCATATATCCTTTACTCCAAAAGTTTCCACGTTTCTGACACCGTCGGCCGGATTGGCCGTCGATGTAAAAGTGTTCTTCTTGAATCGTGAGGTTAGATAGCGGCCGTAGGAATAGGATCGTCTTGCCATCTCCGGCGGCGTGTAGGATGCCCATCGAAGATTGGGACTGAGGCGTCGGCGGCGGATAAATGTACCGCAAAAACGCGTCGGCACTAACCTGCTTCTACCTGTACCTCCTCTGGTTCTTCTTCCTGAAAAAGTAGCAGAGCAAGCGATCGATCGAGCCAGCGACTCGTGATTGAGATTGTTTGAGTTTGATACATCTATAGGTGTTCTCGTTGATTGATTGGAAGTTGGAGAGAAGTGATCTCGGCG-3’；TaRSR1-1B基因ATG起始的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
5.TaRSR1-1B基因启动子与编码区的序列比对与单倍型分析
使用DNAMAN软件(http://www.lynnon.com)对测序结果进行拼接并进行序列比对。序列比对结果如图2所示。
序列比对结果发现在241个小麦品种中的TaRSR1-1B启动子区域中(-1903bp～-1bp)存在5个SNP(-52A/C，-43C/T，-33C/T，-16G/A，-14G/A)，但均不会引起编码氨基酸的改变，属于无义突变位点。在编码序列(1bp～4159bp)存在8个SNP多态性变异位点，通过DnaSP5.10软件(http://www.ub.edu/DnaSP)对编码域进行单倍型鉴定，结果发现这8个SNP紧密连锁形成三种单倍型，分别命名为TaRSR1-1B-Hap1、TaRSR1-1B-Hap2、TaRSR1-1B-Hap3。
6.不同单倍型小麦品种在六倍体小麦中的千粒重分析
241份普通小麦品种的单倍型及在不同单倍型小麦品种的千粒重统计结果如表2所示。通过对SNP位点千粒重进行统计分析，结果如表3和图3所示。
表2 241份普通小麦品种的单倍型及在不同单倍型小麦品种的千粒重统计结果
TaRSR1-1B在三种单倍型小麦品种中的千粒重分析结果如表3所示。
| 组 | TKW(g) |
| Hap1 | 48.72±0.83a |
| Hap2 | 35.93±0.57b |
| Hap3 | 35.21±0.79b |
由表2、表3和图3可得，Hap1单倍型小麦品种的平均千粒重均显著高于Hap2、Hap3单倍型，表明Hap1较Hap2、Hap3为高千粒重优异单倍型。
7.CAPS分子标记开发
由于TaRSR1-1B三种单倍型的差异是单碱基差异(SNP)，可以根据这些差异开发酶切扩增的多态性(CAPS)分子标记。
利用dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)对Hap1优异单倍型与Hap2/3单倍型序列的差异进行分析，Hap1优异单倍型中含有的一个SNP：2592bp(C/T)位于序列TTAACTAA。由于TTAATTAA可以被限制性内切酶Pac I特异性识别并切开，而TTAACTAAA不能被切开，可根据该处序列差异特点，开发CAPS分子标记用于区别Hap1与其它单倍型，并将该分子标记命名为CAPS-2592(TraesCS1B02G076300)，即为TaRSR1-1B以ATG起始的第2592位。
在CAPS-2592标记识别的SNP位点上下游，设计引物CAPS-F/R，CAPS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-GTTTGCATCTGTGAT-3’；CAPS-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，具体为：5’-ATAGTATTGGTACGA-3’。
PCR体系中具体组分为：25μL KOD OneTM PCR Master Mix(2×)，上下游引物各0.3μL(10μM)，200ng DNA模板，补充ddH2O至总体积50μL。
PCR反应程序为：第一步，94℃3min；第二步，98℃10s，56℃30s，68℃3min，32个循环；第三步，68℃5min。
以不同单倍型小麦品种基因组DNA为模板，使用CAPS-F/R引物组扩增不同单倍型小麦中的TaRSR1-1B片段(1914bp～3152bp)，均能获得单一扩增条带(1239bp)。
使用限制性内切酶Pac I对纯化的PCR产物进行酶切，酶切体系为1μL Pac1内切酶；2μL 10×Buffer；7μL PCR产物；补充ddH2O至总体积为20μL；酶切条件为37℃处理1h。Pac I内切酶购自TAKALA公司。
对酶切产物进行电泳检测，电泳检测结果发现Hap2/3单倍型小麦品种扩增产物可以被Pac I内切酶切开为两个片段(679bp和559bp)，而Hap1单倍型小麦材料的DNA扩增产物经酶切后仍然是单片段，无法被切开。具体酶切位点详见图4。
综上，本发明提供的检测小麦粒重基因的分子标记，CAPS-3753分子标记能够区分优异单倍型Hap1与Hap2/3单倍型，可应用于高千粒重小麦新品种的分子设计育种。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种检测小麦粒重基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于小麦TaRSR1-1B基因编码区序列第2592bp位点，且多态性为C/T。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述TaRSR1-1B基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种用于扩增权利要求1所述分子标记的引物组，其特征在于，包括上游引物CAPS-F和下游引物CAPS-R；所述上游引物CAPS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述下游引物CAPS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种检测小麦粒重基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述引物组。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应试剂。
6.一种检测小麦粒重的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用权利要求3所述引物组对待测材料的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
用限制性内切酶Pac I对PCR扩增产物进行酶切，对酶切产物进行电泳检测；
若电泳检测结果出现两个片段，则为低千粒重小麦；
若电泳检测结果为一个片段，则为高千粒重小麦。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的反应体系以50μL计包括：2×KOD OneTM PCR MasterMix 25μL，10μM上游引物CAPS-F0.3μL，10μM下游引物CAPS-R0.3μL，200ng DNA模板，补充ddH2O至总体积50μL。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，PCR扩增反应的程序为：第一阶段94℃预变性3min；第二阶段98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸3min，32个循环；第三阶段：68℃终延伸5min。
9.权利要求1或2所述分子标记、权利要求3所述引物组、权利要求4或5所述试剂盒或权利要求6～8任一项所述方法在不同小麦粒重比较中的应用。
10.权利要求1或2所述分子标记、权利要求3所述引物组、权利要求4或5所述试剂盒或权利要求6～8任一项所述方法在小麦育种和/或辅助小麦育种中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20240123 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |