CN116064902A - 检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子标记辅助育种技术领域，公开了一种检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记，扩增所述dCAPS分子标记的引物的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示、下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。该dCAPS标记能够准确的检测出是否含有TAC1的基因型，可以用于分子标记辅助选育含有AetTAC1‑T093基因的直立株型小麦。

Description

检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子标记辅助育种技术领域，涉及一种检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记及其应用。
背景技术
作物株型主要由穗部形态、植株高度、分蘖数量和角度以及叶夹角等性状决定。分蘖角度定义为主茎与最外侧分蘖间形成的角度，其与作物的光合利用效率、逆境抗性以及产量紧密相关。过窄的分蘖角度通常会导致植株间空气流动差，湿度增大进而引起病害发生，而过大的分蘖角度通常会导致植株间相互遮挡，降低光合利用效率，进而影响产量。因此，开发具有合理分蘖角度的作物材料，通过合理密植，能够极大提高产量。
小麦是我国第二大粮食作物，其产量的提高对于确保我国粮食安全至关重要。目前，小麦高产育种，主要侧重要于聚合与千粒重、分蘖数量和株高以及各种抗性相关基因，极少关注与分蘖角度相关基因。主要是因为目前在小麦中与分蘖角度相关基因报道较少。
普通小麦是异源六倍体植物，其形成过程先后经历了两次多倍化过程：第一次多倍化事件发生在约50万年前，由乌拉图小麦(AuAu; 2n = 2x = 14)和山羊草属植物拟山羊草(BB)发生天然杂交，形成了野生二粒小麦(AuAuBB)。第二次多倍化事件发生在大约8000年前，由栽培二粒小麦(AuAuBB)和少数几例节节麦（DD）杂交形成早期的六倍体小麦。经过不断的驯化，早期的六倍体小麦逐渐演变成为现代六倍体面包小麦。
节节麦（ Aegilops tauschii，2n=14）是普通六倍体小麦D基因组的供体，属于普通小麦重要得二级基因资源库。节节麦自然群体按照遗传多样性和地域分布可分为L1、L2和L3等三个主要系，L1和L2系又进一步细分为2E、2W、1W、1E-X和1E-H/1E-Y等亚系（Zhou, Y.Bai, S. Li, H.  et al. Introgressing the Aegilops tauschii genome into wheatas a basis for cereal improvement.  Nat Plants.7, 774–786(2021); Li, H.Nie,F.Zhu, L et al. New insights into the dispersion history and adaptive evolutionof taxon Aegilops tauschii in China, Journal of Genetics and Genomics, 49,185-194(2022））。其中我国黄河流域为节节麦分布的最东端，其中蕴含有特有的基因资源，具有重要的潜在利用价值，例如代表节节麦种质T093为从河南濮阳采集到，并且完成了高质量参考基因组的构建（Zhou, Y. Bai, S. Li, H.  et al. Introgressing theAegilops tauschii genome into wheat as a basis for cereal improvement.  Nat  Plants.7, 774–786(2021)）。目前仅有2E系中少数几个节节麦参与六倍体小麦形成，而且参与时间较晚导致现有六倍体小麦中D基因组的多样性明显低于A和B亚基因组的遗传多样性，而且小麦D亚基因组遗传多样性要远远低于节节麦自然群体之间的遗传多样性。
TAC1最早在水稻中被鉴定到，并证实参与调控水稻分蘖角度。之后， TAC1同源基因陆续在拟南芥、玉米、油菜、桃树、杨树、李子树和小麦中被鉴定到，分别控制分蘖角度、叶片角度以及分枝角度。
分子标记是一类重要的遗传标记之一，它是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。利用分子标记检测个体之间的遗传多样性最早始于上世纪八十年代，经过多年的发展，已经形成几十种不同类型的标记。根据标记原理，目前常用的分子标记可分为：基于分子杂交的分子标记、基于PCR技术的分子标记、基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记以及单核苷酸多态性标记等。这些分子标记已经被广泛应用于基因组作图和基因定位研究、疾病诊断、物种亲缘关系和系统分类研究以及分子标记辅助选择育种中。酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified PolymorphicSequence，CAPS）标记是根据SNPs位点的DNA序列设计特异的PCR引物，然后将PCR反应产物与限制性内切酶相结合产生的一种分子标记。但SNP位点恰好位于酶切位点的情况较少，所以在此基础上需要进一步改良。衍生型酶切扩增多态性序列（derived Cleaved AmplifiedPolymorphicSequence，dCAPS）是在CAPS标记的基础上进一步改进的分子标记，它的原理是通过在扩增引物中引入错配碱基，SNP位点引入限制性内切酶位点，从而使不同等位基因能被区分鉴定。dCAPS分子标记技术基因定位、图位克隆、基因型鉴定等方面都得到了广泛的应用。目前还没有开发用于鉴别小麦株型的dCAPS分子标记。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记，该dCAPS标记能够准确的检测出是否含有 TAC1的基因型，可以用于分子标记辅助选育含有 AetTAC1-T093基因的直立株型小麦。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记，扩增所述dCAPS分子标记的引物的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示、下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供含有扩增上述检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记的引物的试剂盒。
本发明还提供利用上述检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记鉴定小麦直立株型的方法，包括以下步骤：
以待测节节麦品种的基因组DNA为模板，利用dCAPS分子标记如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示的上下游引物进行PCR扩增；利用限制性内切酶 DdeI对扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行电泳分离，若酶切产物显示一个205bp条带则待测节节麦品种为匍匐株型，若酶切产物显示180bp一个条带或者205bp、180bp两个条带则待测节节麦品种为直立株型。
本发明还提供上述检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记在小麦直立株型分子育种中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明根据节节麦 TAC1基因SNP4核苷酸序列差异设计了一个dCAPS分子标记，利用dCAPS标记对节节麦T093、AK58和AK58-T093渐渗系的 TAC1基因型进行鉴定，结果显示该dCAPS分子标记能够很好地鉴定出渐渗系材料中是否含有 AetTAC1-T093等位基因，表明dCAPS标记能够准确的检测 TAC1的基因型，可以用于分子标记辅助选育含有 AetTAC1-T093基因的直立株型小麦。
附图说明
图1为本发明 AetTAC1-T093、 AetTAC1-AL8/78和 TaTAC1-5A/5B/5D基因部分序列比对及TAC1-dCAPS标记设计示意图。
图2为采用dCAPS标记用于T093、AK58的检测电泳图。
图3为采用TAC1-dCAPS标记鉴定T093、AK58、AK58-T093渐渗系的检测电泳图，图中Home为渐进系个体带有 AetTAC1-T093基因型且为纯合，Negative为渐进系个体不含 AetTAC1-T093基因型，Hetero为杂合个体。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
以下实施例中节节麦材料AL8/78来自东亚，来源于市购；节节麦材料T093来源于河南大学抗逆改良中心麦类作物种子库，其原始采集于河南地区，并于2019年进行了全基因组denovo组装，获得了基因组7条染色体的精细图谱，最终组装基因组大小为4.12Gb，具体见（Zhou, Yun, Shenglong Bai, Hao Li, Guiling Sun, Dale Zhang, Feifei Ma,Xinpeng Zhao, et al. 2021. “Introgressing the Aegilops Tauschii Genome intoWheat as a Basis for Cereal Improvement.” Nature Plants 7 (6): 774–86.https://doi.org/10.1038/s41477-021-00934-w.）；小麦品种AK58，来源于市购；渐渗系材料AT7021、AT9311、AT9261、AT9119、AT9710、AT9365，由T093和AK58杂交获得。
实施例一
1.1 选取节节麦材料
T093是具有直立株型的节节麦材料，AL8/78是具有匍匐株型的节节麦材料。F2群体来源于T093和AL8/78的杂交，共19株。
1.2提取节节麦基因组DNA
每株节节麦于苗期取0.2g左右叶片，放入2mL离心管，同时放入一粒直径6mm的钢珠，经过液氮速冻后，置于研磨仪上，以100Hz的频率震荡研磨90s；加入1000 μL1.5×CTAB溶液（1.5％ CTAB，75 mM Tris-HCl，15 mM EDTA，1.05 M NaCl，PH=8.0），于60℃水浴锅中温浴30min；以12000rpm/min转速离心10min；吸取约800μL上清，加入等体积DNA提取液（氯仿：异戊醇=24：1）；经充分震荡后，室温静置2min；吸取400 μL上清，并加入等体积异丙醇，放入-20℃中静置30 min；以12000rpm/min转速离心10min；去除废液，并用70%酒精清洗沉淀两遍，后加入100 μL无菌水溶解DNA；测定DNA浓度，并用无菌水调至100 ng/μL备用。
1.3设计dCAPS分子标记
节节麦 AetTAC1基因位于第5号染色体。将节节麦T093的 AetTAC1-T093基因（CDS序列如SEQ ID NO.1所示）与AL8/78中的等位基因 AetTAC1-AL8/78基因（CDS序列如SEQ IDNO.2所示）的编码区序列进行比对，发现有四个SNP位点（如图1所示），其中SNP4位点一个碱基A缺失引起 AetTAC1-T093所编码的蛋白从232位置发生移码突变，从而导致破坏了TAC1第Ⅳ保守结构域，从而使节节麦T093具有更紧凑的株型，该SNP4位点位于节节麦 AetTAC1基因CDS序列第701bp处。普通小麦为异源六倍体物种，在5A和5B上同样存在 TaTAC1-5A和 TaTAC1-5B。它们与 TaTAC1-5D为同源基因，序列高度相似，因此为排除 TaTAC1-5A和 TaTAC1- 5B基因的干扰，dCAPS标记下游引物选择为TaTAC1-5D特异性引物（如图1所示）。
本发明根据SNP4碱基A缺失设计了一个dCAPS分子标记，在其扩增的上游引物的第25bp处引入一个C→G的突变碱基（如图1所示），使得 AetTAC1-T093等位基因的PCR扩增产物中有一个 DdeI（CTNAG）酶切位点，而 AetTAC1-AL8/78等位基因的扩增产物没有这个酶切位点。对PCR产物用 DdeI酶切，然后用酶切产物进行电泳检测，即可区分 AetTAC1-T093、 AetTAC1-AL8/78以及杂合型等不同基因型的分型。
扩增上述dCAPS分子标记的引物序列为：
TAC1-dCAPS-F：5 ' -GTCATCTGTGGGAATAAGTAGGTCCTGA-3'（SEQ ID NO.3所示）；
TAC1-dCAPS-R：5 ' -AAGGGTACATCATTGATATATATA-3'（如SEQ ID NO.4所示）。
PCR扩增产物为205bp，然后PCR扩增产物用限制性内切酶DdeI酶切， AetTAC1-T093可以切开得到180bp产物。
1.4dCAPS分子标记的检测方法
PCR体系总体积50μL，其中包括25μL2×TaqPCRMasterMix，dCAPS分子标记的上下游引物各1.5 μL(10μmol/L)，1μL节节麦基因组DNA（100ng/μL）；PCR反应程序如下：94℃，3min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；38个循环； TAC1基因特异性分子标记扩增获得的PCR产物经限制性内切酶 DdeI酶切后，于2％的琼脂糖凝胶中（带有核酸染料），以180 V电压，电泳30 min，后置于凝胶成像仪中成像。
1.5结果与分析
利用dCAPS分子标记对T093、AL8/78及其杂交F2代的 TAC1基因型进行检测，结果显示：dCAPS分子标记引物在T093、AL8/78及其杂交F2代中均能扩增出205 bp的产物。
将PCR产物用限制性内切酶DdeI酶切，然后进行电泳检测（如图2所示）。与预计结果一致，AL8/78的PCR产物不能被DdeI酶切开，电泳结果仍显示一个205 bp的条带，T093的PCR产物能被DdeI酶切，电泳显示为一个180bp的条带，而杂交F2中存在两个亲本类型，即存在205 bp或者180 bp的条带，同时也存在杂合类型，即一个泳道存在205 bp和180 bp两个条带。
实施例二
利用dCAPS分子标记对T093、AK58以及AK58-T093渐渗系个体（即AT7021、AT9311、AT9261、AT9119、AT9710、AT9365）进行鉴定，PCR扩增和酶切步骤同实施例1的1.4和1.5节，结果如图3所示。从图3可以看出，渐渗系个体中含有 AetTAC1-T093等位基因的植株显示出180 bp一个条带，或者205 bp和180 bp两条条带，而不含有 AetTAC1-T093等位基因的植株仅显示出205 bp条带，这表明该dCAPS分子标记可应用于后续小麦分子标记辅助育种中。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (4)

1.一种检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记，其特征在于，扩增所述dCAPS分子标记的引物的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示、下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。
2.含有扩增权利要求1所述的检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记的引物的试剂盒。
3.利用权利要求1所述的检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记鉴定节节麦直立株型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待测节节麦品种的基因组DNA为模板，利用dCAPS分子标记如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的上下游引物进行PCR扩增；利用限制性内切酶DdeI对扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行电泳分离，若酶切产物显示一个205bp条带则待测节节麦品种为匍匐株型，若酶切产物显示180bp一个条带或者205bp、180bp两个条带则待测节节麦品种为直立株型。
4.权利要求1所述的检测节节麦直立株型的dCAPS分子标记在小麦直立株型分子育种中的应用。
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